KR102053735B1 - 흑삼 유산균 발효 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흑삼 유산균 발효 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 흑삼을 프로바이오틱스 활성 및 효소활성이 확보된 유산균으로 발효시켜 흑삼 유산균 발효 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 흑삼을 분말화하는 단계; 정제수에 흑삼 분말을 첨가하여 흑삼분말액을 제조하는 단계; 상기 흑삼분말액을 멸균하는 단계; 상기 멸균된 흑삼분말액을 냉각시키는 단계 및 상기 냉각된 흑삼분말액에 유산균인 기탁번호 KFCC11812P인 Lactobacillus plantarum SRCM 102370을 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 흑삼 유산균 발효 조성물 제조방법을 제공할 수 있다.
이에, 흑삼을 프로바이오틱스 활성 및 효소활성이 확보된 유산균으로 발효되어 제조된 흑삼 유산균 발효 조성물을 제공할 수 있다.

Description

흑삼 유산균 발효 조성물 및 그 제조방법{Black ginseng lactic acid bacteria fermentation composition and method for producing the same}

본 발명은 흑삼 유산균 발효 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 유산균 중 프로바이오틱스 활성(내산성, 내담즙성 등)이 높게 측정되고 베타글루코시데이즈를 포함한 다양한 효소활성이 확보된 균주를 최종 선발하고, 선발된 최종 균주로 흑삼을 발효시켜 효능 및 체내 흡수율이 향상된 흑삼 유산균 발효 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

인삼은 가공 방법에 따라 수삼, 백삼, 태극삼 및 홍삼 등으로 분류된다. 이들 성분 중 대표적인 것이 ginsenoside(G)-Rg3를 비롯한 prosapogenin 배당체 성분으로서 항암효능을 비롯한 다양한 생리활성이 보고되었다. 일반적으로 수증기로 2~3시간 1회 쪄서 제조하는 홍삼 중에는 이들 성분이 극히 미량으로 존재하기 때문에 이들 미량 생리활성 성분을 증가 시키는 가공법의 개발이 시도 되었다.

이와 관련하여 2000년대 초부터 금산 지역을 중심으로 한약재의 수치법(修治法)의 일종인 아홉 번 찌고 아홉 번 말리는 이른바, 구증구포(九蒸九曝)의 원리를 이용하여 인삼을 찌는 가공법이 개발되었고 수삼을 찌고 말리는 과정을 반복하여 색깔이 흑색을 띠게 됨으로 흑삼(black ginseng)이라고 부르게 되었다.

흑삼은 기존의 홍삼과는 외관 특성과 성분 면에서 차별화되고 Rg3를 비롯한 생리활성 성분들이 인삼보다 홍삼이 많고, 홍삼보다는 흑삼이 더 높은 것으로 알려져 있다. 이 외에도 ginsenoside Re, Rf, Rg1, Rg2 및 Rh1의 함량 또한 다른 삼 제품보다 흑삼에서 그 함량이 증가되는 것으로 알려져 있다.

이로 인해 흑삼은 2012년 인삼산업법의 개정으로 기존의 수삼, 백삼, 태극삼, 홍삼 등에 추가하여 인삼류의 새로운 품목으로 지정되었고, 유통이 가능하게 되었다.

여기서, 흑삼에 함유되어 있는 사포닌 즉 ginsenoside는 당부분(glycone)과 비당부분(aglycone)으로 구성된 배당체이며, 구조적으로 triterpenoid dammarane 골격에 glucose, arabinose, xylose, rhamnose 등의 당이 결합되어 삼의 가장 중요한 약리활성성분으로 인정되고 있고, 주로 중추신경계에 대한 작용, 뇌기능에 대한 작용, 항발암과 항암작용, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용 등 여러면에서 우수한 활성을 나타낸다.

Ginsenoside는 현재 20여 종 이상이 보고되고 있으나 인삼에는 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Re, Rg1 등이 대부분을 차지하고 있어 major ginsenoside라 불리고 있다. 이들 외의 ginsenoside는 인삼에는 미량 혹은 존재하지 않지만 물리적, 화학적, 효소적 처리 등에 의해서 ginsenoside의 당 부분이 가수분해되어 분자량이 작은 ginsenoside가 생성되는데 이들을 minor ginsenoside라 한다.

Minor ginsenoside는 major ginsenoside에 비해 흡수율이 높고 생리 활성이 우수하다고 알려져 있다.

*한편 Hasegawa 등의 보고에 따르면, ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1 등의 major ginsenoside가 인체의 소화기관에서 거의 흡수되지 않으며, Rb1 성분의 체내흡수율은 4.35%에 불과한 것으로 보고하고 있고, ginsenoside를 대사시키는 장내 미생물을 동정한 결과 한국인의 약 37.5%가 사포닌을 분해할 수 있는 미생물이 존재하지 않는 것으로 보고되었다.

이러한 선행연구들에 의해 minor ginsenoside로의 전환연구는 지속적으로 진행되고 있고, 특히, Rg3의 전환 방법으로 산 가수분해, 열처리, 미생물 및 효소처리에 의한 생물 전환 초고압 처리 등 다양한 연구가 시도되고 있다.

Rg3는 neuroprotective, hematopoietic, anti-carcinogenic, anti-metastatic, 치매 예방 및 기억력 개선효과를 갖는 것으로 알려져 있고, Rg3 자체만을 가공하여 항암제 등으로 판매하고 있다. 그 외에도 Ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd 등의 대사산물인 compound K(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-ptotopanaxadiol)는 종양형성을 막고 암세포의 침입을 억제함으로 써 악성종양의 생성이나 암의 전이를 막고, 암세포에 강력한 항암효과를 나타낸 것으로 보고하였다.

지금까지 미생물의 생물전환방법으로 major ginsenoside가 minor ginsenoside로 전환되는 연구는 주로 장내세균 Bifidobacterium, 곰팡이, 토양균등 미생물 에 의해 이루어졌으며 혐기성조건에서 균을 배양해야 하거나 또는 식용이 어려운 등 문제점이 있었다.

또한 발효흑삼 연구는 황국균과 백국균과 같은 누룩곰팡이 또는 사카로마이세스 세레비지에와 같은 효모균을 활용한 발효기술이 대부분으로 유산균을 활용한 흑삼발효기술은 특허검색이 되지 않은 실정이다.

Lactobacilli 및 Bifidobacterium과 같은 유산균은 당류를 발효하여 젖산을 생성하는 세균으로서, 다양한 미생물이 존재하는 사람의 장내에서 우세균으로 분포하고 체내 유익균의 성장을 촉진하는 생균 활성제(probiotics)로서 위장기능 개선, 체내 콜레스테롤 흡수저해, 면역조절, 영양소의 흡수 및 이용율을 높이는 등 다양한 질병 예방효과와 생리조절작용을 하는 것으로 밝혀진 각광받는 건강기능성 식품소재이다.

이러한 유산균을 활용하여 흑삼을 발효시켜 살아있는 유용한 미생물을 프로바이오틱(probiotic)으로 공급할 수 있으며, 배당체 구조인 ginsenoside의 당을 분해하여 ginsenoside의 구조를 전환하여 발효 전의 삼에서 섭취할 수 있는 사포닌 보다 효율이 높은 사포닌을 섭취할 수 있으며, 체내 흡수에 도움이 되는 흑삼 발효 조성물을 개발하고자 한다.

본 연구는 진안홍삼연구소에서의 '진세노사이드의 손실이 없는 흑삼의 제조방법(한국등록특허 제10-1842610호)'에 대한 유효특허를 기반으로 제조된 건흑삼 중 상품가치가 떨어진 일부제품을 분말화하여 발효소재의 자원으로 활용하고자 하였고, 흑삼분말 자체를 직접 유산균과 발효하고자 하고 이 또한 선행연구로 보고된 바가 없다.

1. 한국등록특허 제10-1842610호

상기와 같은 문제를 해결하고자, 본 발명은 유산균 중 프로바이오틱스 활성(내산성, 내담즙성 등)이 높게 측정되고 베타글루코시데이즈를 포함한 다양한 효소활성이 확보된 균주를 최종 선발하고, 선발된 최종 균주로 흑삼을 발효시켜 효능 및 체내 흡수율이 향상된 흑삼 유산균 발효 조성물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

흑삼을 프로바이오틱스 활성 및 효소활성이 확보된 유산균으로 발효시켜 흑삼 유산균 발효 조성물을 제조하는 방법에 있어서,

흑삼을 분말화하는 단계;

정제수에 흑삼 분말을 첨가하여 흑삼분말액을 제조하는 단계;

상기 흑삼분말액을 멸균하는 단계;

상기 멸균된 흑삼분말액을 냉각시키는 단계 및

상기 냉각된 흑삼분말액에 기탁번호 KFCC11812P인 Lactobacillus plantarum SRCM 102370을 접종하여 발효하는 단계를 포함하는 흑삼 유산균 발효 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 흑삼분말액을 제조하는 단계는 상기 흑삼분말액이 흑삼분말을 1%의 농도 이상으로 함유하도록 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명을 따른 제조방법에 있어서, 상기 발효하는 단계는 상기 흑삼분말액에 유산균을 3중량%로 접종하여 30 내지 40℃에서 48시간 동안 발효시킬 수 있다.

다른 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은

흑삼을 프로바이오틱스 활성 및 효소활성이 확보된 기탁번호 KFCC11812P인 Lactobacillus plantarum SRCM 102370으로 발효하여 제조된 흑삼 유산균 발효물 포함하는 조성물을 제공한다..

상기 본 발명에 따른 조성물은 진세노사이드 전환으로 체내흡수율이 증대되고, 발효 중 효소활성에 의해 아미노산 ?량이 증가되어 풍미가 향상되며 면역 증진 기능을 가지는 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명의 실시예에 따른 흑삼 유산균 발효 조성물 및 그 제조방법은 유산균 중 프로바이오틱스 활성(내산성, 내담즙성 등)이 높게 측정되고 베타글루코시데이즈를 포함한 다양한 효소활성이 확보된 균주를 최종 선발하여, 선발된 최종 균주로 흑삼을 발효시켜 생물전환으로 효능 및 체내 흡수율이 향상될 수 있다.

또한, 아미노산 전환으로 아미노산 함량이 증가하여 면역 증진 기능을 나타낼 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 흑삼 유산균 발효 조성물 제조방법을 순차적으로 도시한 흐름도.
도 2는 비교균주인 KCTC 3035와 SRCM 102226, SRCM 102370의 진세노사이드Rb1으로부터 Rg3와 CK로의 전환능을 확인한 TLC 분석 결과.
도 3은 발효시간에 따른 흑삼분말 농도별, 균주 접종농도별 pH 변화 그래프.
도 4는 발효시간에 따른 흑삼분말 농도별, 균주농도별 총산도 변화 그래프.
도 5는 발효시간에 따른 흑삼분말 농도별, 균주농도별 생균수 변화 그래프(Log CFU/mL).
도 6은 비교예와 본 발명의 실시예의 유리아미노산의 함량을 비교한 결과 그래프.
도 7의 (a) 및 (b)는 비교예와 본 발명의 실시예에 따른 비장세포 생존율 변화 그래프(24시간 후).
도 8의 (a) 및 (b)는 비교예와 본 발명의 실시예에 따른 Cy에 처리된 비장세포의 세포 증식율 변화 그래프(24시간 후).
도 9의 (a) 및 (b)는 비교예와 본 발명의 실시예에 따른 YAC-1 세포 생존율 변화 그래프(24시간 후).
도 10의 (a) 및 (b)는 비교예와 본 발명의 실시예에 따른 NA 세포 활성 변화 그래프(24시간 후).
도 11의 (a) 및 (b)은 본 발명의 실시예에 따른 흑삼 유산균 발효 조성물 및 이를 동결건조시킨 동결건조물 사진.
도 12a 내지 12c는 본 발명의 실시예에 따른 흑삼 유산균 발효 조성물의 영양성분, 중금속 성분 및 잔류농약성분을 검사한 검사 성적서.

이하, 도면을 참조한 본 발명의 설명은 특정한 실시 형태에 대해 한정되지 않으며, 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있다. 또한, 이하에서 설명하는 내용은 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하의 설명에서 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용되는 용어로서, 그 자체에 의미가 한정되지 아니하며, 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 또한, 이하에서 기재되는 "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것으로 해석되어야 하며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.

이하, 본 발명의 실시 예를 첨부한 도 1 내지 도 10를 참조하여 상세히 설명하기로 한다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 흑삼 유산균 발효 조성물 제조방법을 순차적으로 도시한 흐름도이다.

본 발명의 실시예에 따른 흑삼 유산균 발효 조성물 제조방법은 흑삼을 프로바이오틱스 활성 및 효소활성이 확보된 유산균으로 발효시켜 흑삼 유산균 발효 조성물을 제조하는 방법으로서, 프로바이오틱스 활성 및 효소활성이 확보된 유산균을 이용해 진세노사이드 전환 및 아미노산 전환을 유도하여 효능, 체내흡수율 및 면역 증진 기능이 향상된 흑삼 유산균 발효 조성물을 제공할 수 있다.

여기서, 유산균은 프로바이오틱스 활성(내산성, 내담즙성 등) 및 효소활성이 확보된 것이며, 또한 우수한 항균활성을 나타내는 것으로서 한국미생물보존센터에 2018년 12월 12일 기탁된 기탁번호 KFCC11812P인 Lactobacillus plantarum SRCM 102370이다.

상기 Lactobacillus plantarum SRCM 102370은 (재)발효미생물산업진흥원에서 알타리 김치로부터 분리 배양하여 확립된 균주로서 서열 상동성 검색 결과 Lactobacillus plantarum임을 확인하였으며, 특이적으로 내산성, 내담즙성 및 효소활성이 우수하고, 항균활성으로 식중독 유해 미생물에 대한 억제능이 우수하고, 진세노사이드를 전환시킬 수 있으며, 흑삼에 대한 발효 적성이 우수하다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 흑삼 유산균 발효 조성물 제조방법은 흑삼을 분말화하는 단계(S100), 흑삼분말액을 제조하는 단계(S200), 흑삼분말액을 멸균하는 단계(S300), 흑삼분말액을 냉각시키는 단계(S400) 및 흑삼분말액에 유산균을 접종하여 발효하는 단계(S500)를 포함할 수 있다.

먼저, 흑삼을 분말화하는 단계(S100)는 흑삼을 분쇄하여 분말화하는 것으로, 흑삼 분말을 제조할 수 있다.

여기서 흑삼은 외관상 상품가치가 떨어진 건조 흑삼을 사용할 수 있는데, 이에 흑삼의 활용도를 더욱 높일 수 있다. 또한 이에 한정되지 않고, 흑삼을 건조시켜 사용할 수 있으며, 다양한 상태의 흑삼을 사용할 수도 있다.

흑삼분말액을 제조하는 단계(S200)는 정제수에 흑삼 분말을 첨가하여 용해시켜 흑삼분말액을 제조할 수 있다.

구체적으로, S200 단계는 정제수에 흑삼분말을 흑삼분말액 100중량%를 기준으로 1중량% 이상 혼합하여, 흑삼분말액이 흑삼분말을 1%의 농도 이상으로 함유하도록 제조할 수 있다.

보다 바람직하게는, 흑삼분말액 100중량%를 기준으로, 흑삼분말을 1 내지 2중량%을 혼합하여, 흑삼분말액이 흑삼분말을 1 내지 2%의 농도로 함유하도록 제조할 수 있다.

이에 따라, 흑삼분말이 1%의 농도 미만일 경우 진세노사이드 전환 효과가 미미하며, 흑삼분말이 2중량%를 초과하여도 무방하나 현실적인 단가 및 발효효율을 고려하면, 흑삼분말액이 흑삼분말을 1 내지 2%의 농도로 함유하는 것이 바람직한 것이다.

또한, S200 단계는 발효 시 유산균의 최적 배양 조건을 맞춰주기 위해 흑삼분말액에 설탕을 더 첨가하여 혼합할 수 있다.

이때, 설탕은 흑삼분말액의 당도가 4 내지 6brix가 되도록 첨가될 수 있으며, 5brix가 되는 것이 바람직하다. 이는 상기 당도에서 균의 생육과 관능척도가 가장 우수하기 때문이다.

흑삼분말액을 멸균하는 단계(S300)는 S200 단계에서 제조된 흑삼분말액을 121℃에서 15분 동안 멸균하여, 원료 흑삼에 숙주하고 있을지 모를 미생물 또는 미생물의 포자 등을 완전 사멸시킬 수 있다.

흑삼분말액을 냉각시키는 단계(S400)는 S300 단계에서 멸균된 흑삼분말액을 45 내지 55℃로 냉각시킬 수 있으며, 50℃로 냉각시키는 것이 바람직하다.

이때, 45℃ 미만으로 냉각시킬 경우 외부 낙하균 등의 유입으로 오염될 수 있으며, 55℃ 초과로 냉각시킬 경우 접종되는 유산균의 생육이 제어될 수 있다.

이와 같이 흑삼분말액을 냉각시키는 것은 S500 단계에서 유산균이 활발하게 활성화하여 발효가 용이하게 이루어지도록 하기 위한 것이다.

흑삼분말액에 유산균을 접종하여 발효하는 단계(S500)는 S400 단계에서 냉각된 흑삼분말액에 유산균을 접종하여 발효하는 것으로, 최종적인 흑삼 유산균 발효 조성물을 제조할 수 있다.

S500 단계는 흑삼분말액에 유산균을 3중량% 이상으로 접종하여 30 내지 40℃에서 48시간 이상 동안 발효시킬 수 있으며, 유산균을 3 내지 5중량%로 접종하여 37℃에서 48 내지 50시간 동안 발효시키는 것이 바람직하다. 또한, 유산균을 5중량%로 접종하는 것이 가장 바람직하다.

이때, 발효온도는 유산균 배양 결과에 따라 30 내지 37℃와 유사한 범위로 잡은 것이며, 상기 발효 온도를 벗어나면 발효 효율이 저하될 수 있어, 즉 25℃ 미만일 경우 효소활성이 낮아 발효에 많은 시간이 소요되어 충분한 발효가 이루어지지 않을 수 있고, 45℃를 초과할 경우 효소가 불활성화가 되어 발효 효율이 저하될 수 있기 때문에, 상기 문제를 벗어난 30 내지 40℃에서 발효시키는 것이 바람직하다.

또한, 발효 시간이 48시간 미만일 경우 발효가 충분하게 이루어지지 않을 수 있다.

여기서 효과적인 유산균의 발효를 유산의 생성으로 정의하게 되면, 발효에 의한 바람직한 산도는 pH 0.4일 수 있다.

이에 따라, 유산균이 3중량% 미만일 경우 산도가 너무 낮게 나타날 수 있으며, 이는 발효가 효과적으로 이루어지지 않았음을 의미하고, 즉 발효시키는데 적합한 생균수가 확보되지 않아 발효 효율이 저하될 수 있다.

또한, 유산균이 5중량%를 초과하여도 무방하나 흑삼 유산균 발효 조성물의 발효 완료 시, 제조 특성을 고려하여, 유산균은 3 내지 5중량%으로 접종하는 것이 바람직하다.

상기와 같은 제조 방법을 통해 본 발명의 실시예에 따른 흑삼 유산균 발효 조성물을 제조할 수 있다.

이러한 흑삼 유산균 발효 조성물은 흑삼을 프로바이오틱스 활성 및 효소활성이 확보된 유산균으로 발효하여 제조되어, 흑삼에 함유되어 있는 배당체 구조인 ginsenoside의 당이 분해되어 구조가 전환(진세노사이드 전환)됨으로써, 체내흡수율이 향상되어 섭취자가 보다 효율이 높은 사포닌을 섭취할 수 있도록 할 수 있다.

또한, 흑삼 유산균 발효 조성물은 발효 중 효소활성에 의해 아미노산 ?량이 증가되어 풍미가 향상될 뿐만 아니라, 추가 세포실험을 통해 면역 증진 기능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 흑삼 유산균 발효 조성물은 정제수 및 흑삼분말 1중량%이상, 설탕을 포함하는 흑삼분말액, 유산균 3중량%이상을 포함할 수 있고, 정제수, 흑삼분말 1중량% 내지 2중량% 및 설탕을 포함하는 흑삼분말액, 유산균 3중량% 내지 5중량%를 포함하는 것이 바람직하다.

이때, 흑삼분말의 함량은 흑삼분말액 100중량%를 기준으로 한다.

이와 같이 제조된 흑삼 유산균 발효 조성물을 분석해본 결과, 흑삼에 비해 Rg3, Rk1, Rg5의 함량이 증가되었고, pH는 3.54±0.05이며, 아미노산 함량이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 유산균 선발, 흑삼 유산균 발효 조성물, 그 제조방법에 대하여 실시예, 비교예, 실험예를 통해 구체적으로 설명한다.

이하, 실시되는 실험 예들은 이해를 돕기 위하여 제시되는 것으로서, 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실험 예들에 한정되는 것은 아니다.

[ 실험예 1] 유산균의 최종 균주 선발

1. 균주 배양 및 보관

실험에 사용된 유산균주는 전라북도 순창군에 소재한 발효미생물진흥원에서 전통발효시료에서 분리한 유산균 총 14종과 비교균주로 한국미생물보존센터(KCCM), 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 각 1종씩 분양받아 본 실험에 사용하였다.

확보된 균주는 MRS 액체배지에 1%씩 접종하여 37℃, 48시간 배양하여 사용하였고, 사용이 종료된 후에는 60% 글리세롤 용액과 함께 -70℃ deep freezer에 보관하였다.

여기서, 비교균주는 호서대에서 진행한 발효인삼의 ginsenoside 유도연구에서 효과를 나타낸 Lactobacillus delbrueckii supsp. lactis KCTC 3035(KCTC 1058)와 발효산업미생물진흥원에서 항균활성 확인 시 사용하는 Lactobacillus plantarum KCCM 12116이고, 실험 과정 중 Negative control로 확보된 유산균 중 효소활성 및 발효능, 진세노사이드 전환등이 낮게 나타난 Lactobacillus curvatus SRCM 102226을 함께 참조균주로 설정하였다.

2. 프로바이오틱스 활성 평가

프로바이오틱스 활성을 평가하여 균주를 선별하기 위해 내산성, 내담즙성 및 항균활성을 하기와 같은 방법을 통해 평가하였다.

먼저 분양받은 유산균주와 비교균주를 MRS 배지에서 37℃, 24시간 배양하여 실험을 진행하였다.

내산성을 확인하기 위해 MRS 액체배지에 HCl와 NaOH를 이용하여 각각 pH 2.5와 7.0으로 조절한 후 37℃에서 3시간 진탕 배양한 후, 배양액을 0.85% 멸균 생리식염수로 연속 희석하여 MRS 고체배지에 도말하고 37℃, 48시간 배양하여 생균수를 측정하였다. pH 조절 전 생균수를 대조구로 생존률을 확인하여 내산성 정도를 확인하였다.

내담즙성 분석은 MRS 액체배지에 담즙을 0.3% 첨가하여 37℃에서 3시간 진탕 배양한 후, 배양액을 0.85% 멸균 생리식염수로 연속 희석하여 MRS 고체배지에 도말하고 37℃, 48시간 배양하여 생균수를 측정하였다. 내담즙성은 담즙 첨가 전의 생균수를 대조구로 생존률을 확인하여 담즙성 정도를 확인하였다.

이때, 생존률은 하기 식을 통해 구하였다.

생존률(%)=[생존균수(CFU/mL)/대조구(control) 균수(CFU/mL)]×100

병원균에 대한 항균활성을 측정하는 방법으로는 식품을 부패 또는 오염시켜 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스와 스테필로코커스 아우레우스에 대한 항균활성을 측정하였다. 여기서, 실험균주로는 바실러스 세레우스 KCTC 3624, 스테필로코커스 아우레우스 KCCM 11593을 사용하였고, 실험은 발효미생물산업진흥원의 도움으로 진행되었다. 먼저 각 검정균이 자랄 수 있는 bottom agar(TSA, difco)를 제조한 후, 유산균주를 배지에 각각 접종한다. 이후 검정균을 1% 접종한 top agar(MRS)를 부어 말리고, 37℃, 48시간 경과 후 투명환의 크기를 측정하였다.

실험 결과, 유산균주 14종 중에서 Lactobacillus plantarum SRCM 102370(기탁번호 KFCC11812P)의 내산성, 내담즙성 및 항균활성에 대한 가장 우수한 활성을 확인할 수 있었다.

이때, Lactobacillus curvatus SRCM 102226는 내산성, 내담즙성 및 항균활성이 가장 낮게 나온 균주로 나와 참조균주로 사용하였다.

비교균주, Lactobacillus curvatus SRCM 102226(참조균주), Lactobacillus plantarum SRCM 102370의 내산성, 내담즙성 및 항균활성 결과는 하기 표 1 및 표 2와 같다.

상기 표 1을 보면 알 수 있듯이, 최소한의 probiotics 활성을 확인한 내산성과 내담즙성을 검토한 결과, 비교균주 KCTC 3035와 참조균주 SRCM 102226는 pH 2.5에 노출 시, 유효숫자 미만으로 계수에 어려움이 있어 생존률이 낮은 것을 확인할 수 있었고, 비교균주 KCCM 12116은 생존률이 1.95%로 확인되었다.

반면에, SRCM 102370 균주(기탁번호 KFCC11812P)는 pH 2.5에서 53.51%의 생존률이 확인되었고 게시한 결과를 포함한 모든 시험군에서 가장 우수한 생존력을 확인할 수 있었다.

이는 곧 pH 2.5의 조건에서 3시간 동안 SRCM 102370 균주가 53.51% 이상 생존하여 장으로 이동할 수 있을 것으로 판단된다.

담즙산은 미생물의 세포막에 영향을 주어 미생물이 사멸하는 것으로 보고되었으나, SRCM 102370은 무처리군과 비교하여 그 값이 오히려 증가하는 것으로 확인되었다.

또한, 표 2를 보면 알 수 있듯이, 구토와 설사 등을 유발하는 식중독 관련 병원성 미생물에 대한 항균활성의 측정을 선별한 분리균주를 대상으로 확인한 결과, SRCM 102370 균주(기탁번호 KFCC11812P)는 항균활성이 우수한 비교균주 KCCM 12116과 비교해 유사한 결과를 나타내고, 검정균주 3종에 대한 높은 활성을 보이고 있어 식중독 유해 미생물에 대한 억제능이 우수한 것으로 사료된다.

이에, 유산균주 중에서 내산성, 내담즙성 및 항균활성이 가장 우수한 Lactobacillus plantarum SRCM 102370을 1차 균주로 선별하였다.

3. 효소활성 평가

효소활성을 평가하여 최종균주를 선발하기 위해 하기와 같은 방법을 통해 세포 외 효소활성, API ZYM을 이용한 효소활성을 평가하였다.

먼저, 1차로 선별된 1차 균주의 세포외 효소 활성 측정은 프로테아제와 베타글루코시데이즈에 대하여 조사하였고, 1% skim milk(Difco), 0.5% esculin(sigma)를 각각의 기질로 하여 well diffusion 방법을 이용하여 측정하였다.

또한, 1차 균주의 효소 활성을 조사하기 위해 API ZYM kit(bioMerieux Co., Marcy-I'Etoile, France)를 사용하여 alkaline phosphatase 외 18가지 효소 활성을 검사하였다. 균주를 MRS 고체배지에서 배양하여 균체를 회수하고 멸균수에 3회 세척한 후 멸균수에 현탁하여 시료를 준비하였다. 현탁액 500 ul를 5 mL suspension medium에 풀어준 후 5~6 Mcfarland(bioMerieux Co.)로 탁도를 조정하였다. 탁도를 조정한 현택액을 ZYM kit의 각 큐플에 접종하여 37℃에서 4시간 배양한 후 표현 활성 증가와 용해를 도와주는 ZYM A, B 시약을 각각의 큐플에 한 방울씩 떨어뜨려 5분간 반응 후 색깔의 변화를 관찰하여 효소 활성 정도를 조사하였다. 이때, 색의 변화 정도에 따라 0~5까지의 값으로 표시하였으며, 0은 음성반응, 5 (≥40 nmoles)는 최대 강도의 반응이고 4~1은 각각 30, 20, 10, 5 nmoles의 중간 값을 나타내며 3 이상일 경우 양성으로 판정하였다.

비교균주와 1차 균주의 세포 외 효소활성 및 ZYM kit 결과는 하기 표 3 및 표 4와 같다.

먼저, 표 3을 보면 알 수 있듯이, 비교균주인 KCTC 3035의 반응은 확인하기 어려웠고, KCCM 12116은 활성이 나타나긴 하였으나, SRCM 102370(기탁번호 KFCC11812P)의 활성이 가장 뛰어난 것을 확인하였으며, SRCM 102226은 반응이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 표 4를 보면 알 수 있듯이, ZYM kit를 이용해 추가 효소활성을 검토한 결과에서도 비교균주 및 SRCM 102226(참조균주)에 비해 SRCM 102370의 효소활성이 두드러지는 것을 확인할 수 있었다.

구체적으로, SRCM 102370는 ZYM kit를 통해 β-glucosidase 외에도 11종의 효소활성이 더 있는 것으로 관찰되었다.

지방 분해에 관여하는 Esterase, Esterase lipase와 펩타이드 가수분해 효소인 Leucine arylamidase, Valine arylamidase, Cystine arylamidase 등에서 5~30 nmol의 활성을 나타내었고, 유당 분해에 관여하는 β-galactosidase는 가장 높은 40 nmol의 활성을 나타내었으며, ginsenoside 전환에 필요한 β-glucosidase의 활성은 30 nmol로 확인되었다.

참고로, 이는 SRCM102370의 ginsenoside 전환능을 확인하기 위한 하기 실험(4. Ginsenoside Rb1의 전환)에서 esculin iron agar로 실험한 결과 colony 주변에 검정색 환이 형성됨에 따라 β-glucosidase 활성이 나타난 결과를 뒷받침하고 있다.

이에, 유산균주 중에서 내산성, 내담즙성 및 항균활성이 우수할 뿐만 아니라, 효소활성도 우수한 Lactobacillus plantarum SRCM 102370을 최종균주로 선발하였다.

4. Ginsenoside Rb1의 전환

선발된 최종균주의 적합성을 판단하기 위해 하기와 같은 방법으로 Ginsenoside Rb1의 전환을 평가하였다.

MRS 액체배지에서 24시간동안 배양한 균주를 다시 2 mM의 ginsenoside Rb1을 0.2 um membrain filter로 여과하여 멸균한 후 실험에 사용하였다.

NB 액체 배지에 ginsenoside Rb1의 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 접종하고 37℃, 48시간 배양하여 반응액을 회수하였다. 반응액은 수포화 n-butanol로 사포닌 성분을 추출하여 분석하였다.

TLC는 butanol : Ethyl acetate : water (10 : 2 : 8, v/v/v) 용매로 전개한 후, 10% 황산용액을 분무하고 110℃에서 10분간 가열하여 발색시켰다.

그 결과는 도 2와 같다.

도 2에 나와 있는 바와 같이, Ginsenoside Rb1이 0.5 mM와 유산균을 반응시킨 반응물을 n-butanol을 이용해 전개한 결과, Rg3와 compound K로 변환된 것으로 보이는 것은 SRCM 102370인 것을 확인할 수 있었다.

5. 흑삼분말 용액에서 생존률 검토

선발된 최종균주의 발효 조성물 제조에 대한 적합성을 판단하기 위해 하기와 같은 방법으로 흑삼분말 용액에서의 생존률을 검토하였다.

흑삼분말 1%와 정제수만으로 분말 액체배지를 제조하고 균주는 10⁶ CFU/mL을 접종하고 37℃, 24시간 진탕배양 후, 초기균수를 토대로 생존률을 검토하였다.

발효 종료 시, pH와 총산을 함께 측정하여 균주의 발효를 검토하였다.

그 결과는 하기 표 5와 같다.

표 5를 보면 알 수 있듯이, 초기균수에 비해 SRCM 102226은 생육이 억제된 것으로 보이고, pH의 변화도 거의 무첨가군의 pH(4.96)와 비교할 때 거의 차이가 없는 것으로 보아 발효가 일어나지 않은 것으로 확인되었다.

SRCM 102370은 흑삼에 발효를 진행한 경우 생균수가 약 100배 정도 증가한 Log 8.24 CFU/mL로 확인되었으며, 유산균 발효를 확인할 수 있는 pH의 변화도 확인되어 발효 적성이 좋은 것을 확인할 수 있었다.

이에 최종균주인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) SRCM 102370은 흑삼의 발효에 사용되는 유산균으로 적합하다고 판단된다.

[ 실험예 2] 발효 최적 조건 확립

흑삼 유산균 발효 조성물의 제조에서 발효의 최적 조건을 확립하기 위해, 흑삼분말 1%를 기준으로 0.5, 1, 2%의 흑삼 분말액을 기반으로 설탕으로 당의 농도를 5 brix로 맞추고 유산균 접종량(1%, 3%, 5%)을 달리하고 0, 24, 48시간 배양하여 ginsenoside가 변화되는 것을 TLC 상으로 확인하였으며, pH 변화, 총산도 변화 및 생균수 변화를 관찰하였다.

pH 변화, 총산도 변화 및 생균수 변화의 결과는 도 3 내지 도 5와 같다.

도 3은 발효시간에 따른 흑삼분말 농도별, 균주 접종농도별 pH 변화 그래프, 도 4는 발효시간에 따른 흑삼분말 농도별, 균주농도별 총산도 변화 그래프, 도 5는 발효시간에 따른 흑삼분말 농도별, 균주농도별 생균수 변화 그래프(Log CFU/mL)이다.

먼저, TLC 상의 결과를 토대로 ginsenoside 패턴 변화를 고려 할 때, major ginsenoside가 변화하는 것은 균주 접종량이 5%일 때 더 효과적인 것으로 사료된다.

또한, 도 3 내지 도 5에 나타난 바와 같이, pH와 총산의 변화로 흑삼분말은 최소 1%이상에서 발효조건이 성립되고, 24시간보다는 48시간까지 발효하는 것이 이상적으로 확인되었다.

또한, 생균수 확인 결과 균주 접종량은 최소 3%이상으로 접종하는 것이 생균수가 적합하다고 확인되었다.

따라서, 이 실험 결과로 흑삼분말이 최소 1%이상의 농도의 흑삼분말액을 사용하고, 발효는 48시간이상 진행하되 균주(유산균) 접종량은 3% 이상으로 조건을 확립하였으며, 흑삼분말이 2%의 농도의 흑삼분말액을 사용하고, 발효는 48시간 진행하되 균주(유산균) 접종량은 5%로 최적조건을 확립하였다.

[ 실시예 ] 흑삼 유산균 발효 조성물

정제수에 흑삼분말액 100중량%를 기준으로, 흑삼분말 1중량%를 첨가하고 설탕으로 당의 농도를 5brix로 맞춰 제조된 흑삼분말액을 멸균하고 냉각시킨 후 유산균 5중량%를 접종하고 37℃에서 48시간동안 발효하여 제조하였다.

[ 실험예 3] 흑삼 유산균 발효 조성물의 평가

최종 확립된 조건으로 제조된 흑삼 유산균 발효 조성물인 실시예를 평가하기 위해 기능성 특성과 이화학적 특성을 하기와 같이 평가하였다.

기능성 특성으로는 진세노사이드 함량, 유리아미노산 함량, 유기산 함량 및 항산화 활성을 평가하였다.

1. 진세노사이드 함량

실시예와 비교예의 진세노사이드 함량을 측정하여 비교 평가하였다.

그 결과는 하기 표 6과 같으며, 하기 표 6에서 WG: 수삼(가공전), JK: 시판 흑삼으로 비교예이고, JA는 실시예이다. 단위는 mg/g이고, -는 Not detected이다.

상기 표 6을 보면 알 수 있듯이, JA(실시예)는 가공 전인 WG(수삼)에 비해 비해 Rg3, Rk1, Rg5 등의 함량이 증가됨을 확인할 수 있었고, JK와 달리 주요사포닌으로 알려진 Rg1과 Rb1이 진안 홍삼 연구소의 흑삼 제조기술에 의해 특이 진세노사이드(Rg3, Rk1, Rg5 등)로 전환 된 것으로 확인할 수 있었다.

2. 유리아미노산 및 유기산 함량

실시예를 유산균으로 발효시키지 않은 비교예(control)와 비교하기 위해, 유리아미노산과 유기산을 비교 평가하였다.

유리아미노산은 시료 5 g을 취하여 0.2 N HCl로 50 mL까지 용량을 맞추고 37℃, 3시간 교반한 후, 0.2 ㎛ syringe filter에 통과시킨 후 시료로 사용하였다.

유리 아미노산 분석 조건은 하기 표 7과 같이 설정하여 진행하였다.

유기산은 High Perfomrnace Liquid Chromatography (HPLC)를 이용하여 실시하였고, 시료 5g에 증류수로 50 mL로 맞추고 37℃, 3시간 교반한 후, 0.45㎛ membrane filter에 통과시킨 후 시료로 사용하였다.

유리산 분석 조건은 하기 표 8과 같이 설정하여 진행하였다.

실시예 및 비교예의 유리아미노산 및 유기산의 함량을 비교한 결과는 하기 도 6 및 표 9와 같다.

도 6을 보면 알 수 있듯이, 비교예(control)와 실시예(treatment)의 아미노산 함량은 총 아미노산 함량으로 비교할 경우 약 3배 이상 증가한 것을 확인할 수 있어 발효 중 효소활성이 나타남을 예상할 수 있다.

또한 흑삼 유산균 발효 조성물인 실시예는 특히 필수아미노산으로 분류되는 threonine, valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, lysine, histidine이 모두 발효 전에 비해 증가하여, 성장기 어린이와 노약자의 건강증진에 도움이 될 것으로 사료된다.

본 연구결과는 실시예(흑삼 유산균 발효 조성물)의 유리아미노산 결과로써, 발효 후 산물은 carnosine > beta-alanine > Leusine > Valine > gamma-aminobutyric acid > Lysine > Arginine 순으로 아미노산이 분석되었고, 전체적으로 아미노산 함량이 증가하여 쓴맛, 단맛, 신맛, 감칠맛 등의 맛이 풍부해졌음을 의미한다.

또한, 상기 표 9를 보면 알 수 있듯이, 총 7종의 유기산을 분석한 결과 발효 전 비교예(control)과 비교하여 실시예(treatment)에서 그 값이 크게 증가한 유기산은 Lactic acid > Acetic acid > Succinic acid 순으로 분석되었고, 특히 3종의 유기산은 모두 발효식품에서 주로 검출되는 산으로 흑삼 유산균 발효 조성물의 특유의 산미와 풍미에 영향을 준 것으로 사료된다.

3. 항산화 활성

실시예를 유산균으로 발효시키지 않은 비교예(control)와 비교하기 위해, 항산화 활성을 비교 평가하였다.

그 결과는 하기 표 10과 같다.

상기 표 10을 보면 알 수 있듯이, 발효 전인 비교예(control)의 DPPH free radical 제거 활성은 시료의 처리농도에 따라 점차 증가하여 10000 ㎍/mL의 농도에서 40.66±2.46%로 항산화 효과를 보였고, 발효 후인 실시예(treatment)의 DPPH free radical 제거 활성은 각 시료의 처리농도에 따라 점차 증가하여 10000 ㎍/mL의 농도에서 45.58±1.41%로 항산화 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 및 비교예 모두 농도가 높아질수록 항산화 활성이 높아졌으나, 실시예가 비교예보다 높은 항산화 효과를 보이는 것을 확인하였다.

4. 면역 활성 평가

실시예를 유산균으로 발효시키지 않은 비교예(control)의 면역 활성을 평가하기 위해, 비장 세포에 대한 독성을 평가하였다.

즉, 기존의 면역력 증진에 도움이 된다고 알려진 흑삼에 유산균을 발효시킬 경우 어떤 변화를 나타내는지 확인하고자 진행하였고, 먼저 시료별 처리에 따른 비장세포의 독성 농도를 확인하기 위하여, 비장세포에 실시예 및 비교예를 각각 농도별로 처리하여 24시간 이후에 비장세포의 생존율을 측정하는 것으로 세포 생존율 분석을 수행하였다.

그 결과는 도 7과 같다.

도 7에 나타난 바와 같이, 처리 24시간 후 발효 전 산물인 비교예(control)의 경우 1㎍/mL~500㎍/mL의 농도에서는 세포 독성을 보이지 않았으나, 1000 ㎍/mL에서 시료 자체의 독성으로 인해 세포 생존율을 감소시킨 것으로 관찰되었고, 발효 후 산물인 실시예(treatment)의 경우 1㎍/mL~1000㎍/mL의 농도에서도 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 토대로 기존의 흑삼은 그 자체를 섭취할 경우 섭취하는 양과 농도가 높아질수록 독성이 나타날 수 있고, 이를 실시예와 같이 유산균 발효하게 되면 동일한 농도에서도 세포 독성이 나타나지 않음으로써 보다 안전하다고 사료된다.

또한, 실시예와 비교예의 비교 분석을 위해 세포 증식율에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예와 비교예가 세포에 독성을 미치지 않는 500 ㎍/mL의 농도를 공시료의 최고 농도로 설정하고 Cy(cyclophosphamide)를 처리하여 24시간 이후에 세포 증식율을 측정하였다.

그 결과는 도 8과 같다.

도 8에 나타난 바와 같이, 비교예와 비교하여 Cy를 처리한 실시예의 대식세포 증식능은 약 54~60%로 확인할 수 있었다.

즉, 비교예는 300 ㎍/mL의 농도에서 경우 24시간 경과 시 79.2±4.3%로 나타났으나, 실시예는 100 ㎍/mL의 농도에서 경우 24시간 경과 시 88.7 ±3.2%로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

다시 말해, 유산균 발효를 진행한 실시예는 보다 낮은 농도, 또는 미량 섭취만으로도 발효 전의 흑삼인 비교예보다 면역 증진에 영향을 미칠 수 있음으로 판단될 수 있다.

또한, 실시예 및 비교예 각각의 자연살해세포(Natural killer cell, NK cell)의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 24시간 후 시료 농도에 따른 YAC-1 세포 생존율을 분석하였다.

그 결과는 도 9과 같다.

도 9에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 비교예와 실시예는 각각 500㎍/m의 농도에서는 유의적인 차이가 없었으나, 1000㎍/mL 이상의 농도에서 세포 생존율이 유의하게 감소된 것으로 나타났다.

따라서 각 시료의 농도에 따른 NK cell 활성 비교 분석을 위해 500㎍/mL을 시료의 최대 처리 농도로 설정하여 시험을 진행하였다.

NK 세포는 선천성 면역 반응 중 하나로 바이러스에 감염된 세포, 종양 세포, 비정상 세포, 표적 세포를 인지하여 결합한 뒤 독성과립들을 세포에 통과시켜 세포사멸을 유도한다. NK 세포의 활성은 다양한 활성화 및 억제 수용체를 통한 신호전달 균형에 의해 조절되는데, 이렇게 세포와 결합했을 때 오는 활성 신호와 억제 신호를 인식하여 정상 세포는 공격하지 않고 비정상 세포는 제거함으로써 세포 살해 활성이 조절된다.

NK 세포의 활성 측정은 YAC-1 세포에 대한 NK 세포의 공격으로 인해 발생하는 LDH를 측정함으로써 평가하였다.

그 결과는 표 11 및 도 10과 같다.

표 11 및 도 10에 나타난 바와 같이, 실시예 및 비교예는 농도가 증가함에 따라 NK의 활성이 점차 증가된 것으로 나타났는데, 비교예의 경우 10 ㎍/mL에서 106.5±1.8%, 30 ㎍/mL에서 128.4±4.0%, 50 ㎍/mL에서 134.7±3.8%, 100 ㎍/mL에서 142.7±1.8%, 300 ㎍/mL에서 160.4±5.1, 500 ㎍/mL에서 158.5±3.7로 조사되었으며, 실시예의 경우 10 ㎍/mL에서 114.9±2.2%, 30 ㎍/mL에서 135.0±2.8%, 50 ㎍/mL에서 145.7±4.8%, 100 ㎍/mL에서 151.1±4.7%, 300 ㎍/mL에서 173.6±6.8, 500㎍/mL에서 162.9±5.0로 나타나 실시예는 비교예에 비해 NK 세포 활성이 더 높은 것으로 확인되었다.

5. 이화학적 특성

실시예를 유산균으로 발효시키지 않은 비교예(control)와 비교하기 위해, 이화학적 특성을 비교 평가하였다.

그 결과는 하기 표 12와 같다.

상기 표 12를 보면 알 수 있듯이, 실시예(Treatment)는 발효가 안정적으로 진행되어 초기 균 접종량에 비해 발효 종료 시 생균수는 Log 8.57 CFU/mL로 관찰되었고 산이 증가함에 따라 비교예(control)보다 pH가 낮아져 pH도 3.54로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고 다른 구체적인 형태로 실시할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것이다.

한국미생물보존센터(국내) KFCC11812P 20181212

Claims (5)

1. 내산성, 내담즙성이 우수하며, ginsenoside 전환에 필요한 β-glucosidase의 활성이 높은 기탁번호 KFCC11812P인 Lactobacillus plantarum SRCM 102370으로 흑삼을 발효하여 제조되어 진세노사이드 Rg3, Rk1, Rg5의 함량이 증가되고, 발효 중 효소활성에 의해 아미노산 ?량이 증가되어 풍미가 향상되며, 면역 증진 기능과 항산화 활성이 증가된 흑삼 유산균 발효 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제

Images