JP2012509661A - バチルス属菌株を用いた発酵茶の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質(Main Substrate)を準備する。そして、伝統発酵食品から分離した下記表1の菌株を三角フラスコ(例えば、1000ml)に入れた菌株活性化用培地に接種した後、振動培養器(Shaking Incubator)で20〜40℃、60〜80時間培養する。
振動培養器で60〜80時間培養された菌株を回収して、まず遠心分離器で菌株と活性培地を分離する。このとき、遠心分離は、2000〜4500rpmの速度で5〜10分間行い、培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を用いて上層液の活性培地を除去する。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、0.8〜1.0%の生理食塩水を用いて菌株を2〜4回洗浄する。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように30秒〜1分間混合する。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、2000〜4500rpmの速度で5〜10分間遠心分離し、真空吸入器を使用して食塩水を除去する。前記のような方法を2〜4回繰り返して、活性培地成分を完全に除去する。
適切な微生物の代謝のため、緑茶の他に水分やエネルギー源を供給する必要がある。エネルギー源として供給する食品添加物としては、糖類、タンパク質等があるが、添加物の種類や濃度により発酵茶の味が変わってくる。具体的に、発酵液は、砂糖0.05〜10.0%、果糖0.005〜10.0%と、タンパク質粉末0.005〜1.0%を混合して製造する。具体的な製造方法は、精製水に、砂糖0.05〜10.0%、果糖0.005〜10.0%となるように溶解させた後、100〜140℃で10〜20分間高温加圧滅菌させる。滅菌が完了した発酵液は、常温で冷却させた後、タンパク質粉末0.005〜1.0%を混合する。
タンパク質粉末が除かれた発酵液での安定した菌株に、タンパク質粉末を加えて発酵菌液を製造する。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合する。混合発酵菌液中、発酵菌株の数が103〜108CFU/mLとなるように製造する。緑茶乾燥葉(水分含量5%未満)重量に対する水分比率が60%よりも大きいと、水の色が赤くなって味が落ち、緑茶葉どうしが付着して加工時に問題となる等、最終製品の形状や品質が低下し得る。また、30%未満の場合、菌による緑茶葉の均一な発酵が困難となり得る。したがって、緑茶乾燥葉の重量に対する発酵液の割合は、30〜60%となるように混合する。発酵菌液を一度に緑茶に混合させる場合、均等な発酵菌液の混合が困難であるため、緑茶を混合しながら、発酵液全体の20〜30%ずつを3〜5回に分けて混合する。緑茶乾燥葉に水分を混合させると発熱反応が表れるが、急速な温度増加により菌株が損傷を受けないよう、発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌させ続けて茶の内部温度が急速に上昇しないようにする。5〜30分後に発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度20〜70℃の恒温発酵槽における発酵工程を経る。発酵温度が40度を超えると、バチルス(Bacillus spp)を除く他の菌株の成長が難しくなるため、熟成期間中における他の雑菌の増殖抑制効果が期待できる。発酵時間は最低24時間から最長28日間実施し、熱風乾燥で80〜120℃、3〜7時間乾燥させる。
<緑茶葉と接種菌準備段階>
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質(Main Substrate)を準備した。そして、伝統発酵食品から分離した上記表1の各菌株を三角フラスコ(1000ml)に入れた菌株活性化用活性培地[Difco(登録商標)Potato Dextrose Broth(組成培地100mL当たりPotato starch(ジャガイモ澱粉)0.4%、Dextorse(デキストロース)2%)]に接種した後、振動培養器(Shaking Incubator)で、25℃、72時間培養した。
振動培養器で72時間培養された各菌株を回収して、1回目として、遠心分離器で3000rpmの速度で10分間遠心分離して、菌株と活性培地を分離した。培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を使用して上層液の活性培地を除去した。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、0.9%の生理食塩水を用いて菌株を4回洗浄した。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように1分間混合した。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、3000rpmの速度で10分間遠心分離し、真空吸入器を使用して、食塩水を除去した。前記のような方法を4回繰り返して、活性培地成分を完全に除去した。場合により、次のように接種菌株を準備したりもした:菌株活性用活性培地(Difco potato dextrose broth)に菌株を接種後72時間培養した菌液から菌株を回収し、遠心分離器で3000rpmの速度で10分間遠心分離して、活性培地と分離した。続いて、分離された菌株重量の9倍のマルトデキストリンを分離菌株と混合して、混合された生地をスプレードライ(spraydrying)機で乾燥させて菌粉末形態に製造し、完成した菌粉末の菌数を測定して接種菌株を準備した。
発酵液重量全体を基準に、砂糖5.0重量%及び果糖5.0重量%を含む発酵液に、菌株を入れて安定化させた。具体的には、精製水に、砂糖5.0重量%及び果糖5.0重量%を溶解させた後、120℃で15分間高温加圧滅菌させた。滅菌が完了した発酵液は、常温で25℃まで冷却させた。冷却された発酵液250mLに菌株を入れ、インキュベーターで24時間培養した。
前記安定化した発酵液に、分離大豆タンパクパウダー(Kimoon)1.0重量%を入れて発酵菌液を製造した。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合した。発酵菌液内の発酵菌株の数は、106CFU/mLであった。前記発酵菌液の比率は、緑茶乾燥葉重量に対し50%となるように混合した。このとき、発酵液全体の20%ずつ、計5回に分けて、時間差を置いて混合した。発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌し続けることにより、茶の内部の温度が急速に上昇しないようにした。20分後、発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度50℃の恒温発酵槽で10日間発酵を行い、その後、100℃で5時間熱風乾燥した。
前記実施例1〜10により得られた発酵茶に含まれている一般細菌と特定病原性細菌の数を測定した結果、下記表2の結果を得た。
実施例1〜10により製造された発酵茶の味と香り、水の色を含む総合的嗜好度が発酵菌株によってどのように変化するのかを調査するために、パネルテスト(Panel Test)を実施した。検査方法は、専門評価者10人が、実施例1〜10により製造された発酵緑茶10種に対し、嗜好度が高いと考える試料に複数投票(Multi−Voting)する評価法を利用し、その評価結果を下記表3に示した。
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質(Main Substrate)を準備する。そして、伝統発酵食品から分離した下記表1の菌株を三角フラスコ(例えば、1000ml)に入れた菌株活性化用培地に接種した後、振動培養器(Shaking Incubator)で20〜40℃、60〜80時間培養する。
振動培養器で60〜80時間培養された菌株を回収して、まず遠心分離器で菌株と活性培地を分離する。このとき、遠心分離は、2000〜4500rpmの速度で5〜10分間行い、培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を用いて上層液の活性培地を除去する。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、0.8〜1.0%の生理食塩水を用いて菌株を2〜4回洗浄する。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように30秒〜1分間混合する。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、2000〜4500rpmの速度で5〜10分間遠心分離し、真空吸入器を使用して食塩水を除去する。前記のような方法を2〜4回繰り返して、活性培地成分を完全に除去する。
適切な微生物の代謝のため、緑茶の他に水分やエネルギー源を供給する必要がある。エネルギー源として供給する食品添加物としては、糖類、タンパク質等があるが、添加物の種類や濃度により発酵茶の味が変わってくる。具体的に、発酵液は、砂糖0.05〜10.0%、果糖0.005〜10.0%と、タンパク質粉末0.005〜1.0%を混合して製造する。具体的な製造方法は、精製水に、砂糖0.05〜10.0%、果糖0.005〜10.0%となるように溶解させた後、100〜140℃で10〜20分間高温加圧滅菌させる。滅菌が完了した発酵液は、常温で冷却させた後、タンパク質粉末0.005〜1.0%を混合する。
タンパク質粉末が除かれた発酵液での安定した菌株に、タンパク質粉末を加えて発酵菌液を製造する。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合する。混合発酵菌液中、発酵菌株の数が103〜108CFU/mLとなるように製造する。緑茶乾燥葉(水分含量5%未満)重量に対する水分比率が60%よりも大きいと、水の色が赤くなって味が落ち、緑茶葉どうしが付着して加工時に問題となる等、最終製品の形状や品質が低下し得る。また、30%未満の場合、菌による緑茶葉の均一な発酵が困難となり得る。したがって、緑茶乾燥葉の重量に対する発酵液の割合は、30〜60%となるように混合する。発酵菌液を一度に緑茶に混合させる場合、均等な発酵菌液の混合が困難であるため、緑茶を混合しながら、発酵液全体の20〜30%ずつを3〜5回に分けて混合する。緑茶乾燥葉に水分を混合させると発熱反応が表れるが、急速な温度増加により菌株が損傷を受けないよう、発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌させ続けて茶の内部温度が急速に上昇しないようにする。5〜30分後に発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度20〜70℃の恒温発酵槽における発酵工程を経る。発酵温度が40度を超えると、バチルス(Bacillus spp)を除く他の菌株の成長が難しくなるため、熟成期間中における他の雑菌の増殖抑制効果が期待できる。発酵時間は最低24時間から最長28日間実施し、熱風乾燥で80〜120℃、3〜7時間乾燥させる。
<緑茶葉と接種菌準備段階>
乾燥した緑茶葉を無菌工程に適用して主基質(Main Substrate)を準備した。そして、伝統発酵食品から分離した上記表1の各菌株を三角フラスコ(1000ml)に入れた菌株活性化用活性培地[Difco(登録商標)Potato Dextrose Broth(組成培地100mL当たりPotato starch(ジャガイモ澱粉)0.4%、Dextorse(デキストロース)2%)]に接種した後、振動培養器(Shaking Incubator)で、25℃、72時間培養した。
振動培養器で72時間培養された各菌株を回収して、1回目として、遠心分離器で3000rpmの速度で10分間遠心分離して、菌株と活性培地を分離した。培地と菌株の分離が完了した試料は、真空吸入器を使用して上層液の活性培地を除去した。活性培地が残留すると発酵の際に緑茶の香味に影響を与えるので、0.9%の生理食塩水を用いて菌株を4回洗浄した。洗浄方法は、活性培地が除去された菌株沈殿物に生理食塩水を入れ、電動混合器で菌株堆積物が生理食塩水によく分散されるように1分間混合した。菌株が分散された生理食塩水菌液は、活性培地を除去する過程と同様、3000rpmの速度で10分間遠心分離し、真空吸入器を使用して、食塩水を除去した。前記のような方法を4回繰り返して、活性培地成分を完全に除去した。場合により、次のように接種菌株を準備したりもした:菌株活性用活性培地(Difco potato dextrose broth)に菌株を接種後72時間培養した菌液から菌株を回収し、遠心分離器で3000rpmの速度で10分間遠心分離して、活性培地と分離した。続いて、分離された菌株重量の9倍のマルトデキストリンを分離菌株と混合して、混合された生地をスプレードライ(spraydrying)機で乾燥させて菌粉末形態に製造し、完成した菌粉末の菌数を測定して接種菌株を準備した。
発酵液重量全体を基準に、砂糖5.0重量%及び果糖5.0重量%を含む発酵液に、菌株を入れて安定化させた。具体的には、精製水に、砂糖5.0重量%及び果糖5.0重量%を溶解させた後、120℃で15分間高温加圧滅菌させた。滅菌が完了した発酵液は、常温で25℃まで冷却させた。冷却された発酵液250mLに菌株を入れ、インキュベーターで24時間培養した。
前記安定化した発酵液に、分離大豆タンパクパウダー(Kimoon)1.0重量%を入れて発酵菌液を製造した。滅菌された反応タンク、小包装単位ごとに準備された緑茶主基質に前記発酵菌液を混合した。発酵菌液内の発酵菌株の数は、106CFU/mLであった。前記発酵菌液の比率は、緑茶乾燥葉重量に対し50%となるように混合した。このとき、発酵液全体の20%ずつ、計5回に分けて、時間差を置いて混合した。発酵菌液を混合した後も、茶葉を攪拌し続けることにより、茶の内部の温度が急速に上昇しないようにした。20分後、発熱反応が完了し、温度が低下した緑茶発酵菌液混合物は、口を塞いで外気の流入を防ぎ、温度50℃の恒温発酵槽で10日間発酵を行い、その後、100℃で5時間熱風乾燥した。
前記実施例1〜10により得られた発酵茶に含まれている一般細菌と特定病原性細菌の数を測定した結果、下記表2の結果を得た。
実施例1〜10により製造された発酵茶の味と香り、水の色を含む総合的嗜好度が発酵菌株によってどのように変化するのかを調査するために、パネルテスト(Panel Test)を実施した。検査方法は、専門評価者10人が、実施例1〜10により製造された発酵緑茶10種に対し、嗜好度が高いと考える試料に複数投票(Multi−Voting)する評価法を利用し、その評価結果を下記表3に示した。
Claims (16)
- (i)バチルス属菌株を準備するステップ;
(ii)前記バチルス属菌株を安定化させるステップ;及び
(iii)前記安定化バチルス属菌株を茶葉に処理して発酵させるステップ
を含む発酵茶の製造方法。 - 前記バチルス属菌株は、発酵食品から分離されたバチルス属菌株であることを特徴とする、請求項1記載の発酵茶の製造方法。
- 前記バチルス属菌株は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ソノレンシス(Bacillus sonorensis)及びバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)からなる群から選択された1以上の菌株であること特徴とする、請求項1記載の発酵茶の製造方法。
- 前記バチルス属菌株は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)F1017、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)F1232、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)F1267、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)F1268、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)F1200、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)F1337、バチルス・ソノレンシス(Bacillus sonorensis)F1005、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)F1004、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)F1236及びバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)F1279からなる群から選択された1以上の菌株であることを特徴とする、請求項3記載の発酵茶の製造方法。
- 前記バチルス属菌株は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)F1017であることを特徴とする、請求項4記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ(i)は、バチルス属菌株が含まれている培地を遠心分離した後、塩水で洗浄して培地を除去することを含む、請求項1記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ(ii)は、タンパク質粉末を含まない滅菌発酵液にバチルス属菌株を入れて培養することを含む、請求項1記載の発酵茶の製造方法。
- 前記発酵液は、砂糖、果糖及び水を含む、請求項7記載の発酵茶の製造方法。
- 前記製造方法は、ステップ(iii)以前に、ステップ(ii)で安定化されたバチルス属菌株を含む培養液にタンパク質粉末を添加するステップをさらに含む、請求項1記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ(iii)は、ステップ(ii)で安定化されたバチルス属菌株を含む培養液にタンパク質粉末を添加して得られた発酵菌液を茶葉に処理して発酵させる、請求項9記載の発酵茶の製造方法。
- 前記発酵菌液は、発酵菌液全体の重量を基準に、砂糖0.05〜10.0重量%、果糖0.005〜10.0重量%、及びタンパク質粉末0.005〜1.0重量%を含むことを特徴とする、請求項10記載の発酵茶の製造方法。
- 前記タンパク質粉末は、大豆粉末である、請求項9記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ(iii)は、時間間隔を置いて3〜5回に分割して発酵菌液を茶葉に処理する、請求項10記載の発酵茶の製造方法。
- 前記発酵菌液を茶葉に処理する際及び処理した後、茶葉を攪拌することを特徴とする、請求項10記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ(iii)の発酵菌液は、103〜108CFU/mlのバチルス属菌株を含むことを特徴とする、請求項10記載の発酵茶の製造方法。
- 前記ステップ(iii)は、40〜70℃の温度で行われることを特徴とする、請求項1記載の発酵茶の製造方法。
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