CN103966131A - 一种具有高肽酶活力的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有高肽酶活力的植物乳杆菌及其应用，属于微生物领域。本发明提供的植物乳杆菌于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.8243，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其作为附属发酵剂添加到原料乳中，能够能在成熟期内维持较高的活菌数，加速切达干酪蛋白质的降解，提高游离氨基酸含量，最终有利于加速奶酪成熟和风味的形成。

Description

一种具有高肽酶活力的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有高肽酶活力的植物乳杆菌及其应用，属于微生物领域。

背景技术

干酪是一种营养价值很高的发酵乳制品，它含有丰富的蛋白质、脂肪及全部的必须氨基酸、维生素和矿物质等，是最接近完善的食品。发酵乳是指液体乳中加入发酵剂，通过微生物的发酵作用，将乳糖转化为乳酸，降低了乳制品的pH值和酸度，赋予了乳制品特殊的口感和质地。干酪成熟的过程需经历一系列连续而复杂的生化反应，是由微生物和酶共同作用的过程，主要包括蛋白质水解、脂肪分解和乳糖代谢这三类最基本的生化反应。在这三个最基本的生化反应中，蛋白质水解是最复杂也是最重要的一种，通过这些复杂的变化，奶酪形成特有的风味。蛋白质的变化包括以下几个方面：原料乳中的蛋白质在凝乳酶的作用下水解，形成大分子量的水溶性酪蛋白衍生肽类或者中间肽类；酪蛋白衍生肽在发酵剂乳酸菌释放的蛋白酶作用下进一步分解，产生更小的肽类包括苦味肽；在发酵剂和非发酵剂菌株溶解后释放的肽酶作用下，逐步分解形成短肽或者游离的氨基酸；游离的氨基酸在发酵剂和非发酵剂菌株溶解后释放的转氨酶作用下形成风味前体酮酸类物质，再进一步转化形成胺类、酸类、醛类、醇类、酯类等风味物质，从而形成奶酪的特征风味。

切达奶酪属于硬质奶酪的一种，温和的口感更符合东方人的喜好，然而切达奶酪的成熟时间比较长，生产成本很高，若能缩短成熟期，将产生一定的经济效益。因此，加速切达奶酪成熟和风味的形成是有必要的。

乳杆菌是发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌，是一种存在于人类体内的益生菌。乳杆菌广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，而且植物乳杆菌易被人体吸收，相比动物源乳杆菌更具活力，在人体内可发挥其强大而稳定的生物功效。乳杆菌耐酸性强，能调节机体胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价，提高机体免疫力等。本发明筛选出一株具有高肽酶活力的植物乳杆菌，并证明了其对加速切达奶酪的成熟和风味形成有良好效果。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有高肽酶活力的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.8243，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述植物乳杆菌具有如下特点：

(1)在酸性(pH4.0)环境下生长良好；(2)在高盐浓度(3％NaCl)环境下生长良好；(3)能在低温环境下生长；(4)细胞自溶度较高；(5)菌株产酸能力不强；(6)细胞内总肽酶活力高。

本发明的另一个目的是提供所述植物乳杆菌在切达干酪制备中的应用，是将所述植物乳杆菌作为附属发酵剂添加到切达奶酪制作过程，加速奶酪的成熟和风味的形成。具体地，是将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在脱脂乳培养基中发酵得到凝乳，然后将凝乳添加到原料乳中。

具体技术方案为：

(1)原料乳的预处理：将合格的标准化原料乳进行巴氏杀菌，63℃-68℃下杀菌30min或者72℃下杀菌15秒，然后快速冷却到30℃-32℃；

(2)发酵剂的添加：在热杀菌后的10％(m/v)脱脂乳培养基中活化发酵剂菌株，30℃下活化培养10h-12h，再按1％-2％体积比的接种量接种到原料乳中，搅拌均匀；

(3)附属发酵剂的添加：在热杀菌后的10％(m/v)脱脂乳培养基中活化附属发酵剂，30℃下活化培养12h，然后按1％-5％体积比的接种量接种到原料乳中，搅拌均匀、静置，直到酸度降低至2.22°T左右；

(4)凝乳酶的添加：待酸度合适后，将凝乳酶溶解于水后添加到牛乳中，凝乳酶的添加量是按质量比0.001％-0.002％，搅拌均匀，凝乳一段时间；

(5)切割凝乳、加热搅拌及排除乳清：待凝乳充分形成后，进行切割；升温至38℃-39℃并保温30min-45min，当pH降至6.1左右时，排除全部的乳清；

(6)凝块的堆酿：排除乳清后，挤压形成凝块，然后将凝块切割成两块并定时翻转，每10min-15min翻面，翻转三次后将两块凝块堆起，在此过程中测定排除的乳酸酸度，当pH＝5.2-5.4，酸度为55.56°T-66.67°T时，堆酿结束；

(7)切碎与加盐：堆酿结束后，将干酪块切割成小颗粒，在30℃-32℃下，按干酪块2.2％-2.7％(质量比)的添加量分两次加入NaCl，并不断搅拌；

(8)压榨成型：室温下，将适量干酪粒放入模具中，用一定重量的物体进行压榨15h-18h；

(9)真空包装、成熟：压榨完成后，进行真空包装，然后置于4℃-10℃环境下进行成熟。所述发酵剂来源于丹尼斯克公司，产品型号：CHOOZIT RA21LYO。

所述凝乳酶来源于丹尼斯克公司，产品编号：MARZYME150。

所述植物乳杆菌在促进干酪蛋白质水解中的应用也属于本发明要求保护的范围。

本发明提供的植物乳杆菌具有高肽酶活性，将其作为附属发酵剂用于切达奶酪制作中，能在成熟期内维持较高的活菌数，加速切达干酪蛋白质的降解，提高游离氨基酸含量，最终有利于加速奶酪成熟和风味的形成。添加附属发酵剂植物乳杆菌CGMCC NO.8243得到的干酪的水溶性氮、5％PTA-SN和12％TCASN的含量高，可有效提高蛋白分解程度，增加游离氨基酸含量，从而缩短干酪成熟周期，降低生产成本。

生物材料保藏

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.8243，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1表示植物乳杆菌菌株在pH4.0的条件下的生长情况。

图2表示在不同浓度的NaCl条件下植物乳杆菌的生长情况。

图3表示植物乳杆菌的自溶度。

图4表示植物乳杆菌的总肽酶活力。

图5为成熟期间各干酪中微生物变化。

图6为成熟期间各干酪pH值变化。

图7为干酪在成熟期内蛋白质水解情况，A组是只添加发酵剂的切达干酪，B组是添加发酵剂和附属发酵剂的切达干酪。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1菌株的分离及鉴定

1)样品稀释液的制备及细菌分离

无菌操作将25g泡菜到盛有225mL无菌的生理盐水的均质杯内进行均质，8000r/min下离心1min～2min，制成1:10样品液。再用lml无菌枪头吸取样品处理液1ml加入9ml灭菌生理盐水中，震荡混匀即成10^-2稀释液，依次类推，连续稀释至10^-4。在10^-2、10^-3、10^-4梯度分别吸lml稀释液到培养皿中，并倒入50℃左右MRS琼脂培养基，混匀，37℃培养48h。

2)菌株初步纯化

用接种针挑取平皿表面及底部圆形的乳酸菌疑似单菌落，在MRS平板培养中划线接种，37℃培养48h。

3)革兰氏染色

挑取单菌落，做革兰氏染色实验，在光学显微镜下观察并记录现象，将革兰氏阳性菌平板纯化四代，镜检后转斜面贮藏，分离得到菌株CCFM412。

4)菌株的16srDNA序列分析

利用细菌16srDNA通用引物，扩增得到16SrDNA序列长度为1454bp；其16srDNA序列在NIBC中进行同源性比对后发现，该菌株与植物乳杆菌属具有100％同源性，结果显示该菌株属于植物乳杆菌属。所得植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.8243，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例2菌种特性验证

1、耐酸性实验

将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM412接种于MRS培养基中，37℃下培养24h，再经MRS培养液传代培养2～3次后，取得到的菌液1.0mL，用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗两次并重悬在PBS中，再与9.0mL pH值分别为4.0、5.0、6.0的MRS进行混合，37℃下培养24h，分别测定不同酸性环境下植物乳杆菌CCFM412的OD₆₀₀值。

实验结果见附图1，结果表明植物乳杆菌CFM412在pH4.0的酸性条件下培养24h后OD₆₀₀值增加量为0.6794，具有较好的耐酸能力。

2、耐盐性实验

将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM412接种于MRS培养基中，37℃下培养24h，再经MRS培养液传代培养2～3次后，取得到的菌液1.0mL，用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗两次并重悬在PBS中，与9.0mL NaCl浓度分别为0％、2％、4％、6％的MRS进行混合，37℃下培养24h，分别测定不同环境下植物乳杆菌CCFM412的OD₆₀₀值。

实验结果见附图2，结果表明植物乳杆菌CFM412在盐浓度为4％的条件下培养24h后OD₆₀₀值增加量为0.8871，在盐浓度为6％的条件下培养24h后OD₆₀₀值增加量为0.7509，具有较好的耐盐能力。

3、低温条件下生长情况

将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM412接种于MRS培养基中，37℃下培养24h，再经MRS培养液传代培养2～3次后，取得到的菌液1.0mL，与19mL的MRS混合后，分别在5℃、10℃、15℃下培养24h，观察菌株在低温条件下的生长情况。

实验结果如表1，结果表明植物乳杆菌CFM412能在低温条件下生长。

表1菌株低温条件生长情况

注:“-+”代表略有生长，“+”代表生长，“++”代表生长良好

4、细胞自溶度的测定

将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM412接种于MRS培养基中，37℃下培养24h，再经MRS培养液传代培养2～3次后，按2％(V/V)的接种量接种于液体MRS中培养18h，取出菌体培养液并冷冻离心(5000g，15min，4℃)，将所得菌体悬浮于pH7.0的0.05mol/L磷酸钠缓冲液中，以磷酸钠缓冲液作为空白对照，调节菌体悬浮液的初始OD₆₀₀为1.0左右。将悬浮液和空白试剂置于30℃下6h，分别测定初始、3h、6h、24h的OD₆₀₀，分别记作OD₀、OD₃、，OD₆、OD₂₄。菌体自溶度计算方法如下：

自溶度(％)＝OD₀-OD_n/OD₀×100％

其中，OD_n表示测定时间n对应的OD值，n为3，6，24.

实验结果见附图3，结果表明植物乳杆菌CFM412在30℃条件下培养3h、6h、24h后细胞自溶度分别为13.96％，17.73％，25.48％，具有较高的自溶度。

5、产酸能力

将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM412接种于MRS培养基中，37℃下培养24h，再经MRS培养液传代培养2～3次后，按2％(V/V)的接种量接种于液体MRS中培养18h，取出菌体培养液并冷冻离心(5000g，15min，4℃)，将所得菌体悬浮于pH7.0的0.05mol/L磷酸钠缓冲液中，以磷酸钠缓冲液作为空白试剂，调节菌体悬浮液的初始OD₆₀₀为1.0左右。将含菌体的缓冲液按2％(v/v)的接种量接入脱脂培养基中，37℃下培养18h，测定脱脂乳培养基的初始pH(pH₀)和脱脂乳培养基的pH(pH₁)，以△pH＝pH₀-pH₁计算得到菌株的产酸能力。向培养基中添加磷酸钠缓冲液作为对照。

实验结果见表2，结果表明植物乳杆菌CFM412在37℃条件下培养18h后脱脂培养基的△pH＝0.84，相比发酵剂菌株具有较低的产酸能力。

表2菌株产酸能力

6、细胞内总肽酶活力测定

将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM412接种于MRS培养基中，37℃下培养24h，再经MRS培养液传代培养2～3次后，按2％(V/V)的接种量接种于液体MRS中增殖培养18h，取出菌体培养液并冷冻离心(5000g，15min，4℃)，将所得菌体悬浮于pH7.0的0.05mol/L磷酸钠缓冲液中，-80℃下反复冻融，再用0.22μm的玻璃珠进行细胞破碎，然后冷冻离心(20000g，10min，4℃)，收集上清液，即为菌体无细胞提取液(CFE)，取适量CFE采用考马斯亮蓝G-250方法测定其蛋白质含量，其余CFE保存于-20℃下。

精确配制2.0mmol/L的亮氨酸溶液，稀释得到一系列不同浓度的亮氨酸溶液，加入2mL镉-茚三酮试剂，85℃下水浴10min后，室温下冷却，在λ＝507nm处测定吸光度值，制作氨基酸含量的标准曲线。按10g/L的含量将酪蛋白溶解于0.05mmol/L的柠檬酸钠溶液(pH5.4，含2g/L的叠氮钠)中，85℃下加热10min，冷却至30℃，按120mg/ml的量加入凝乳酶(加入前以1:20的比例溶解在pH5.4的柠檬酸钠溶液中)，30℃下酶解24h，85℃下热处理10min，使凝乳酶失活。用pH7.0的0.05mol/L的柠檬酸钠溶液调节pH为6.0，用0.2μm膜过滤，即得总肽酶活力测定的反应底物，保存于-20℃下备用。在100μL的反应底物中加入蛋白含量100μg的菌体无细胞提取液，30℃下酶解24h，加入2mL镉-茚三酮试剂，85℃下水浴10min，室温下冷却后，在λ＝507nm处测定吸光度值，根据氨基酸标准曲线，可得酶解液的总游离氨基酸浓度。

实验结果见图4，结果表明植物乳杆菌CFM412细胞内总肽酶活力为9.240U，相比其他菌株具有很高的总肽酶活力。

通过上述实验证明，本发明的植物乳杆菌CCFM412具有下述性质：具有耐酸性，在低pH下可以生长；具有耐盐性，在高盐条件下可以生长；可以在低温条件下生长；细胞具有高自溶度；产酸能力不强；细胞内总肽酶活力高。

实施例2切达干酪的制备

切达干酪的生产工艺如下：原料乳(江苏省无锡市天资乳业，新鲜牛乳)进行巴氏灭菌后冷却至31℃，添加发酵剂和附属发酵剂，31℃下保温30-40min，添加一定量的凝乳酶凝乳一段时间，切割凝块成1cm边长的正方体颗粒后，以5℃/min的速度升温至39℃并缓慢搅拌，39℃下保温搅拌，排除乳清，对凝块进行堆酿，将凝块切碎以干法加盐，进行压榨后真空包装，再置于4℃-10℃环境下进行成熟。

实验设计两组，A组是只加入发酵剂制得的切达干酪，B组是通过添加发酵剂和附属发酵剂共同制得的切达干酪。

具体步骤如下:

(A)原料乳的预处理：购自于无锡天资乳业的合格的标准化的原料乳，30min内转运到实验室中，将合格的标准化原料乳进行巴氏杀菌，65℃下30min，然后快速冷却到31℃；

(B)发酵剂的添加：在热杀菌后的10％脱脂乳培养基中活化发酵剂菌株，30℃下12h，再按1％体积比的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀；

上述发酵剂来源于丹尼斯克公司(产品型号：CHOOZIT RA21LYO)

(C)附属发酵剂的添加：先将附属发酵剂在热杀菌后的10％脱脂乳培养基中进行活化，30℃下12h，然后按1％体积比的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀，静置，直至酸度降低到2.22°T左右；

(D)凝乳酶的添加：待酸度合适后，按0.002％质量比的添加量，将凝乳酶溶解于水后添加到牛乳中。搅拌均匀，凝乳30min；

(E)切割凝乳、加热搅拌及排除乳清：待凝乳充分形成后，即析出的乳清清澈时，进行切割，测定乳清酸度，乳清酸度为13.2°T，然后，升温至39℃并保温45min并缓慢搅拌，当pH降至6.1左右时，排除全部的乳清；

(F)凝块的堆酿：排除乳清后，挤压形成凝块，然后将凝块切割成两块并定时翻转，每15min翻面，翻转三次后将两块凝块堆起。在此过程中测定排除的乳酸酸度，当pH＝5.2，酸度为60°T时，堆酿结束；

(G)切碎与加盐：堆酿结束后，将干酪块切割成1cm³的小颗粒，在31℃下，按干酪块重量的2.2％分两次采用干法加盐加入NaCl，并不断搅拌；

(H)压榨成型：室温下，将适量干酪粒放入模具中，用50kg的桶装水进行压榨18h；

(I)真空包装、成熟：压榨完成后，进行真空包装。然后置于8℃环境下进行成熟。

实施例3干酪的微生物及理化特性分析

理化指标是为了衡量本发明制备的干酪在符合规定范围内。蛋白分解程度是衡量成熟的标准之一，分解程度高才利于分解出更多小分子物质，利于风味的形成。以下均检测获得的A组和B组干酪在成熟期的各项指标(自制作得到新鲜干酪起记作成熟期的第0个月)，其后每隔一个月对奶酪样品进行分析测定。

1.微生物分析

在A组干酪和B组干酪成熟期中的第0个月，1个月，2个月，3个月4个月，5个月分别取样(取干酪中心区域样品0.5g，放入9ml灭菌生理盐水中,震荡混匀即成10^-1稀释液，依次类推，连续稀释至10^-8，选取三个梯度分别吸l ml稀释液至于培养皿中,并倒入MRS琼脂培养基，混匀，37℃下恒温培养箱中培养48h。)，测定干酪中菌落数目。

结果如图5所示，可以看出,随着成熟时间延长,A组干酪中的发酵剂数目从log＝10.19cfu/g奶酪下降至log＝7.31cfu/g奶酪；在B组干酪中，发酵剂数目从log＝10.06cfu/g奶酪下降至log＝7.18cfu/g奶酪，而附属发酵剂数目在前三个月增长明显，从log＝7.80cfu/g奶酪升高至log＝8.93cfu/g奶酪，三个月之后，没有明显变化。因此，添加附属发酵剂的干酪能在成熟期内维持较高的活菌数，有利于加速奶酪成熟和风味的形成。

2.干酪理化指标的测定

1)干酪pH值测定

在A组干酪和B组干酪成熟期第0个月，1个月，2个月，3个月4个月，5个月分别取10g干酪,6000r/min下匀浆1min,用40℃蒸馏水处理,浸提水和样品收集到100mL容量瓶中,将混合物强力振荡,调整至室温(25℃),加蒸馏水至刻度,过滤。滴定酸度采用0.1M氢氧化钠溶液中和滴定,用pH计测定pH值。

结果如图6所示，可以看出，pH的整体变化趋势是先下降后升高，然后趋于平缓。在第三个月，A组奶酪和B组奶酪都降低到较低的pH值，而且B组奶酪具有更低pH值，分析是由于其维持有较高的活菌数，乳酸菌产酸使pH降低，三个月后A和B组奶酪均具有较低pH值。在20℃的成熟环境下，附属发酵剂CCFM410对奶酪体系中贡献了部分酸。

2)水分的测定(中华人民共和国国家标准硬质干酪检验方法GB5421-85)

将称量皿置于烘箱中，105℃下烘干至恒重。分别称入通过搅拌机搅碎的A组干酪颗粒(贮存第1天)和B组干酪颗粒(贮存第1天)2-3g(准确至0.2mg)，干酪样品在105℃的烘箱内干燥两次重量差不大于2mg为止，计算出干酪中的水分百分含量。水分含量计算公式如下：

水分(％)＝(W1一W2)/(W1一W)×100

式中:W一称量皿重量，g；

W1一称量皿和样品重，g；

W2一称量皿和干燥后样品重，g

结果如表3所示。

3)脂肪测定(哥特里一罗兹法测定)

分别称取1.00g研碎的A组干酪和B组干酪(贮存第1天),加到10ml的70℃温水中，沸水浴至其溶解,再加入1.25ml氨水，充分混匀，沸水浴5min，再振摇2min，加入10ml乙醇，充分摇匀，于冷水中冷却后加入25ml乙醚，振摇0.5min加入25ml石油醚，再振摇0.5min，静置30min，待上层液澄清时，读取醚层体积。放出醚层至一已恒重的烧杯中，置沸水浴上挥干醚类物质，于105℃烘箱中干燥1h后称量，再置烘箱中干燥1h后称量,至前后两次质量差不超过l mg。

X＝(M1-M0)×V×100/25×M

x一样品中脂肪含量，％

M0一烧杯质量，g

M1一烧杯加脂肪的质量，g

M一样品质量，g

V一读取醚层体积，ml

结果如表3所示。

4)蛋白质含量的测定

取成熟期第0个月(贮存第1天)A组干酪和B组干酪进行总氮测定:凯氏定氮，GBSOO9.5-2003(样品不用处理，直接称取0.2g左右)结果如表3所示:

表3奶酪的理化成分测定结果

3、蛋白质水解程度的测定

分别在A组干酪和B组干酪成熟期开始的第0个月，1个月，2个月，3个月4个月，5个月取样进行水溶性氮含量和12％TCA可溶性氮含量的测定，具体操作如下:

(1)水溶性测定:分别准确称取0.75gA组和B组干酪，加入25mLpH4.6的醋酸盐缓冲溶液(0.2mol/L,pH4.6,54.44g乙酸钠加入23ml冰乙酸,定容至2L)，将干酪充分磨碎,再用25mL的缓冲液充分冲洗,悬浮液在4000rpm的离心机中离心20min,取上清液定容移入凯氏消化瓶,进行微量凯氏定氮,以可溶性氮含量占干酪总氮量的百分数(％)表示。

结果如图7中(A)所示，可以看出，随成熟时间延长，两组干酪的水溶性氮含量增加，但是增加程度逐渐变小，表明蛋白质的分解程度逐渐趋于平缓。相比于A组干酪，B组干酪的水溶性氮含量更高。水溶性氮主要是凝乳酶和蛋白酶的作用引起的一定的蛋白质降解。由于附属发酵剂的添加，干酪pH不同，酶的作用效果不同，所以，初始水溶性氮含量不同，但没有差异(P<0.05)。

(2)12％TCA-SN测定:准确称取1.5g干酪，加入25mL12％的TCA溶液，将干酪充分磨碎，再用20mL的缓冲液(质量分数为12％的TCA溶液，取12g三氯乙酸溶解到到100ml的蒸馏水中)充分冲洗，悬浮液进行离心，4000rpm下20min，取上清液定量移入凯氏消化瓶，进行微量凯氏定氮，并以12％TCA-SN含量占干酪总氮量的百分数(％)表示。

结果如图7中(B)所示,可以看出，随成熟时间延长，两组干酪的12％TCA检测的可溶性氮含量增加，相比于A组干酪，B组干酪具有较高的非蛋白氮含量。四个月后两组干酪的非蛋白氮含量差异显著(p<0.05),B组干酪的非蛋白氮的含量为10.53％，A组干酪中的非蛋白氮含量为9.39％,这表明成熟干酪的次级蛋白质降解,高、中分子量肽类被降解成低分子量肤类以及氨基酸等。因此，添加CCFM412菌株可有效提高蛋白分解程度，加速干酪成熟的作用。

(3)5％PTA-SN测定:准确量取10ml奶酪水溶性部分，加入2.5mL20％(w质量/v体积)的TCA溶液中混匀，在室温下静置30min，混合液在4000rpm的离心机中离心20min，取上清液定量移入凯氏消化瓶，进行微量凯氏定氮，并以5％PTA-SN含量占干酪总氮量的百分数(％)表示。

结果如图7中(C)所示，可以看出，B组干酪的5％PTA检测的可溶性氮含量随着成熟时间延长逐渐增加，与A组干酪相比，B组干酪中的含量更高。5％PTA-SN一定程度上表征了游离氨基酸含量。三个月后两组干酪的5％PTA-SN含量差异显著(p<0.05)，这表明附属发酵剂的添加，促进了体系中游离氨基酸的释放。因此，添加CCFM412菌株可提高游离氨基酸含量，加速干酪成熟的形成。

以上实验证明了CCFM412菌株可加速切达干酪蛋白质的降解，从而加速干酪的成熟。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一株具有高肽酶活力的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.8243，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述植物乳杆菌在促进干酪蛋白质水解中的应用。

3.权利要求1所述的植物乳杆菌在加速切达干酪成熟中的应用。

4.一种应用权利要求1所述植物乳杆菌制备干酪的方法，其特征在于，是向原料乳中加入附属发酵剂植物乳杆菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将附属发酵剂植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在脱脂乳培养基中发酵得到凝乳，再将凝乳加入到原料乳中。

6.权利要求4所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)原料乳的预处理：将标准化原料乳进行巴氏杀菌，63℃-68℃下杀菌30min或者72℃下杀菌15秒，然后快速冷却到30℃-32℃；

(2)发酵剂的添加：在热杀菌后的10％脱脂乳培养基中活化发酵剂菌株，30℃下10h-12h，再按1％-2％体积比的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀；

(3)附属发酵剂的添加：先将附属发酵剂在热杀菌后的10％脱脂乳培养基中进行活化，30℃下12h，然后按1％-5％体积比的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀，静置，到酸度降低至2.22°T左右；

(4)凝乳酶的添加：待酸度合适后，添加凝乳酶，搅拌均匀，凝乳一段时间；

(5)切割凝乳、加热搅拌及排除乳清：待凝乳充分形成后，进行切割；升温至38℃-39℃并保温30min-45min，当pH降至6.1左右时，排除全部的乳清；

(6)凝块的堆酿：排除乳清后，挤压形成凝块，然后将凝块切割成两块并定时翻转，每10min-15min翻面，翻转三次后将两块凝块堆起，在此过程中测定排除的乳酸酸度，当pH＝5.2-5.4，酸度为55.56°T-66.67°T时，堆酿结束；

(7)切碎与加盐：堆酿结束后，将干酪块切割成小颗粒，在30℃-32℃下，按干酪块2.2％-2.7％的添加量分两次加入NaCl，并不断搅拌；

(8)压榨成型：室温下，将适量干酪粒放入模具中，用一定重量的物体进行压榨15h-18h；

(9)真空包装、成熟：压榨完成后，进行真空包装，然后置于4℃-10℃环境下进行成熟。

7.权利要求1所述植物乳杆菌在奶酪制备中的应用。