CN111374304A - 利用枯草芽孢杆菌的食用酶食品的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有高浓度的α淀粉酶(α‑amylase)的食用酶食品的制备方法，尤其，涉及一种具有高浓度酶的食用酶食品的制备方法，即，通过第一次接种，将耐热性高的枯草芽孢杆菌接种于大豆来生成高浓度的α淀粉酶，通过第二次接种，利用乳酸菌及热进行杀菌，从而使得最终产物具有微生物学稳定性(细菌总数少于103cfu/g)。

Description

利用枯草芽孢杆菌的食用酶食品的制备方法
技术领域
本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌来制备具有高浓度的酶，尤其具有高浓度的α淀粉酶(α-amylase)的食用酶食品的方法，尤其涉及一种具有高浓度酶的食用酶食品的制备方法，即，通过第一次接种，将耐热性高的枯草芽孢杆菌接种于大豆来生成高浓度的α淀粉酶，通过第二次接种，利用乳酸菌及热来杀菌，从而使得最终产物具有微生物学稳定性(细菌总数少于103cfu/g)。
背景技术
α淀粉酶是指对从人体分泌的葡萄糖苷进行水解的酶。葡萄糖苷是将葡萄糖作为糖部分的配糖物的总称，在大多数情况下，人类通过摄取葡萄糖苷形态的碳水化合物来消化为能量。
更具体而言，α淀粉酶通过使多糖中的α-1，4-糖苷键水解而生成葡萄糖，α淀粉酶除了人的唾液、胰腺之外，还广泛分布于动物、植物、微生物系统中。
这种α淀粉酶是在人体的消化吸收中发挥重要作用的酶之一，然而，当年龄增加或者身体平衡降低时，分泌量变低，因而消化吸收率下降，即使摄取饮食或具有生理活性的物质，它也不会被吸收，因此效果低于摄入量。
在这种情况下，为了提高消化吸收率，经常使用摄取发酵食品或者摄取含有有益微生物的益生菌(Probiotics)制品(以健康功能食品为基准，为108cfu/g至1010cfu/g)或酶食品的方法来改善现状，但也存在一些问题。
在益生菌的情况下，摄取时可通过有益菌分泌的α淀粉酶和其他消化酶来改善消化吸收率，但是，其作为一种利用高浓度(108cfu/g至1010cfu/g)的活菌的方法，当在如移植手术患者、先天性/后天性免疫缺陷综合征患者、接受抗癌治疗的患者等免疫缺陷被诱导的状态下，或者如婴儿等免疫系统不完全的状态或者因极度疲劳而免疫功能低下的状态下摄取时，存在可能会导致菌血症(Bacteremia)的风险。
事实上，韩国食品药品监督管理局(KFDA)报告了2012年至2017年韩国国内益生菌副作用事例累计件数668件，每年发生100多件副作用事例。
稳定摄取α淀粉酶的其他方法包括摄取发酵食品，但在大多数发酵食品的情况下，由于进行低温熟化且熟化时间长，因此，由于温度低，微生物的活性受到抑制，α-淀粉酶的分泌量不多，大部分情况下随着熟化时间的流逝，逐渐失去酶的能力。
在酶食品的情况下，在韩国食品法典规定的内容中，公开了“通过在植物原料中培养食用微生物而大量含有酶，或者从食品中提取含酶部分或将其作为主要原料进行加工”，除了不检测到大肠杆菌(Escherichia coli.)的条件之外，没有其他微生物学标准。
通常，在酶食品的情况下，为了降低生产成本，通过将生产高浓度的α淀粉酶及蛋白酶(Protease)的诸如曲霉属(Aspergillus sp.)等的曲菌接种于谷物并进行发酵的方法来制备，这也包含高浓度(108cfu/g至1010cfu/g)的活菌。
如曲霉属的曲菌可生产高浓度的α淀粉酶及蛋白酶，但其为真菌，因此不易调亡。
问题在于，由于如益生菌副作用事例那样使用活菌，因此，当在如前所述的诸如移植手术患者、先天性/后天性免疫缺陷综合征患者、接受抗癌治疗的患者等免疫缺陷被诱导的状态下，或者如婴儿等免疫系统不健全的状态或者因极度疲劳而免疫功能低下的状态下摄取时，可能会导致菌血症，并且如曲霉属的曲霉为真菌，因而相比由常规的益生菌导致的菌血症，可能会导致更严重水平的菌血症。
在韩国授权专利第10-1866468号(发明名称：利用通过培养微生物谷物获取的酶浓缩发酵物的酶食品、减肥食品及其制备方法)的情况下，使用川崎曲霉(Aspergilluskawachi)及米曲霉菌(Aspergillus oryzae)来制备发酵物之后，通过过滤膜过滤来解决相应问题，但是，在此情况下，具有如下问题，即，需过滤酶浓缩液，因而，随之需要高费用及设施，并且，在过滤之后用作培养基的大豆成为废弃物等。
发明内容
本发明提供一种具有高浓度酶的食用酶食品的制备方法，即，通过第一次接种，将耐热性高的枯草芽孢杆菌接种于大豆来生成高浓度的α淀粉酶，通过第二次接种，利用乳酸菌及热来杀菌，从而使得最终产物具有微生物学稳定性(细菌总数少于103cfu/g)。
本发明的利用枯草芽孢杆菌的食用酶食品的制备方法包括：(1)准备步骤，准备作为发酵对象的发酵原料；(2)第一次发酵步骤，以发酵原料总重量为基准在准备的发酵原料添加中3倍至10倍量的水，并以1×107cfu/ml至1×109cfu/ml第一次接种枯草芽孢杆菌，在35℃至45℃的温度下，发酵24小时至168小时来获得第一次发酵产物；(3)第二次发酵步骤，在第一次发酵产物中，以1×107cfu/ml至1×109cfu/ml第二次接种乳酸菌，并在35℃至45℃的温度下，发酵24小时至168小时来获得第二次发酵产物；以及(4)低温杀菌步骤，在50℃至70℃的温度下，对第二次发酵产物进行20分钟至40分钟的低温杀菌。
发酵原料可以为选自由大豆粉末、大豆粉碎物、脱脂大豆粉末、脱脂大豆粉碎物或它们的两种以上的混合物构成的组中的发酵原料。
发酵原料还可包含MgSO4、葡萄糖及K2HPO4。
枯草芽孢杆菌可选自由枯草芽孢杆菌LS(Bacillus subtilis LS)(KFCC11483P)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC 19659)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(KCCM 12513)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(KCCM12149)以及它们的两种以上的组合构成的组。
乳酸菌可选自由植物乳杆菌LS-65(Lactobacillus plantarum LS-65)(KCCM80199)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophillus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、乳酸明串珠菌(Leuconostoc lactis)、嗜柠檬酸明串珠菌(Leuconostoc citreum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)以及它们的两种以上的组合构成的组。
在第一次发酵步骤之前，还可包括对发酵原料进行灭菌的灭菌步骤。
在低温杀菌步骤之后，还可包括对第二次发酵产物进行热风干燥后加工成粉末形态的后处理步骤。
热风干燥可通过40℃至60℃温度的热风进行38小时至58小时的干燥。
根据本发明，具有提供一种具有高浓度酶的食用酶食品的制备方法的效果，通过第一次接种，将耐热性高的枯草芽孢杆菌接种于大豆来生成高浓度的α淀粉酶，通过第二次接种，利用乳酸菌(Lactobacillus plantarum LS-65)及热进行杀菌，从而使得最终产物具有微生物学稳定性(细菌总数少于103cfu/g)。
并且，根据本发明，具有提供一种利用微生物之间的相互作用及低温杀菌来提供不损失α淀粉酶的同时微生物性安全(细菌总数少于103cfu/g)的酶食品的效果。
附图说明
图1为示出不同工序步骤的发酵产物的pH的图表。
图2为示出不同工序步骤的发酵产物的α淀粉酶酶活性的图表。
具体实施方式
以下，参考附图详细说明本发明的具体实施例。
本发明的利用枯草芽孢杆菌的食用酶食品的制备方法的特征在于，包括：(1)准备步骤，准备作为发酵对象的发酵原料；(2)第一次发酵步骤，以发酵原料总重量为基准在准备的发酵原料中添加3倍至10倍量的水，并以1×107cfu/g至1×109cfu/g第一次接种枯草芽孢杆菌，在35℃至45℃的温度下，发酵24小时至168小时来获得第一次发酵产物；(3)第二次发酵步骤，在第一次发酵产物中，以1×107cfu/ml至1×109cfu/ml第二次接种乳酸菌，并在35℃至45℃的温度下，发酵24小时至168小时来获得第二次发酵产物；以及(4)低温杀菌步骤，在50℃至70℃的温度下，对第二次发酵产物进行20分钟至40分钟的低温杀菌。根据本发明的方法获得的酶食品的特征在于，确保微生物学安全性(细菌总数少于103cfu/g)，包含高浓度的α淀粉酶。
(1)的发酵原料准备步骤为准备作为发酵对象的发酵原料的步骤，发酵原料可以为选自由大豆粉末、大豆粉碎物、脱脂大豆粉末、脱脂大豆粉碎物或它们的两种以上的混合物构成的组中的发酵原料。
上述发酵原料还可包含促进枯草芽孢杆菌分裂的MgSO4、发挥食物功能来促进原料发酵的葡萄糖，以及提高枯草芽孢杆菌的代谢活性来促进酶分泌的K2HPO4。
例如，发酵原料可包含10重量百分比至30重量百分比的葡萄糖、0重量百分比至10重量百分比的MgSO4、0重量百分比至10重量百分比的K2HPO4以及余量的作为发酵原料的大豆。
(2)的第一次发酵步骤以如下方式进行，即，以发酵原料总重量为基准在准备的发酵原料中添加3倍至10倍量的水，并以1×107cfu/g至1×109cfu/g第一次接种枯草芽孢杆菌，在35℃至45℃的温度下，发酵24小时至168小时来获得第一次发酵产物。第一次发酵步骤利用枯草芽孢杆菌酶，使作为发酵原料的大豆发酵获得酶、特别α淀粉酶含量高的第一次发酵产物，其中，枯草芽孢杆菌已知具有优异的耐热性，难以进行灭菌处理，但是酶，特别是α淀粉酶的产生能力优秀。
此时所使用的枯草芽孢杆菌可选自由枯草芽孢杆菌LS(Bacillussubtilis LS)(KFCC11483P)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC19659)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(KCCM 12513)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(KCCM 12149)以及它们的两种以上的组合构成的组。优选地，枯草芽孢杆菌可以为枯草芽孢杆菌LS(BacillussubtilisLS)(KFCC11483P)。
在第一次发酵步骤之前，还可包括对发酵原料进行灭菌的灭菌步骤。优选地，此时所使用的灭菌可以是高压灭菌，例如，高压灭菌可在120℃至130℃下，借助于30分钟至2小时的热处理来进行。在这种灭菌步骤中，由于发酵原料还未进行第一次发酵和/或第二次发酵，因此，在发酵产物中不包含大量的酶等，因而不会发生酶损失甚至失活，因此可以实施。
(3)的第二次发酵步骤以如下方式进行，即，在第一次发酵产物中，以1×107cfu/g至1×109cfu/g第二次接种乳酸菌，并在35℃至45℃的温度下，发酵24小时至168小时来获得第二次发酵产物，借助于使用该乳酸菌的第二次发酵步骤来增加发酵产物的pH，借助于pH的增加杀死在第一次发酵步骤中所使用的耐酸性极低的枯草芽孢杆菌。
此时所使用的乳酸菌作为植物性乳酸菌，植物性乳酸菌强力生产乳酸，对枯草芽孢杆菌具有杀菌能力，通常，由于芽孢杆菌属(Bacillussp.)在热杀菌时生成内生孢子(Endo-spore)，在热杀菌时也在相对高的温度下生存，因此，在本发明中，作为对此的完善方法，可投入强力生成乳酸的乳酸菌培养液，使pH降低为3.5至4.0之间，借助于乳酸菌进行第二次发酵，以便形成芽孢杆菌属能够凋亡的环境，特别优选地，可选自由植物乳杆菌LS-65(Lactobacillus plantarum LS-65)(KCCM 80199)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophillus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、乳酸明串珠菌(Leuconostoc lactis)、嗜柠檬酸明串珠菌(Leuconostoc citreum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)以及它们的两种以上的混合物构成的组。
(4)的低温杀菌步骤是将第二次发酵产物在50℃至70℃的温度下，低温杀菌20分钟至40分钟，通过低温杀菌，使由枯草芽孢杆菌生产而在发酵产物中以高浓度包含的酶的损失、特别是热处理导致的α淀粉酶的损失实现最小化，可以获得α淀粉酶含量高的发酵食品。
在低温杀菌步骤之后，还可包括对第二次发酵产物进行热风干燥后加工成粉末形态的后处理步骤。通过后处理步骤，可便利地流通及使用酶食品。
此时，热风干燥可借助于利用40℃至60℃温度的热风进行38小时至58小时的干燥而执行。
并且，在第一次发酵中所使用的枯草芽孢杆菌或在第二次发酵中所使用的乳酸菌，可在培养种菌，浓缩及冷冻干燥液体枯草芽孢杆菌或乳酸菌并添加赋形剂后，制备成高浓度的微生物粉末来使用。
以下，将对本发明的优选实施例及多个比较例进行记述。
以下多个实施例仅用于例证本发明，不得理解为限制本发明的范围。
制备例1：枯草芽孢杆菌的培养
枯草芽孢杆菌的培养基通常使用营养培养基(Nutrient broth)，在121℃的常规微生物培养基的杀菌条件下进行15分钟以上的加热灭菌，枯草芽孢杆菌的接种量为1×105cfu/ml至1×106cfu/ml，在35℃至40℃下培养12小时至18小时，培养后的枯草芽孢杆菌的活菌数表现为1×109cfu/ml至1×1010cfu/ml范围，且借助于离心分离而浓缩的杆菌的活菌数表现为1×1011cfu/ml至7×1012cfu/ml。当对其进行冷冻干燥而使用粉末状的枯草芽孢杆菌时，通常添加粉末组合物中所使用的水量的1％(v/w)至10％(v/w)，此时添加的枯草芽孢杆菌的活菌数为1×107cfu/g至1×109cfu/g。
制备例2：乳酸菌的培养
乳酸菌的培养基通常使用MRS培养基，在121℃的常规微生物培养基的杀菌条件下进行15分钟以上的加热灭菌，乳酸菌的接种量为1×105cfu/ml至1×106cfu/ml，在40℃至45℃下培养12小时至18小时，培养后的乳酸菌的活菌数表现为1×109cfu/ml至1×1010cfu/ml的范围，且借助于离心分离而浓缩的乳酸菌的活菌数表现为1×1011cfu/ml至5×1012cfu/ml。当对其进行冷冻干燥而使用粉末状的乳酸菌时，通常添加粉末组合物中所使用的水量的1％(v/w)至10％(v/w)，此时添加的植物性乳酸菌的活菌数为1×107cfu/g至1×109cfu/g。
制备例3：发酵原料的制备
发酵原料作为大豆组合物，可使用大豆、脱脂大豆粉、大豆粉、大豆粉碎物或它们的混合物，其混合比没有限制。用作发酵原料(80重量百分比至90重量百分比)、MgSO4(0重量百分比至10重量百分比)、葡萄糖(10重量百分比至30重量百分比)、K2HPO4(0重量百分比至10重量百分比)，根据发酵所使用的菌株，可以不使用MgSO4及K2HPO4，发酵原料使用不足8％的含水量。使用脱脂大豆、大豆粉时，使用小于50目的尺寸。在准备的发酵原料中添加3倍至10倍的蒸馏水或纯化水，使NK蒸煮器旋转而悬浮组合物后，在121℃下灭菌1小时。
实验例1：第一次接种及发酵
将完成灭菌的发酵原料冷却至35℃至45℃，使得枯草芽孢杆菌粉末或种菌培养液稀释液达到1×107cfu/ml至1×109cfu/ml，接种加水量的1％(v/w)至10％(v/w)。优选地，发酵温度为40℃，发酵时间为72小时最佳。
实验例2：第二次接种及发酵
在第一次发酵完成后获得的第一次发酵产物中，使得乳酸菌粉末或种菌培养液稀释液达到1×107cfu/ml至1×109cfu/ml，接种加水量的1％(v/w)至10％(v/w)。优选地，发酵温度为40℃，发酵时间为48小时最佳。
实验例3：低温杀菌及加工
在第二次发酵及杀菌完成后，将获得的第二次发酵产物中，在60℃下进行30分钟的低温杀菌并冷却至30℃以下的温度后，利用减压热风干燥器或常压热风干燥器在50℃至60℃下进行48小时的干燥。利用针磨机(pin mill)将完成干燥的第二次发酵产物粉碎至50目以下的尺寸来而使用。
本发明包括根据上述提及的方法制备的含有高浓度α淀粉酶的酶食品的制备方法。
实施例1
1.枯草芽孢杆菌的培养
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis LS)(KFCC11483P)以1×105cfu/ml至1×106cfu/ml接种于在121℃下经过15分钟以上灭菌的营养培养基，并在36℃下进行15小时的振荡培养(100rpm)。利用离心分离对培养结束后的枯草芽孢杆菌进行浓缩并冷冻干燥后，添加葡萄糖、乳糖等糖类，根据常规方法制备了高浓度的枯草芽孢杆菌粉末，此时，枯草芽孢杆菌的个体数为1.1×1011cfu/g。
2.乳酸菌的培养
将作为乳酸菌的植物乳杆菌65(Lactobacillus plantarum LS-65)(KCCM 80199)以1×105cfu/ml至1×106cfu/ml接种于在121℃下经过15分钟以上灭菌的MRS培养基，并在40℃下进行16小时的振荡培养(100rpm)。利用离心分离对培养结束后的乳酸菌进行浓缩并冷冻干燥后，添加葡萄糖、乳糖等的糖类，根据常规方法制备了高浓度的乳酸菌粉末，此时，乳酸菌的个体数为1.0×1011cfu/g至1.2×1011cfu/g。
3.发酵原料的制备
使用含水量为7％的利用针磨机粉碎至50目以下尺寸的大豆粉末来制备由80重量百分比的大豆粉末、20重量百分比的葡萄糖组成的粉末组合物，并添加10倍的蒸馏水。使NK蒸煮器旋转而混合后，在121℃下灭菌60分钟。
4.第一次接种及发酵
将完成灭菌的培养液冷却至38℃并接种以1.0×108cfu/g稀释的1重量百分比的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis LS)(KFCC11483P)后，在38℃下进行了72小时培养。
5.第二次接种及发酵
在第一次发酵后获得的第一次发酵产物中接种以1.0×1010cfu/g稀释的1重量百分比的乳酸菌植物乳杆菌LS-65(Lactobacillus plantarum LS-65)(KCCM 80199)后，在38℃下进行了48小时培养。
6.低温杀菌及加工
将第二次发酵完成后获得的第二次发酵产物在60℃下进行30分钟的杀菌后，冷却至30℃以下。将冷却的第二次发酵产物放入热风干燥器，在50℃下进行48小时的干燥，直到水份达到少于5％为止，利用针磨机将完成干燥的生成物质块粉碎至50目以下的尺寸，获得了含有高浓度的α淀粉酶的酶食品粉末。
试验例：发酵及分析条件
按照在上述实施例中实施的条件来制备高浓度的α淀粉酶酶食品，每24小时取样测量了枯草芽孢杆菌数、乳酸菌数、pH及α淀粉酶酶活性，而且，对含有最终获得的高浓度α淀粉酶的酶食品粉末，测量了水份含量、α淀粉酶酶活性等。测量方法基于食品法典进行了测量。
方法
1)发酵试料取样
第一次接种之前，通过蒸汽(steam)喷嘴将进行24小时、48小时、72小时发酵中的发酵原料样品分别按每次30ml取样到50ml锥形管(Cornical-tube)中。
2)枯草芽孢杆菌数的测量
利用营养琼脂(Nutriunt Agar)培养基测量了枯草芽孢杆菌数，并且，在加入90ml的生理食盐水(0.85％的NaCl)进行灭菌的四角瓶中加入取样试料10ml，并在混合的溶液中再次取样1ml，放入装有9ml生理食盐水的灭菌试验管中进行稀释，以这种方式，分别稀释为106、107、108，在37℃的培养基中翻转1天至2天进行平板培养后测量了菌数。
3)乳酸菌数测量
乳酸菌数测量是利用BCP添加平板测量用琼脂培养基进行测量，在加入90ml的生理食盐水(0.85％的NaCl)进行灭菌的四角瓶中加入取样的试料10ml，并在混合的溶液中再次取样1ml，放入装有9ml生理食盐水的灭菌试验管进行稀释，以这种方式，分别稀释为106、107、108，在37℃的培养基中翻转1天至2天进行平板培养后测量了菌数。
4)细菌总数测量
细菌总数测量仅对低温杀菌工序及干燥后的粉末进行了测量。测量时利用常规琼脂培养基进行了测量，并且在加入90ml的生理食盐水(0.85％的NaCl)进行灭菌的四角瓶中加入取样的试料10ml，并在混合的溶液中再次取样1ml，放入装有9ml生理食盐水的灭菌试验管进行稀释，以这种方式，分别稀释为101、102、103，在37℃的培养基中翻转1天至2天进行平板培养后测量了菌数。
5)α淀粉酶酶活性的测量
α淀粉酶的活性测量是根据食品法典的对酶食品的试验法而实施。在试验用试管中加入1％可溶性淀粉溶液5ml、Mcllvaine缓冲液(pH7.0)13ml和0.1％NaCl溶液1ml，加热至37℃并加入试料1ml后，在37℃下反应20分钟。反应后，在100℃下加热10分钟使试料灭活，然后，冷却至室温，并在10000rpm下离心分离10分钟，测量了上清液中的还原糖量。另外，将在100℃下加热10分钟而失活的试料1ml如上所述进行操作，作为空白试验。在0.4ml的试料反应液中加入DNS溶液1.2ml，然后，在100℃下加热5分钟并冷却至常温后，在540nm下测量了吸光度。使用D-葡萄糖作为标准物质制作了校准曲线，利用校准曲线，通过含有粒曲1g的滴加，将酶1分钟反应生成的D-葡萄糖的量换算为D-葡萄糖的μg数来计算α淀粉酶的活性(单位/g)。
6)pH的测量
利用ph计测量在乳酸菌数测量中使用后剩下的四角瓶中的混合液并示出pH值。
7)第二次发酵产物的干燥
将在第一次接种后72小时发酵、在第二次接种后48小时发酵完成的第二次发酵产物，在60℃下杀菌30分钟后，冷却至30℃并回收，放入减压热风干燥器，在50℃下干燥48小时，直到水份达到不足5％时为止，利用针磨机将完成干燥的发酵产物粉碎至50目以下的尺寸，获得了含有高浓度的α淀粉酶的酶食品粉末。
试验结果
将培养时间、各工序的pH及乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌数的变化结果显示于下表1中。
表1
Figure BDA0002178542500000111
第一次接种时，确认了pH随着枯草芽孢杆菌的数的增加而增加，在第二次接种后，由于乳酸菌的作用，pH下降，同时芽孢杆菌的活菌数减少。
低温杀菌之后，细菌总数为101，微生物几乎全部被杀死，干燥后，增加至102，这被认为是因为随着水份的挥发，培养物的浓度增加。
将发酵时间及各工序的α淀粉酶浓度显示于下表2中。
表2
Figure BDA0002178542500000121
确认了随着枯草芽孢杆菌的培养时间变长，α淀粉酶的分泌量增加，在接种乳酸菌的第二次接种后也以缓慢的速度增加，但是，低温杀菌后重新减少。在第二次接种后增加的α淀粉酶被认为是乳酸菌的分泌物。
干燥后，α淀粉酶的数量显著增加，这被认为是因为没有热的损失，只有水份挥发，发酵产物被浓缩。
实施例2
使用作为在实施例1的大酱中分离的枯草芽孢杆菌的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis LS)(KFCC11483P)之外3种枯草芽孢杆菌，即，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(ATCC 19659)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(KCCM 12513)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(KCCM 12149)，比较了α淀粉酶活性。
将营养培养基1L在作为常规微生物培养基灭菌条件的121℃下进行15分钟的加热而灭菌，并冷却至37℃后，分别接种1重量百分比的上述4个菌株稀释液(1.×106cfu/ml)，在37℃下培养了18小时。
利用离心分离器将完成培养的培养液在10000rpm下离心分离30分钟，仅取样α淀粉酶融化的上清液，并利用超滤法(Ultrafiltration；Amicon ultracel MembraneMWCO5kDa)浓缩上清液，通过冷冻干燥来除去水份，制备成了冷冻干燥物，再次加入相当于冷冻干燥物重量10倍的蒸馏水而制备了酶试液。
实验例4：各菌株的α淀粉酶活性的测量
按照各菌株准备两组10倍稀释酶试液各5ml，一组酶试液作为对照组，不进行任何处理，另一组酶试液在60℃下热处理1小时，确认了酶对耐热性的失活程度。
酶的淀粉分解能力根据食品法典进行。首先，在试验用试管中加入1％可溶性淀粉溶液5ml、Mcllvaine缓冲液(pH 7.0)13ml和0.1％NaCl溶液1ml，加热至37℃并加入试料1ml后，在37℃下反应了20分钟。反应后，在100℃下加热10分钟,将试料灭活，然后冷却至室温，并在10000rpm下离心分离10分钟，测量了上清液中的还原糖的量，另外，通过将在100℃下加热10分钟后失活的试料1ml如上所述进行操作，作为空白试验。在试料反应液0.4ml中加入DNS溶液1.2ml，然后，在100℃下加热5分钟并冷却至常温后，在540nm下测量了吸光度。使用D-葡萄糖作为标准物质，制作了校准曲线，利用校准曲线，通过含有粒曲1g的滴加，将酶1分钟反应生成的D-葡萄糖的量换算为D-葡萄糖的μg数来计算α淀粉酶的活性(单位/g)。各菌株的α淀粉酶冷冻干燥物以及对其的热处理的试验结果显示于下表3中。
表3
Figure BDA0002178542500000131
Figure BDA0002178542500000141
如上述试验结果所示，各菌株培养后，进行离心分离并对上清液中存在的酶进行浓缩及冷冻干燥的酶粉末试验的结果，在枯草芽孢杆菌LS(KFCC 11483P)的酶粉末中确认了最高的α淀粉酶酶活性，并且，确认了即使在加热处理时枯草芽孢杆菌LS(KFCC 11483P)的酶也没有失活。
以上仅是对本发明所记载的具体例进行了详细说明，但只要是本发明所属技术领域的普通技术人员便明白，在本发明的技术思想范围内，可进行多种变形及修改，这种变形及修改包含于所附的权利要求范围，这是不言而喻的。

Claims (8)

1.一种利用枯草芽孢杆菌制备酶食品的方法，其特征在于，包括：
(1)准备步骤，准备作为发酵对象的发酵原料；
(2)第一次发酵步骤，以发酵原料总重量为基准在准备的发酵原料中添加3倍至10倍量的水，并以1×107cfu/g至1×109cfu/g第一次接种枯草芽孢杆菌，在35℃至45℃的温度下，发酵24小时至168小时来获得第一次发酵产物；
(3)第二次发酵步骤，在第一次发酵产物中，以1×107cfu/ml至1×109cfu/ml第二次接种乳酸菌，并在35℃至45℃的温度下，发酵24小时至168小时来获得第二次发酵产物；以及
(4)低温杀菌步骤，在50℃至70℃的温度下，对第二次发酵产物进行20分钟至40分钟的低温杀菌。
2.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌制备酶食品的方法，其特征在于，发酵原料为选自由大豆粉末、大豆粉碎物、脱脂大豆粉末、脱脂大豆粉碎物或它们的两种以上的混合物构成的组中的发酵原料。
3.根据权利要求2所述的利用枯草芽孢杆菌的食用酶食品的制备方法，其特征在于，发酵原料还包含MgSO4、葡萄糖及K2HPO4。
4.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌制备酶食品的方法，其特征在于，枯草芽孢杆菌选自由枯草芽孢杆菌LS(KFCC11483P)、枯草芽孢杆菌(ATCC 19659)、枯草芽孢杆菌(KCCM 12513)、枯草芽孢杆菌(KCCM 12149)以及它们的两种以上的组合构成的组。
5.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌制备酶食品的方法，其特征在于，乳酸菌选自由植物乳杆菌LS-65(KCCM 80199)、清酒乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、肠膜明串珠菌、戊糖片球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、乳酸明串珠菌、嗜柠檬酸明串珠菌、鼠李糖乳杆菌以及它们的两种以上的混合物构成的组。
6.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌制备酶食品的方法，其特征在于，在第一次发酵步骤之前，还包括对发酵原料进行灭菌的灭菌步骤。
7.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌的食用酶食品的制备方法，其特征在于，在低温杀菌步骤之后，还包括对第二次发酵产物进行热风干燥后加工成粉末形态的后处理步骤。
8.根据权利要求7所述的利用枯草芽孢杆菌的食用酶食品的制备方法，其特征在于，热风干燥利用40℃至60℃温度的热风进行38小时至58小时的干燥。
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