KR102325467B1 - 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 제조방법 및 이를 이용하여 제조한 효소식품 - Google Patents

용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 제조방법 및 이를 이용하여 제조한 효소식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 제조방법 및 이를 이용하여 제조한 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품에 관한 것이다. 보다 더 자세하게 본 발명에서는 배양용수로서 10~100%(v/v) 용암해수를 사용한 미생물 배지를 사용하여 용암해수에 포함되어 있는 천연 미네랄이 배지상의 단백질과 결합하여 미네랄-단백질염 상태로 전환되어 배지 상의 염도 조절을 할 뿐만 아니라, 바실러스의 원활한 배양을 유도하고, 바실러스 균주의 전분분해 효소 및 단백질분해 효소의 분비능 및 이들의 효소활성을 촉진하게 한다. 이렇게 제조된 바실러스 배양액 및 전분분해 효소 및 단백질분해 효소가 다량 포함된 조성물은 미네랄-단백질염 효소체 형성 효과로 인해 동결건조 또는 분무건조하여도 이로 인해 그 활성이 제한되지 않을 뿐만 아니라, 외부위협인자인 위산과 담즙산의 급격한 pH 변화에 따른 스트레스에 대한 섭취 안정성이 향상되면서도 효소활성의 외부위협인자인 온도 스트레스에 대한 내성이 증가되어 식품에 적용 시 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품으로 활용 가능하다.

Description

용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 제조방법 및 이를 이용하여 제조한 효소식품 {Method of preparing lava seawater natural mineral fermented enzyme and enzyme food thereby}
본 발명은 용암해수를 별도의 전처리 없이 바실러스 균주의 배양용수로 사용하여 바실러스 균주의 배양 및 알파-아밀라아제와 프로테아제의 효소 생성과 안정성을 용이하게 증강시키는 효능이 있는 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 발효 효소를 이용하여 제조하여 천연 건강식품으로 이용 가능한 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품을 제조하는 방법에 관한 것이다.
보다 바람직하게는 본 발명에서는 상기 발효 효소의 제조를 위해, 효소를 생산하는 특정 바실러스 속 미생물을 이용하여, 이 미생물의 배양을 위해 배지에 용암해수의 농도가 10~100%(v/v)이 되도록 용암해수를 첨가하는 방법을 이용하며, 이로 인해 용암해수에 포함되어 있는 천연 미네랄이 바실러스 배양 배지상의 단백질과 미네랄-단백질염 상태로 비수용화되어 배지 상의 염도 조절을 통해 바실러스의 원활한 배양을 유도한다.
위 조건으로 바실러스 생육 및 효소생성에 최적화된 조건을 구현 시, 배양 중에 생성되는 알파-아밀라아제 및 프로테아제는 배지상에 존재하는 용암해수 유래 잔류 천연 미네랄에 의해 효소의 활성이 향상되고 최종적으로 비수용성 미네랄-단백질염에 의해 미네랄-단백질염 효소체를 형성하게 되면서 섭취 시의 외부위협인자인 위산과 담즙산의 급격한 pH 변화에 따른 스트레스에 대한 섭취 안정성이 향상되며, 효소활성의 외부위협인자인 온도 스트레스에 대한 내성이 증가되어 경시 안정성이 향상된 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 특성을 나타내었다. 또한 이를 식품으로 제조하기 위하여 곡류혼합물에 효소 배양을 통해 효소식품의 형태로 제조하였을 때 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 특징인 섭취 안정성과 경시 안정성 향상의 특성이 동일하게 유지되는 것을 확인하였다.
효소(Enzyme)는 생체 내에 존재하는 수많은 생물화학반응을 촉진하는 생체 촉매로서, 세포의 대사를 진행시켜 생장, 분해, 소화 등의 중요한 기능이 지속적으로 작용하게 하는 주요 단위체이다. 효소는 특정한 기질에 대해서만 반응하는 기질특이성을 가지며, 대부분 단백질로 구성되어 있기 때문에 단백질의 성질을 나타낸다. 효소는 단백질의 특성상 변성의 원인이 되는 온도 및 열에 불안정하며 또한 강산이나 강알칼리와 같은 pH에 의해 활성에 큰 영향을 받는다(장판식 외., 2010, 이해하기 쉬운 식품효소공학, 수학사).
효소는 농축수산, 섬유, 제약, 바이오 등 여러 산업분야에서 다양한 목적으로 사용되고 있으며 식품분야에서도 식품가공, 제조에 식품첨가물로서 주로 사용되고 있다. 또한 식품의 한 종류로도 사용되고 있는데 식약처에서는 효소가 함유된 식품을 효소식품이라 명칭하고 식품공전에 다음과 같이 정의하고 있다.
효소식품(Enzyme food) : 식물성 원료에 식용 미생물을 배양시켜 효소를 다량 함유하게 하거나 식품에서 효소함유 부분을 추출한 것 또는 이를 주원료로 하여 섭취가 용이하도록 가공한 것(Korea Food and Drug Administration. 2010).
이와 같은 효소식품은 발효와 숙성과정을 통해 식품 중의 다양한 영양소와 생리활성물질을 생성하고 유익균을 증식시키는 등의 역할을 하는데, 이러한 효소식품의 효소적 기능을 부여하기 위해 곡류, 과일, 채소의 내제 효소와 미생물의 발효과정을 통해 생성된 발효 효소를 식품에 적용하여 효소식품의 형태로 제공할 수 있다(Huh SH et al., 1997).
인체 노화의 진행에 따라 청년기에 풍부하게 분비되던 체내 효소는 점점 그 양과 활성이 감소하게 되는데 특히 식품 섭취 시 소화에 중요하게 작용하는 타액, 위장액 그리고 췌장액의 분비 및 활성 감소에 따라 전분을 분해하는 알파-아밀라아제(α-amylase), 단백질을 분해하는 프로테아제(protease), 지방을 분해하는 리파아제(lipase) 등 주요 효소 활성이 낮아지게 되어 섭취한 식품에 대한 충분한 소화에 어려움을 겪게 된다(신현재, 2010). 효소식품은 이러한 노령화에 의한 체내 효소 감소를 보조하여 섭취한 식품을 보다 쉽게 분해, 흡수 할 수 있도록 하는 보조적인 역할도 기대할 수 있다.
효소식품을 생산하기 위해 사용되는 균주로는 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.)과 바실러스 속(Bacillus sp.) 식품미생물이 주로 이용되고 있다. 특히 바실러스 속 균주는 50년 이상 산업적으로 사용되어온 주요 생물자원으로 짧은 세대기간, 저렴한 성장 배지 조성 및 고수율의 효소 분비능 등의 장점을 가진 균주로 효소식품 제조에 특히 많이 활용되고 있다(Dae-Hoon Lee et al., 2015). 그러나 효소식품을 제조하기 위하여 가공 중 발생하는 온도, 산도 등 여러 외부인자들에 의해 효소활성이 영향을 받게 되는데 이는 효소가 대부분 단백질로 구성되어 열과 강산, 강알칼리에 의해 쉽게 변성되는 특성에 기인한다. 이러한 특성에 따라 효소식품이라 제조된 것을 섭취하더라도 효소 활성이 체내 소화기관의 pH 변화에 의해 쉽게 실활되어 식품 소화의 보조적 기대효과가 감소되기도 한다.
따라서 식품업계에서는 이와 같은 효소식품의 특성에 따라 제조적 한계를 극복하는 해결방안이 필요한 상황이다. 이를 위해 식품업계 일부에서는 효소를 안정화하는 방법으로 알긴산, 펙틴, 키토산 등과 같은 식품첨가물을 첨가하여 미세캡슐화하는 방법(Lee DH et al., 2015)과 효소식품을 bead 형태의 제형으로 제조하는 방법(Gu YR et al., 2015)이 이용되고 있다. 그러나 이러한 식품첨가물을 통해 효소를 안정화하는 방식은 역설적으로 첨가물에 의한 알러지 등과 같은 면역과민반응 및 복통, 설사 등의 이상반응을 야기할 가능성이 있어 섭취 시 주의할 필요가 있으며 일부 첨가물은 사용량에 한계치가 정해져 있다.
효소 안정화를 위해 사용하는 식품첨가물에 의한 건강상의 우려를 극복하기 위해 식품업계에서는 천연유래의 성분이나 물질로 효소 안정화를 유도할 수 있는 새로운 기술이 요구되는 실정이다.
용암해수에는 일반 해수나 심층수, 삼다수보다 나트륨, 마그네슘, 칼슘, 칼륨 등의 필수 미네랄뿐만 아니라 일반 유용 미네랄 성분들(철, 망간, 아연, 몰리브덴, 셀레늄 등)이 더 많이 함유되어 있다. 그 중에서도 인슐린 분비를 안정시키거나 당뇨병, 고지혈증 등의 개선효과가 있다고 알려진 바나듐, 혈액순환 촉진, 면역력 증강, 항암작용을 갖는 게르마늄, 지방의 산화작용억제, 심장과 간을 유지하는 상승효과, 라디칼 소거능력, 항암, 불임, 노화 및 콜레스테롤 수치 개선효과가 있는 셀레늄의 함유는 해양 심층수에서도 보고된 적이 없는 용암해수만의 특징이다. 게다가 이들 미네랄은 이온화된 상태에 있으며, 이온화된 미네랄은 인체나 타 동물에 대해 소화흡수가 용이하다. 또한, 용암해수는 대장균, 질산성질소, 인산염인, 페놀류 등이 검출되지 않은 청정한 지하수 자원이며, 비소, 수은, 카드늄 등 유해성분이 검출되지 않거나 납이 극히 미량이 검출되기 때문에 산업화 적용에 장애요인이 없는 청정 원료이다.
용암해수를 효소 배양 및 효소식품 제조에 사용함에 있어 기대할 수 있는 기능은 용암해수에 함유된 천연 미네랄 중 2가 이온을 나타내는 미네랄로서 칼슘, 마그네슘과 같이 함유량이 높은 미네랄에 의하여 미생물의 효소 생산성 및 효소 활성의 증가를 기대할 수 있으며, 또한 고농도 천연 미네랄에 의한 단백질의 염석반응으로 효소 단백질 및 배지 내 단백질이 미네랄과 결합되어 비수용성화 되어 물에 대한 용해도가 달라짐으로 미네랄-단백질염 효소체가 생성되는 것을 기대할 수 있다.
이에 본 발명에서는 이러한 용암해수를 통해 새로운 효소 안정화 기술을 제공하고자 하였다. 즉, 본 발명에서는 우리 몸에 유익한 천연 미네랄이 함유되어 있고 식용으로 섭취 가능한 용암해수를 사용하여 염 농도가 높은 배지에서 바실러스 배양 배지를 미네랄-단백질염으로 유도시켜 염 농도를 조절함으로써 바실러스의 고농도 배양이 가능하도록 하고 배지 내 잔존하는 용암해수 유래 천연 미네랄 배양을 통해 생성되는 효소의 활성을 향상시키고자 하였다. 또한 생성된 효소를 외부 스트레스로부터 보호하기 위한 기재로 용암해수의 염석반응(salting-out)으로 수득한 미네랄-단백질염은 효소와 결합된 형태인 미네랄-단백질염 효소체로 전환되면서 섭취 시 생체 내 위장관을 통과하며 발생하는 효소의 실활을 최소화 하고자 하였으며, 효소의 온도 안정성을 강화하여 경시 안정성이 증대된 신규한 형태의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소 및 이를 이용한 효소식품을 개발하고자 하였다.
대한민국 등록특허 제10-2084350호 (발명의 명칭 : 용암해수 미네랄 코팅 프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 이용한 용암해수 미네랄 코팅 프로바이오틱스, 출원인 : 현대바이오랜드, 등록일 : 2020년02월26일)
장판식, 노봉수, 유상호, 김묘정, 김영완. (2010) 이해하기 쉬운 식품효소공학. 수학사. Korea Food and Drug Administration. 2010. Food Code. Korea Food and Drug Administration, Seoul, Korea. p 239-240. Huh SH, Kim MH. (1997) The modern health and health food. Hongikjea press, Seoul, Korea. p 35-36. 신현재. (2010) 춤추는 효소. 이채. Dae-Hoon Lee, Hee Kyung Jung, and Joo-Heon Hong. (2015) Research Trends of Enzyme Food in Korea, Food Industry and Nutrition, p 18-22. Lee DH, Park HM, HONG JH. (2015) Physicochemical properties and microencapsulation process of rice fermented with Bacillus subtilis CBD2. Korean J Food Preserve 22:225-231. Gu YR, Park HM, HONG JH. (2015) Physicochemical properties and in vitro dissolution of alginic acid bead coating α-amylase. J Chitin Chitosan 20: 189-195.
본 발명의 목적은 용암해수를 별도의 전처리 없이 바실러스 균주의 배양용수로 사용하여 배지 내에 생성된 미네랄-단백질염이 바실러스 균주의 배양 중에 알파-아밀라아제와 프로테아제와 반응하여 미네랄-단백질염 효소체를 생성함으로써, 효소 활성을 용이하게 증강시키는 효능이 있는 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 제조방법을 제공하는 데에 있다. 또한 본 발명의 목적은 상기 발효 효소를 이용하여 제조하여 효소의 외부위협인자인 pH 변화에 따른 섭취 안정성, 온도 변화에 따른 경시 안정성을 동시에 증가시키는 효과가 있는 식품으로 이용 가능한 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품을 제조하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 제조방법에 관한 것이다.
상기 제조방법은, 바람직하게는, (제1단계) 용암해수가 10~100%(v/v) 포함된 물을 배양용수로 이용하여 제조된 바실러스 배양용 배지를 준비하는 단계;
(제2단계) 상기 바실러스 배양용 배지에 바실러스를 접종하고 배양하여 용암해수 천연 미네랄 발효 효소가 포함된 바실러스 배양액을 얻는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 제1단계의 배지 내에는 미네랄-단백질염이 생성되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 제1단계의 배지는 바람직하게는, 바실러스의 배양이 가능한 모든 배지일 수 있으나, 더 바람직하게는, 구성성분으로, 카제인, 유당, 탈지대두분이 포함되고, 상기 구성성분을 용암해수가 10~100%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 바실러스 배양용 배지일 수 있다.
보다 더 바람직하게는 상기 제1단계의 배지는 총 부피 1ℓ 기준, 카제인 0.1~0.5%(w/v), 유당 1~10%(w/v), 탈지대두분 1~10%(w/v)가 되도록 각 성분을 용암해수가 10~100%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 바실러스 배양용 배지일 수 있다. 상기 배지 멸균은 121~123℃에서 30~60분간 수행하는 것이 좋다. 본 과정에서 용암해수의 천연 미네랄과 배지 내 카제인, 탈지대두분 등의 단백질이 미네랄-단백질염 형태로 전환되어 바실러스 배양용 배지 내에 미네랄-단백질염이 형성되며, 이후 생성된 효소와 결합하여 미네랄-단백질염 효소체를 형성하게 된다.
상기 제2단계의 바실러스 균주는 바실러스 속(Bacillus sp.)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 더 바람직하게는 전분분해 효소인 알파-아밀라아제(α-amylase)와 단백질분해 효소인 프로테아제(protease) 생성능이 있는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8051 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8051, 기탁번호 KCCM12944P) 또는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8052 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8052, 기탁번호 KCCM12945P)에서 선택될 수 있다.
상기 바실러스 균주의 배양조건은 100~200rpm, 30~35℃, 0.1~0.8bar, 0.3~1.0vvm 조건으로 60~72시간인 것이 바람직하다.
배양 종료 후 10~30rpm, 4~10℃, 0bar, 0vvm, 4~8시간의 조건으로 반응하여 생성된 효소가 배지 내 미네랄-단백질염과 미네랄-단백질염 효소체를 형성할 수 있는 반응공정을 갖게 하는 것이 좋다.
또한 본 발명은 상기 제2단계 이후에,
(제3단계) 곡류혼합분을 전처리하여 곡류혼합물을 얻는 단계;
(제4단계) 상기 곡류혼합물에 제2단계의 바실러스 배양액을 접종하고 발효하여 효소를 함유하는 곡류발효액을 얻는 단계;
(제5단계) 상기 곡류발효액을 건조하여 효소식품을 얻는 단계;
를 포함하는 단계를 수행하여, 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제3단계의 곡류혼합분은 현미, 보리, 통밀, 검종콩, 팥, 조, 수수, 귀리, 메밀, 호밀, 옥수수, 율무, 대두, 감자 및 고구마에서 선택되는 1종 이상의 원료가 함유된 것일 수 있다. 상기 곡류혼합분은 알파-아밀라아제 및 프로테아제에 처리하여 곡류혼합물 상태로 제조 후 본 발명에서 사용할 수 있다.
바람직하게는, 곡류혼합분에 1~5배 중량의 물을 첨가하고 100~105℃로 가열하여 전분을 팽윤시키고 식품첨가물 효소제인 알파-아밀라아제를 첨가 후 80~90℃에서 2~4시간 반응하고 이어서 프로테아제를 첨가하여 50~55℃에서 2~4시간 반응을 진행 후 90~100℃에서 2~4시간 가열하여 효소활성을 실활함으로써 곡류혼합물을 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 곡류혼합분을 전처리하지 않을 경우, 곡류의 분자량이 크기 때문에 바실러스 균주가 천연 알파-아밀라아제와 프로테아제를 생산하기 위한 배양용 배지로 이를 사용하기에 적절하지 않아, 바실러스 배양액 접종을 통해 효소식품의 배양이 원활히 이루어지게 하기 위함이다. 즉, 2단계인 바실러스 배양액에서 생성되는 효소만으로는 전분 등의 고분자로 이루어진 곡류혼합분을 완전히 저분자화하기 어렵기 때문에 바실러스가 효소발효를 위해 사용하기 용이하도록 곡류혼합물을 효소를 통해 전처리하여 저분자화 하는 것이다.
본 발명에서는 또한 상기 곡류혼합물 대신 과채혼합물, 배아혼합물, 기타혼합물 등의 다양한 식품원료혼합물을 사용하여 식품공전에서 정의하고 있는 효소식품의 종류별 제조가 가능하다.
상기 4단계의 배양은 제3단계의 곡류혼합물 100 중량부 기준으로 제2단계의 바실러스 배양액 2~4 중량부를 접종하여 배양하는 것이 좋다. 배양조건은 150~250rpm, 30~35℃, 0.1~0.8bar, 0.3~1.0vvm 조건으로 10~12시간인 것이 바람직하다.
상기 5단계의 건조는 바람직하게는 분무건조 또는 동결건조 방식을 선택하여 건조를 하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 분무건조를 택하여 제조시간을 단축하는 것이 좋으며 분무건조를 위한 조건은 내부온도 140~180℃, 외부온도 80~90℃, 디스크 회전속도 10,000~12,000rpm에서 수행하는 것이 좋다.
본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 발효 효소를 함유한 다양한 제형의 식품을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 미네랄-단백질염이 생성된 용암해수가 포함된 배지에서 전분분해 효소인 알파-아밀라아제(α-amylase)와 단백질분해 효소인 프로테아제(protease) 생성능이 있는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8051 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8051, 기탁번호 KCCM12944P) 또는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8052 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8052, 기탁번호 KCCM12945P)에 관한 것일 수 있다.
본 발명은 용암해수 천연 미네랄 발효 효소 및 이를 이용한 효소식품의 제조방법에 관한 것이다. 보다 더 자세하게 본 발명에서는 배양용수로서 10~100%(v/v) 용암해수를 사용한 미생물 배지를 사용하여 용암해수에 포함되어 있는 천연 미네랄이 배지상의 단백질과 결합하여 미네랄-단백질염 상태로 전환되어 배지 상의 염도 조절을 할 뿐만 아니라, 바실러스의 원활한 배양을 유도하고, 바실러스 균주의 전분분해 효소(α-amylase, 알파 아밀라아제) 및 단백질분해 효소(protease, 프로테아제)의 분비능 및 이들의 효소활성을 향상하게 한다. 이렇게 제조된 바실러스 배양액 및 전분분해 효소 및 단백질분해 효소가 다량 포함된 조성물은 미네랄-단백질염 효소체 형성 효과로 인해 동결건조 또는 분무건조하여도 이로 인해 그 활성이 제한되지 않을 뿐만 아니라, 외부위협인자인 위산과 담즙산의 급격한 pH 변화에 따른 스트레스에 대한 섭취 안정성이 향상되면서도 효소활성의 외부위협인자인 온도 스트레스에 대한 내성이 증가되어 식품에 적용 시 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품으로 활용 가능하다.
도 1은 바실러스 배양 전의 멸균된 제조예 1의 기본 배지, 실시예 1의 용암해수 농도별 배지 내의 미네랄-단백질염의 건조중량과 미네랄-단백질염 내의 단백질 함량을 나타내는 그래프이다.
도 2는 제조예 2의 배양액, 실시예 2의 용암해수가 농도별로 첨가된 배양 배지에 배양된 배양액 내의 바실러스 생균수를 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 제조예 2, 실시예 2의 배양액 내 배양일자별 바실러스 생균수를 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 제조예 2, 실시예 2의 배양액 내의 배양 날짜별 알파-아밀라아제, 프로테아제의 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 제조예 2의 효소 분말(배양액 분말), 실시예 2의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소 분말(배양액 분말)의 알파-아밀라아제, 프로테아제의 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 6은 실시예 2의 회수된 분말의 미네랄-단백질염 효소체 형성 상태를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope:SEM)으로 촬영한 사진이다.
도 7은 제조예 3의 효소식품 분말, 실시예 3의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말의 알파-아밀라아제, 프로테아제의 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 8은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8051 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB805, 기탁번호 KCCM12944P), 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8052 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8052, 기탁번호 KCCM12945P)로 각각 제조한 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말의 알파-아밀라아제와 프로테아제의 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 9는 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말의 제조방법에 대한 간략한 제조공정도를 나타낸 것이다.
도 10은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8051 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8051, 기탁번호 KCCM12944P)의 16s rRNA 유전자 염기서열을 나타낸다.
도 11은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8052 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8052, 기탁번호 KCCM12945P)의 16s rRNA 유전자 염기서열을 나타낸다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<제조예 1: 바실러스 기본배지 제조 단계>
본 발명에서 바실러스를 배양을 하기 위한 기본배지로서 1ℓ 당 카제인 0.2%(w/v), 유당 6%(w/v) 및 탈지대두분 6%(w/v)가 되도록 물에 용해하여 121~123℃에서 60분간 멸균하였다. 이후 발효조 배양을 위해 바실러스 종배양액을 준비하였다.
* 바실러스 종배양액 : 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8051 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8051, 기탁번호 KCCM12944P)를 탈지대두분 5%(w/v) 배지에서 160rpm, 35℃ 조건으로 24시간 배양한 것, 이하 바실러스 종배양액이라 함은 이를 말함.
<제조예 2: 바실러스의 배양 및 효소 생산>
제조예 1에서 멸균된 배지에 준비한 바실러스 종배양액을 발효조의 멸균배지에 접종하고 180rpm, 34℃, 0.5bar, 0.8vvm 조건으로 72시간 동안 배양하였다.
<제조예 3: 효소식품의 제조>
곡류혼합물 제조를 위해 위해 1ℓ 당 15곡 곡류혼합분(현미 46%, 보리 15%, 통밀 15%, 검정콩 2%, 팥 2%, 조 2%, 수수 2%, 귀리 2%, 메밀 2%, 호밀 2%, 옥수수 2%, 율무 2%, 대두 2%, 감자 2%, 고구마 2%) 4%(w/v)를 물에 용해 후 100~105℃, 0.8~1bar에서 30분간 살균하여 전분을 팽윤시켰다. 살균된 곡류혼합분에 식품첨가물 알파-아밀라아제를 첨가 후 80~90℃에서 2시간 효소반응을 진행하였고, 이후 식품첨가물 프로테아제를 첨가하여 50~55℃에서 2시간 효소반응을 수행하였다. 효소반응 종료 후 90~100℃에서 2시간 열처리를 통해 효소 실활하였고, 이 상태의 조성물을 본 발명에서 곡류혼합물이라 명명하였다.
상기 곡류혼합물 100g 기준, 제조예 2에서 배양된 바실러스 배양액 2.5g을 접종하고, 180rpm, 34℃, 0.5bar, 0.8vvm 조건으로 12시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 불순물을 제거하기 위해 20mesh 채망을 이용하여 여과하였다.
상기 배양액 내에는 바실러스 균주가 배양을 통해 생산해 낸 효소가 대량 생산되어 있으며, 이 상태의 배양액을 분무건조기를 사용하여 분무건조하였다. 분무건조 시 내부온도 140~180℃, 외부온도 80~90℃, 디스크 회전속도 10,000~12,000rpm에서 수행하였다. 이렇게 분무건조되어 수득된 조성물을 본 발명에서 제조예 3의 효소식품이라 명명하였다.
<실시예 1: 용암해수가 첨가된 바실러스 배양용 배지 제조 단계>
용암해수가 10~100%(v/v) 포함된 물을 배양용수로 준비하고, 상기 배양용수를 제조예 1에서 이용한 기본 배지 제조 조건에서 물 대신 사용하였다.
각 농도별 용암해수가 포함된 배양용수를 사용하여 배지를 제조예 1에서와 같이 멸균하였다. 용암해수를 이용하여 멸균된 배지를 제조 시 용암해수의 천연 미네랄이 배지 성분들의 단백질과 반응하여 염 상태로 전환된 미네랄-단백질염이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
이후 발효조 배양을 위해 제조예 1과 같이 바실러스 종배양액을 준비하였다.
<실시예 2: 바실러스의 배양 및 용암해수 천연 미네랄 발효 효소 생산>
실시예 1의 조건 중 40%(v/v) 용암해수를 이용하여 제조한 배지에 실시예 1에서 준비한 바실러스 종배양액을 접종하고, 180rpm, 34℃, 0.5bar, 0.8vvm 조건으로 72시간 동안 배양하였다.
이 후 배양종료 후 배지 내 생성된 미네랄-단백질염이 30rpm, 10℃, 0bar, 0vvm 조건으로 6시간 동안 반응하여 생성된 효소와 미네랄-단백질염 효소체가 형성될 수 있도록 하였다.
<실시예 3: 곡류발효액을 통한 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품의 생산>
곡류혼합물을 준비하여 제조예 3과 같은 방법으로 다음의 배양을 실시하였다.
실시예 2에서 배양된 배양액을 곡류혼합물 100g 기준 2.5g이 되도록 접종하고, 180rpm, 34℃, 0.5bar, 0.8vvm 조건으로 12시간 동안 배양하여 곡류발효물을 제조하였다.
배양종료 후 상기 곡류발효물을 제조예 3과 동일한 방법으로 건조하여 효소식품을 제조하였고, 이를 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품이라 명명하였다.
<실험예 1: 배양 전 배지에서의 용암해수 농도에 따른 미네랄-단백질염 양과 단백질 양 비교>
실시예 1에서 이미 설명한 바와 같이, 용암해수를 이용하여 멸균된 배지를 제조하게 되면 용암해수의 천연 미네랄이 배지 성분들의 단백질과 반응하여 염 상태로 전환되어 미네랄-단백질염이 생성된다. 이 미네랄-단백질염은 제조예 1에서 사용한 기본배지에서도 소량 생성되나 용암해수가 포함된 배지에서는 생성량이 현저하게 증가한다.
이를 측정하기 위해, 바실러스 배양 전의 멸균된 제조예 1의 기본배지, 실시예 1의 용암해수 포함 배지 자체만을 4℃에서 1시간 정치시킨 후 6,000rpm, 30분간 원심분리하여 미네랄-단백질염을 회수하고 회수물을 동결건조하였다.
다음으로, 미네랄-단백질염의 건조중량과 미네랄-단백질염 내의 단백질량을 확인하였다. 이 단백질량은 BCA protein assay로 측정하여 미네랄-단백질염에 포함되어 있는 단백질 함량을 확인하였다.
각 실험 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1의 결과에 따르면 제조예 1의 기본배지에 비해 용암해수가 농도별로 포함된 용암해수 배지 내의 미네랄-단백질염, 상기 미네랄-단백질염이 용암해수 첨가량 10~100%(v/v)와 비례하여 증가하는 것으로 나타났다. 이를 통해, 농도별 용암해수를 이용하여 멸균된 배지 제조 시 바실러스 배양 시 생성되는 효소의 미네랄-단백질염 효소체 형성 목적으로 사용 가능한 미네랄-단백질염의 생성양을 확인할 수 있다.
<실험예 2: 용암해수 농도별 바실러스 생균수 확인>
용암해수 농도에 따른 바실러스의 생균수를 검토하기 위해 제조예 2의 24시간 배양된 배양액과 실시예 2의 용암해수 농도별로 24시간 배양된 배양액을 취하여 생리식염수로 희석 후 희석액을 페트리디쉬(petridish)에 1ml 분주하고 멸균된 plate count agar (BD) 20ml을 혼합하여 굳혔다. 35℃ 정치배양기에서 24시간 배양된 콜로니를 개수하여 바실러스 생균수를 확인하였고, 이를 도 2에 나타내었다(이하, 바실러스 생균수 측정법이라 한다).
도 2의 결과에 따르면 제조예 2에서 배양된 바실러스 생균수는 7.9x108 CFU/ml 이었으며, 실시예 2의 용암해수 10~100% 농도에서 배양된 바실러스 생균수는 최소 2.6x109 CFU/ml(용암해수 농도 10%)에서 최대 4.0x109 CFU/ml(용암해수 농도 40%)로 용암해수 첨가에 의하여 균체의 생육도가 증가하여 바실러스의 배양성이 향상되는 것을 확인하였다. 특히 실시예 2의 용암해수 40% 농도에서는 최대 4.0x109 CFU/ml까지 생균수가 증가하는 최적의 조건임을 확인할 수 있었다.
<실험예 3: 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 제조 날짜별 특성 확인>
제조예 2와 실시예 2의 조건으로 바실러스를 배양하되, 날짜별 배양 조건을 확립하기 위해, 1일, 2일, 3일 배양된 각각의 배양액을 바실러스 생균수 측정법으로 생균수를 측정하였으며, 알파-아밀라아제와 프로테아제 효소활성을 측정하였다. 실시예 2에서의 배지 내 용암해수 농도는 40%(v/v)가 되게 하였다. * 이후 실시예 2의 실험 조건은 배지 내 용암해수 농도 40%(v/v)에서 배양된 것을 사용하였다.
배양액의 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성은 배양지표로써, 식품의약품안전처의 식품공전 효소식품 시험법을 사용하여 측정하였다. 이를 통해 최적의 효소생산 시간을 확인하고자 하였다. 또한, 각 효소활성은 각 날짜별의 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성을 측정하였다.
도 3의 결과에 따르면 제조예 2 대비 실시예 2 조건에서 3~4배 더 많은 생균수가 확인된다. 배양 2일차까지 생균수의 증가가 관찰되었지만, 배양 3일차에서는 오히려 생균수가 감소하는 결과가 관찰되었다. 위 결과를 바탕으로, 용암해수 사용 시 생균수가 증가하나 배양일수가 계속 증가되어도 생균수의 지속적인 증가는 이루어지지 않는 것으로 확인되었다.
그러나 생균수에 비례하지 않고, 건조된 분말 내 효소의 활성은, 도 4의 결과에 따르면, 제조예 2의 경우, 배양 3일차에서 알파-아밀라아제의 효소활성이 403,669unit/g, 프로테아제의 효소활성은 552unit/g인 것으로 나타났으며, 실시예 2의 경우 배양 3일차 알파-아밀라아제의 효소활성은 521,865unit/g, 프로테아제의 효소활성은 831unit/g로 확인되었다.
위 결과를 바탕으로 배양 3일차 조건에서 더 높은 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성을 나타내는 결과를 확인하였다.
또한, 이후 실험에서 효소의 섭취 안정성, 경시 안정성 특성을 비교하기 위해 배양 3일차 바실러스 배양액을 분무건조하여 바실러스 배양액 효소분말 및 용암해수 천연 미네랄 발효 효소분말을 획득하였고, 각각의 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성을 측정하였다.
도 5의 결과에 따르면 제조예 2를 분무건조했을 경우 알파-아밀라아제 효소활성은 4,989,735unit/g 나타났으며, 프로테아제 효소활성은 6,835unit/g 측정되었다. 실시예 2를 분무건조했을 경우 알파-아밀라아제 효소활성은 7,339,875unit/g 나타났으며, 프로테아제 효소활성은 10,252unit/g 측정되었다.
위 결과를 바탕으로 용암해수가 첨가될 경우 분말화를 위한 건조 시에도 더 높은 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성이 유지되는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 4: 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 섭취 안정성 확인 - 내산성 /내담즙산성>
제조된 효소분말의 내산성 실험을 위해 염산을 사용하여 정제수 100ml의 pH를 3.0으로 조절 후 멸균하고, 멸균된 정제수 100mL에 펩신(Sigma P7000, 250 Units/mg) 0.4g을 혼합하여 인공위액을 제조하였다.
또한, 내담즙산성 실험을 위해 멸균된 정제수 100ml에 제균된 oxgall 용액 0.3mL을 혼합하여 인공담즙액을 제조하였다.
제조한 인공위액 100mL에 제조예 2과 실시예 2()의 효소분말을 0.5g씩 각각 혼합하였다. 각 혼합액을 즉시 취하여 각각의 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성을 측정하였다.
이 후, 각 혼합액을 37℃, 2시간 정치반응하고 반응액을 취하여 각각의 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성을 측정하였다.
내산성 확인시험을 수행하고 반응액을 원심분리하여 상등액을 제거 후 침전된 효소분말을 회수하였다. 회수한 효소분말에 인공담즙액을 혼합하고 각 혼합액을 즉시 취하여 각각의 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성을 측정하였다. 이후 각 혼합액을 37℃, 2시간 정치반응하고 반응액을 취하여 각각의 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성을 측정하였다.
또한 내산성-내담즙산성 연속실험을 수행하여 결과를 표 1 및 표 2에 나타내었다.
알파-아밀라아제 효소활성
구분 안정성 실험 전
분말화 상태 (unit/g)		 내산성 실험 내담즙산성 실험
인공위액
처리 즉시(unit/g)		 인공위액
처리 2시간 후
(unit/g)		 인공담즙액
처리 즉시
(unit/g)		 인공담즙액
처리 2시간 후 (unit/g)
제조예 2 4,989,735 1,698,301 669,819 381,551 157,111
안정성 (%) 100 34 13 7 3
실시예 2 7,339,875 3,669,937 2,935,950 2,642,355 1,467,975
안정성 (%) 100 50 40 36 20
표 1의 결과에 따르면, 알파-아밀라아제 활성에 있어 실시예 2의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소분말은 제조예 2의 효소분말보다 내산성-내담즙산성에 대한 효소 안정성이 우수한 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 용암해수 배양을 통한 미네랄-단백질염 효소체 생성 시 내산성-내담즙산성에 대한 보호효과를 부여 할 수 있음을 확인할 수 있었다.
프로테아제 효소활성
구분 안정성 실험 전
분말화 상태 (unit/g)		 내산성 실험 내담즙산성
인공위액
처리 즉시(unit/g)		 인공위액
처리 2시간 후
(unit/g)		 인공담즙액
처리 즉시
(unit/g)		 인공담즙액
처리 2시간 후 (unit/g)
제조예 2 6,835 4,098 4,082 1,627 752
안정성 (%) 100 60 59 24 11
실시예 2 10,252 7,689 7,483 4,408 3,075
안정성 (%) 100 75 73 43 30
표 2의 결과에 따르면, 실시예 2의 용암해수 천연 미네랄 발효효소 분말이 제조예 2의 효소분말보다 내산성-내담즙산성에 대한 프로테아제 효소활성 안정성이 우수한 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 용암해수 배양을 통한 미네랄-단백질염 효소체 생성 시 내산성-내담즙산성에 대한 보호효과를 부여 할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<실험예 5: 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 보관 온도에 따른 경시 안정성 확인>
제조예 2의 효소분말, 실시예 2의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소분말을 밀폐보관 용기에 각각 5g씩 소분하여 4℃, 15℃, 25℃, 35℃ 항온항습기(습도 75%)에 4개월간 보관하며 1개월 단위로 효소활성 측정법에 의거하여 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성을 측정하여 표 3에 기재하였다.
제조예 2 4℃ 15℃ 25℃ 35℃
효소활성 알파-아밀라아제 프로
테아제		 알파-아밀라아제 프로
테아제		 알파-아밀라아제 프로
테아제		 알파-아밀라아제 프로
테아제
0일
(unit/g)		 4,989,735 6,835 4,989,735 6,835 4,989,735 6,835 4,989,735 6,835
30일
(unit/g)		 4,988,700 6,811 4,751,213 6,522 4,342,763 6,132 4,014,433 5,846
60일
(unit/g)		 4,769,721 6,519 4,506,151 6,277 3,745,135 5,713 3,671,787 5,041
90일
(unit/g)		 4,602,155 6,275 4,379,941 5,940 3,541,468 5,176 3,167,897 4,245
120일
(unit/g)		 4,490,760 6,151 4,241,274 5,741 3,343,122 4,674 2,744,354 3,622
안정성(%) 90 90 85 84 67 68 55 53
실시예 2 4℃ 15℃ 25℃ 35℃
효소활성 알파-아밀라아제 프로테아제 알파-아밀라아제 프로테아제 알파-아밀라아제 프로테아제 알파-아밀라아제 프로테아제
0일
(unit/g)		 7,339,875 10,252 7,339,875 10,252 7,339,875 10,252 7,339,875 10,252
30일
(unit/g)		 7,339,875 10,252 7,329,415 10,122 7,164,770 10,031 7,035,664 9,946
60일
(unit/g)		 7,310,112 10,211 7,261,254 10,009 7,003,459 9,864 6,864,159 9,453
90일
(unit/g)		 7,294,518 10,186 7,226,486 9,991 6,974,028 9,653 6,514,433 9,014
120일
(unit/g)		 7,266,476 10,149 7,193,077 9,944 6,899,482 9,473 6,312,292 8,714
안정성(%) 99 99 98 97 94 92 86 85
표 3의 결과에 따르면, 실시예 2의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소분말이 제조예 2의 효소분말보다 알파-아밀라아제와 프로테아제의 활성이 장기간 각 온도 범위에서 안정적으로 유지되어 120일 내의 경시 안정성이 높은 것으로 확인되었다. 이를 통해 미네랄-단백질염 효소체 생성을 통한 온도 조건별 변화에 대한 경시 안정성 효과가 부여되었음을 확인할 수 있다.
<실험예 6: 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품의 효소 활성 확인>
제조예 3의 효소식품 분말, 실시예 3의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말의 알파-아밀라아제, 프로테아제 활성을 측정하였다.
도 6의 결과에 따르면 제조예 3의 경우 알파-아밀라아제 활성이 383,825unit/g 로 나타났으며, 프로테아제 활성은 525unit/g 측정되었다. 실시예 3의 경우 알파-아밀라아제 활성은 564,605unit/g로 나타났으며, 프로테아제 활성은 788unit/g 측정되었다.
위 결과를 바탕으로 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말에서 더 높은 알파-아밀라아제, 프로테아제 활성 결과를 확인하였다. 이를 통해 실시예 2의 미네랄-단백질염 효소체 형성에 의한 효소활성 증가 특성이 효소식품 제조 시에도 동일하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 7: 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품의 섭취 안정성 확인 - 내산성/내담즙산성>
실험예 4의 방법으로 제조예 3의 효소식품 분말, 실시예 3의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말의 내산성-내담즙산성 연속실험을 수행하여 결과를 표 4, 5에 나타내었다.
알파-아밀라아제 효소활성
구분 안정성 실험 전
분말화 상태 (unit/g)		 내산성 실험 내담즙산성 실험
인공위액 처리 즉시(unit/g) 인공위액 처리 2시간 후
(unit/g)		 인공담즙액
처리 즉시
(unit/g)		 인공담즙액
처리 2시간 후 (unit/g)
제조예 3 383,825 122,824 46,059 26,867 11,514
안정성 (%) 100 32 12 7 3
실시예 3 564,605 271,010 237,134 197,611 118,567
안정성 (%) 100 48 42 35 21
표 4의 결과에 따르면, 알파-아밀라아제 활성에 있어 실시예 3의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말은 제조예 3의 효소식품 분말보다 내산성-내담즙산성에 대한 효소 안정성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 곡류혼합물에 용암해수 천연 미네랄 발효 효소를 배양하여 식품화한 효소식품에서도 내산성-내담즙산성 안정성 증가 특성이 동일하게 유지됨을 알 수 있다.
프로테아제 효소활성
구분 안정성 실험 전
분말화 상태 (unit/g)		 내산성 실험 내담즙산성 실험
인공위액 처리 즉시(unit/g) 인공위액 처리 2시간 후
(unit/g)		 인공담즙액
처리 즉시
(unit/g)		 인공담즙액
처리 2시간 후 (unit/g)
제조예 3 525 325 320 141 78
안정성 (%) 100 62 61 27 15
실시예 3 788 630 614 394 291
안정성 (%) 100 80 78 50 37
표 5의 결과에 따르면, 프로테아제 활성에 있어 실시예 3의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말은 제조예 3의 효소식품 분말보다 내산성-내담즙산성에 대한 효소 안정성이 우수한 것을 확인할 수 있다.
이를 통해 용암해수 천연 미네랄 발효 효소에 곡류혼합물을 첨가하여 식품화한 효소 식품에서도 내산성-내담즙산성 안정성 증가 특성이 동일하게 유지됨을 알 수 있다.
<실험예 8: 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품의 온도에 따른 경시 안정성 비교>
제조예 3의 효소식품 분말, 실시예 3의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말을 밀폐보관 용기에 각각 5g씩 소분하여 4℃, 15℃, 25℃, 35℃ 항온항습기(습도 75%)에 4개월간 보관하며 1개월 단위로 효소활성 측정법에 의거하여 알파-아밀라아제, 프로테아제 활성을 측정하여 표 6에 기재하였다.
제조예 3 4℃ 15℃ 25℃ 35℃
효소활성 알파-아밀라아제 프로테아제 알파-아밀라아제 프로테아제 알파-아밀라아제 프로테아제 알파-아밀라아제 프로테아제
0일
(unit/g)		 383,825 525 383,825 525 383,825 525 383,825 525
30일
(unit/g)		 380,153 502 374,545 495 334,879 462 320,477 443
60일
(unit/g)		 361,251 481 354,754 470 294,465 419 273,015 391
90일
(unit/g)		 342,566 460 334,531 452 257,777 379 236,481 322
120일
(unit/g)		 333,927 446 314,736 430 237,971 330 191,912 267
안정성(%) 87 85 82 82 62 63 50 51
실시예 3 4℃ 15℃ 25℃ 35℃
효소활성 알파-아밀라아제 프로테아제 알파-아밀라아제 프로테아제 알파-아밀라아제 프로테아제 알파-아밀라아제 프로테아제
0일
(unit/g)		 564,605 788 564,605 788 564,605 788 564,605 788
30일
(unit/g)		 559,874 780 560,431 780 554,197 761 537,876 733
60일
(unit/g)		 547,380 768 540,349 761 531,675 744 516,788 709
90일
(unit/g)		 541,780 755 534,974 749 517,891 733 497,354 681
120일
(unit/g)		 536,374 748 530,728 740 508,144 693 474,268 630
안정성(%) 95 95 94 94 90 88 84 80
표 6의 결과에 따르면, 실시예 3의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말이 제조예 3의 효소식품 분말보다 120일 내의 경시 안정성이 높은 것으로 확인된다. 이를 통해 실시예 2의 용암해수 천연 미네랄 발효 효소의 경시 안정성 증가 특성이 실시예 3의 효소식품 제조 시에도 동일하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 9: 바실러스 균주별 효소생산 특성>
바실러스 균주에 따른 차이를 비교하기 위해 종배양액에 사용했던 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8051 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8051, 기탁번호 KCCM12944P) 외에도 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8052 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8052, 기탁번호 KCCM12945P)로 제조한 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품 분말의 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성을 측정하였다.
도 7의 결과에 따르면, 두 균주의 알파-아밀라아제, 프로테아제 효소활성은 큰 차이를 보이지 않았으며 비슷한 효소활성 결과값을 나타내었다. 위 결과를 바탕으로 두 균주 모두 효소식품 제조에 유용하게 활용될 수 있음을 확인할 수 있다.
한편, 이 신규 균주들 외 시판되는 종균용 다른 일반 바실러스 균주를 구입하여 효소식품을 제조하였으나 실시예 3보다는 제조예 3에 준하는 효소 활성 값이 나타났다. 이에 용암해수를 배양용수로 이용하는 과정에 가장 최적인 바실러스 균주는 본 발명에서 사용한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8051 균주와 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8052 균주인 것이 입증되었다.
이상과 같이, 본 발명에 대해 상기 제조예, 실시예 및 실험예를 참조하고 설명하였으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명에 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허 청구 범위의 기술적 사항에 의해 정해져야 할 것이다.
[수탁기관]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM12944P
수탁일자 : 20210129
기탁기관명 : 한국미생물보존센터
수탁번호 : KCCM12945P
수탁일자 : 20210129
<110> HYUNDAI BIOLAND Co.,Ltd. <120> Method of preparing lava seawater natural mineral coating enzyme and enzyme food thereby <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1468 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct 60 gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac 120 tccgggaaac cggggctaat accggatgct tgtttgaacc gcatggttca gacataaaag 180 gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac 240 ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 300 agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 360 tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta 420 gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca 480 cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta 540 ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac 600 cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg 660 tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt 720 ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 780 tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc 840 taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg 900 acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960 accaggtctt gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt 1020 gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080 cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg 1140 gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200 tacacacgtg ctacaatggg cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc 1260 cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg 1320 ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380 cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt tggagccagc 1440 cgccgaaggt gggacagatg attggggt 1468 <210> 2 <211> 1473 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bacillus amyloliquefaciens <400> 2 ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct 60 ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga 120 taactccggg aaaccggggc taataccgga tgcttgtttg aaccgcatgg ttcagacata 180 aaaggtggct tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg 240 taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg 300 actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg 360 aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt 420 gttagggaag aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa 480 gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga 540 attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct 600 caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc 660 cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc 720 tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg 780 gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg 840 cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga 900 attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa 960 ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca 1020 gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1080 gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact 1140 gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct 1200 gggctacaca cgtgctacaa tgggcagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca 1260 atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga 1320 atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1380 cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc tttttggagc 1440 cagccgccga aggtgggaca gatgattggg gtg 1473

Claims (10)

  1. (제1단계) 용암해수가 10~100%(v/v) 포함된 물을 배양용수로 이용하여 카제인, 유당 및 탈지대두분이 포함되도록 용해하고 멸균하여 미네랄-단백질염이 형성된 바실러스 배양용 배지를 준비하는 단계;
    (제2단계) 상기 바실러스 배양용 배지에 바실러스를 접종하고 배양하여 바실러스 배양액을 얻는 단계;
    (제3단계) 곡류혼합분을 전처리하여 곡류혼합물을 얻는 단계;
    (제4단계) 상기 곡류혼합물에 제2단계의 바실러스 배양액을 접종하고 발효하여 곡류발효액을 얻는 단계; 및,
    (제5단계) 상기 곡류발효액을 건조하여 효소식품을 얻는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제3단계의 곡류혼합물을 제조하기 위한 전처리 방법은 알파-아밀레아제 첨가 후 80~90℃에서 2~4시간, 프로테아제를 첨가하고 50~55℃에서 2~4시간 효소반응하고, 90~100℃에서 2~4시간 효소실활을 하여 수행되는 것을 특징으로 하는 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제5단계의 건조는 분무건조 또는 동결건조 방식을 선택하여 건조하는 것을 특징으로 하는 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품의 제조방법.
  8. 제1항의 방법으로 제조한 것을 특징으로 하는 용암해수 천연 미네랄 발효 효소식품.
  9. 알파-아밀라아제(α-amylase) 또는 프로테아제(protease) 생성능이 우수한 효소 식품 제조용 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8051 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8051, 기탁번호 KCCM12944P).
  10. 알파-아밀라아제(α-amylase) 또는 프로테아제(protease) 생성능이 우수한 효소 식품 제조용 바실러스 아밀로리퀴페시언스 HDB8052 균주(Bacillus amyloliquefaciens HDB8052, 기탁번호 KCCM12945P).
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