CN101798591B - 一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的pcr快速检测方法 - Google Patents

Abstract

一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，属于食品微生物的检测方法。包括以下工艺步骤：1)牛乳嗜冷菌的筛选；2)提取牛乳嗜冷菌的基因组；3)PCR扩增；4)扩增产物进行电泳检测；5)结果判断。本发明不仅有助于为生产健康、安全、营养的乳制品提供一定的技术支持与工艺参考，而且也有助于乳业的健康发展与长足进步，使现代生物技术促对传统嗜冷菌的鉴定方法手段和方法得到快速发展。采用本发明的检测方法缩短了检测周期，由原来的10多天缩短到1天，甚至不到1天；运用了分子生物学法提高了检测的灵敏度和精确度，检测精度达到100％。

Description

一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法

技术领域

本发明属于食品微生物的检测方法，具体涉及一种牛乳中嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法。 

背景技术

研究结果表明，鲜牛奶中含有在冷藏温度下大量繁殖的嗜冷菌，这些菌通常引起奶与奶制品出现酸味、异味、变色、凝固、发粘等变质现象。嗜冷菌种类繁多，在已经了解的嗜冷菌中，细菌是最多的一类，有30多个属，其中属于革兰氏阴性的假单胞菌属(Pseudomonas)和革兰氏阳性的芽孢杆菌属(Bacillus)的较多。嗜冷菌在长期生物进化过程中形成了一系列适应低温的机制。这些机制包括营养物质的吸收和转运、DNA的复制合成、蛋白质的合成、能量代谢、细胞的分裂等方面。嗜冷菌营养体对UHT热处理很敏感，在UHT热处理过程中将会失去活性，但嗜冷菌的芽孢却是耐热的。 

牛乳和乳制品最常见的风味缺陷-水果味和酸败味，是牛乳中含有的大量的嗜冷菌对牛乳中的组成成分作用后的产物。所有的这些风味缺陷如酸败味、奶酪味、苦味、酵母味和鱼腥味等产生的原因都被研究过。嗜冷菌分泌的蛋白酶和脂酶作用于牛乳中的蛋白质和脂肪而使其分解和被嗜冷菌吸收利用。嗜冷菌所分泌的热稳定的胞外酶在牛乳中含量很低时也能水解牛乳中的蛋白质和脂肪，从而引起超高温牛乳产生苦味和出现胶凝沉淀；也能引起乳制品产生臭味，同时对消毒乳质量、干酪生产、酸奶质量等均产生一定的影响。 

嗜冷菌污染是现代乳制品加工过程中最常见的问题，大多数嗜冷菌在贮存 时能产生耐热的酶类，这些酶能耐受巴氏消毒甚至UHT处理，导致乳及乳制品风味、品质降低，保质期缩短，甚至危及加工过程的顺利进行，从而影响产品的质量及加工过程的顺利进行。开展嗜冷菌的快速检测和鉴定技术，及时而有有针对性地采取相应的措施，对提高乳制品品质，延长保质期，具有重要的意义，不同地区、和不同的奶牛饲养方法等对嗜冷菌种类和数量都具有一定的影响，因此无论何地，也无论何种饲养和管理方法，牛奶中或多或少都可能会有嗜冷菌污染，无非是嗜冷菌种类和数量上的差异。不同厂家以及不同的鉴定方法等对嗜冷菌种类和数量的鉴定和检测具有一定的影响，即使同一地区，由于各种原因也会造成牛乳中嗜冷菌种类和数量才在一定的差异。 

要减少嗜冷菌的危害，早期对牛奶原料中嗜冷菌的检测和控制是关键。但当前国内外尚无统一的标准，更没有包括PCR在内的快速检测方法。迄今，嗜冷菌的检验大多采用传统粗放的方法，即在5-7℃培养10d后计数。该方法的缺点是费时费力，对操作技术的要求高，在实际生产中存在严重滞后的问题，往往是尚未完成检测，原料奶已是成品，有的或许已进入市场。原因是乳制品为保鲜类产品。生产周期短，大多在10d以内，巴氏杀菌奶则更短一般在2-3d内。 

传统的嗜冷菌的鉴定方法还包括形态观察、培养特征观察、需氧性试验、淀粉水解试验、各种糖发酵试验、吲哚试验等等系列的鉴定步骤，这些鉴定方法工作量大、试验内容繁多、时间长。 

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种简单、灵敏、准确且快速的牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR的检测方法的技术方案。 

所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于包括以 下工艺步骤： 

1)牛乳嗜冷菌的筛选 

用接种环无菌操作从原料乳中取样，在特异筛选培养基制成的平板上进行划线分离，在温度30-37℃下培养15-25小时后，平板上生长的暗红色菌落，即为待鉴定菌株， 

所述的特异筛选培养基配方为：酵母提取物1-3g/L、蛋白胨2-5g/L、葡萄糖0.5-1.5g/L、甲基紫0.0001-0.01g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.01-0.1g/L、琼脂15.0-20.0g/L，用蒸馏水定容至1L，并调pH为6.0，121℃灭菌20分钟； 

2)提取牛乳嗜冷菌的基因组 

挑取待鉴定菌株的单菌落接入70mL的特异筛选培养基中，在温度30-37℃，转速100-200转/分钟的恒温摇床中培养15-25小时后，收集菌株，并提取菌株的DNA； 

3)PCR扩增 

将菌株DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系为：含20mmol/L Mg²⁺的10×Buffer2μL、2.5mmol/L的dNTPs1.5μL、0.25μmol/L的F1和F2引物各1μL、5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL、DNA模板2μL、双蒸水或三蒸水12μL， 

扩增条件控制为95℃变性3分钟后进入PCR循环，循环条件为94℃30秒、56℃30秒、72℃70秒，扩增35个循环后72℃延伸补足10分钟， 

所述的引物F 1：5′-GAGGAAGGTGGGGATGACGT-3′， 

所述的引物F2：5′-GCCAAGGCATCCACC-3′； 

4)扩增产物进行电泳检测 

取3μL步骤3)得到的扩增产物与1μL浓度为0.02-0.05％的溴酚蓝混合， 取混合液在含有0.5-1μg/mLEB溶液的0.8-1％琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，电泳条件为电压60-80V，电流40-50mA，电泳液中含有0.5-1μg/mL的EB溶液，电泳直至溴酚蓝条带移动到距凝胶前1.5-2cm为止； 

5)结果判断 

若扩增后电泳检测出1.5KB大小的扩增产物，即可鉴定该原料乳中的菌株为嗜冷菌假单胞菌。 

所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于步骤1)中取样平板划线后，在32-35℃培养箱中培养17-23小时，所述的特异筛选培养基配方为：酵母提取物1.5-2.5g/L、蛋白胨3-4g/L、葡萄糖0.7-1.3g/L、甲基紫0.0005-0.005g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.02-0.08g/L、琼脂15.0-20.0g/L。 

所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于步骤1)中所述的特异筛选培养基配方为：酵母提取物2.5g/L、蛋白胨3.5g/L、葡萄糖1.0g/L、甲基紫0.001g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.05g/L、琼脂15.0-20.0g/L。 

所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于步骤2)中培养条件为：温度32-35℃，转速120-170转/分钟的恒温摇床中培养17-23小时。 

所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于步骤2)中菌株DNA提取的步骤包括： 

a.取步骤2)得到的培养液1.5mL，10000-12000rpm离心1-3分钟，收集细菌菌体； 

b.在收集到的菌体中加入500-600μL TE悬浮沉淀，并加25-35μL浓度为 8-10％的SDS溶液和5-15μL溶菌酶，混匀，25-37℃保温1-2小时后，90-95℃水浴保温5-10分钟； 

c.在上述溶液中加入85-95μL浓度为5-10mol/L的NaCl溶液，85-95μLCTAB/NaCl溶液，混匀，55-65℃保温15-25分钟； 

d.用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，10000-11000rpm离心5-15分钟，将上清液移至干净离心管，再用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，静置5-10分钟后，10000-11000rpm离心5-15分钟，将上清液移至干净离心管，所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的浓度比为24∶1； 

e.在上述得到的上清液中，加入上清液1-2倍体积的无水乙醇，颠倒混合，-20℃放置5-15分钟后，10000-12000rpm离心5-10分钟，沉淀DNA； 

f.除去经步骤e的离心管中的液体，再用浓度为70-75％的乙醇漂洗2-3次，离心5-6秒，干燥后加25-35μL双蒸水，震荡混匀，离心5-6秒，然后加入DNA保存液5-15ul，4℃保存。 

6.如权利要求1所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于步骤2)中菌株DNA提取的步骤包括： 

a.取步骤2)得到的培养液1.5mL，12000rpm离心1分钟，收集细菌菌体； 

b.在收集到的菌体中加入584μL TE悬浮沉淀，并加30.7μL浓度为10％的SDS溶液，10μL溶菌酶，混匀，37℃保温1小时后，95℃水浴保温5分钟； 

c.在上述溶液中加入92.3μL浓度为5mol/L的NaCl溶液，92.3μLCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟； 

d.用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，11000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管，再用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，静置5分钟后，11000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管，所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇 的浓度比为24∶1； 

e.在上述得到的上清液中，加入上清液一倍体积的无水乙醇，颠倒混合，-20℃放置10分钟后，12000rpm离心8分钟，沉淀DNA； 

f.除去经步骤e的离心管中的液体，再用浓度为70％的乙醇漂洗2次，离心5-6秒，干燥后加30μL双蒸水，震荡混匀，离心5～6秒，然后加入DNA保存液10ul作为DNA模板保存液，4℃保存。 

本发明利用现代生物学技术，对建立嗜冷菌的PCR鉴定关键技术进行研究。建立嗜冷菌的分子生物学鉴定方法，有助于快速和准确鉴定当地嗜冷菌种类和分布规律，从而采取对应的措施来控制产品的质量。本发明不仅有助于为生产健康、安全、营养的乳制品提供一定的技术支持与工艺参考，而且也有助于乳业的健康发展与长足进步，使现代生物技术促对传统嗜冷菌的鉴定方法手段和方法得到快速发展。采用本发明的检测方法缩短了检测周期，由原来的10多天缩短到1天，甚至不到1天；运用了分子生物学法提高了检测的灵敏度和精确度，检测精度达到100％。 

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明。 

实施例1 

1.牛乳嗜冷菌的筛选 

配制筛选培养基，该培养基组成为酵母提取物2.5g、蛋白胨3.5g、葡萄糖1.0g、甲基紫0.001g、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.05g、琼脂15.0-20.0g、水1000mL，配制方法为将上述培养基组成称量放入1000ml烧杯中，先用600ml水溶解，定容至1000ml，调节pH为6.0，按照每瓶150ml培养基分装到300ml三角烧瓶，瓶口包扎后高压蒸汽121℃灭菌20分钟，灭菌完成后取出，冷却至45℃时无菌操 作进行倒平板，平板凝固后放置做筛选菌株用； 

用接种环无菌操作从原料乳中取样，在上述平板上进行划线分离，然后在35℃培养箱中培养20小时，挑取平板上生长的暗红色菌落，即为待鉴定的原料乳中可能的嗜冷菌菌株。 

2.提取牛乳嗜冷菌的基因组 

在上述平板上挑取单菌落接入盛有70ml上述培养基的150ml三角烧瓶中，在35℃、150转/分钟的恒温摇床中培养20小时，按照下列方法提取该菌的DNA： 

a.取上述的培养液1.5mL，12000rpm离心1分钟，收集细菌菌体； 

b.在收集到的菌体中加入584μLTE悬浮沉淀，并加30.7μL浓度为10％的SDS溶液和0μL溶菌酶，混匀，37℃保温1小时后，95℃水浴保温5分钟； 

c.在上述溶液中加入92.3μL浓度为5mol/L的NaCl溶液，92.3μLCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟； 

d.用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，11000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管，再用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，静置5分钟后，11000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管，所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的浓度比为24∶1； 

e.在上述得到的上清液中，加入上清液1倍体积的无水乙醇，颠倒混合，-20℃放置10分钟后，12000rpm离心8分钟，沉淀DNA； 

f.除去经步骤e的离心管中的液体，再用浓度为70％的乙醇漂洗2次，离心5秒，干燥后加30μL双蒸水，震荡混匀，离心5秒，然后加入DNA保存液10ul作为DNA模板保存液，4℃保存。 

3.PCR扩增 

设计合成特异性引物F15′-GAGGAAGGTGGGGATGACGT-3′和F2 5′-GCCAAGGCATCCACC-3′，在下列条件下进行PCR扩增待检测菌株DNA：10×Buffer(含20mmol/L Mg2+)2μL、dNTPs(2.5mmol/L)1.5μL、上F1和F2引物(0.25μmol/L)各1μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL、DNA模板2μL、双蒸水或三蒸水12μL，扩增条件控制为变性温度95℃、3分钟；后35个循环为94℃、30秒；56℃、30秒；72℃、70秒；延伸温度72℃、10分钟。 

4.扩增产物进行电泳检测及结果判断 

取3μL扩增产物与1μL浓度为0.02％的溴酚蓝混合，取混合液在含有0.5μg/mLEB的1％琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在电压60V，电流40mA下进行电泳，电泳液中含有0.5μg/mL的EB溶液，电泳直至溴酚蓝条带移动到距凝胶前2cm为止，紫色检测仪观察电泳结果，PCR扩增后出现1.5KB扩增产物，即可鉴定该菌为嗜冷菌假单胞菌属菌株。 

实施例2 

1)牛乳嗜冷菌的筛选 

用接种环无菌操作从原料乳中取样，在用特异筛选培养基制成的平板上进行划线分离，在30℃培养箱中培养15小时后，挑取平板上生长的暗红色菌落，即为待鉴定菌株， 

所述的特异筛选培养基配方为：酵母提取物3g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖1.5g/L、甲基紫0.01g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.1g/L、琼脂15.0-20.0g/L，水1L，并调pH为6.0，121℃灭菌20分钟； 

2)提取牛乳嗜冷菌的基因组 

在上述平板上挑取单菌落接入70mL的特异筛选培养基中，在温度35℃，转速200转/分钟的恒温摇床中培养25小时后，收集菌株，并按以下步骤提取菌株的DNA： 

a.取上述的培养液1.5mL，10000rpm离心2分钟，收集细菌菌体； 

b.在收集到的菌体中加入600μL TE悬浮沉淀，并加35μL浓度为8％的SDS溶液，15μL溶菌酶，混匀，35℃保温2小时后，90℃水浴保温10分钟； 

c.在上述溶液中加入95μL浓度为8mol/L的NaCl溶液，95μL CTAB/NaCl溶液，混匀，60℃保温25分钟； 

d.用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，10000rpm离心5分钟，将上清液移至干净离心管，再用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，静置10分钟后，10000rpm离心5分钟，将上清液移至干净离心管，所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的浓度比为24∶1； 

e.在上述得到的上清液中，加入上清液2倍体积的无水乙醇，颠倒混合，-20℃放置15分钟后，10000rpm离心10分钟，沉淀DNA； 

f.除去经步骤e的离心管中的液体，再用浓度为75％的乙醇漂洗3次，离心6秒，干燥后加35μL双蒸水，震荡混匀，离心6秒，然后加入DNA保存液15ul作为DNA模板保存液，4℃保存。 

3)PCR扩增 

将步骤2)得到的菌株DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系为：含有20mmol/LMg²⁺的10×Buffer3μL、2.5mmol/L的dNTPs2μL、0.25μmol/L的F1和F2引物各0.5μL、5U/μL的Taq DNA聚合酶1μL、DNA模板4μL、双蒸水或三蒸水10μL， 

扩增条件控制为变性温度95℃、3分钟后35个循环为94℃、30秒；56℃、30秒；72℃、70秒；延伸温度72℃、10分钟， 

所述的引物F1：5′-GAGGAAGGTGGGGATGACGT-3′， 

所述的引物F2：5′-GCCAAGGCATCCACC-3′； 

4)扩增产物进行电泳检测 

取3μL扩增产物与1μL浓度为0.05％的溴酚蓝混合，取混合液在含有1μg/mLEB的1％琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在电压70V，电流45mA下进行电泳，电泳液中含有0.5μg/mL的EB溶液，电泳直至溴酚蓝条带移动到距凝胶前2cm为止，紫色检测仪观察电泳结果； 

5)结果判断 

若扩增后电泳检测出1.5KB大小的扩增产物，即可鉴定该原料乳中的菌株为嗜冷菌假单胞菌。 

实施例3 

1)牛乳嗜冷菌的筛选 

用接种环无菌操作从原料乳中取样，在用特异筛选培养基制成的平板上进行划线分离，在37℃培养箱中培养25小时后，挑取平板上生长的暗红色菌落，即为待鉴定菌株， 

所述的特异筛选培养基配方为：酵母提取物1g/L、蛋白胨2g/L、葡萄糖0.5g/L、甲基紫0.0001g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.01g/L、琼脂15.0-20.0g/L，水1L，并调pH为6.0，121℃灭菌20分钟； 

2)提取牛乳嗜冷菌的基因组 

在上述平板上挑取单菌落接入70mL的特异筛选培养基中，在温度37℃，转速100转/分钟的恒温摇床中培养25小时后，收集菌株，并按以下步骤提取菌株的DNA： 

a.取上述的培养液1.5mL，10000rpm离心3分钟，收集细菌菌体； 

b.在收集到的菌体中加入500μL TE悬浮沉淀，并加25μL浓度为9％的SDS溶液，15μL溶菌酶，混匀，25℃保温2小时后，90℃水浴保温10分钟； 

c.在上述溶液中加入85μL浓度为10mol/L的NaCl溶液，85μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温15分钟； 

d.用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，10000rpm离心15分钟，将上清液移至干净离心管，再用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，静置10分钟后，10000rpm离心15分钟，将上清液移至干净离心管，所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的浓度比为24∶1； 

e.在上述得到的上清液中，加入上清液1倍体积的无水乙醇，颠倒混合，-20℃放置10分钟后，10000rpm离心10分钟，沉淀DNA； 

f.除去经步骤e的离心管中的液体，再用浓度为75％的乙醇漂洗2次，离心5秒，干燥后加25μL双蒸水，震荡混匀，离心5秒，然后加入DNA保存液15ul作为DNA模板保存液，4℃保存。 

3)PCR扩增 

将步骤2)得到的菌株DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系为：20mmol/L Mg²⁺的10×Buffer3μL、2.5mmol/L的dNTPs2μL、0.25μmol/L的F1和F2引物各0.5μL、5U/μL的Taq DNA聚合酶1μL、DNA模板4μL、双蒸水或三蒸水10μL， 

扩增条件控制为变性温度95℃、3分钟后35个循环为94℃、30秒；56℃、30秒；72℃、70秒；延伸温度72℃、10分钟， 

所述的引物F1：5′-GAGGAAGGTGGGGATGACGT-3′， 

所述的引物F2：5′-GCCAAGGCATCCACC-3′； 

4)扩增产物进行电泳检测 

取3μL扩增产物与1μL浓度为0.03％的溴酚蓝混合，取混合液在含有0.6μg/mLEB的1％琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，在电压80V，电流50mA下进 行电泳，电泳液中含有0.6μg/mL的EB溶液，电泳直至溴酚蓝条带移动到距凝胶前2cm为止，紫色检测仪观察电泳结果； 

5)结果判断 

若扩增后电泳检测出1.5KB大小的扩增产物，即可鉴定该原料乳中的菌株为嗜冷菌假单胞菌。 

序列表 

<110>浙江科技学院 

<120>一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法 

<130>1 

<140>200910154038.3 

<141>2009-10-22 

<160>2 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>1 

gaggaaggtg gggatgacgt    20 

<210>2 

<211>15 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

gccaaggcat ccacc         15 

Claims (6)

1.一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1)牛乳嗜冷菌的筛选

用接种环无菌操作从原料乳中取样，在特异筛选培养基制成的平板上进行划线分离，在温度30-37℃下培养15-25小时后，平板上生长的暗红色菌落，即为待鉴定菌株，

所述的特异筛选培养基配方为：酵母提取物1-3g/L、蛋白胨2-5g/L、葡萄糖0.5-1.5g/L、甲基紫0.0001-0.01g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.01-0.1g/L、琼脂15.0-20.0g/L，用蒸馏水定容至1L，并调pH为6.0，121℃灭菌20分钟；

2)提取牛乳嗜冷菌的基因组

挑取待鉴定菌株的单菌落接入70mL的特异筛选培养基中，在温度30-37℃，转速100-200转/分钟的恒温摇床中培养15-25小时后，收集菌株，并提取菌株的DNA；

3)PCR扩增

将菌株DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系为：含20mmol/L Mg²⁺的10×Buffer2μL、2.5mmol/L的dNTPs1.5μL、0.25μmol/L的F1和F2引物各1μL、5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL、DNA模板2μL、双蒸水或三蒸水12μL，

扩增条件控制为95℃变性3分钟后进入PCR循环，循环条件为94℃30秒、56℃30秒、72℃70秒，扩增35个循环后72℃延伸补足10分钟，

所述的引物F1：5′-GAGGAAGGTGGGGATGACGT-3′，

所述的引物F2：5′-GCCAAGGCATCCACC-3′；

4)扩增产物进行电泳检测

取3μL步骤3)得到的扩增产物与1μL浓度为0.02-0.05％的溴酚蓝混合，取混合液在含有0.5-1μg/mLEB溶液的0.8-1％琼脂糖凝胶中进行电泳和显色，电泳条件为电压60-80V，电流40-50mA，电泳液中含有0.5-1μg/mL的EB溶液，电泳直至溴酚蓝条带移动到距凝胶前1.5-2cm为止；

5)结果判断

若扩增后电泳检测出1.5KB大小的扩增产物，即可鉴定该原料乳中的菌株为嗜冷菌假单胞菌。

2.如权利要求1所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于步骤1)中取样平板划线后，在32-35℃培养箱中培养17-23小时，所述的特异筛选培养基配方为：酵母提取物1.5-2.5g/L、蛋白胨3-4g/L、葡萄糖0.7-1.3g/L、甲基紫0.0005-0.005g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.02-0.08g/L、琼脂15.0-20.0g/L。

3.如权利要求1所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于步骤1)中所述的特异筛选培养基配方为：酵母提取物2.5g/L、蛋白胨3.5g/L、葡萄糖1.0g/L、甲基紫0.001g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.05g/L、琼脂15.0-20.0g/L。

4.如权利要求1所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于步骤2)中培养条件为：温度32-35℃，转速120-170转/分钟的恒温摇床中培养17-23小时。

5.如权利要求1所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于步骤2)中菌株DNA提取的步骤包括：

a.取步骤2)得到的培养液1.5mL，10000-12000rpm离心1-3分钟，收集细菌菌体；

b.在收集到的菌体中加入500-600μL TE悬浮沉淀，并加25-35μL浓度为8-10％的SDS溶液和5-15μL溶菌酶，混匀，25-37℃保温1-2小时后，90-95℃水浴保温5-10分钟；

c.在上述溶液中加入85-95μL浓度为5-10mol/L的NaCl溶液，85-95μLCTAB/NaCl溶液，混匀，55-65℃保温15-25分钟；

d.用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，10000-11000rpm离心5-15分钟，将上清液移至干净离心管，再用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，静置5-10分钟后，10000-11000rpm离心5-15分钟，将上清液移至干净离心管，所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的浓度比为24∶1；

e.在上述得到的上清液中，加入上清液1-2倍体积的无水乙醇，颠倒混合，-20℃放置5-15分钟后，10000-12000rpm离心5-10分钟，沉淀DNA；

f.除去经步骤e的离心管中的液体，再用浓度为70-75％的乙醇漂洗2-3次，离心5-6秒，干燥后加25-35μL双蒸水，震荡混匀，离心5-6秒，然后加入DNA保存液5-15ul，4℃保存。

6.如权利要求1所述的一种牛乳嗜冷菌假单胞菌的PCR快速检测方法，其特征在于步骤2)中菌株DNA提取的步骤包括：

a.取步骤2)得到的培养液1.5mL，12000rpm离心1分钟，收集细菌菌体；

b.在收集到的菌体中加入584μL TE悬浮沉淀，并加30.7μL浓度为10％的SDS溶液，10μL溶菌酶，混匀，37℃保温1小时后，95℃水浴保温5分钟；

c.在上述溶液中加入92.3μL浓度为5mol/L的NaCl溶液，92.3μLCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟；

d.用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，11000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管，再用等体积氯仿-异戊醇混合液抽提，静置5分钟后，11000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管，所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的浓度比为24∶1；

e.在上述得到的上清液中，加入上清液一倍体积的无水乙醇，颠倒混合，-20℃放置10分钟后，12000rpm离心8分钟，沉淀DNA；

f.除去经步骤e的离心管中的液体，再用浓度为70％的乙醇漂洗2次，离心5-6秒，干燥后加30μL双蒸水，震荡混匀，离心5～6秒，然后加入DNA保存液10ul作为DNA模板保存液，4℃保存。