CN106148251B - 一种类芽孢杆菌发酵液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种类芽孢杆菌发酵液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类芽孢杆菌发酵液及其制备方法和应用，所述发酵液是由类芽孢杆菌CGMCC No.8333经过发酵培养而得的发酵上清液。并且经过试验证明所述类芽孢杆菌发酵液具有促进植物乳杆菌ST‑III在乳中生长的作用。本发明提供的发酵液制备方法简单，设备要求低，成本低廉；采用的类芽孢杆菌CGMCC No.8333来源于食品，安全无毒，发酵制备的上清液可直接应用于食品加工中。并且本发明的发酵液极大的提高了植物乳杆菌ST‑III在实际产品开发中的应用潜力。

Description

一种类芽孢杆菌发酵液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，涉及一种发酵液及其制备方法和应用，更具体涉及一种类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液及其制备方法以及其促进植物乳杆菌ST-III在牛乳基质中生长的作用。
背景技术
植物乳杆菌ST-III对人体具有巨大的益生作用，自中国发明专利ZL03116377.7首次公开了植物乳杆菌ST-III菌株及其调节血脂方面的应用后，近年来对植物乳杆菌ST-III的研究也越来越多，在中国发明专利ZL200410066891.7中又公开了其能够降低血清胆固醇和提高高密度脂蛋白胆固醇含量，具有控制或减轻体重，辅助减肥的功效，也有报道其具有粘附肠道上皮细胞的作用，可见植物乳杆菌ST-III对人体有多方面的益处，同时植物乳杆菌ST-III全基因组于2010年测定，并在实际生产中得到广泛应用。
然而，经过研究发现，将植物乳杆菌ST-III添加到牛乳中培养，生物量很低，几乎没有生长，分析其原因可能是无法利用牛乳自主合成某些必须营养物质。目前主要的促生长手段是通过外源添加一些必须氨基酸或多肽类等促生长物质，由于这些原料价格昂贵，增加了企业成本，限制了植物乳杆菌ST-III的部分应用。因此寻找一种来源安全，制备简单，价格低廉的促进植物乳杆菌ST-III生长物质十分必要。
发明内容
针对现状，为解决现有技术中的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种发酵液，该发酵液通过对类芽孢杆菌CGMCC No.8333进行发酵培养得到，该发酵液具有促进植物乳杆菌ST-III在乳生长的作用。
本发明的目的之二是提供一种上述发酵液的制备方法，通过合适的发酵条件对其进行培养，得到的发酵上清液菌种活性高。
本发明的目的之三是提供一种上述发酵液的应用，即该发酵液具有促进植物乳杆菌ST-III在乳中生长的作用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种类芽孢杆菌发酵液，所述发酵液是由类芽孢杆菌CGMCC No.8333经过发酵培养而得的发酵上清液。
一种制备上述类芽孢杆菌发酵液的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)活化：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于TYC培养基中，在温度为25-35℃、摇床转速为150-200rpm/min的条件下培养24h作为种子液；
(2)扩培：按照体积百分比为3％的接种量将种子液接种于质量百分比为10％的脱脂乳培养基中，在25-35℃、150-200rpm/min的条件下培养96-168h得纯培养物；
(4)离心：将步骤(2)所得纯培养物于温度为4-15℃、转速为5000-10000rpm/min条件下离心5-10min，取上清液即得类芽孢杆菌发酵液。
上述制备类芽孢杆菌发酵液的方法中，步骤(2)所述的培养时间优选为120-144小时，更优选为120小时。
上述制备类芽孢杆菌发酵液的方法中，步骤(3)所述的温度为优选为5-10℃，更优选为10℃；和/或转速优选为6000-9000rpm/min，更优选为8000rpm/min。
所述的TYC培养基为常规的TYC培养基，由以下组分组成：胰蛋白酶胨15g/L，蔗糖50g/L，酵母膏5.0g/L，L-胱氨酸0.2g/L，乙酸钠20g/L，Na2SO40.1g/L，NaCl 1g/L，Na2HPO4·12H2O 2g/L，NaHCO32g/L，琼脂18g/L，余量为水。
所述的脱脂乳培养基也是常规的脱脂乳培养基，是将脱脂乳粉(购自恒天然商贸(上海)有限公司的)溶解于水中混合即得，需要说明的是，这里所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总质量的质量百分比。
上述类芽孢杆菌发酵液也可以制成冻干粉，即将离心得到的上清液(类芽孢杆菌发酵液)进行真空冷冻干燥3天，即得所述的冻干粉。
本发明的一个重要的发明点在于所述的类芽孢杆菌发酵液在乳制品中的应用。经过试验证明所述类芽孢杆菌发酵液具有促进植物乳杆菌ST-III在乳中生长的作用。
在上述应用中，申请人通过以下具体操作步骤进行：
(1)将类芽孢杆菌发酵液于115-121℃条件下，灭菌处理15-20min；
(2)然后将灭菌处理后的类芽孢杆菌发酵液按照体积百分比为10-30％的比例加入到质量百分比为10％的乳液中，混合均匀，得混合乳液；
(3)将活化好的植物乳杆菌ST-III以体积百分比为2％的比例接种至混合乳液中，混合均匀，35℃下静置培养16-24小时。
其中，优选地，所述类芽孢杆菌发酵液的添加量为20％，所述百分比为体积百分比。
并且本发明所采用的乳液为本领域常规乳原料，较佳的为选自生牛乳、脱脂牛乳和复原乳中的任意一种，更佳的为选自生牛乳和脱脂乳中的任一种。
本发明所采用的类芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.8333,保藏时间为2013年10月14日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，该菌株的分类命名是类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，培养物名称为BD3526，并且该类芽孢杆菌CGMCCNo.8333已经在中国发明专利ZL201310752153.7中首次公开，该专利的申请日是2013年12月31日，公开日是2014年4月23日。
需要说明的是，如果没有特殊说明，本发明所采用的各种试剂和原料均能够通过市场购买而得。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的发酵液制备方法简单，设备要求低，成本低廉；采用的类芽孢杆菌CGMCC No.8333来源于食品，安全无毒，发酵制备的上清液可直接应用于食品加工中。
(2)本发明最重要的发明点在于本发明制备的发酵液对植物乳杆菌ST-III在乳中的生长具有显著促进作用，极大的提高了植物乳杆菌ST-III在实际产品开发中的应用潜力。
具体实施方式
下面将对本发明进行更详细地描述，应该注意的是，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例1
类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液的制备方法，具体如下：
(1)活化：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于50ml TYC培养基中，在温度为25℃、摇床转速为200rpm/min的条件下培养24h作为种子液；
(2)扩培：按照体积百分比为3％(V/V)的接种量将种子液接种于500ml质量百分比为10％的脱脂乳培养基中，在温度为25℃、摇床转速为200rpm/min的条件下培养120h得纯培养物；
(3)离心：将步骤(2)所得纯培养物于温度为10℃、转速为8000rpm/min条件下离心10min，取上清液即得类芽孢杆菌发酵液。
实施例2
类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液的制备方法，具体如下：
(1)活化：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于50mlTYC培养基中，在温度为30℃、摇床转速为180rpm/min的条件下培养24h作为种子液；
(2)扩培：按照体积百分比为3％的接种量将种子液接种于500ml质量百分比为10％的脱脂乳培养基中，在温度为30℃、摇床转速为180rpm/min的条件下培养144h得纯培养物；
(3)离心：将步骤(2)所得纯培养物于温度为10℃、转速为10000rpm/min条件下离心5min，取上清液即得类芽孢杆菌发酵液。
实施例3
类芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括如下步骤：
(1)活化：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于TYC培养基中，在温度为35℃、摇床转速为150rpm/min的条件下培养24h作为种子液；
(2)扩培：按照体积百分比为3％的接种量将种子液接种于质量百分比为10％的脱脂乳培养基中，在35℃、150rpm/min的条件下培养96h得纯培养物；
(5)离心：将步骤(2)所得纯培养物于温度为15℃、转速为6000rpm/min条件下离心8min，取上清液即得类芽孢杆菌发酵液。
实施例4
类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液冻干粉的制备方法，具体如下：
(1)活化：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于50mlTYC培养基中，在温度为30℃、摇床转速为180rpm/min的条件下培养24h作为种子液；
(2)扩培：按照体积百分比为3％的接种量将种子液接种于500ml质量百分比为10％的脱脂乳培养基中，在温度为30℃、摇床转速为180rpm/min的条件下培养168h得纯培养物；
(3)离心：将步骤(2)所得纯培养物于温度为4℃、转速为10000rpm/min条件下离心5min，取上清液即得类芽孢杆菌发酵液。
(4)将离心得到的上清液进行真空冷冻干燥3天，即得所述的冻干粉。
为了证明类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液对植物乳杆菌ST-III在乳中的促生长作用，申请人进行了如下实验，具体包括如下实验例和对比例：
实验例1
(1)植物乳杆菌ST-III种子液的制备：在无菌操作条件下将植物乳杆菌ST-III纯培养物以2％(v/v)比例接种至MRS培养基(即乳酸细菌培养基，由以下组分组成：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温801.0mL/L、乙酸钠5.0g/L、K2HPO4·3H2O 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·H2O0.25g/L、琼脂18.0g/L、蒸馏水1L、pH：6.2～6.6)，35℃静置培养18h备用；
(2)取8ml生牛乳在121℃条件下灭菌处理15min，冷却至室温备用；
(3)取上述实施例1制备的上清液(类芽孢杆菌发酵液)2ml灭菌处理后添加到步骤(2)得到的生牛乳中；
(4)将步骤(1)制备的植物乳杆菌ST-III种子液以2％(v/v)比例接种至步骤(3)所得的生牛乳中，35℃条件下静置培养24h，结果是牛乳出现凝乳现象。
实验例2
(1)植物乳杆菌ST-III种子液的制备：在无菌操作条件下将植物乳杆菌ST-III纯培养物以2％(v/v)比例接种至MRS培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取5mL 10％脱脂乳118℃，灭菌处理20min，冷却至室温备用；
(3)取实施例2制备的上清液(类芽孢杆菌发酵液)1ml灭菌处理后添加到步骤(2)灭菌处理后的脱脂乳中；
(4)将步骤(1)制备的植物乳杆菌ST-III种子液以2％(v/v)比例接种步骤(3)所得的脱脂乳中，35℃静置培养24h，结果是牛乳出现凝乳现象。
实验例3
(1)植物乳杆菌ST-III种子液的制备：在无菌操作条件下将植物乳杆菌ST-III纯培养物以2％(v/v)比例接种至MRS培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取6ml生牛乳在118℃条件下灭菌处理20min，冷却至室温备用；
(3)取实施例1制备的发酵上清液4ml灭菌处理后添加到步骤(2)生牛乳中；
(4)将步骤(1)制备的种子液以2％(v/v)比例接种步骤(3)所述的生牛乳中，在35℃条件下静置培养24h，结果是牛乳pH下降，发生凝乳。
实验例4
(1)植物乳杆菌ST-III种子液的制备：无菌操作将植物乳杆菌ST-III纯培养物以2％(v/v)比例接种至MRS培养基种，35℃静置培养18h备用；
(2)取5ml生牛乳在118℃条件下灭菌处理15min，冷却至室温备用；
(3)取实施例4制备的发酵上清液冻干粉0.1g，去离子水复溶至10ml，取1ml灭菌处理后添加到步骤(2)灭菌处理后的牛乳中；
(4)将步骤(1)制备的植物乳杆菌种子液以2％(v/v)比例接种至步骤(3)所得的牛乳中，在35℃条件下静置培养24h，结果是牛乳出现凝乳现象。
实验例5
(1)植物乳杆菌ST-III种子液的制备：无菌操作将植物乳杆菌ST-III纯培养物以2％(v/v)比例接种至MRS培养基种，35℃静置培养18h备用；
(2)取5ml生牛乳在118℃条件下灭菌处理15min，冷却至室温备用；
(3)取实施例4制备的发酵上清液冻干粉0.1g，去离子水复溶至10ml，取1ml灭菌处理后添加到步骤(2)灭菌处理后的牛乳中；
(4)将步骤(1)制备的植物乳杆菌种子液以2％(v/v)比例接种至步骤(3)所得的牛乳中，在35℃条件下静置培养16h，结果是牛乳出现凝乳现象，pH从6.44降到5.04，活菌数达到8.92Log CFU/ml。
对比例1
(1)植物乳杆菌ST-III种子液的制备：无菌操作条件下将植物乳杆菌ST-III纯培养物以2％(v/v)比例接种至MRS培养基，35℃静置培养18h备用；
(2)取8ml生牛乳在118℃条件下灭菌处理15min，冷却至室温备用；
(3)将步骤(1)制备的种子液以2％(v/v)比例接种步骤(2)所述的生牛乳中，在35℃条件下静置培养24h，牛乳未出现凝乳现象。
在培养时间均为24h的情况下，将上述实验例1～4和对比例1进行pH值及凝乳情况进行对比，结果见表1，具体是采用pH计测定乳培养液pH值；观察培养过程中培养基凝乳情况；利用MRS平板倾注法对乳培养基中的ST-III菌落计数，单位为log CFU/ml。
表1 pH值及凝乳情况对比
由表1可知，对比例1在没有加入类芽孢杆菌发酵液的情况下，经过24h后pH值下降不明显(仅从6.44下降到6.04)，没有发生凝乳现象，并且菌落数也相对来讲增加的较少，实验例1～4和对比例1相比，在经过24h培养后pH值分别从6.04降低至5.01、4.83、4.70、4.74，牛乳发生凝乳现象，并且活菌数从8.00log CFU/ml分别提高至9.26log CFU/ml、9.27CFU/ml、9.27CFU/ml、9.28CFU/ml，从对比数据来看，本发明的类芽孢杆菌发酵液极大提高了植物乳杆菌ST-III的生物量，能够显著促进植物乳杆菌ST-III在牛乳基质中的生长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.类芽孢杆菌发酵液和植物乳杆菌ST-III在制备乳制品中的应用，其特征在于，所述类芽孢杆菌发酵液具有促进植物乳杆菌ST-III在乳中生长的作用；所述类芽孢杆菌发酵液是由类芽孢杆菌CGMCC No.8333经过发酵培养而得的发酵上清液，其制备方法包括如下步骤：
(1)活化：将类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于TYC培养基中，在温度为25-35℃、摇床转速为150-200rpm的条件下培养24h作为种子液；
(2)扩培：按照体积百分比为3％的接种量将种子液接种于质量百分比为10％的脱脂乳培养基中，在温度为25-35℃、摇床转速为150-200rpm的条件下培养96-168h得纯培养物；
(3)离心：将步骤(2)所得纯培养物在温度为4-15℃、转速为5000-10000rpm条件下离心5-10min，取上清液即得类芽孢杆菌发酵液；
类芽孢杆菌发酵液和植物乳杆菌ST-III在制备乳制品中的应用时，具体操作步骤如下：
①将类芽孢杆菌发酵液于115-121℃条件下，灭菌处理15-20min；
②然后将灭菌处理后的类芽孢杆菌发酵液按照体积百分比为10-30％的比例加入到质量百分比为10％的乳液中，混合均匀，得混合乳液；
③将ST-III纯化物接至MRS培养基进行活化18小时，将活化好的植物乳杆菌ST-III按照体积百分比为2％的接种比例接种至混合乳液中，混合均匀，35℃条件下静置培养16-24小时。
2.根据权利要求1所述的类芽孢杆菌发酵液和植物乳杆菌ST-III在制备乳制品中的应用，其特征在于，步骤(2)中的培养时间为120-144小时。
3.根据权利要求1或2所述的类芽孢杆菌发酵液和植物乳杆菌ST-III在制备乳制品中的应用，其特征在于，步骤(2)中的培养时间为120小时。
4.根据权利要求1所述的类芽孢杆菌发酵液和植物乳杆菌ST-III在制备乳制品中的应用，其特征在于，步骤(3)中的温度为5-10℃，和/或转速为6000-9000rpm。
5.根据权利要求1或4所述的类芽孢杆菌发酵液和植物乳杆菌ST-III在制备乳制品中的应用，其特征在于，步骤(3)中的温度为10℃，和/或转速为8000rpm。
6.根据权利要求1所述的类芽孢杆菌发酵液和植物乳杆菌ST-III在制备乳制品中的应用，其特征在于，所述类芽孢杆菌发酵液的添加量为20％，所述百分比为体积百分比。
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Induction of plantaricin production in Lactobacillus plantarum NC8 after coculture with specific gram-positive bacteria is mediated by an autoinduction mechanism;Antonio Maldonado et al.;《Journal of Bacteriology》;20040331;第186卷(第5期);第1556-1564页 *
Paenibacillus bovis BD3526产胞外多糖的培养条件优化;崔燕丽等;《食品与发酵工业》;20160531;第42卷(第5期);第108-113页 *
促进植物乳杆菌ST-Ⅲ在脱脂乳中生长营养因子的研究;陈帅;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20100515(第5期);摘要 *

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