CN102223806A - 利用芽孢杆菌菌株制备发酵茶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用从韩国传统发酵食品中分离出的芽孢杆菌制备具有优良风味的发酵茶的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种无病原体或其它微生物污染的具有改善风味的发酵茶的制备方法。
背景技术
一般而言，茶经微生物发酵后，其味道、气味和色泽会因为微生物的代谢作用而发生改变，从而带来风味的改变。也就是说，通过微生物所特有的酶对茶中的碳水化合物、蛋白质、儿茶素和矿物质的代谢作用，茶的有机酸、多酚等的组成发生了改变，因而导致味道、气味、色泽的改变。通过发酵产生的茶风味的变化取决于相关的微生物、茶成分的含量、无蛋白质发酵肉汤的组成、发酵温度、发酵时间等。
因此，为了生产优质的发酵茶，重要的是适宜微生物的选择、无蛋白质发酵肉汤的组成、以及发酵温度和时间的确定等。通常，通过将经热处理的茶叶单独放在容器中来获得发酵茶。因此，发酵会受到空气传播的微生物或非特定厌氧微生物或其他微生物的影响，尤其是附着于茶叶上的真菌。特别是，致病微生物如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等产生的毒素以及真菌产生的毒素如黄曲霉毒素可能是有害的。此外，提供具有可再现口味的茶是有难度的，因为不能控制微生物的种类和数量。
发明内容
技术问题
本发明旨在提供一种具有优良风味并免于致病菌的发酵茶，利用从韩国传统发酵食品包括酱油(soy sauce)、豆瓣酱(soybean paste)、jeotgal(发酵鱼类)、baechu(大白菜)泡菜、萝卜泡菜、含水泡菜等中分离得到的微生物发酵绿茶制备而得。
问题的解决方案
总的来说，本发明提供了一种制备发酵茶的方法，包括：(i)制备芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株；(ii)稳定所述芽孢杆菌菌株；和(iii)通过用稳定的芽孢杆菌菌株处理来发酵茶叶。
芽孢杆菌菌株可以选自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
其他的特征和方面将通过以下详细的说明与权利要求来体现。
本发明的积极效果
本发明使得制备的发酵茶具有优良的风味并具有缓解涩味和苦味的改善特性以及免于病原体或其他不良微生物的侵害。
本发明的实施方式
在此，“无蛋白质发酵肉汤”是指用不含蛋白质粉的培养基发酵的菌株的混合物。
在此，“含蛋白质发酵肉汤”是指用含蛋白质粉的培养基发酵的菌株的混合物。
“从发酵食品分离的芽孢杆菌菌株”在此是指从发酵食品如酱油、豆瓣酱、jeotgal(发酵鱼类)、baechu(大白菜)泡菜等中分离得到的芽孢杆菌菌株。尤其是，所述发酵食品可以是韩国传统的发酵制品。
本发明提供了一种制备发酵茶的方法，包括：(i)制备芽孢杆菌；(ii)稳定芽孢杆菌；和(iii)通过用稳定的芽孢杆菌菌株处理来发酵茶叶。
在本发明的一个实施方式中，芽孢杆菌菌株可以选自地衣芽孢杆菌F1017、地衣芽孢杆菌F1232、地衣芽孢杆菌F1267、地衣芽孢杆菌F1268、地衣芽孢杆菌F1200、短小芽孢杆菌F1337、索诺拉沙漠芽孢杆菌F1005、枯草芽孢杆菌F1004、枯草芽孢杆菌F1236和枯草芽孢杆菌F1279。特别地，地衣芽孢杆菌F1017可以用于味道方面。该菌株保藏于韩国食品研究院(KFRI)，并且可以轻易的从KFRI处获得。
在本发明的一个实施方式中，在步骤(i)中，对含有芽孢杆菌菌株的培养基离心处理后，用盐水清洗除去培养基。培养基可以完全除去因为其可能影响茶的风味。在芽孢杆菌菌株被冻干成粉末形式的实例中，对含有芽孢杆菌菌株的培养基进行离心的步骤和用盐水清洗的步骤可以省略，并且马上进行步骤(ii)的稳定芽孢杆菌菌株。
在本发明的另一个实施方式中，在步骤(ii)中，可以通过在无菌的不含蛋白质粉的无蛋白质发酵肉汤中培养芽孢杆菌菌株来稳定芽孢杆菌菌株。
特别地，不含蛋白质粉的无蛋白质发酵肉汤可以含有砂糖、果糖和水。在菌株稳定过程中不添加蛋白质粉的原因是为了避免微生物分解产生的恶臭。
本发明的制备方法可以进一步包括在步骤(iii)之前，向含有稳定的芽孢杆菌菌株的培养基中添加蛋白质粉。通过向含有稳定的芽孢杆菌菌株的培养基中添加蛋白质粉，而非是在菌株稳定过程中添加，可以制得具有优良风味的发酵茶。
蛋白质粉是指蛋白质被制成粉末形式，可以使用任意蛋白质成分。例如，可以利用动物蛋白质粉或植物蛋白质粉。动物蛋白质粉的例子可以包括牛肉粉、牛奶蛋白质粉等。从安全方面考虑植物蛋白质粉可能更优选，因为牛肉粉有一定的风险如疯牛病。
植物蛋白质粉可以是大豆粉，大豆粉是指粉末形式的大豆。大豆粉的例子可以包括大豆蛋白质粉、大豆卵磷脂粉、大豆肽粉等。
在步骤(iii)中，可以通过向含有稳定的芽孢杆菌菌株的培养基中添加蛋白质粉而获得含蛋白质发酵肉汤来发酵茶叶。
在一个实施方式中，含蛋白质发酵肉汤可以包括0.05-10.0wt％的砂糖、0.005-10.0wt％的果糖和0.005-1.0wt％的蛋白质粉，以含蛋白质发酵肉汤的总重量计。在上述范围中，所述菌株的发酵可以最佳。
在一个实施方式中，可以通过用含蛋白质发酵肉汤间断地处理3-5次来发酵茶叶。如果和绿茶叶一次混合，则很难实现与含蛋白质发酵肉汤的均匀混合。当向茶叶中添加含蛋白质发酵肉汤时，需要连续不断的搅动茶叶。以防止干的绿茶叶接触到水时温度快速升高而破坏菌株。
用含蛋白质发酵肉汤处理的茶叶可以是未经加工的绿茶叶或干的绿茶叶，即使是干茶叶发酵也是可行的。干茶叶的利用是令人满意的，因为这可以用到储存的干绿茶。
在本发明的一个实施方式中，步骤(iii)的含蛋白质发酵肉汤可以包括103-108CFU/mL的芽孢杆菌菌株。菌株在上述范围时，发酵可有效地进行。
在本发明的一个实施方式中，步骤(iii)可以在适宜制备具有优良风味的发酵茶的温度下进行，而没有特别的限制。例如，可以在15-70℃，特别是40-70℃进行。如15-40℃的发酵可以是低温发酵。在该实例中，通过例如有机酸的处理可以抑制非期望的微生物的增殖。
温度40℃以上时，不需任何添加剂就可以抑制非期望的微生物的增殖，不会损害茶的风味特征。如果发酵温度在40℃以上，芽孢杆菌菌株以外的微生物生长不良。对于芽孢杆菌菌株的生长，温度可以不高于70℃。
在下文中，将对本发明中制备发酵茶的方法的每一个步骤作出描述。
<准备绿茶叶和菌株>
通过无菌过程制备干燥的绿茶叶作为主要底物。将如表1所列的从韩国传统发酵食品中分离出的菌株，接种到活化培养基，在锥形瓶(如，1000ml)中活化菌株，并且在20-40℃的温度下在震荡培养器上培养60-80小时。
表1
| 菌株 | 菌株号 | 来源 | |
| 实施例1 | 地衣芽孢杆菌 | F1017 | 发酵大豆块 |
| 实施例2 | 地衣芽孢杆菌 | F1232 | 酱油 |
| 实施例3 | 地衣芽孢杆菌 | F1267 | 红辣椒酱 |
| 实施例4 | 地衣芽孢杆菌 | F1268 | 红辣椒酱 |
| 实施例5 | 地衣芽孢杆菌 | F1200 | 豆瓣酱 |
| 实施例6 | 短小芽孢杆菌 | F1337 | 豆瓣酱 |
| 实施例7 | 索诺拉沙漠芽孢杆菌 | F1005 | 发酵大豆块 |
| 实施例8 | 枯草芽孢杆菌 | F1004 | 发酵大豆块 |
| 实施例9 | 枯草芽孢杆菌 | F1236 | 酱油 |
| 实施例10 | 枯草芽孢杆菌 | F1279 | 红辣椒酱 |
<制备菌株>
收集在震荡培养器上培养了60-80小时的菌株，并且从活化培养基上离心分离菌株。在2000-4500rpm离心5-10分钟进行离心，利用真空抽吸器将上清液即活化培养基从分离的样品中除去。由于在发酵过程中剩余的活化培养基可能会影响绿茶的风味，因此将菌株在0.8-1.0％的生理盐水中清洗2-4次。也就是说，向除去活化培养基的菌株沉淀物中添加生理盐水，用电搅拌器均匀混合生成物0.5-1分钟，以便于菌株沉淀物很好的分散在生理盐水中。将最终的分布有菌株的生理盐水溶液在2000-4500rmp离心5-10分钟，并用真空抽吸器除去生理盐水。重复上述步骤2-4次至完全除去活化培养基。
<制备无蛋白质发酵肉汤和稳定菌株>
为保证微生物充分的新陈代谢，除了绿茶外还需要提供水和能量来源，作为能量来源的食品添加物可以是糖、蛋白质质等。发酵茶的味道取决于添加物的种类和用量。特别地，无蛋白质发酵肉汤是通过混合0.05-10.0％的砂糖、0.005-10.0％的果糖和0.005-1.0％的蛋白质粉来制备的。特别是，在纯净水中溶解0.05-10.0％的砂糖和0.005-10.0％的果糖后，将生成物在100-140℃下灭菌10-20分钟。将灭菌后的无蛋白质发酵肉汤冷却至室温，再混合0.005-1.0％的蛋白质粉。
菌株在清洗过程中可能受到破坏，为确保菌株进行有效的发酵代谢，有必要在无蛋白质发酵肉汤中稳定菌株。为此，在添加蛋白质粉之前，先将无蛋白质发酵肉汤(100-500ml)和经生理盐水清洗2-4次的菌株混合，在20-40℃的温度下在培养器中培养12-36小时以稳定菌株。
<绿茶的发酵和干燥>
在稳定于无蛋白质发酵肉汤的菌株中添加蛋白质粉以制备含蛋白质发酵肉汤，在灭菌的反应罐中，将作为主要底物的制成小包装单位的绿茶和含蛋白质发酵肉汤混合。含蛋白质发酵肉汤混合物中菌株的数量控制在103-108CFU/ml。以干燥绿茶叶(含水量＜5％)的重量计，当水分含量超过60％时，发酵茶变红，味道变差，而且也因为绿茶叶互相粘连而难于操作。另外，当水分含量小于30％时，菌株对绿茶叶的发酵会是不均匀的。因此，以干燥绿茶叶的重量计，无蛋白质发酵肉汤应当以30-60％的量混合。如果含蛋白质发酵肉汤和绿茶叶一次混合，则很难实现和含蛋白质发酵肉汤的均匀混合。因此，无蛋白质发酵肉汤和绿茶叶的混合是分3-5次，每次混合总量的20-30％。当在干燥的绿茶叶中添加水时，会发生放热反应。因此，为防止菌株被温度的快速升高所破坏，在向茶叶中添加含蛋白质发酵肉汤后需要连续不断的搅动茶叶。在放热反应完成5-30分钟后，冷却下来的含蛋白质发酵肉汤混合物在20-70℃恒温发酵罐中发酵，并隔绝外界空气。如果发酵温度高于40℃，除芽孢杆菌外的其他微生物的增殖被抑制。因此可以阻止熟化(aging)过程中非期望的微生物的增殖。发酵至少进行24小时至28天。然后，生成物在80-120℃下热风干燥3-7小时。
本发明制备的发酵绿茶，在最终产品中含有不超过102-108CFU/g的总微生物。没有检测到致病微生物。
实施例
下面将描述实施例和实验。以下的实施例和实验仅用作说明目的，并不限制公开的范围。
按如下所述制备发酵绿茶。
实施例1-10：制备发酵茶
<制备绿茶叶和菌株>
通过无菌过程制备干燥的绿茶叶作为主要底物，将表1所述的从韩国传统发酵食品中分离出的菌株接种到锥形瓶(1000ml)内的活化培养基上以活化菌株[DifcoTM马铃薯右旋糖肉汤(每100ml培养基含有0.4％马铃薯淀粉和2％右旋糖)]，25℃下在震荡培养器中培养72小时。
菌株从韩国食品研究院(KFRI)处获得。它们是从豆瓣酱、红辣椒酱、酱油或发酵大豆块中分离出的地衣芽孢杆菌F1017(实施例1)，地衣芽孢杆菌F1232(实施例2)，地衣芽孢杆菌F1267(实施例3)，地衣芽孢杆菌F1268(实施例4)，地衣芽孢杆菌F1200(实施例5)，短小芽孢杆菌F1337(实施例6)，索诺拉沙漠芽孢杆菌F1005(实施例7)，枯草芽孢杆菌F1004(实施例8)、枯草芽孢杆菌F1236(实施例9)和枯草芽孢杆菌F1279(实施例10)。
<制备菌株>
收集在震荡培养箱中培养了72小时的菌株，在3000rpm下离心10分钟，从活化培养基中分离出菌株。利用真空抽吸器从分离的样本中除去上清液即活化培养基。用0.9％的生理盐水清洗菌株4次，因为在发酵过程中剩余的活化培养基可能会影响绿茶的风味。也就是说，向除去活化培养基的菌株沉淀物中添加生理盐水后，用电搅拌器均匀混合生成物1分钟，以便于菌株沉淀物很好的分散在生理盐水中。将最终的分布有菌株的生理盐水溶液在3000rmp下离心10分钟，并用真空抽吸器除去生理盐水。重复上述步骤4次至完全除去活化培养基。或者，按如下所述制备菌株。在向活化培养基上(DifcoTM马铃薯右旋糖肉汤)接种菌株以活化菌株后，培养72小时。然后收集菌株并在3000rpm下离心10分钟，以从活化培养基中分离菌株。然后将分离的菌株和9倍菌株重量的麦芽糖糊精混合。将得到的浆液进行喷雾干燥制成粉末。然后，对粉末中的微生物数量计数。
<制备无蛋白质发酵肉汤和稳定菌株>
在含有占无蛋白质发酵肉汤总重量5wt％的砂糖和5wt％的果糖的无蛋白质发酵肉汤中稳定菌株。特别是，在纯净水中溶解5wt％的砂糖和5wt％的果糖后，在120℃下对所得混合物灭菌15分钟。将灭菌后的无蛋白质发酵肉汤冷却到25℃，在冷却后的无蛋白质发酵肉汤(250ml)中添加菌株，并在培养器中培养24小时。
<发酵并干燥绿茶>
在无蛋白质发酵肉汤中添加1.0wt％的大豆蛋白质粉(Kimoon)，制备含蛋白质发酵肉汤。在灭菌的反应罐中，将制成小包装单位的主要底物绿茶和含蛋白质发酵肉汤混合。含蛋白质发酵肉汤混合物中菌株的数量为106CFU/ml。将占干燥绿茶叶重量50％的无蛋白质发酵肉汤与绿茶叶混合，以每次20％的量间断地分5次将无蛋白质发酵肉汤与绿茶叶混合。为防止温度快速升高对菌株造成破坏，在向茶叶中添加含蛋白质发酵肉汤后，要连续不断的搅动茶叶。待放热反应完成20分钟后，冷却下来的含蛋白质发酵肉汤混合物在50℃的恒温发酵罐中发酵，并隔绝外界空气。发酵过程持续10天。然后将生成物在100℃下热风干燥5小时。
在最终得到的发酵绿茶产品中含有总量不超过102-108CFU/g的微生物。
检验实例1：微生物污染情况
对实施例1-10制得的发酵茶含有的总微生物数目和特定病原体的数目计数。结果列在表2中。
表2
*CFU/g：菌落形成单位/克，每克绿茶中的微生物数。
检验实例2：感官评价
对实施例1-10中依赖相关菌株制得的发酵绿茶，采取评审检验来研究其味道、气味和色泽。10位专家被要求以多选的方式从实施例1-10制得的10种发酵绿茶中选出他们喜欢的样品。试验结果如下。
表3
Claims (16)
1.一种制备发酵茶的方法，包括：
制备芽孢杆菌菌株；
稳定所述芽孢杆菌菌株；和
通过用稳定的芽孢杆菌菌株处理来发酵茶叶。
2.权利要求1的制备发酵茶的方法，其中所述芽孢杆菌菌株从发酵食品中分离。
3.权利要求1的制备发酵茶的方法，其中所述芽孢杆菌菌株选自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
4.权利要求3的制备发酵茶的方法，其中所述芽孢杆菌菌株选自地衣芽孢杆菌F1017、地衣芽孢杆菌F1232、地衣芽孢杆菌F1267、地衣芽孢杆菌F1268、地衣芽孢杆菌F1200、短小芽孢杆菌F1337、索诺拉沙漠芽孢杆菌F1005、枯草芽孢杆菌F1004、枯草芽孢杆菌F1236和枯草芽孢杆菌F1279。
5.权利要求4的制备发酵茶的方法，其中所述芽孢杆菌菌株是地衣芽孢杆菌F1017。
6.权利要求1的制备发酵茶的方法，其中所述的制备芽孢杆菌包括离心含有芽孢杆菌菌株的培养基并且用盐水清洗芽孢杆菌菌株以除去培养基。
7.权利要求1的制备发酵茶的方法，其中所述的稳定芽孢杆菌菌株包括在无菌的不含蛋白质粉的无蛋白质发酵肉汤上培养所述芽孢杆菌菌株。
8.权利要求7的制备发酵茶的方法，其中所述无蛋白质发酵肉汤含有砂糖、果糖和水。
9.权利要求1的制备发酵茶的方法，其进一步包括在所述的发酵茶叶前，向含有稳定的芽孢杆菌菌株的培养基中添加蛋白质粉。
10.权利要求9的制备发酵茶的方法，其中所述的发酵茶叶包括通过用含蛋白质发酵肉汤处理来发酵茶叶，所述含蛋白质发酵肉汤是通过向含有稳定的芽孢杆菌菌株的培养基中添加蛋白质粉而获得的。
11.权利要求10的制备发酵茶的方法，其中所述含蛋白质发酵肉汤包括以含蛋白质发酵肉汤的总重量计的0.05-10.0wt％的砂糖、0.005-10.0wt％的果糖和0.005-1.0wt％的蛋白质粉。
12.权利要求9的制备发酵茶的方法，其中所述蛋白质粉是大豆粉。
13.权利要求10的制备发酵茶的方法，其中所述的发酵茶叶包括用含蛋白质发酵肉汤间断地处理茶叶3-5次。
14.权利要求10的制备发酵茶的方法，其中在用含蛋白质发酵肉汤处理期间或之后搅动茶叶。
15.权利要求10的制备发酵茶的方法，其中所述含蛋白质发酵肉汤含有103-108CFU/mL的芽孢杆菌菌株。
16.权利要求1的制备发酵茶的方法，其中所述的发酵茶叶在40-70℃进行。
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