KR20200080629A - 바실러스 서브틸리스를 이용한 식용 효소식품의 제조방법 - Google Patents

바실러스 서브틸리스를 이용한 식용 효소식품의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고농도의 알파아밀라아제(α-amylase)를 가지는 식용 효소식품의 제조방법에 관한 것으로서, 특히 1차 접종으로 내열성이 높은 바실러스 서브틸리스를 대두에 접종하여 고농도의 알파아밀라아제를 생성하게 하고, 2차 접종으로 유산균 및 열을 이용하여 살균함으로써 최종 산물에 미생물학적 안정성(총 세균수 103 cfu/g 미만)을 가지며, 고농도의 효소를 갖는 식용 효소식품의 제조방법에 관한 것이다.

Description

바실러스 서브틸리스를 이용한 식용 효소식품의 제조방법{Manufacturing method for edible enzyme food using Bacillus sbutilis}
본 발명은 바실러스 서브틸리스를 이용하여 고농도의 효소, 특히 고농도의 알파아밀라아제(α-amylase)를 가지는 식용 효소식품의 제조방법에 관한 것으로서, 특히 1차 접종으로 내열성이 높은 바실러스 서브틸리스를 대두에 접종하여 고농도의 알파아밀라아제를 생성하게 하고, 2차 접종으로 유산균 및 열을 이용하여 살균함으로써 최종 산물에 미생물학적 안정성(총 세균수 103 cfu/g 미만)을 가지며, 고농도의 효소를 갖는 식용 효소식품의 제조방법에 관한 것이다.
알파아밀라아제는 인체에서 분비되는 글루코시드를 가수분해하는 효소를 말한다. 글루코시드는 글루코오스를 당부분으로 하는 배당체의 총칭이며, 대부분의 경우, 인간은 글루코시드 형태의 탄수화물을 섭취하여 에너지로 소화한다.
보다 자세하게 말하면, 알파아밀라아제는 다당류에서 α-1,4-글리코시드 결합을 가수분해시켜 글루코오스를 생성하는데, 인간의 침, 췌장 외에도 동물, 식물. 미생물계에 널리 분포한다.
이러한 알파아밀라아제는 인간의 소화 흡수에 있어 중요한 역할을 하는 효소 중 하나이나, 나이가 들어가거나 몸의 항상성이 떨어질 경우, 분비량이 낮아지게 되고, 이로 인하여 소화 흡수율이 떨어지게 되어 음식물이나 생리활성이 있는 물질을 섭취하더라도 흡수되지 않아 섭취대비 적은 효과가 발생하게 된다.
이렇게 될 경우, 소화흡수율을 높이기 위하여 흔히 발효식품을 섭취하거나 유익 미생물이 함유된 프로바이오틱스(Probiotics) 제품(건강기능식품 기준 108 cfu/g 내지 1010 cfu/g) 또는 효소식품을 섭취하는 방법을 사용하여 상황을 개선하고자 하지만 몇 가지 문제점이 있다.
프로바이오틱스의 경우, 섭취 시 유익균이 분비하는 알파아밀라아제 및 다른 소화효소를 통하여 소화흡수율이 개선될 수 있으나, 이는 살아있는 고농도(108 cfu/g 내지 1010 cfu/g)의 생균을 이용하는 방법으로 이식수술환자, 선천성/후천성 면역결핍증 환자, 항암치료를 받는 환자들과 같이 면역 결핍이 유도되어 있거나, 영아와 같이 면역체계가 완성되지 않은 상태 또는 극도의 피로에 의하여 면역력이 저하된 상태에서 섭취 시 균혈증(Bacteremia)을 일으킬 수 있는 위험이 있다.
실제로 식약처에서 발표한 2012 내지 2017년 국내 프로바이오틱스 부작용 사례 집계건수는 668건으로 매년 100건이 넘는 부작용 사례를 남기고 있다.
알파아밀라아제를 안정적으로 섭취하는 다른 방법은 발효식품을 섭취하는 것이나, 대부분의 발효식품의 경우 저온숙성을 하며 숙성기간이 오래되기 때문에 저온으로 인하여 미생물의 활동이 저해되어 분비하는 알파아밀라아제의 양이 많지 않으며, 숙성기간이 경과함에 따라 점차적으로 효소의 능력을 상실한 경우가 대부분이다.
효소식품의 경우, 한국의 식품공전에 규정된 내용을 보면 "식물성 원료에 식용미생물을 배양시켜 효소를 다량 함유하게 하거나 식품에서 효소함유부분을 추출한 것 또는 이를 주원료로 하여 가공한 것"을 말하며, 대장균(Escherichia coli.) 불검출 조건 외 별다른 미생물학적 기준은 없다.
보통, 효소식품의 경우, 생산단가를 낮추기 위하여 높은 농도의 알파아밀라아제 및 프로테아제(Protease)를 생산하는 아스퍼질러스속(Aspergillus sp.)과 같은 국균을 곡물에 접종하여 발효하는 방법으로 제조되며, 이 또한 고농도(108 cfu/g 내지 1010 cfu/g)의 생균을 포함하게 된다.
아스퍼질러스속과 같은 국균은 높은 농도의 알파아밀라아제 및 프로테아제를 생산 할 수 있으나, 진균이므로 잘 사멸하지 않는다.
문제는 프로바이오틱스 부작용 사례와 같이 생균을 이용하기 때문에 앞서 말한 이식수술환자, 선천성/후천성 면역결핍증 환자, 항암치료를 받는 환자들과 같이 면역 결핍이 유도되어 있거나 영아와 같이 면역 체계가 완성되지 않은 상태 또는 극도의 피로에 의하여 면역력이 저하된 상태에서 섭취시 균혈증을 일으킬 수 있고, 아스퍼질러스속과 같은 국균은 진균이므로 일반적인 프로바이오틱스에 의한 균혈증 보다 더욱 심각한 수준의 균혈증을 일으킬 수 있다는 것이다.
한국등록특허 제10-1866468호(발명의 명칭: 미생물 곡물 배양을 통해 얻은 효소 농축 발효물을 이용한 효소식품 및 다이어트 식품과 이들의 제조방법)의 경우 백국(Aspergillus kawachi)및 황국(Aspergillus oryzae)을 사용하여 발효물을 제조 후 여과막 여과를 통하여 해당 문제점을 해결한 것으로 생각되나, 이 경우, 효소 농축액을 여과하여야 하므로 그에 따른 고가의 비용 및 시설이 필요한 문제점이 있고 여과 후 배양 배지로 사용되었던 대두가 폐기물이 되는 등의 문제점이 있다.
본 발명은 1차 접종으로 내열성이 높은 바실러스 서브틸리스를 대두에 접종하여 고농도의 알파아밀라아제를 생성하게 하고, 2차 접종으로 유산균 및 열을 이용하여 살균함으로써 최종 산물에 미생물학적 안정성(총 세균수 103 cfu/g 미만)을 가지며, 고농도의 효소를 갖는 식용 효소식품의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스를 이용한 효소식품의 제조방법은, (1) 발효의 대상이 되는 발효원물 준비단계; (2) 준비된 발효원물에 발효원물 총 중량을 기준으로 3 내지 10배량의 물을 첨가하고 바실러스 서브틸리스를 1X107 내지 1X109 cfu/㎖로 1차 접종하고, 35 내지 45℃의 온도에서 24 내지 168시간 동안 발효시켜 1차 발효산물을 수득하는 1차 발효단계; (3) 1차 발효산물에 유산균을 1X107 내지 1X109 cfu/㎖로 2차 접종하고, 35 내지 45℃의 온도에서 24 내지 168시간 동안 발효시켜 2차 발효산물을 수득하는 2차 발효단계; 및 (4) 2차 발효산물을 50 내지 70℃의 온도에서 20 내지 40분 동안 저온살균시키는 저온살균단계;를 포함한다.
발효원물은 대두 분말, 대두 분쇄물, 탈지 대두 분물, 탈지 대두 분쇄물 또는 이들 중 2 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발효원물일 수 있다.
발효원물은 MgSO4, 글루코스 및 K2HPO4를 더 포함할 수 있다.
바실러스 서브틸리스는 바실러스 서브틸리스 엘에스(Bacillus subtilis LS)(KFCC11483P), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(ATCC 19659), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 12513), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 12149) 및 이들 중 2 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
유산균은 락토바실러스 플랜타럼 엘에스-65(Lactobacillus plantarum LS-65)(KCCM 80199), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 페르멘튬(Lactobacillus fermentum), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophillus), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 및 이들 중 2 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
1차 발효단계 이전에 발효원물을 멸균시키는 멸균단계를 더 포함할 수 있다.
저온살균단계 이후, 2차 발효산물을 열풍건조 후 분말 형태로 가공하는 후처리단계를 더 포함할 수 있다.
열풍건조는 40 내지 60℃의 온도의 열풍으로 38 내지 58시간 동안 건조시키는 것에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 1차 접종으로 내열성이 높은 바실러스 서브틸리스를 대두에 접종하여 고농도의 알파아밀라아제를 생성하게 하고, 2차 접종으로 유산균(Lactobacillus plantarum LS-65) 및 열을 이용하여 살균함으로써 최종 산물에 미생물학적 안정성(총 세균수 103 cfu/g 미만)을 가지며, 고농도의 효소를 갖는 식용 효소식품의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 미생물 사이의 상호작용 및 저온살균을 이용하여 알파아밀라아제 효소의 손실 없이 미생물학적으로 안전한(총 세균수 103 cfu/g 미만) 효소식품을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 공정단계별 발효산물의 pH를 나타낸 그래프이다.
도 2는 공정단계별 발효산물의 알파아밀라아제 효소활성을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스를 이용한 효소식품의 제조방법은, (1) 발효의 대상이 되는 발효원물 준비단계; (2) 준비된 발효원물에 발효원물 총 중량을 기준으로 3 내지 10배량의 물을 첨가하고 바실러스 서브틸리스를 1X107 내지 1X109 cfu/g로 1차 접종하고, 35 내지 45℃의 온도에서 24 내지 168시간 동안 발효시켜 1차 발효산물을 수득하는 1차 발효단계; (3) 1차 발효산물에 유산균을 1X107 내지 1X109 cfu/g로 2차 접종하고, 35 내지 45℃의 온도에서 24 내지 168시간 동안 발효시켜 2차 발효산물을 수득하는 2차 발효단계; 및 (4) 2차 발효산물을 50 내지 70℃의 온도에서 20 내지 40분 동안 저온살균시키는 저온살균단계;를 포함함을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 따라 수득되는 효소식품은 미생물학적 안전성(총 세균수 103 cfu/g 이하)이 확보되고, 고농도의 알파아밀라아제를 포함함을 특징으로 한다.
(1)의 발효원물 준비단계는 발효의 대상이 되는 발효원물을 준비하는 단계로서, 발효원물은 대두 분말, 대두 분쇄물, 탈지 대두 분물, 탈지 대두 분쇄물 또는 이들 중 2 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발효원물일 수 있다.
상기 발효원물은 바실러스 서브틸리스의 분열을 촉진하는 MgSO4, 먹이로써 기능하여 원물의 발효를 촉진시키는 글루코스 및 바실러스 서브틸리스의 대사활성을 높여 효소분비를 촉진하는 K2HPO4를 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 발효원물은 10 내지 30중량%의 글루코스, 0 내지 10중량%의 MgSO4, 0 내지 10중량%의 K2HPO4 및 발효원물로서의 대두를 잔량으로 포함할 수 있다.
(2)의 1차 발효단계는 준비된 발효원물에 발효원물 총 중량을 기준으로 3 내지 10배량의 물을 첨가하고 바실러스 서브틸리스를 1X107 내지 1X109 cfu/g로 1차 접종하고, 35 내지 45℃의 온도에서 24 내지 168시간 동안 발효시켜 1차 발효산물을 수득하는 것으로 이루어진다. 1차 발효단계는 내열성이 우수한 것으로 알려져서 멸균처리는 어려우나, 효소, 특히 알파아밀라아제의 생산능이 우수한 것으로 알려진 바실러스 서브틸리스로 발효원물로서의 대두를 발효시켜 효소, 특히 알파아밀라아제 함량이 높은 1차 발효산물을 수득한다.
이때 사용되는 바실러스 서브틸리스는 바실러스 서브틸리스 엘에스(Bacillus subtilis LS)(KFCC11483P), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(ATCC 19659), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 12513), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 12149) 및 이들 중 2 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바실러스 서브틸리스는 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 엘에스(Bacillus subtilis LS)(KFCC11483P)일 수 있다.
1차 발효단계 이전에 발효원물을 멸균시키는 멸균단계를 더 포함할 수 있다. 이때 사용되는 멸균은 바람직하게는 고압멸균일 수 있으며, 고압멸균은 예를 들어 120 내지 130℃에서 30분 내지 2시간 동안의 열처리에 의하여 수행될 수 있다. 이러한 멸균단계는 아직 발효원물이 1차 발효 및/또는 2차 발효가 수행되지 않았기에 발효산물 중에 효소 등이 다량으로 포함되어 있지 않아 효소의 손실 내지는 실활이 일어나지 않기 때문에 실시가 가능하다.
(3)의 2차 발효단계는 1차 발효산물에 유산균을 1X107 내지 1X109 cfu/g로 2차 접종하고, 35 내지 45℃의 온도에서 24 내지 168시간 동안 발효시켜 2차 발효산물을 수득하는 것으로 이루어지며, 이 유산균을 사용한 2차 발효단계에 의하여 발효산물의 pH를 증가시키고, pH의 증가에 의하여 1차 발효단계에서 사용된 내산성이 매우 낮은 바실러스 서브틸리스를 사멸시키도록 한다.
이때 사용되는 유산균은 식물성 유산균으로서, 식물성 유산균은 유산을 강력하게 생산하여 바실러스 서브틸리스에 대하여 살균능력이 있는 것이며, 통상적으로 바실러스속(Bacillus sp.)은 열 살균 시 내생포자(Endo-spore)를 생성하여 열 살균 시에도 상대적으로 높은 온도에서 살아남기 때문에 본 발명에서는 이에 대한 보완방법으로 유산을 강력하게 생성하는 유산균 배양액을 투입하여 pH를 3.5 내지 4.0 사이로 낮출 수 있도록 하여 바실러스속이 사멸할 수 있는 환경을 조성하도록 유산균에 의한 2차 발효를 수행하며, 특히 바람직하게는, 락토바실러스 플랜타럼 엘에스-65(Lactobacillus plantarum LS-65)(KCCM 80199), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 페르멘튬(Lactobacillus fermentum), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophillus), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 및 이들 중 2 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
(4)의 저온살균단계는 2차 발효산물을 50 내지 70℃의 온도에서 20 내지 40분 동안 저온살균시키는 것으로 이루어지며, 저온살균을 통하여 바실러스 서브틸리스에 의해 생산되어 발효산물 중에 고농도로 포함된 효소, 특히 열처리를 통한 알파아밀라아제의 손실을 최소화시켜 알파아밀라아제 함량이 높은 발효식품을 수득할 수 있다.
저온살균단계 이후, 2차 발효산물을 열풍건조 후, 분말 형태로 가공하는 후처리단계를 더 포함할 수 있다. 후처리단계를 통하여 효소식품의 유통 및 사용을 편리하게 할 수 있다.
이때, 열풍건조는 40 내지 60℃의 온도의 열풍으로 38 내지 58시간 동안 건조시키는 것에 의해 수행될 수 있다.
또한, 1차 발효에 사용되는 바실러스 서브틸리스나 2차 발효에 사용되는 유산균은 종균을 배양하여 액체 바실러스 서브틸리스 또는 유산균을 농축 및 동결건조시켜 부형제를 첨가 후, 고농도의 미생물 분말로 만들어 사용할 수 있다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다.
이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안될 것이다.
<제조예 1> 바실러스 서브틸리스의 배양
바실러스 서브틸리스의 배양배지는 통상 영양배지(Nutrient broth)를 사용하며, 가열멸균은 통상의 미생물배지 살균조건인 121℃에서 15분 이상 하며, 바실러스 서브틸리스의 접종량은 1X105 내지 1X106 cfu/㎖, 35 내지 40℃에서 12 내지 18시간 배양하며, 배양 후의 바실러스 서브틸리스의 생균수는 1X109 내지 1X1010 cfu/㎖ 범위를 나타내며 원심분리에 의해 농축한 바실러스의 생균수는 1X1011 내지 7X1012 cfu/㎖을 나타낸다. 이를 동결건조하여 분말상의 바실러스 서브틸리스를 사용할 경우는 통상 분말조성물에 사용되는 가수량의 1 내지 10%(v/w)를 첨가하여 사용하며, 이때 첨가된 바실러스 서브틸리스의 생균수는 1X107 내지 1X109 cfu/g으로 한다.
<제조예 2> 유산균의 배양
유산균의 배양배지는 통상 MRS배지를 사용하며, 가열멸균은 통상의 미생물배지 살균조건인 121℃에서 15분 이상 하며, 유산균 접종량은 1X105 내지 1X106 cfu/㎖, 40 내지 45℃에서 12 내지 18시간 배양하며 배양 후의 유산균의 생균수는 1X109 내지 1X1010 cfu/㎖ 범위를 나타내며, 원심분리에 의해 농축한 유산균의 생균수는 1X1011 내지 5X1012 cfu/㎖을 나타낸다. 이를 동결건조하여 분말상의 유산균을 사용할 경우는 통상 분말조성물에 사용되는 가수량의 1 내지 10%(v/w)를 첨가하여 사용하며 이때 첨가된 식물성 유산균의 생균수는 1X107 내지 1X109 cfu/g으로 한다.
<제조예 3> 발효원물 제조
발효원물은 대두조성물로서, 대두, 탈지대두분, 대두분, 대두파쇄물 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으며, 그 혼합비에는 제한이 없다. 발효원물(80 내지 90중량%), MgSO4(0 내지 10중량%), 글루코스(10 내지 30중량%), K2HPO4(0 내지 10중량%)로 사용되며, 발효에 사용하는 균주에 따라 MgSO4 및 K2HPO4의 경우 사용하지 아니할 수 있으며, 발효원물은 함수량 8% 미만을 사용한다. 탈지대두, 대두분을 사용 시 50 mesh 이하의 크기로 사용한다. 준비된 발효원물에 증류수 혹은 정제수를 3 내지 10배 가수하고 NK증자기를 회전시켜 조성물을 현탁 후, 121℃에서 1시간 멸균한다.
<실험예 1> 1차 접종 및 발효
멸균이 완료된 발효원물을 35 내지 45℃로 냉각하고, 바실러스 서브틸리스 분말 혹은 종균배양액 희석액을 1X107 내지 1X109 cfu/㎖이 되도록 하여 가수량의 1 내지 10%(v/w)를 접종한다. 바람직하게 발효온도는 40℃ 발효시간은 72시간이 가장 적절하다.
<실험예 2> 2차 접종 및 발효
1차 발효가 완료되어 수득된 1차 발효산물에 유산균 분말 혹은 종균배양액 희석액을 1X107 내지 1X109 cfu/㎖이 되도록 하여 가수량의 1 내지 10%(v/w)를 접종한다. 바람직하게 발효온도는 40℃ 발효시간은 48시간이 가장 적절하다.
<실험예 3> 저온살균 및 가공
2차 발효 및 살균이 완료되어 수득된 2차 발효산물은 60℃에서 30분 저온살균하고 30℃ 이하로 냉각 후, 감압 열풍건조기 혹은 상압 열풍건조기를 이용하여 50 내지 60℃에서 48시간 건조한다. 건조가 완료된 2차 발효산물은 핀밀(pin mill)을 이용하여 50 mesh 이하의 크기로 분쇄하여 사용한다.
본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 제조한 고농도의 알파아밀라아제를 함유하는 효소식품의 제조 방법을 포함한다.
<실시예 1>
1. 바실러스 서브틸리스의 배양
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis LS)(KFCC11483P)를 121℃에서 15분 이상 멸균된 영양배지에 1X105 내지 1X106 cfu/㎖로 접종하여 36℃에서 15시간 진탕배양(100 rpm) 하였다. 배양이 끝난 바실러스 서브틸리스는 원심분리를 이용하여 농축하여 동결건조 시킨 후, 포도당, 유당 등의 당류를 첨가시켜 고농도의 바실러스 서브틸리스 분말을 통상의 방법에 준하여 제조하였으며, 이때 바실러스 서브틸리스의 개체수는 1.1X1011 cfu/g 이었다.
2. 유산균의 배양
유산균인 락토바실러스 플랜타럼 엘에스 65(Lactobacillus plantarum LS-65)(KCCM 80199)를 121℃에서 15분 이상 멸균된 MRS배지에 1X105 내지 1X106 cfu/㎖로 접종하여 40℃에서 16시간 진탕배양(100 rpm) 하였다. 배양이 끝난 유산균은 원심분리를 이용하여 농축하여 동결건조 시킨 후, 포도당, 유당 등의 당류를 첨가시켜 고농도의 유산균 분말을 통상의 방법에 준하여 제조하였으며, 이때 유산균의 개체수는 1.0 내지 1.2X1011 cfu/g 이었다.
3. 발효원물 제조
함수량 7%의 핀밀을 이용하여 50 mesh 이하로 분쇄된 대두 분말을 이용하여 대두 분말 80중량%, 글루코스 20중량%로 조성된 분말조성물을 제조하여 증류수를 10배 가수했다. NK증자기를 회전시켜 혼합 후, 121℃에서 60분간 멸균했다.
4. 1차 접종 및 발효
멸균이 완료된 배양액을 38℃로 냉각하고 1.0X108 cfu/g로 희석된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis LS)(KFCC11483P) 1중량% 접종 후, 38℃에서 72시간 배양하였다.
5. 2차 접종 및 발효
1차 발효 후 수득된 1차 발효산물에 1.0X1010 cfu/g로 희석된 유산균 락토바실러스 플랜타럼 엘에스 65(Lactobacillus plantarum LS-65)(KCCM 80199) 1중량%를 접종 후 38℃에서 48시간 배양하였다.
6. 저온살균 및 가공
2차 발효가 완료되어 수득된 2차 발효산물을 60℃에서 30분 살균 후, 30℃ 이하로 냉각했다. 냉각된 2차 발효산물을 감압 열풍건조기에 넣고 50℃에서 48시간 건조하여 수분이 5% 미만이 될 때까지 건조하고 건조가 완료된 생성물질 조각은 핀밀을 이용하여 50 mesh 이하의 크기로 분쇄하여 고농도의 알파아밀라아제를 포함하는 효소식품 분말을 수득하였다.
<시험예> 발효 및 분석 조건
상기 실시예에서 실시한 바와 같은 조건으로 고농도의 알파아밀라아제 효소식품을 제조하며 매 24시간 마다 시료를 채취하여 바실러스 서브틸리스 수, 유산균 수, pH 및 알파아밀라아제 효소 활성을 측정하였으며, 최종적으로 얻은 고농도의 알파아밀라아제를 포함하는 효소식품 분말에 대하여 수분 함량, 알파아밀라아제 효소 활성 등을 측정하였다. 측정 방법은 식품공전에 기초하여 측정하였다.
<방법>
1) 발효시료 채취
1차 접종 전, 24, 48, 72시간 발효 중인 발효원물의 샘플을 스팀(steam) 노즐을 통하여 50 ㎖ 코니컬튜브(Cornical-tube)에 각 30 ㎖씩 채취하였다.
2) 바실러스 서브틸리스 수 측정
바실러스 서브틸리스 수 측정은 영양한천(Nutriunt Agar) 배지를 이용하여 측정하였으며, 90 ㎖의 생리식염수(NaCl 0.85%)를 담아 멸균한 사각병에 채취한 시료 10 ㎖을 넣어 혼합한 용액에서 다시 1 ㎖을 취해 생리식염수 9 ㎖가 들어있는 멸균시험관에 넣어 희석하는 방식으로 각각 106, 107, 108으로 희석하여 37℃ 배양기에서 1 내지 2일 뒤집어서 평판배양한 후 균수를 측정하였다.
3) 유산균 수 측정
유산균 수 측정은 BCP 첨가 평판측정용 한천배지를 이용하여 측정하였으며, 90 ㎖의 생리식염수(NaCl 0.85%)를 담아 멸균한 사각병에 채취한 시료 10 ㎖을 넣어 혼합한 용액에서 다시 1 ㎖을 취해 생리식염수 9 ㎖가 들어있는 멸균시험관에 넣어 희석하는 방식으로 각각 106, 107, 108으로 희석하여 37℃ 배양기에서 1 내지 2일 뒤집어서 평판배양한 후, 균수를 측정하였다.
4) 총 세균수 측정
총 세균수 측정은 저온 살균공정 및 건조 후 분말에 대해서만 측정하였다. 측정시 일반 한천배지를 이용하여 측정하였으며, 90 ㎖의 생리식염수(NaCl 0.85%)를 담아 멸균한 사각병에 채취한 시료 10 ㎖을 넣어 혼합한 용액에서 다시 1 ㎖을 취해 생리식염수 9 ㎖가 들어있는 멸균시험관에 넣어 희석하는 방식으로 각각 101, 102, 103으로 희석하여 37℃ 배양기에서 1 내지 2일 뒤집어서 평판배양한 후, 균수를 측정하였다.
5) 알파아밀라아제 활성 측정
알파아밀라아제 활성 측정은 식품공전의 효소식품에 대한 시험법에 의하여 실시하였다. 시험용 시험관에 1% 가용성 전분용액 5 ㎖, 맥바인 완충액(pH 7.0) 13 ㎖와 0.1% NaCl 용액 1 ㎖를 넣고 37℃로 가온하고 시료 1 ㎖를 넣은 후, 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 후, 100℃에서 10분간 가열하여 시료를 불활성화시킨 다음, 실온으로 냉각하였고, 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액 중의 환원당 량을 측정하였다. 별도로 100℃에서 10분간 가열하여 활성을 잃은 시료 1 ㎖를 위와 같이 조작하여 공시험용으로 하였다. 시료 반응액 0.4 ㎖에 DNS 용액 1.2 ㎖를 넣은 다음 100℃에서 5분간 가열하였고 상온으로 냉각한 후, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 D-glucose를 사용하여 검량선을 작성하였고, 알파아밀라아제의 활성도(unit/g)는 입국 1 g이 함유하는 역가로 1분간 효소가 반응하여 생성되는 D-glucose의 양을 검량선을 이용하여 D-glucose의 ㎍수로 환산하여 계산하였다.
6) pH 측정
유산균수 측정에 사용하고 남은 사각병의 혼합액을 pH meter로 측정하여 pH 값을 나타내었다
7) 2차 발효산물의 건조
1차 접종 후 72시간 발효. 2차 접종 후 48시간 발효가 완료된 2차 발효산물을 60℃에서 30분 살균 후, 30℃로 냉각 후 회수하여 감압 열풍건조기에 넣고 50℃에서 48시간 건조하여 수분이 5% 미만이 될 때까지 건조하고 건조가 완료된 발효산물은 핀밀을 이용하여 50 mesh 이하의 크기로 분쇄하여 고농도의 알파아밀라아제를 포함하는 효소식품 분말을 얻었다.
<시험결과>
배양시간, 공정별 pH 및 유산균, 바실러스, 효모 균수의 변화의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
1차 접종 시 바실러스 서브틸리스의 수가 증가함에 따라 pH가 증가하였으며, 2차 접종 후, 유산균의 작용으로 pH가 하강하면서 바실러스의 생균수가 줄어들었음을 확인하였다.
저온 살균 후, 총 세균수는 101 으로 거의 모든 미생물이 살균되었으며, 건조 후, 102 으로 증가된 것은 수분이 휘산됨에 따라 배양물의 농도가 증가하기 때문인 것으로 여겨진다.
발효시간 및 공정별 알파아밀라아제 농도를 하기 표 2에 나타내었다.
Figure pat00002
알파아밀라아제는 바실러스 서브틸리스의 배양시간이 길어짐에 따라 분비량이 증가하였으며, 유산균을 접종한 2차 접종 후에도 느린 속도로 증가하였으나, 저온살균 후 다시 감소함을 확인하였다. 2차 접종 후 증가한 알파아밀라아제의 경우, 유산균의 분비물로 여겨진다.
건조 후, 알파아밀라아제의 수가 크게 증가한 것은 열에 대한 손실 없이 수분만이 휘산되어 발효산물이 농축되었기 때문인 것으로 여겨진다.
<실시예 2>
실시예 1의 된장에서 분리된 바실러스 서브틸리스인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis LS)(KFCC11483P) 외 3종의 바실러스 서브틸리스 즉, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(ATCC 19659), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 12513) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 12149)를 사용하여 알파아밀라아제 활성을 비교하였다.
영양배지 1ℓ을 통상의 미생물배지 멸균조건인 121℃에서 15분 가열하여 멸균하고 37℃까지 냉각 후, 상기 4개 균주 희석액(1.X106 cfu/㎖)을 각 1중량% 접종하여, 37℃에서 18시간 배양하였다.
배양이 종료된 배양액은 원심분리기를 이용하여 10,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 알파아밀라아제가 녹아 있는 상등액 만을 취하였으며, 상등액은 한외여과(Ultrafiltration ; Amicon ultracel Membrane MWCO5kDa)을 이용하여 농축하고 동결건조를 통해 수분을 제거하여 동결건조물로 만들었으며, 다시 동결건조물 중량의 10배에 해당하는 증류수를 가수하여 효소 시험액을 제조하였다.
<실험예 4> 각 균주의 알파아밀라아제 활성 측정
각 균주별 10배 희석 효소 시험액을 5 ㎖ 씩 2세트 준비하고, 1세트의 효소시험액은 대조구로써 아무런 처리도 하지 않았으며, 다른 1세트의 시험액은 60℃에서 1시간 가열처리하여 내열성에 대한 효소의 실활정도를 확인하였다.
효소의 전분 분해능은 식품공전에 따라 진행하였다. 먼저 시험용 시험관에 1% 가용성 전분용액 5 ㎖, 맥바인 완충액(pH 7.0) 13 ㎖와 0.1% NaCl용액 1 ㎖를 넣고 37℃로 가온하고 시료 1 ㎖를 넣은 후, 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응 후, 100℃에서 10분간 가열하여 시료를 불활성화시킨 다음 실온으로 냉각하였고, 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액 중의 환원당 양을 측정하였다. 별도로 100℃에서 10분간 가열하여 활성을 잃은 시료 1 ㎖를 위와 같이 조작하여 공시험용으로 하였다. 시료 반응액 0.4 ㎖에 DNS용액 1.2 ㎖를 넣은 다음, 100℃에서 5분간 가열하였고 상온으로 냉각한 후, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 D-glucose를 사용하여 검량선을 작성하였고, 알파아밀라아제의 활성도(unit/g)는 입국 1 g이 함유하는 역가로 1분간 효소가 반응하여 생성되는 D-glucose의 양을 검량선을 이용하여 D-glucose의 ㎍수로 환산하여 계산하였다. 각 균주별 알파아밀라아제 효소 동결건조물 및 그 열처리에 대한 시험결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure pat00003
상기 시험결과와 같이 각 균주배양 후, 원심분리하고 상등액에 존재하는 효소를 농축 및 동결건조한 효소분말을 시험한 결과, 바실러스 서브틸리스 LS(KFCC 11483P)의 효소분말에서 가장 높은 알파아밀라아제 효소활성을 확인하였으며, 가열 처리 시에도 바실러스 서브틸리스 LS(KFCC 11483P)의 효소가 실활되지 않는 것을 확인하였다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
(도면 부호 없음)

Claims (8)

  1. (1) 발효의 대상이 되는 발효원물 준비단계;
    (2) 준비된 발효원물에 발효원물 총 중량을 기준으로 3 내지 10배량의 물을 첨가하고 바실러스 서브틸리스를 1X107 내지 1X109 cfu/g로 1차 접종하고, 35 내지 45℃의 온도에서 24 내지 168시간 동안 발효시켜 1차 발효산물을 수득하는 1차 발효단계;
    (3) 1차 발효산물에 유산균을 1X107 내지 1X109 cfu/㎖로 2차 접종하고, 35 내지 45℃의 온도에서 24 내지 168시간 동안 발효시켜 2차 발효산물을 수득하는 2차 발효단계; 및
    (4) 2차 발효산물을 50 내지 70℃의 온도에서 20 내지 40분 동안 저온살균시키는 저온살균단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스를 이용한 효소식품의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 발효원물이 대두 분말, 대두 분쇄물, 탈지 대두 분물, 탈지 대두 분쇄물 또는 이들 중 2 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발효원물임을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스를 이용한 효소식품의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 발효원물이 MgSO4, 글루코스 및 K2HPO4를 더 포함함을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스를 이용한 효소식품의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 바실러스 서브틸리스가 바실러스 서브틸리스 엘에스(Bacillus subtilis LS)(KFCC11483P), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(ATCC 19659), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 12513), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 12149) 및 이들 중 2 이상의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스를 이용한 효소식품의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 유산균이 락토바실러스 플랜타럼 엘에스-65(Lactobacillus plantarum LS-65)(KCCM 80199), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 페르멘튬(Lactobacillus fermentum), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophillus), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 및 이들 중 2 이상의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스를 이용한 효소식품의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 1차 발효단계 이전에 발효원물을 멸균시키는 멸균단계를 더 포함함을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스를 이용한 효소식품의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 저온살균단계 이후, 2차 발효산물을 열풍건조 후 분말 형태로 가공하는 후처리단계를 더 포함함을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스를 이용한 효소식품의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 열풍건조가 40 내지 60℃의 온도의 열풍으로 38 내지 58시간 동안 건조시키는 것에 의해 수행되는 것임을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스를 이용한 효소식품의 제조방법.
KR1020180170266A 2018-12-27 2018-12-27 바실러스 서브틸리스를 이용한 식용 효소식품의 제조방법 KR20200080629A (ko)

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