KR20160063025A - 페디오코커스 펜토사세우스 kcc-23 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

페디오코커스 펜토사세우스 kcc-23 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주 및 이를 이용한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-23의 항균 활성을 이용하여 다양한 항균용 조성물을 제공하며, 특히 사일리지 제조용 미생물 첨가제를 제공한다. 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 소화율을 개선할 수 있고, 항균 효과가 우수하며, 풍미 개선으로 기호성을 향상시킬 수 있어 가축의 품질을 높일 수 있다.

Description

페디오코커스 펜토사세우스 KCC-23 및 이를 포함하는 조성물{Pediococcus pentosaceus KCC-23 and composition comprising the same}
본 발명은 신규한 페디오코커스 펜토사세우스 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항곰팡이 활성이 우수한 신규한 페디오코커스 펜토사세우스 균주 및 이를 이용한 품질이 개선된 사일리지에 관한 것이다.
생균제 식품 생산품은 기능성 식품 시장에서 중요한 역할을 하며, 이는 전체 기능성 시장의 60-70% 사이에 포함된다(Holzapfel, 2006). 생균제는 인간 및 동물의 장내에 발견되는 것을 제외한 살아있는 미생물이며, 대상에 특정한 건강상 이익을 제공한다(FAO/WHO, 2006). 이들 미생물은 바람직하게는 장내 미생물 균총 밸런스를 변화시키고, 장내 완전성 및 유동성을 촉진한다. 이들은 발효성 산의 생산에 의한 원치 않는 미생물의 생장을 억제하고, 감염에 대해 저항성을 증가시킨다(Veldman, 1992). 또한 다른 장점은 주로 건강한 소화관 장내 미소 생물군의 유지 및 이의 회복력의 증가뿐만 아니라 락토스 내성의 조절, 장 기능, 위장 안정, 설사병 예방 및 증상 완화, 콜레스테롤 수준의 감소, 및 고혈압 및 면역 시스템의 조절과 관련된다(Leahy et al.,2005 de Vrese and Schrezenmeir, 2008).
조사료는 일시에 다량 생산되므로 연중 안정적인 급여를 위해서는 저장을 해야 하는데, 수분을 제거한 저장이 건초인 반면 수분이 있는 상태에서 저장을 하는 것이 사일리지(silage)이다. 최근 들어 사일리지의 품질 향상을 위한 첨가제의 필요성에 대한 인식이 확산되면서 국내산 사일리지용 첨가제를 개발하기 위한 연구가 이루어지고 있다.
그러나, 사일리지는 가열공정을 거치지 않기 때문에 곰팡이 등과 같은 미생물들은 적당한 환경(온도, 영양 및 pH 조건)이 구비되면 번식이 용이하여 사일리지의 보관에 어려움을 겪고 있다. 또한, 사일리지 제조기술 부족과 유통, 보관 시 부주의로 곰팡이 등이 발생하면서 가축의 기호성이 감소되고 섭취량이 줄어드는 문제가 발생한다. 또한, 호기조건에 있는 사일리지는 영양적으로도 커다란 손실을 유발한다.
따라서, 사일리지에 발생하는 곰팡이를 억제함으로써 발효 효율 및 사료 저장성을 증진시킬 뿐만 아니라 사료의 영양성, 기호성 및 소화율도 향상시킬 수 있는 첨가제의 개발이 필요하다. 또한 병원성 균을 사멸시키며, 면역 시스템을 가속화하여, 생리학적 기능을 향상시킬 수 있는 생균제의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 신규 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 균주를 포함하는 항균제 조성물, 항산화용 조성물, 사일리지 제조를 위한 미생물 첨가제, 사일리지 제조방법, 또는 사료 첨가제 등을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 제공한다.
상기 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-23 균주는 2014년 07월 01일자로 농업생명공학연구원(KACC)에 기탁하였으며, 수탁번호 KACC91961P를 부여받았다.
곰팡이 등은 발효가 불량한 사일리지에서 다량 발견되고 발효가 양호하게 된 사일리지에서는 육안으로 판별하기 어려울 정도이기 때문에 사일리지 곰팡이 억제기능이 우수한 균주를 선발 및 분리하여 사일리지 보존성을 높이고자 하였다.
본 발명의 발명자들은 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 식품으로부터 분리하는 단계; 상기 분리한 페디오코커스 펜토사세우스 균주의 효소 활성능을 검정하는 단계; 상기 분리한 신규 미생물인 페디오코커스 펜토사세우스 균주의 동정 단계; 및 상기 분리된 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 이용하여 프로바이오틱 특성을 검정하는 단계를 거쳐, 항균 활성, 항산화 활성이 우수한 신규 미생물인 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 얻었다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주는 부패 미생물의 활성을 저하시키고 생육을 억제시켜 항균 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 부패 미생물은 아스퍼질러스 푸미가테스(Aspergillus Fumigates), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium Chrysogenum), 페니실리움 로케포티(Penicillium Roqueforti), 보트리티스 엘립티카(botrytis elliptica) 및 후자리움 옥시스포럼(Fusarium Oxysporum)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기와 같은 우수한 항균 효과로 인해 상기 균주는 항균용 조성물 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 프로바이오틱 효과로 인해서 다양한 항균용 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 신규 균주가 독성이 없으면서, 항균 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있다는 것을 실험을 통해서 밝혀내었다.
본 발명의 균주는 바람직하게는 상기 우수한 항균 활성으로 인해 사일리지 제조시 저장성을 증진시킬 수 있고, 영양성분의 파괴를 예방할 수 있다.
또한, 부패 미생물등과 같은 원하지 않는 미생물에 의한 사일리지 풍미 감소 등을 예방하여, 가축의 기호성을 증진시킬 수 있는 추가 효과까지 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예들에 따르면, 본 발명의 신규 균주는 우수한 항산화 활성을 가지며, 본 발명의 균주를 포함하는 항산화용 조성물을 제공할 수 있다.
일반적으로 활성산소는 단백질의 SH기와 반응해서 효소의 활성을 잃게 하거나 가교결합의 형성, DNA, RNA, 효소 및 세포막을 구성하고 있는 불포화 지방산을 산화시켜 과산화지질을 형성하게 하는데, 과산화지질은 생체에 매우 유독하여 생체의 기능을 저하시켜서 결국에는 혈액순환장애, 피로, 심장병, 간장장애, 발암 등과 같은 질병의 원인이 되고 궁극적으로 노화의 원인이 된다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주가 항균 효과뿐만 아니라, 상기 활성산소의 억제 효과, 즉 항산화 효과가 우수함을 실험을 통해 확인하였다.
상기와 같은 우수한 항산화 효과로 인해 상기 균주는 항산화용 조성물 제조에 이용할 수 있으며, 특히, 우수한 프로바이오틱 효과로 인해서 다양한 항산화용 조성물을 포함하는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조에 이용될 수 있다.
발명의 항산화용 조성물이 포함되는 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 제조는 업계에서 일반적으로 실시하는 방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 신규 균주가 독성이 없으면서, 항산화 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있다는 것을 실험을 통해서 밝혀내었다.
본 발명은 상기 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 포함하는 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 또한 제공한다.
상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 첨가하는 대상이 되는 식물체는, 예를 들어 볏짚, 라이그라스(ryegrass), 총체보리, 총체벼, 호밀 또는 옥수수일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사료로 이용될 수 있는 식물체라면 모두 이용될 수 있다.
상기 식물체 사일리지 발효용 미생물 첨가제는 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 포함하는 배양원액, 또는 상기 배양원액의 희석액의 형태로 첨가할 수 있다.
또한 본 발명은 식물체에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물체 사일리지 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물체 사일리지 제조방법은 당업계에서 사용되는 일반적인 방법으로서, 예를 들어 식물체의 발효를 위한 복수의 발효 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 복수의 발효 단계들은, 예를 들어 혐기성균인 초산균의 발효 단계 및 이후 젖산균의 발효 단계 등을 포함할 수 있으며, 당업자에 의해 적절한 조건으로 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 사료 첨가제는 업계에서 일반적으로 이용되는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 신규 균주가 독성이 없으면서, 항균 활성이 뛰어나, 우수한 프로바이오틱 제제로 이용될 수 있고, 이러한 신규 균주는 우수한 항균 활성으로 인해 사료 첨가제 제조시 저장성을 증진시킬 수 있고, 영양성분의 파괴를 예방할 수 있다.
본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-23은 우수한 항균 활성을 가진다.
또한, 본 발명에 따른 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-23은 항산화 효과가 우수하다.
본 발명에 따른 상기 균주를 이용하여 다양한 항균용 조성물 또는 항산화용 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 균주를 이용하여 제조된 식물체 사일리지는 가축의 소화율을 개선할 수 있고, 항균 효과가 우수하며, 풍미 개선으로 기호성을 향상시킬 수 있어 가축의 품질과 생산성을 높일 수 있다.
또한 상기 사일리지는 저장성이 향상되어 농가 소득 증대에 크게 기여할 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물 또는 항산화용 조성물은 독성이 없어 우수한 프로바이오틱 효과를 가지므로, 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등 다양한 형태로 활용될 수 있다.
도 1은 식품 부패균에 대한 Pediococcus pentosaceus KCC-23 균주의 항곰팡이 활성을 나타낸 사진이다(A; A. fumigatus, B; G. moniliformis, C: P. roqueforti, D: B. elliptica, E: F. oxysporum).
도 2의 A는 KCC-23의 산에 대한 내성, B는 담즙염에 대한 내성, C는 세포표면 소수성 및 자가응집%, D는 위액에 대한 내성을 나타낸다.
도 3은 KCC-23의 발효성 대사물질의 과산화수소에 대한 내성(A) 및 자유 라디칼 제거 활성(B)을 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
샘플의 동정 및 분리
이탈리안 라이그라스 사료 작물은 대한민국, 천안으로부터 수득하여 멸균 프로필렌 백 안에 보관하였다. 수집된 샘플을 세척하고 작은 조각으로 조각내었다. 샘플의 1 그램을 멸균수 10ml와 혼합하고 108까지 단계 희석하였다. 이후 플레이트를 24 내지 48시간 동안 28±2°C에서 배양하였다. 랜덤하게 28 분리물을 선택하고 예비 항진균성, MRS, 보리, 옥수수 및 이탈리안 라이그라스 즙 내 분리물의 성장, 담즙염에 대한 내성을 분석하였다. Pediococcus pentosaceus KCC-23(이하 KCC-23)의 최대 항진균성 및 성장 활성 및 담즙염 내성을 나타내었다.
KCC-23의 생화학적 및 생리학적 특성
그람 염색, 카탈라제 활성 및 운동성을 Kozaki, M., T. Uchimura, and S. Okada. 1992. Experimental manual of lactic acid bacteria, p. 3437. Asakurasyoten, Tokyo, Japan에 설명된 LAB 방법에 따라 결정하였다. API 50 CH 테스트 키트를 탄수화물 대사 테스트를 수행하기 위해 사용하였다. MRS 배지 내 분리물 성장의 형태를 직접 및 도립 현미경(CKX41, Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 통해 관찰하였다.
KCC-23의 분자적 확인
KCC-23의 DNA를 시판중인 키트 방법을 사용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 주형으로 유전체 DNA와 함께 공용 프라이머(27F AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG & 1492R GTA TTA CCG CGG CTG CTG G)를 사용하여 PCR(Applied Bio system-9700)을 통해 증폭하였고, Solgent Co. Ltd. (16S rRNA, Seoul, Korea) 내 Genetic Analyzer 3130 (Applied Bio-system, USA)를 통해 시퀀싱(sequencing)하였다. 분리물의 정렬된 16S rRNA는 NCBI Gene Bank의 데이터 베이스로 BLAST로 분석하였다. 최대 아이덴티티 스코어를 선택하고 ClustalW 멀티플 정렬 소프트웨어를 사용하여 정렬하였다.
KCC-23의 항생제 민감성 실험
KCC-23의 항생제 민감성은 디스크 확산법(Arasu MV, Duraipandiyan V, Ignacimuthu S (2013) Antibacterial and antifungal activities of polyketide metabolite from marine Streptomyces sp. AP-123 and its cytotoxic effect. Chemosphere 90:479487)을 사용하여 조사하였다. 간단하게, 박테리아 108CFU/ mL을 포함하는 4시간 활성 KCC-23 현탁액의 100μl를 고체화된 MRS 배지의 위에 확산시키고 10분 동안 건조시켰다. 일반적인 항생제 디스크의 여러 가지 형태를 배지의 표면에 두고, 항생제의 확산을 위해 상온에서 10분 동안 두었다. 이후 플레이트를 배양기 내 24시간 동안 30°C에서 배양하였다. 이후 억제 존은 표준 항생제 디스크 차트를 통해 측정하였다.
항진균 실험
진균 배양 및 제조
Aspergillus Fumigates, Penicillium Chrysogenum, Penicillium Roqueforti, botrytis elliptica, 및 Fusarium Oxysporum과 같은 연구에 사용된 진균 균주는 KACC로부터 수득하였다. 진균 분상재 포자를 감자한천배지(PDA) 위 1주령 배양물로부터 준비하였다. 플레이트는 멸균수로 두 번 세척하고 트리톤 X100의 0.05%를 사용하여 수득하였다. 약 5x102 분생자를 포함하는 10μl 분생자 현탁액을 항진균 분석을 위해 사용하였다.
주입 평판법(pour plate method)에 의한 KCC-23의 항진균 특성의 스크리닝
본 방법은 하나는 KCC-23이 자라는 배지 및 다른 하나는 진균이 자라는 배지로, 페트리디스크 위 두가지 다른 배지층으로 이루어진다. MRS 액체배지 내 24시간 성장한 KCC-23 배양물을 고체화된 MRS 한천 플레이트 위에 스폿(spot)하였다. 이후 플레이트를 24시간 동안 30±2°C에서 배양하고, 이후 MRS 배지 위 각각 분생자 현탁액의 5μl를 포함하는 감자 덱스트로스 배지(0.8%)를 덮어씌웠다. 이후 플레이트를 일주일 동안 30±2°C에서 호기적으로 배양하고 이후 진균 성장을 관찰하였다.
미생물 희석 방법
KCC-23의 항진균 활성은 약간 변형된 P. Lavermicocca, F. Valerio, A. Visconti, Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products, Appl. Environ. Microbiol. 69 (2003) 634640에 개시된 방법을 사용하여 분석하였다. 간단하게 KCC-23의 발효성 대사물의 190μl를 96 웰에 투입하고 이후 분생자 현탁액 10 μl를 접종하였다. 발효성 대사물이 없는 것을 대조군으로 하였다. 실험에 사용된 모든 플레이트를 96시간 동안 25±2°C에서 배양하였다. 진균 성장은 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 580nm에서 측정하였다. 여기에 대조군 내 진균의 성장은 100% 성장으로 보았다. 이로부터 진균 성장 억제율을 계산하였다.
분리물의 생균제 특성
KCC-23의 pH 내성
1N HCl을 사용하여 MRS 액체배지의 여러 가지 pH(2, 3, 4, 및 5.7)을 준비하고 새로운 KCC-23 배양물을 여러 가지 pH를 갖는 MRS 액체배지에 접종하고 3시간 동안 30±2°C에서 배양하였다. 배양물의 1 ml를 즉시(0시간) 각 튜브로부터 분리하고 멸균수로 10배 단계 희석한 후 BCP 및 MRS 배지에 퍼트렸다. 유사하게 배양물의 1ml를 3시간 이후 각 튜브로부터 분리하고 플레이팅은 BCP 및 MRS 배지를 사용하여 완료했으며, 배양 이후 박테리아 수(CFU/ml)을 기록하였다.
KCC-23의 담즙염 내성
새로운 KCC-23을 0.3%의 우담 및 0.5% 소듐 디옥시콜레이트(DCA) 담즙염(sigma, USA)을 포함하는 MRS 액체 배지에 접종하고 이를 30±2°C에 배양하였다. 부분 표본을 여러 가지 시간 간격으로 추출하고 600nm에서 흡수를 측정하였다. 담즙염이 없는 배지를 대조군으로 하였다. 결과는 대조군에 비해 담즙염 내에서 600nm에서 박테리아의 성장으로 나타냈다.
세포 표면 소수성
KCC-23의 세포 표면 소수성 특성은 약간 변형된 Rosenberg M, Gutnick D, Rosenberg E (1980) Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell-surface hydrophobicity. FEMS Microbiol Lett 9: 2933에 개시된 방법을 사용하여 분석하였다. MRS 액체배지 내 성장된 새로운 KCC-23는 10분 동안 8000 rpm으로 원심분리하고 펠렛으로 수집한 후 PBS로 두 번 세척하였다. 이후 세척된 펠렛은 PBS 내 재현탁하였다. KCC-23 현탁액의 3ml 및 자일렌 또는 클로로폼 1ml는 볼텍싱하여 혼합하고 상분리를 위해 1시간 동안 30±2°C에서 배양하였다. 수상을 수득하고 600 nm에서 이의 흡수를 측정하였으며 하기 식을 사용하여 소수성 %를 계산하였다.
=100 x (OD초기- OD최종)/OD초기,
=ΔOD/OD초기 x100
KCC-23의 자가 응집(AA)
MRS 내 새로 성장한 KCC-23(4X108 세포)를 10분 동안 4°C에서 12000g으로 원심분리하고 수득한 펠렛을 PBS로 두 번 세척하였다. 이후 4ml PBS에 재현탁하고 600nm에서 초기 PD를 수득하고 이후 37°C에서 3시간 동안 배양하였다. 상부 및 하부로부터 1시간 간격으로 부분표본을 추출하고 3.9 ml PBS와 혼합하여 600 nm에서 판독하였다. 응집률은 하기 식에 따라 계산하였다.
%Aa= 1-(At /A0)*100.
At= 여러 시간 간격에(1, 2 및 3 시간) 흡수, A0 - 0 시간에 초기 흡수.
KCC-23에 위액 스트레스
KCC-23의 위액 내성은 Charteris WP, Kelly PM, Morelli L, Collins JK (1998) Development and application of an in vitro methodology to deter mine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract. J Appl Microbiol 84:759768의 방법에 따라 자극된 위액에 대하여 수행하였다. 위액은 물 내 펩신(3mg/ml) 및 소듐 클로라이드(NaCl, 0.5%)를 혼합하여 제조하였다. 용액의 pH는 1N HCl을 사용하여 pH 2 및 3으로 조절하였다. 새로운 배양물 30ml를 20분 동안 6000g으로 4°C에서 원심분리하고 펠렛을 수득 후 K2HPO4 (50mM, 6.5 pH)으로 3회 세척하였다. 이후 펠렛은 동일한 용액 내 재현탁하였다. 현탁액 1ml를 여러 pH의 위액 9ml와 혼합하고 3시간 동안 37°C에서 배양하였다. 총 살아있는 세포를 배양 전 후 세었다.
KCC-23의 프리바이오틱(Prebiotics) 활용
KCC-23의 프리바이오틱 활용은 Zago M, Fornasari ME, Carminati D, Burns P, Sua`rez V, Vinderola G, Reinheimer J, Giraffa G (2011) Characterization and probiotic potential of Lactobacillus plantarum strains isolated from cheeses. Food Microbiol 28:10331040의 방법을 사용하여 분석하였다. MRS 액체배지는 2% 라피노스로 보충하였다. 2% 글루코스로 보충된 MRS 액체배지는 양성 대조군으로 하였다. 밤새 배양된 새로운 배양물(1%)를 프리바이오틱 보충된 액체배지 20 ml에 추가하고 24시간 동안 37°C 및 180 rpm으로 배양하였다. 배양물을 600 nm에서 흡수를 측정하기 위해 각 튜브로부터 추출하였다. 이후 KCC-23 생장율을 하기 식에 따라 계산하였다.
[((MRSp-MRSb)*100)/ MRSp-MRSb)]
MRSp- 라피노스 처리됨, MRSb- 탄소 소스가 없음 (음성 대조군), MRSg- 글루코스 처리됨 (양성 대조군)
항산화제 분석
과산화수소에 대한 내성
KCC-23 분리물을 여러 가지 과산화수소 농도(0.5, 0.1, 1.5 및 2 mM)를 갖는 MRS 액체배지 50 ml를 포함하는 100 ml Erlenmeyer 플라스크 내 생키고 오비탈 배양기 쉐이커에 30±2°C로 배양하였다. 세포 성장은 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 600nm에서 측정하였다. 과산화수소가 없는 것은 대조군으로 하였다. 세포 생장의 증가는 광학 밀도(OD)와 직접적으로 비례한다.
DPPH 분석
KCC-23의 분리물을 3일 동안 150 rpm에서 오비탈 쉐이커 내 MRS 액체배지를 포함하는 멸균 원뿔 플라스크에서 3일 동안 30±2°C에서 배양하였다. 이후, 액체배지를 여과하고 상청액을 15분 동안 8000 rpm으로 원심분리하여 분리하였다. 이러한 상청액을 항산화 분석에 사용하였다. 상청액의 여러 가지 부피를 0.05mM DPPH의 1ml와 혼합하고 30분 동안 상온에서 보관하였다. 이후 흡수를 517nm에서 측정하였다. 물은 블랭크(blank)로, 메탄올은 대조군으로 하였다. 자유 라디칼 제거 활성률을 하기 식에 따라 계산하였다.
%= [1-(ATest-Ablank)/A control] x100.
실험 결과
이온 분리물의 분리 및 형태학적 특성
이탈리안 라이그라스 사료로부터 총 28개 균주를 분리하였으며, 이들 가운데 여러 즙(IRG, 보리, 옥수수 및 MRS)에 성장, 담즙 내성 및 항진균 활성에 기초하여 한 균주를 선별하고 KCC-23으로 명명하였다. KCC-23이 보이는 기초적인 생리-화학적 결과는 그람 양성, 비운동성, 원형, 카탈라제 음성 및 중온성 성질이다.
KCC-23의 분자적 특성
KCC-23의 분자적 특성은 16S rRNA 서열 분석에 기초하여 분석하였다. 이로부터 KCC-23이 Pediococcus pentosaceus 균주임을 확인하였다. 새로운 P. pentosaceus KCC-23를 농업생명공학연구원(KACC)에 기탁하고, 기탁번호 KACC91961P를 부여받았다.
KCC-23의 생화학적 특성
탄수화물을 발효하기 위한 P.pentosaceus KCC-23의 능력은 API 50 CH 키트법을 사용하여 스크리닝 하였다. P.pentosaceus는 cellobios, glucose arabinose, sucrose, mannitol, fructose 및 trehalose를 발효시킨다. 나머지 당은 P.pentosaceus에 의해 발효되지 않는다(표 1).
탄수화물 명칭 P. pentosaceus KCC-23 P. pentosaceus CRAG3*
Glycerol - NA
Erythritol - NA
D-Arabinose +++ +++
D-Ribose - NA
D-Xylose - -
D-Adonitol - -
Methyl- βD-xiloside - NA
D-Galactose ++ +++
D-Glucose +++ +++
D-Fructose ++ ++
D-Mannose - +++
L-Sorbose - NA
L-Rhamnose + ++
Dulcitol - -
Inositol - -
D-Mannitol ++ ++
D-Sorbitol - -
Methyl- αD-mannoside - NA
Methyl- αD-glucoside - NA
N-acetyl glucosamine - NA
Amygdalin - NA
Arbutin - NA
Esculin ferric citrate - NA
Salicin - NA
D-Celiobiose +++ +++
D-Maltose ++ +++
D-Lactose ++ -
D-Melibiose - -
D-Saccharose - NA
D-Trehalose +++ +++
Inulin - -
D-Melezitose - NA
D-Raffinose ++ -
Amidon - NA
Glycogen - NA
Xylitol - NA
Gentiobiose - NA
D-Turanose - NA
D-Lyxose - NA
D-Tagatose - NA
D-Fucose - NA
L-Fucose - NA
D-Arabitol - NA
L-Arabitol - NA
Potassium gluconate - NA
Potassium 2-Ketogluconate +++ NA
Potassium 5-Ketogluconate - NA
+++: 강한 양성 반응, ++: 보통의 양성 반응, -: 음성 반응, NA- 분석되지 않음
*Rishikesh Shukla and Arun Goyal, 2014
항생제 민감도 분석
KCC-23의 항생제 민감도는 항생제 디스크 주변의 억제 직경의 구역을 측정하여 스크리닝 하였다. 직경에 기초하여, 이를 내성 및 민감도로 분류하였다. KCC-23 분리물은 Chloramphenicol, Kanamycin, Nitrofurantoin, Tetracycline, Streptomycin, Ampicillin, Cefoxitin, Dicloxacillin, 및 Cefuroxime에 민감성 및 Sulphafurazole, Colistin methane sulphonate, Gentamicin, Cefalexin 및 Co-Trimoxazole 항생제에 내성을 나타냈다(표 2).
S.No 항생제 명칭 농도
(μg)		 P. pentosaceus KCC-23 P. pentosaceus CRAG3*
1 Chloramphenicol (C) 50 S S
2 Kanamycin (K) 30 S R
3 Nitrofurantoin (NIT) 50 M S
4 Tetracycline (TE) 100 S S
5 Streptomycin (S) 25 S NA
6 Sulphafurazole (SF) 300 R NA
7 Colistin methanesulphonate(CL) 100 R NA
8 Dicloxacillin (D/C) 1 S NA
9 Ampicillin (AMP) 10 S R
10 Amikacin (AK) 30 R R
11 Gentamicin (GEN) 10 R R
12 Cefoxitin (CX) 30 S NA
13 Cefalexin (CN) 30 R NA
14 Cefuroxime (CXM) 30 S NA
15 Co-Trimoxazole (COT) 25 R R
8mm 이하 보통=M, 10mm 이상 민감성=S, R= 저항성, ND=분석되지 않음
*Rishikesh Shukla and Arun Goyal, 2014
KCC-23의 항진균 활성
KCC-23 분리물은 KCC-23 균주 주변의 실험된 진균의 성장을 강하게 억제하였다. 이러한 결과는 KCC-23이 본 연구에 실험된 식품 병원균에 대한 길항성 특징을 갖는 것을 보여준다(도 1). 나아가, 마이크로 희석법을 사용하여 KCC-23에 의한 이차 대사물질의 항진균 활성을 조사하였다. 이러한 결과는 KCC-23 발효성 대사물질이 A. Fumigates (70.79%), P. Chrysogenum (63.30%), P. Roqueforti (53.32%), botrytis elliptica (56.16%) 및 F. Oxysporum (52.10%)의 성장을 지연시키는 것으로 나타났다(도 1F).
pH, 담즙염 내성
KCC-23을 30±2°C에서 위 조건 내 KCC-23의 생존 특성을 확인하기 위해 낮은 pH에 두었다. 콜로니의 수는 MRS 액체배지의 pH가 감소할 때 감소하였다. KCC-23의 초기 수는 pH 5.7, 4.0, 3.0, 및 2.0 각각에 9.3 내지 8.6, 8.3, 7.3 및 5.7 CFU/ml로 감소하였다. 낮은 pH에 대한 KCC-23의 한계(marginal) 감소는 위 조건에서와 같은 KCC-23의 산 내성을 나타냈다(도 2a).
KCC-23은 3시간 동안 0.3% 각각 우담 및 0.5% 소듐 디옥시콜레이트를 포함하는 MRS 배지로 보충하였고, 대조군에 비해 570nm에서 광학 밀도가 감소하였다. 흡수의 증가는 세포 활성의 증가에 직접적으로 비례하고, 여기서 대조군 및 담즙염 보충된 MRS 액체배지 내 흡수의 증가를 관찰하였다. 그러나 대조군과 비교할 때, 담즙염은 독성이므로, 담즙염 보충된 MRS 액체배지에서 세포 활성의 한계 감소가 관찰되었다. 이는 독성 담즙염 내 KCC-23의 생존 능력을 나타냈다(도 2b).
세포 표면 소수성
KCC-23의 세포 표면 소수성의 백분율은 자일렌 및 클로로폼 탄수화물을 사용하여 결정하였다. 소수성의 %는 자일렌 및 클로로폼의 존재 하에 KCC-23으로부터 획득하였고 각각 32.9 ±1.9 및 20.1 ±0.19 %를 나타냈다. 나아가 KCC-23의 잠재적 자가 응집%를 측정하였다. KCC-23의 자가 응집은 시간이 증가함에 따라 각각 1, 2 및 3 시간 후에, 20.1 ± 0.3, 61.1 ± 3.07 및 67.3 ±0.2 %로 증가하였다(도 2c). 3시간 동안 펩신으로 pH 2 및 3의 인공 위액에 KCC-23을 노출시킬 때, 세포 수는 pH 2 및 3 각각에 34.4% 및 21.4%로 감소하였다. 라피노스와 같은 프리바이오틱의 존재 하에 KCC-23의 성장 프로파일을 측정하였다. 이는 라피노스의 63.1 ±3.7%를 보였고, 24시간 이후 대조군으로 사용된 글루코스에 대한 KCC-23에 의해 사용되었다(도 2d).
항산화 활성
KCC-23의 내성은 과산화수소의 여러 가지 농도에 대하여 측정하였다. KCC-23은 24시간 동안 과산화수소의 여러 농도(0.5, 1.0, 및 1.5mM)를 포함하는 MRS에 접종하였고, 이 결과 KCC-23은 여러 농도의 과산화수소에 생존하는 한계 능력을 갖는 것을 보였다. KCC-23 발효 대사물질의 자유 라디칼 제거 능력은 DPPH 방법으로 분석하였다. 이는 사용된 발효 대사물질의 부피 증가와 함께 자유 라디칼 제거 활성이 증가함을 보였다(도 3a 및 도 3b).
농업생명공학연구원 KACC91961P 20140701

Claims (9)

  1. 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주.
  2. 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 포함하는 항균용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 균주는 아스퍼질러스 푸미가테스(Aspergillus Fumigates), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium Chrysogenum), 페니실리움 로케포티(Penicillium Roqueforti), 보트리티스 엘립티카(botrytis elliptica) 및 후자리움 옥시스포럼(Fusarium Oxysporum)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-23 (KACC91961P)균주를 포함하는 항균용 조성물은 식품 조성물, 화장품 조성물, 약학 조성물 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제.
  6. 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 포함하는 사료용 조성물.
  7. 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 첨가하는 것을 특징으로 하는 사일리지 제조방법.
  8. 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) KCC-23 (KACC91961P) 균주를 포함하는 항산화용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스 KCC-23 (KACC91961P) 균주를 포함하는 항산화용 조성물은 식품 조성물, 화장품 조성물, 약학 조성물 제조에 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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