CN104450578B - 一种高产癸酸乙酯的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

一种高产癸酸乙酯的植物乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产癸酸乙酯的植物乳杆菌及其应用，属于微生物学领域。本发明提供的植物乳杆菌CGMCC No.9739(1)具有耐酸性，在酸性(pH 4.0)环境下生长良好；(2)具有耐胆盐能力，在1‑3‰胆盐环境下生长良好；(3)细胞自溶度较高；(4)菌株产酸能力不强；(5)细胞内癸酸乙酯合成能力高；(6)细胞内癸酸乙酯分解能力弱。

Description

一种高产癸酸乙酯的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种高产癸酸乙酯的植物乳杆菌及其应用，尤其是该菌在乳制品中的应用，属于微生物学领域。
背景技术
乙酯类物质尤其是C2-C10的乙酯类物质在低浓度时，对发酵乳制品整体风味的平衡起促进作用，能够赋予奶酪果香风味，如苹果味、香蕉味、菠萝味等特征风味。拥有果香风味的发酵乳制品能够吸引中国消费者，增强发酵乳制品在中国的发展前景。目前研究发现，发酵乳制品中癸酸乙酯物质的合成途径主要是通过酯化反应和醇解反应进行的。酯化反应是脂肪酸(C2-C10)与乙醇在酯酶的作用下进行；醇解反应是甘油三酯(C2-C10)与乙醇在醇酰基转移酶的作用下进行；其中，酯酶除了拥有合成酯的能力，还具有降解酯的能力。因此影响发酵乳制品中乙酯合成的因素主要有1、底物：脂肪酸和乙醇；2、酶：酯酶和醇酰基转移酶。
为了提高发酵乳制品中乙酯的含量，国外学者Romain Richoux等人(RomainRichoux,Marie-Bernadette Maillard et al.,(2008).Enhancement of ethyl esterand flavour formation in Swiss cheese by ethanol addition(International DairyJournal).1140–1145.)发现通过添加乙醇能够提高发酵乳制品——奶酪中乙酯的含量，但是并未考虑代谢过程中微生物细胞内酶活对乙酯合成的影响。此外，乳杆菌是一类革兰氏阳性、无芽孢杆菌，能够代谢糖类发酵产生乳酸，广泛存在于发酵乳制品以及人肠道中，是食品工业上的常用菌种，在发酵乳制品中乳杆菌是应用范围最广的一类菌株。随着乳杆菌在人们健康饮食中扮演的角色越来越重要，筛选出一株具有高乙酯合成能力的乳杆菌，将其应用到发酵乳制品中具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种具有高产癸酸乙酯能力的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，于2014年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.9739，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
所述的植物乳杆菌CGMCC No.9739具有下述性质：(1)具有耐酸性，在酸性(pH4.0)环境下生长良好；(2)具有耐胆盐能力，在1-3‰胆盐环境下生长良好；(3)细胞自溶度较高，24h时达到18.2％；(4)菌株产酸能力不强，18h后pH变化0.63±0.02；(5)细胞内癸酸乙酯合成能力高，24h癸酸乙酯产量达到44.91±0.83μg/mg细胞总蛋白；(6)细胞内癸酸乙酯分解能力低，每分钟催化每克蛋白产0.15±0.00μmol对硝基苯酚。
本发明提供的植物乳杆菌CGMCC No.9739可应用于奶酪、发酵乳和乳酸菌乳饮料等的制备。
本发明还提供了一种制备植物乳杆菌CGMCC No.9739直投式工作发酵剂的方法：植物乳杆菌CGMCC No.9739以1-3％的接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃培养20-24h，使得植物乳杆菌CGMCC No.9739活菌数达到108cfu/mL以上，进行离心处理，离心条件：4000rpm、10min、4℃，用pH7.0的PBS缓冲液冲洗沉淀2次后，加入冻干保护剂，调整细胞浓度至109cfu/mL，混合均匀后进行真空冷冻干燥，冻干后即得所述的植物乳杆菌CGMCCNo.9739直投式工作发酵剂。
本发明还提供了一种应用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备卡门贝尔奶酪的方法：将经过巴氏杀菌的牛乳冷却至32℃(在奶酪的后续操作过程中保持该温度)，加入发酵剂和霉菌发酵剂，预酸化一段时间后，加入附属发酵剂植物乳杆菌CGMCC No.9739，搅拌均匀。然后加入凝乳酶进行凝乳。待凝乳完成后，进行切割操作，切割大小为1cm左右的正方体。切割结束后进行排乳操作，排乳过程需在1h内完成。将排除乳清的凝块装入塑料磨具中进行塑形和进一步排除乳清操作。待乳清pH达到5.4时，取出凝块进行盐渍处理。盐渍1h后取出晾干，放置恒温恒湿培养箱成熟。
本发明还提供了一种应用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备瑞士奶酪的方法：将经过巴氏杀菌的牛乳冷却至35℃(在奶酪的后续操作过程中保持该温度)，加入嗜热发酵剂和丙酸菌发酵剂，预酸化一段时间后，加入附属发酵剂植物乳杆菌CGMCC No.9739，搅拌均匀。然后加入凝乳酶进行凝乳。待凝乳完成后，进行切割操作。切割后保温静置一段时间，边搅拌边程序升温至54℃进行热烫处理，热烫时间45min后进行排乳处理。将排除乳清的凝块装入模具中进行塑形和进一步排除乳清操作，工作温度为50℃，持续时间为9h，每3h翻转一次。将排乳结束的凝块进行盐渍处理，温度为7℃，时间为2天，盐渍结束后取出晾干，放置恒温恒湿培养箱成熟。
本发明还提供了一种应用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备发酵乳的方法：(1)原料乳的获取，(2)向原料乳中加入8-12％的蔗糖，搅拌溶解；(3)将乳化稳定剂溶解后按以0.3％加入原料乳中，在18-22MPa下进行均质；(4)按照乳体积计3-5％，向乳中接入保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌CGMCC No.9739发酵剂(三者体积比为1：1：1)；(5)接种后的牛乳在37℃下进行发酵，发酵时间6-8h至凝乳。将凝乳后的酸乳放置于4℃成熟24h后，即得到所述的发酵乳。
本发明还提供了一种应用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备活性乳酸菌乳饮料的方法：将原料乳进行巴氏杀菌处理，冷却至42℃。按照乳体积计3-5％，向乳中接入保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌CGMCC No.9739工作发酵剂(三者体积比为1：1：1)。接种后的牛乳在42℃下进行发酵，发酵时间4-6h至凝乳。冷却搅拌后，加入其它配料(稳定剂、乳化剂、螯合剂)。均质后包装即得到所述的发酵乳。
本发明的有益效果是：
1、安全健康，成本低廉：本发明中所述的植物乳杆菌CGMCC No.9739是可用于食品的安全菌株，可用于制备食品用发酵剂，制得的乳制品相较通过直接添加酯类物质等，生产成本小、绿色天然，营养健康。
2、本发明植物乳杆菌CGMCC No.9739能有效提高发酵乳制品中癸酸乙酯物质的含量，且对产品感官品质特性具有一定的改善作用。
生物材料保藏
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2014年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.9739，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1表示植物乳杆菌菌株在不同pH条件和不同浓度的胆盐条件下的生长情况。
图2表示植物乳杆菌的自溶度。
图3表示添加或者不添加植物乳杆菌CGMCC No.9739的卡门贝尔奶酪中乙酯合成能力；不同字母表示不同组别间具有显著性差异(P≤0.05)。
图4表示添加或者不添加植物乳杆菌CGMCC No.9739的卡门贝尔奶酪的风味评价。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1未添加植物乳杆菌CGMCC No.9739的卡门贝尔奶酪
卡门贝尔奶酪的生产工艺如下：原料乳经巴氏灭菌后迅速冷却至32℃，添加发酵剂(乳酸乳球菌-MA 14 LYO,Danisco)和霉菌发酵剂(卡地青霉-PC 12 LYO 20 D,Danisco和白地霉-GEO17 LYO 2 D,Danisco)，在32℃条件下保温30-40min，向牛乳中加入800μg/g的乙醇后添加一定量的凝乳酶凝乳45min，将凝块切割成1cm边长的正方体颗粒后，32℃后保温愈合后缓慢搅拌，排除乳清，对凝块装在模具中的奶酪进行压榨塑形，进一步排除乳清。乳清排除后，将干酪晾置一段时间，进行盐渍处理。再放置在一定温度下进行成熟。
具体步骤如下:
A)原料乳的预处理：购自于无锡天资乳业的合格的标准化原料乳。在63℃-68℃下巴氏杀菌30min后，快速冷却到30℃-32℃。
B)发酵剂和霉菌发酵剂的添加：发酵剂菌株在经过热杀菌的10％脱脂乳培养基中30℃活化10h-12h，以2％(体积比)的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀，霉菌发酵剂直接添加2％。
C)凝乳酶的添加：当酸度达到要求后，凝乳酶以0.001％-0.002％的添加量添加到牛乳中，搅拌均匀，凝乳一段时间。上述凝乳酶来源于丹尼斯克公司(产品编号：MARZYME150)。
D)切割凝乳、加热搅拌及排除乳清：凝乳酶添加后，待凝乳充分形成，即可进行切割。凝块切割大小为1-2cm左右的正方体，32℃愈合1h后，排除乳清。
E)入模与盐渍：排除乳清后，将凝块装入塑料模具中，塑形并继续排除乳清。在此过程中经常测定排除的乳清pH值，当乳清达到pH＝5.4时，入模结束。将干酪放入21％的盐水中进行盐渍1h，取出晾干30min。
F)成熟：盐渍结束后的干酪，放入恒温恒湿培养箱中进行成熟。成熟环境：14℃。90％相对湿度，14天后用锡箔纸进行包装。成熟时间为1个月。
实施例2添加植物乳杆菌CGMCC No.9739的卡门贝尔奶酪
1、植物乳杆菌CGMCC No.9739直投式工作发酵剂的制备。
植物乳杆菌CGMCC No.9739以1-3％的接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃培养20-24h，使得植物乳杆菌CGMCC No.9739活菌数达到108cfu/mL以上，进行离心处理，离心条件：4000rpm，10min，4℃，用pH7.0的PBS缓冲液冲洗沉淀2次后，加入冻干保护剂，调整细胞浓度至109cfu/mL，混合均匀后进行真空冷冻干燥，冻干后即得所述的植物乳杆菌CGMCCNo.9739直投式工作发酵剂。
2、含有植物乳杆菌CGMCC No.9739的卡门贝尔奶酪的制作
卡门贝尔奶酪的生产工艺如下：原料乳经巴氏灭菌后迅速冷却至32℃，添加发酵剂、霉菌发酵剂和植物乳杆菌CGMCC No.9739直投式工作发酵剂，在32℃条件下保温30-40min，向牛乳中加入800μg/g的乙醇后添加一定量的凝乳酶凝乳45min，将凝块切割成1cm边长的正方体颗粒后，32℃后保温愈合后缓慢搅拌，排除乳清，对凝块装在模具中的奶酪进行压榨塑形，进一步排除乳清。乳清排除后，将干酪晾置一段时间，进行盐渍处理。再放置在一定温度下进行成熟。
具体步骤如下:
A)原料乳的预处理：
标准化原料乳在63℃-68℃下巴氏杀菌30min后，快速冷却到30℃-32℃。
B)发酵剂和霉菌发酵剂的添加
发酵剂和霉菌发酵剂菌株在经过热杀菌的10％脱脂乳培养基中30℃活化10h-12h，以2％(体积比)的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀。
C)附属发酵剂的添加
植物乳杆菌CGMCC No.9739作为附属发酵剂，在经过热杀菌的10％脱脂乳培养基中30℃活化12h后，以2％-5％体积比的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀，静置一段时间，至pH降低0.2左右。
D)凝乳酶的添加
当酸度达到要求后，凝乳酶以0.001％-0.002％的添加量添加到牛乳中，搅拌均匀，凝乳一段时间。上述凝乳酶来源于丹尼斯克公司(产品编号：MARZYME 150)
E)切割凝乳、加热搅拌及排除乳清
凝乳酶添加后，待凝乳充分形成，即可进行切割。凝块切割大小为1-2cm左右的正方体，32℃愈合1h后，排除乳清。
F)入模与盐渍
排除乳清后，将凝块装入塑料模具中，塑形并继续排除乳清。在此过程中经常测定排除的乳清pH值，当乳清达到pH＝5.4时，入模结束。将干酪放入21％的盐水中进行盐渍1h，取出晾干30min。
G)成熟
盐渍结束后的干酪，放入恒温恒湿培养箱中进行成熟。成熟环境：14℃。90％相对湿度，14天后用锡箔纸进行包装。成熟时间为1个月。
3、奶酪中乙酯含量的检测
将实施例1和实施例2中的奶酪样品于室温下粉碎后，取3g立即装入20mL的萃取小瓶中，同时加入内标1μL庚酸甲酯(27.38mg/ml)，采用固相微萃取方法对各奶酪进行风味成分的提取。自动进样装置将萃取头CAR/PDMS(涂抹厚度为85um)插入密封的萃取瓶中，萃取头暴露在样品上部的空气中，于40℃萃取40分钟。
气谱条件为：毛细管柱为HP Innowax。柱长及口径选择：30m×0.25mm×0.25mm，载气为氦气，进口温度为250℃，分流比25，柱流速为1mL/min；程序升温：初始温度为35℃，5min；以5℃/min升温至220℃，保持5min。
质谱条件为：离子化方式为EI，发射电流为200μA，发射能量为70eV，接口温度为280℃，离子源温度为200℃，质量扫描范围为15-500。
结果见图3。由图3可知，在卡门贝尔奶酪制作过程中添加植物乳杆菌CGMCCNo.9739发酵剂，可使所生产的奶酪中乙酯含量与对照相比，从116.82ng/g显著提高到了234.39ng/g。这主要是在相同含量的乙醇背景下，由于酯酶合成活力和醇酰基转移酶活力高，促进了酯化反应和醇解反应的进行，使得代谢生成的癸酸乙酯物质显著提高。
4、奶酪感官分析
10名经过培训的专业感官评价人员对实施例1和实施例2制备的卡门贝尔奶酪作感官评价(1-3分(弱)；4-7分(中等)；8-10分(强))，评价结果如图4所示。图4-A的滋味感官评价的结果显示添加植物乳杆菌CGMCC No.9739发酵剂后滋味较未发酵的奶酪有更多的果香味。图4-B的气味感官评价的结果显示添加植物乳杆菌CGMCC No.9739发酵剂后气味较未发酵的奶酪有更多的果香味。
实施例3使用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备瑞士奶酪
将经过巴氏杀菌的牛乳冷却至35℃(在奶酪的后续操作过程中保持该温度)，加入嗜热发酵剂和丙酸菌发酵剂，预酸化一段时间后，加入下述制备的植物乳杆菌CGMCCNo.9739附属发酵剂，搅拌均匀。然后加入凝乳酶进行凝乳。待凝乳完成后，进行切割操作。切割后保温静置一段时间，边搅拌边程序升温至54℃进行热烫处理，热烫时间45min后进行排乳处理。将排除乳清的凝块装入模具中进行塑形和进一步排除乳清操作，工作温度为50℃，持续时间为9h，每3h翻转一次。将排乳结束的凝块进行盐渍处理，温度为7℃，时间为2天，盐渍结束后取出晾干，放置恒温恒湿培养箱成熟。
结果：瑞士奶酪基本理化组分没有改变，但癸酸乙酯含量显著提高，果香风味得到增强。
实施例4使用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备发酵乳
A)原料乳的获取：购自于无锡天资乳业的合格的标准化原料乳。
B)向原料乳中加入8-12％的蔗糖，搅拌溶解。
C)将乳化稳定剂溶解后按以0.3％加入牛乳中，在18-22MPa下进行均质。
D)按照乳体积计3-5％向乳中接入保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和上述制备的植物乳杆菌CGMCC No.9739工作发酵剂(其体积比为1：1：1)
E)接种后的牛乳在37℃下进行发酵，发酵时间6-8h至凝乳。将凝乳后的酸乳放置于4℃成熟24h后，即得到所述的发酵乳。
结果：发酵乳中癸酸乙酯含量显著提高，果香风味得到增强。
实施例5使用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备活性乳酸菌乳饮料
将原料乳进行巴氏杀菌处理，冷却至42℃。按照乳体积计3-5％向乳中接入保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和上述制备的植物乳杆菌CGMCC No.9739工作发酵剂(三菌体积比为1：1：1)。接种后的牛乳在42℃下进行发酵，发酵时间4-6h至凝乳。冷却搅拌后，加入其它配料(稳定剂、乳化剂、螯合剂)。均质后包装即得到所述的发酵乳。
结果：乳酸菌乳饮料中癸酸乙酯含量显著提高，果香风味得到增强。
实施例6植物乳杆菌CGMCC No.9739在直投式发酵剂制备中的应用
植物乳杆菌CGMCC No.9739直投式发酵剂含有活菌数在109-1010cfu/mL。该菌剂可直接加入到发酵乳制品中进行发酵，从而省略了传统继代式发酵剂使用过程中菌种活化等扩大培养过程，减少了菌种车间的成本和空间。
制备步骤如下：
1、植物乳杆菌CGMCC No.9739的活化：
从保存于-80℃的甘油管内吸取100～300μL植物乳杆菌CGMCC No.9739菌液，接种至1000mL MRS肉汤培养基中，于37℃恒温孵育24～48h；吸取200～500μL孵育后菌液接种至1000mL MRS肉汤培养基中，重复这一步骤2～4次得到活化的植物乳杆菌CCFM12菌液，使得植物乳杆菌CCFM12活菌数达到108cfu/mL以上。将活化后的菌液在4000rpm/min，10min，4℃条件下离心使菌体沉淀，弃去上清后用pH7.0的PBS缓冲液对菌体沉淀进行洗涤并重悬，重复这一步骤2～3次并弃去上清，得到菌体浓度在109～1010cfu/g的活性菌体。
2、直投式发酵剂的制备：
选择脱脂乳液作为冻干保护剂，将离心得到的菌体和脱脂乳液(10％的脱脂乳，混匀后在105℃10～15min湿热灭菌得到)按质量比1:10～1:20充分混匀，得到菌体浓度在108～109cfu/g的植物乳杆菌CGMCC No.9739脱脂乳悬浮液。将悬浮液置于-80℃冰箱中预冻2～3h，预冻完成后置于真空冻干机中冻干。即得到活菌浓度在109～1010cfu/g的冻干植物乳杆菌CGMCC No.9739菌粉发酵剂。
实施例7植物乳杆菌CGMCC No.9739的特性
植物乳杆菌CGMCC No.9739的菌种培养方法如下：
MRS平板纯化分离：无菌条件下用接种环挑取植物乳杆菌CGMCC No.9739，在MRS平板上划线，平板置于培养箱中37℃培养48h，挑取单菌落进行镜检，实现菌株纯种分离。
菌株活化：从-70℃冰箱中取出冻藏菌株，融化后取100微升菌液接种于灭菌的MRS液体培养基中，在温度37℃下生长18h，划线，在固体MRS中37℃下培养48h，挑选单菌落接种于灭菌的MRS液体培养基，活化三代后进行实验。
MRS培养基组成：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母提取物、20g葡萄糖、5g乙酸钠、2g磷酸氢二钾、2g柠檬酸二胺、0.1g硫酸镁、0.05g硫酸锰、1g吐温80与1000mL蒸馏水，pH6.2-6.4，该培养基在115℃下灭菌20min。
培养条件：厌氧条件37℃下静置培养。
1、耐酸性实验
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CGMCC No.9739接种于MRS培养基中，在37℃下培养24h，如此反复传代培养2～3次后，选取在上述条件下生长得到的菌液1.0mL，接种于9.0mL pH值分别为4.0、5.0、6.0的MRS培养基后，在37℃下进行培养24h，测定不同酸性环境下植物乳杆菌CGMCC No.9739的OD600值。通过测定OD600值的变化大小。
实验结果见图1，植物乳杆菌CGMCC No.9739在pH4.0的酸性条件下培养24h后OD值增加量为4.8819，具有较好的耐酸能力。
2、耐胆盐性实验
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CGMCC No.9739接种于MRS培养基中，在37℃下培养24h，如此反复传代培养2～3次后，选取在上述条件下生长得到的菌液1.0mL，接种于9.0mL胆盐浓度分别为0‰、2‰、3‰的MRS后，在37℃下进行培养24h，测定不同盐浓度环境下植物乳杆菌CGMCC No.9739的OD600值。实验结果见图1，植物乳杆菌CGMCC No.9739在2‰的高盐条件下培养24h后OD值增加量为6.4723，在3‰的条件下培养24h后OD值增加量为7.8218，具有较好的耐盐能力。
3、细胞自溶度的测定
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CGMCC No.9739接种于MRS培养基中，在37℃下培养24h，如此反复传代培养2～3次后，选取在上述条件下生长得到的菌液以2％(V/V)的接种量接入液体MRS中进行增殖培养12h，将菌体培养液取出，冷冻离心(5000g，15min，4℃)，将离心所得的菌体加入0.05mol/L的pH7.0的PBS缓冲液中制成悬浮液，调整初始OD600为1.0左右，用PBS缓冲液作为空白试剂调零。将悬浮液和空白试剂放置在30℃下6h，在600nm处分别测定初始、6h、24h的吸光度，分别记作OD0，OD6，OD24。菌体自溶度计算方法如下：
自溶度(％)＝OD0-ODn/OD0×100％；其中，ODn表示测定时间n对应的OD值，n为6、24。植物乳杆菌CGMCC No.9739在30℃条件下培养6h和24h后细胞自溶度分别为7.80％，18.12％，具有高的自溶度。
4、产酸能力
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CGMCC No.9739接种于MRS培养基中，在37℃下培养24h，如此反复传代培养2～3次后，选取在上述条件下生长得到的菌液以2％(V/V)的接种量接入脱脂乳中进行增殖培养18h，测定脱脂乳培养基的pH(pH1)和脱脂乳培养基的初始pH(pH0)，以ΔpH＝pH0-pH1计算得到菌株的产酸能力，植物乳杆菌CGMCC No.9739的△pH(24h)为1.32。
5、细胞内乙酯合成能力的测定
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CGMCC No.9739接种于MRS培养基中，在37℃下培养24h，如此反复传代培养2～3次后，选取在上述条件下生长得到的菌液以2％(V/V)的接种量接入液体MRS中进行增殖培养16h，将菌体培养液取出，冷冻离心(5000rpm，5min，4℃)，将离心所得的菌体悬浮于0.1mol/L的pH7.0的PBS缓冲液中，进行超声波破碎(功率40％，超声5s，停5s，超声20min)，将破碎后的细胞冷冻离心(5000rpm，5min，4℃)，收集上清液，即为菌体无细胞提取液(CFE)，取出一部分采用考马斯亮蓝G-250方法测定CFE中蛋白质含量，其余CFE放置在-20℃下备用。
酯酶(合成)活力测定的酶反应体系中包含0.1M PBS(pH 7.0)，5.5mM甘油三酯(三癸酸甘油酯)，5M乙醇和菌体无细胞提取液(蛋白浓度为1-3mg/ml)，30℃下反应17h后。用正己烷对1ml反应体系进行萃取，同时加入C17:0内标。离心(3000rpm，3min)后进行GC测定。GC条件设置如下：色谱柱DB-WAX(30m×0.32mm×0.25um)，FID检测。载气流量2mL/min，采用分流进样，分流比为15:1，进样口温度240℃。程序升温：40℃，保持3min，以5℃/min升至190℃，以4℃/min升温至220℃，并保持2min。1个酶活单位U：24h每克蛋白催化生成1μg癸酸乙酯。
醇酰基转移酶活力测定的酶反应体系包括0.1M PBS(pH 7.0)，5.5mM脂肪酸(癸酸)，5M乙醇和菌体无细胞提取液(蛋白浓度为1-3mg/ml)，30℃下反应17h后。用正己烷对1ml反应体系进行萃取，同时加入C17:0内标。离心(3000rpm，3min)后进行GC测定。GC条件设置如下：色谱柱DB-WAX(30m×0.32mm×0.25um)，FID检测。载气流量2mL/min，采用分流进样，分流比为15:1，进样口温度240℃。程序升温：40℃，保持3min，以5℃/min升至190℃，以4℃/min升温至220℃，并保持2min。1个酶活单位U：24h每克蛋白催化生成1μg癸酸乙酯。测得24h每克蛋白催化生成癸酸乙酯44.91±4.82μg。
6、细胞内乙酯分解能力的测定
酯酶(分解)活力测定的酶反应体系中包含0.1M PBS(pH 7.0)，25mM癸酸对硝基苯酯和菌体无细胞提取液(蛋白浓度为1-3mg/mL)，37℃下反应2h后，0.5M NaOH终止反应。测定OD400值。得到酯酶(分解)活力为0.15U，酶活单位：每克蛋白每分钟反应生成的对硝基苯酚微摩尔量。
以上实验证明，植物乳杆菌CGMCC No.9739具有下述性质：(1)具有耐酸性，在低pH下可以生长；(2)具有耐盐性，在高盐条件下可以生长；(3)细胞具有高自溶度；(4)产酸能力不高；(5)细胞内癸酸乙酯合成能力高；(6)细胞内癸酸乙酯分解能力低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，于2014年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9739，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.含有权利要求1所述植物乳杆菌CGMCC No.9739的发酵剂。
3.权利要求1所述植物乳杆菌CGMCC No.9739在制备奶酪、发酵乳和乳酸菌乳饮料方面的应用。
4.一种制备植物乳杆菌CGMCC No.9739直投式工作发酵剂的方法，其特征在于，将植物乳杆菌CGMCC No.9739以1-3％的接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃培养20-24h，使得植物乳杆菌CGMCC No.9739活菌数达到108cfu/mL以上，离心收集菌体，用pH7.0的PBS缓冲液冲洗菌体沉淀数次后，加入冻干保护剂，调整细胞浓度至109cfu/mL，混合均匀后进行真空冷冻干燥即得。
5.一种应用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备卡门贝尔奶酪的方法，其特征在于，将经过巴氏杀菌的牛乳冷却至32℃，加入发酵剂和霉菌发酵剂，预酸化一段时间后，加入植物乳杆菌CGMCC No.9739发酵剂，搅拌均匀；然后加入凝乳酶进行凝乳，待凝乳完成后，进行切割操作，切割大小为1cm左右的正方体；切割结束后进行排乳操作，排乳过程需在1h内完成；将排除乳清的凝块装入塑料磨具中进行塑形和进一步排除乳清操作，待乳清pH达到5.4时，取出凝块进行盐渍处理；盐渍1h后取出晾干，放置恒温恒湿培养箱成熟。
6.一种应用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备瑞士奶酪的方法，其特征在于，将经过巴氏杀菌的牛乳冷却至35℃，加入嗜热发酵剂和丙酸菌发酵剂，预酸化一段时间后，加入植物乳杆菌CGMCC No.9739发酵剂，搅拌均匀；然后加入凝乳酶进行凝乳，待凝乳完成后，进行切割操作；切割后保温静置一段时间，边搅拌边程序升温至54℃进行热烫处理，热烫时间45min后进行排乳处理；将排除乳清的凝块装入模具中进行塑形和进一步排除乳清操作，工作温度为50℃，持续时间为9h，每3h翻转一次；将排乳结束的凝块进行盐渍处理，温度为7℃，时间为2天，盐渍结束后取出晾干，放置恒温恒湿培养箱成熟。
7.一种应用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备发酵乳的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)获取原料乳，(2)向原料乳中加入8-12％的蔗糖，搅拌溶解；(3)将乳化稳定剂溶解后按以0.3％加入原料乳中，在18-22MPa下进行均质；(4)按照乳体积计3-5％，向乳中接入保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌CGMCC No.9739，三菌体积比为1：1：1；(5)接种后的乳液在37℃下进行发酵，发酵时间6-8h至凝乳；将凝乳后的酸乳放置于4℃成熟24h后，即得到所述的发酵乳。
8.一种应用植物乳杆菌CGMCC No.9739制备活性乳酸菌乳饮料的方法，其特征在于，将原料乳进行巴氏杀菌处理，冷却至42℃；按照乳体积计3-5％，向乳中接入保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌CGMCC No.9739，三者体积比为1：1：1；接种后的牛乳42℃下进行发酵，发酵时间4-6h至凝乳；冷却搅拌后，加入其它配料，均质后包装即得。
9.权利要求2所述植物乳杆菌CGMCC No.9739发酵剂在制备活性乳酸菌饮料或发酵乳中的应用。
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