CN109456919A - 一种副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微生物菌类，副干酪乳杆菌，其特征在于：它是副干酪乳杆菌CG‑C1，保藏号：CGMCCNo.12941。保藏日期：2016年09月08日。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地点：中国，北京，中国科学院微生物研究所。本发明产品来源百岁健康老人肠道。经试验证明，副干酪乳杆菌CG‑C1用于益生菌发酵乳的生产，该方法安全风险低，简单易实现，可以保证菌株数量，成本较低，相对其他方法而言具有明显的优势。因此该发酵乳产品可以调节肠道菌群，维持肠道微生态系统平衡，可以加强肠道紧密连接蛋白表达，提高肠道上皮的屏障功能，可以降低胆固醇水平，可以改善便秘和腹泻问题。

Description

一种副干酪乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于食品科学技术领域，具体属于微生物领域，主要涉及一种副干酪乳杆菌及其应用。
背景技术
益生菌是一类活的微生物，当摄入足够数量时会对宿主产生有益的作用。有研究统计，益生菌产品的市场销售年增长率高达20％，仅以乳杆菌作为发酵剂的食品工业所创造的经济价值就占全球发酵类食品的20％。在欧洲，添加益生乳酸菌的食品产值占食品总产值的5％，其价值占所有功能食品的65％。
益生菌已被证明具有很多生理功能：益生菌具有免疫调节作用，通过提高食物能量产出或改变新陈代谢等活动，来维持机体正常状态下的免疫功能水平；益生菌具有抑制有害菌的作用，因此可以调节肠道菌群，维持肠道微生态系统平衡；益生菌可以加强肠道紧密连接蛋白表达，提高肠道上皮的屏障功能；益生菌可以降低胆固醇水平；益生菌可以改善便秘和腹泻问题。
食品工业的益生菌70％应用于乳制品中。其中发酵乳是是益生菌的优良载体，益生菌发酵乳收到消费者的追逐，成为市场主要增长点。然而益生菌发酵乳存在以下问题：第一，益生菌在发酵乳中存活率低。由于益生菌本身的生长特性，造成益生菌在发酵乳中生长缓慢或存活能力下降；第二，益生菌的添加会对发酵乳本身的特性产生负面影响。作为益生菌的菌株代谢能力特别是产酸能力很强，影响发酵乳的风味、质地，后酸化问题尤为突出。
目前已有的抑制益生菌在发酵乳后酸化方法有：降低发酵乳中益生菌的数量，但会影响益生菌的益生功能；通过高压或高温处理弱化菌株防止后酸化，添加天然防腐剂Nisin控制发酵菌种的生长能力和产酸，添加葡萄糖氧化酶延缓酸奶后酸化等，但是添加其他物质或进行特殊处理时会引发发酵乳品质变化，使发酵乳体系更加复杂，增加产品成本；基因工程，通过物理、化学等方法进行诱变，改变菌株的遗传物质，得到弱酸化的突变型菌株，这种方法具有明显的不确定性，突变型目的菌株恰好具有弱后酸化特性的几率较低，较为困难，并且基因工程目前本身就存在较大的争议；筛选，从庞大的益生菌菌群中筛选出本身具有弱后酸化特征的菌株，用于益生菌发酵乳的生产，该方法安全风险低，简单易实现，可以保证菌株数量，成本较低，相对其他方法而言具有明显的优势。
发明内容
本发明的目的是获得一种来源健康人群肠道或传统发酵食品，经脱脂乳培养基筛选，得到弱后酸化菌株，称为副干酪乳杆菌。
本发明的第一方面，提供了一种副干酪乳杆菌。它是副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei，保藏号：CGMCC No.12941。保藏日期：2016年09月08日。保藏单位：中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地点：中国，北京，中国科学院微生物研究 所。
本发明的第二方面，提供了本发明所述的副干酪乳杆菌的用途，它被用于制备发酵乳，用于调节人体肠道菌群、加强人体免疫力、预防肿瘤。
发酵乳制作具体步骤如下：
(1)提前活化菌株：对筛得的“弱酸化菌”,即一种副干酪乳杆菌CG-C1进行活化，在无菌环境下，吸取原始菌株保菌乳液于MRS液体培养基中，37℃恒温培养12h，进行活化，连续活化三代。对第三代工作用菌进行革兰氏染色并镜检，镜检合格用菌置于4℃冰箱，暂存待用，以2％的接种量进行活化，得到第三代工作用菌100ml，镜检合格后，置于4℃冰箱保存备用。
(2)计算原料用量：按照蛋白质3％、脱脂乳粉32.9％、蔗糖7％的比例计算出所需原料用量。
(3)原料预处理和混合：纯水预热至50℃，按比例加入脱脂乳粉和白砂糖，搅拌混合 5～10min。
(4)静置水合：混合乳液静置30min。
(5)定容分装：量筒定容，分装于烧杯，封口膜封口。
(6)杀菌：样品置于95℃水浴锅，待样品温度达到95℃，杀菌5min。
(7)冷却：样品置于冷水浴，降温至43℃左右。
(8)菌液离心：取活化好的第三代工作用菌，分装于已灭菌的50ml离心管，4500r速度离心10min，倒掉上层培养基，留下菌沉淀。
(9)接种：将发酵剂以0.02％的接种量接种于脱脂乳，用适量生理盐水溶解实验菌的菌沉淀并摇匀，全部接种于500ml的脱脂乳中，以只接种发酵剂而未接种实验菌的样品作为空白对照。
(10)分装：乳液分装于已灭菌的10ml离心管中，每管装7-8ml，不宜太满，太满容易导致发酵乳被污染。
(11)发酵：43℃恒温发酵，观察凝乳情况，定时测定发酵乳pH值，待样品pH值下降到接近4.5时，置于4℃冰箱，降温终止发酵。
(12)低温储藏：发酵乳产品置于4℃冰箱，储存待检测。
该方法安全风险低，简单易实现，可以保证菌株数量，成本较低，相对其他方法而言具有明显的优势。因此该发酵乳产品可以调节肠道菌群，维持肠道微生态系统平衡，可以加强肠道紧密连接蛋白表达，提高肠道上皮的屏障功能，可以降低胆固醇水平，可以改善便秘和腹泻问题。
附图说明
图1 4℃条件下21d内发酵乳样品pH值的变化
图2 4℃条件下21d内发酵乳样品酸度的变化
图3 10℃条件下21d内发酵乳样品pH值的变化
图4 10℃条件下21d内发酵乳样品酸度的变化
图5 25℃条件下21d内发酵乳样品pH的变化
图6 25℃条件下21d内发酵乳样品酸度的变化
图7在4℃储藏条件下发酵乳样品中的活菌数变化
图8在10℃储藏条件下发酵乳样品中的活菌数变化
图9在25℃储藏条件下发酵乳样品中的活菌数变化
具体实施方式
本发明人经多次筛选和培育，从百岁老人粪便中分离得到1株副干酪乳杆菌CG-C1，该菌株具有明显弱酸化能力。经试验证明，该菌株的后酸化作用较其他实验菌明显弱(P<0.01)。
副干酪乳杆菌CG-C1于2016年09月08日，申请中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。保藏号：CGMCCNo.12941。
文中所用“本发明副干酪乳杆菌”指副干酪乳杆菌CG-C1，保藏号：CGMCCNo.12941。应理解这些术语还包括衍生副干酪乳杆菌CG-C1菌株，尤其是弱酸化特性的衍生菌株。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一、材料方法
1.1菌株
从自由菌种裤中随机挑选48株副干酪乳杆菌用于筛选，实验菌株分离自健康人体肠道或传统发酵食品，经过16S rDNA序列分析，全部为副干酪乳杆菌。
1.2主要试剂
表1主要试剂信息
生理盐水：9.0g/L的NaCl溶液，121℃15min灭菌。
酚酞乙醇溶液：0.5g酚酞/100ml无水乙醇，混匀备用。
12％脱脂乳：称取12％脱脂乳粉，剩余88％用水补齐，混合均匀，121℃15min灭菌。
MRS液体培养基：48g MRS肉汤粉/1L水，加热煮沸溶解，121℃15min灭菌。
MRS固体培养基：63g MRS琼脂粉/1L水，加热煮沸溶解，121℃15min灭菌，冷却至55℃恒温暂存待用，或凝固后用微波炉加热溶解后冷却至55℃恒温暂存待用。
pH＝5.4的MRS固体培养基：63g MRS琼脂粉/1L水，加热煮沸溶解，冷却至室温，用盐酸调节pH至5.4，分装，121℃15min灭菌，冷却至55℃恒温暂存待用，或凝固后用微波炉加热溶解后冷却至55℃恒温暂存待用。
1.3主要仪器设备
表2实验仪器及设备信息
1.4实验方法
1.4.1菌株活化和保存
在无菌环境下，吸取原始菌株保菌乳液于MRS液体培养基中，37℃恒温培养12h，进行活化，连续活化三代。对第三代工作用菌进行革兰氏染色并镜检，镜检合格用菌置于4℃冰箱，暂存待用。
1.4.2弱后酸化副干酪乳杆菌的筛选
将工作用菌以2％的接种量接种于12％脱脂乳中，37℃恒温培养。分别在培养至3h、6h、 9h、12h、24h、48h、72h时刻测定脱脂乳体系的pH值和滴定酸度(°T)，滴定酸度的测定方法参照GB/T5413.28-1997。
分析各菌株在脱脂乳体系中37℃条件下培养72h内的pH值和滴定酸度的变化趋势，筛选出差异性显著的产酸能力弱的菌株。
筛选期间，随机抽取部分筛得的“弱酸化菌”和“强酸化菌”所在的脱脂乳样品，用倾注平板的方法对其进行活菌数的测定，结果以cfu/ml表示。
1.4.3弱后酸化副干酪乳杆菌在发酵乳体系验证
添加初步筛选出的“弱酸化菌株”而制作发酵乳，为实验组；未添加“弱酸化菌株”正常制作的发酵乳为空白对照组，检测两组发酵乳体系在储藏期内的酸度和活菌数的变化，验证“弱酸化菌株”的后酸化能力和存活率。
副干酪乳杆菌发酵乳的生产工艺流程如下：
原料预热与混合——静置水合——定容分装——封口灭菌——冷却——接种——分装——恒温发酵——低温储存
发酵乳制作具体步骤如下：
(1)提前活化菌株：对筛得的“弱酸化菌”按前述方法以2％的接种量进行活化，得到第三代工作用菌100ml，镜检合格后，置于4℃冰箱保存备用。
(2)计算原料用量：按照蛋白质3％、脱脂乳粉32.9％、蔗糖7％的比例计算出所需原料用量。
(3)原料预处理和混合：纯水预热至50℃，按比例加入脱脂乳粉和白砂糖，搅拌混合 5～10min。
(4)静置水合：混合乳液静置30min。
(5)定容分装：量筒定容，分装于烧杯，封口膜封口。
(6)杀菌：样品置于95℃水浴锅，待样品温度达到95℃，杀菌5min。
(7)冷却：样品置于冷水浴，降温至43℃左右。
(8)菌液离心：取活化好的第三代工作用菌，分装于已灭菌的50ml离心管，4500r速度离心10min，倒掉上层培养基，留下菌沉淀。
(9)接种：将发酵剂以0.02％的接种量接种于脱脂乳，用适量生理盐水溶解实验菌的菌沉淀并摇匀，全部接种于500ml的脱脂乳中，以只接种发酵剂而未接种实验菌的样品作为空白对照。
(10)分装：乳液分装于已灭菌的10ml离心管中，每管装7-8ml，不宜太满，太满容易导致发酵乳被污染。
(11)发酵：43℃恒温发酵，观察凝乳情况，定时测定发酵乳pH值，待样品pH值下降到接近4.5时，置于4℃冰箱，降温终止发酵。
(12)低温储藏：发酵乳产品置于4℃冰箱，储存待检测。
在发酵乳制作完成的第1天测定两组样品的初始pH值、滴定酸度和活菌数，然后将样品分成同样的三份分别置于4℃、10℃、25℃三个温度条件下恒温培养，进行储藏实验，分别于发酵乳制作完成的第4d、7d、14d、21d测定发酵乳样品的pH值、滴定酸度(°T) 和活菌数。
注：此处测定活菌数用pH＝5.4的MRS固体培养基，此酸度条件下可以使杆菌生长而抑制球菌生长。测定结果以cfu/ml表示，实验组的菌落总数减去空白组的菌落数得到实验组中“弱酸化菌”的活菌数。
分析储藏期21d内各样品的酸度变化和活菌数变化，筛选出后酸化程度弱且存活率较高的副干酪乳杆菌，以达到预期筛选目的。
1.4.4数据处理
利用IBM SPSS Statistics 21软件对实验数据进行统计分析，对脱脂乳体系筛选数据中 72h时刻各样品的pH值和酸度进行单因素方差分析，显著性水平为P<0.01；对筛选时随机抽取的培养72h的样品活菌数和酸度进行双因素相关分析，显著性水平为P<0.05；对发酵乳体系验证数据中21d时刻的pH值和酸度进行单因素方差分析，显著性水平为P<0.01。
二、结果分析
2.1弱后酸化菌株筛选
将48株菌株分批次进行筛选实验，每批次实验除接种菌株不同外，培养温度、脱脂乳浓度、培养时间等其他因素均相同。各菌株所在脱脂乳样品在37℃条件下培养72h内pH值和滴定酸度值汇总如下：
表3菌株脱脂乳体系72h内pH值变化表
表4菌株脱脂乳体系72h内滴定酸度变化表
(1)在接种后37℃培养的前6h内，脱脂乳体系的pH值下降程度、酸度上升程度都很小，pH值依然在5.5以上，酸度依然在40°T以下，而发酵剂则可以在6h内使体系pH 值降至4.5，酸度升至80°T以上，因此可以认为，添加副干酪乳杆菌菌株对发酵剂的发酵影响很小。
(2)在接种后37℃培养12h之后，各菌株所在体系的酸度开始快速变化，并且在不同菌株之间出现明显差异，可以认为，此阶段为各菌株快速利用脱脂乳中营养成分进行生理代谢的阶段，产酸迅速。
(3)在接种后37℃培养24h之后，脱脂乳体系的pH值和酸度变化趋于缓慢，在48h后，两个变量更加趋于稳定，变化很小，可能是较高的酸度环境抑制了体系内菌株的产酸能力，也可能是脱脂乳体系的营养残存较少，使体系内的菌株无法利用营养进行生理代谢产酸。
(4)在接种后37℃培养72h时，各菌株的产酸程度几乎达到了最大值，可以认为，此时刻的酸度近似为体系的最终酸度，可以通过此时酸度来表示体系内菌株的最大产酸能力。因此将筛选条件定为接种后37℃培养72h时刻体系的pH值在4.00以上，酸度值在100.0°T 以下，筛选出5株“弱酸化菌株”，编号分别为：E097-A-01、E139-A-05、C065-A-09、 E143-A-04、C125-A-09。
研究选取了几株具有代表性的“弱酸化菌株”和“强酸化菌株”进行了活菌数检测，并将各菌活菌数与最终酸度进行了双因素相关性分析。
表5抽取菌样品72h活菌数与72h酸度表
由表5分析，所在体系酸度值从94.0°T到209.2°T不等的11株菌，在接种后37℃培养72h后，在体系中的存活情况相近，最终活菌数都在109CFU/ml以上，体系活菌数与最终酸度相关性不大(P＝0.319>0.05)。原因可能是菌株的接种量虽然有差异，但是在培养72h后，其数量和生长状态已经趋于稳定。因此可以认为，所筛选的“弱酸化菌株”的确是产酸能力弱而不是因为添加量少而导致体系最终酸度低。
2.2弱后酸化菌株发酵乳体系验证
2.2.1发酵乳21d内酸度变化
对筛选出的5株酸化能力相对最弱的菌株进行了发酵乳体系验证，制作了各菌株所在发 酵乳样品在保质期内的pH值和酸度变化趋势图(如图1-图6)。
(1)三个温度储藏条件下，体系酸度均呈现出相似的变化趋势。储藏期的前7d内各发酵乳样品的酸度快速上升，可以认为此阶段为菌株利用发酵乳中残存的营养进行旺盛的生理代谢产酸时期；储藏7d-14d内，各发酵乳样品的酸度变化趋于缓慢；储藏14d-21d内，各发酵乳样品的酸度趋于稳定，变化很小，可以认为储藏后期，产品达到最大酸度，此时期内的酸度近似为其中菌株的最大酸化能力。
(2)4℃和10℃储藏条件下，菌株C065-A-09的后酸化能力比其他4株菌明显更弱(P<0.01)，且它与空白组对比差别不大，最终pH依然在4.0左右，此酸度在人们感官可以接受的范围内，因此4℃和10℃储藏条件下，将菌株C065-A-09定为理想的“弱后酸化目标菌”。
(3)25℃储藏条件下，菌株E139-A-05的后酸化能力与其他4株菌相比，具有显著性差异(P<0.05)，但是它的最终pH值已降到3.3左右，比空白组高出很多，此酸度为消费者不能接受，因此25℃储藏条件下，未能得到理想的“弱后酸化目标菌”。由此可见，发酵乳产品的低温储藏是非常重要的，弱后酸化的菌株在常温条件下会大量生长，使产品的酸度上升，缩短货架期。
2.2.2发酵乳中实验菌21d内存活情况
实验菌在21d内存活情况如图7-图9
(1)三个温度储藏条件下，各菌株的生长存活情况大不相同。总体来看，在4℃和10℃的低温环境中，各菌株在储藏前2周保持生长或稳定，储藏期最后1周开始表现出数量下降的衰退趋势或保持稳定，这符合菌株的生长规律，前期利用营养物质生长繁殖，同时受到低温环境的限制，生长繁殖速度不至于很快，后期因营养物质匮乏，其数量开始下降或稳定。在25℃的常温环境中，各菌株均在储藏期前1周内迅速生长繁殖，随后菌株E097-A-01和菌株E143-A-04数量开始急剧下降，而另外三株菌则依然缓慢上升或保持稳定，直到储藏期结束。此结果说明25℃的温度条件对菌株生长繁殖的抑制作用不明显，因此各菌株均在储藏前期利用营养物质大量增殖，之后因营养物质限制而进入衰退期或稳定。
(2)尽管不同温度条件下，不同菌株的活菌数表现出很大差异，但是无论哪个温度条件下，各菌株最终活菌数均在108cfu/ml以上，存活情况良好，且菌株C065-A-09这一株“弱后酸化目标菌”的活菌数无论在哪一温度条件下均保持了较好的稳定性，没有出现大量减少的情况，相对其他4株菌表现出更优良的特性。
实施例2
发酵乳制作具体步骤如下：
(1)提前活化菌株：对筛得的“弱酸化菌”,即一种副干酪乳杆菌CG-C1进行活化，在无菌环境下，吸取原始菌株保菌乳液于MRS液体培养基中，37℃恒温培养12h，进行活化，连续活化三代。对第三代工作用菌进行革兰氏染色并镜检，镜检合格用菌置于4℃冰箱，暂存待用，以2％的接种量进行活化，得到第三代工作用菌100ml，镜检合格后，置于4℃冰箱保存备用。
(2)计算原料用量：按照蛋白质3％、脱脂乳粉32.9％、蔗糖7％的比例计算出所需原料用量。
(3)原料预处理和混合：纯水预热至50℃，按比例加入脱脂乳粉和白砂糖，搅拌混合 5～10min。
(4)静置水合：混合乳液静置30min。
(5)定容分装：量筒定容，分装于烧杯，封口膜封口。
(6)杀菌：样品置于95℃水浴锅，待样品温度达到95℃，杀菌5min。
(7)冷却：样品置于冷水浴，降温至43℃左右。
(8)菌液离心：取活化好的第三代工作用菌，分装于已灭菌的50ml离心管，4500r速度离心10min，倒掉上层培养基，留下菌沉淀。
(9)接种：将发酵剂以0.02％的接种量接种于脱脂乳，用适量生理盐水溶解实验菌的菌沉淀并摇匀，全部接种于500ml的脱脂乳中，以只接种发酵剂而未接种实验菌的样品作为空白对照。
(10)分装：乳液分装于已灭菌的10ml离心管中，每管装7-8ml，不宜太满，太满容易导致发酵乳被污染。
(11)发酵：43℃恒温发酵，观察凝乳情况，定时测定发酵乳pH值，待样品pH值下降到接近4.5时，置于4℃冰箱，降温终止发酵。
(12)低温储藏：发酵乳产品置于4℃冰箱，储存待检测。

Claims (2)

1.一种副干酪乳杆菌，其特征在于：它是副干酪乳杆菌CG-C1，保藏号：CGMCCNo.12941,保藏日期：2016年09月08日,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地点：中国，北京，中国科学院微生物研究所。
2.一种发酵乳的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提前活化菌株：对筛得的“弱酸化菌”,即一种副干酪乳杆菌CG-C1进行活化，在无菌环境下，吸取原始菌株保菌乳液于MRS液体培养基中，37℃恒温培养12h，进行活化，连续活化三代。对第三代工作用菌进行革兰氏染色并镜检，镜检合格用菌置于4℃冰箱，暂存待用，以2％的接种量进行活化，得到第三代工作用菌100ml，镜检合格后，置于4℃冰箱保存备用。
(2)计算原料用量：按照蛋白质3％、脱脂乳粉32.9％、蔗糖7％的比例计算出所需原料用量。
(3)原料预处理和混合：纯水预热至50℃，按比例加入脱脂乳粉和白砂糖，搅拌混合5～10min。
(4)静置水合：混合乳液静置30min。
(5)定容分装：量筒定容，分装于烧杯，封口膜封口。
(6)杀菌：样品置于95℃水浴锅，待样品温度达到95℃，杀菌5min。
(7)冷却：样品置于冷水浴，降温至43℃左右。
(8)菌液离心：取活化好的第三代工作用菌，分装于已灭菌的50ml离心管，4500r速度离心10min，倒掉上层培养基，留下菌沉淀。
(9)接种：将发酵剂以0.02％的接种量接种于脱脂乳，用适量生理盐水溶解实验菌的菌沉淀并摇匀，全部接种于500ml的脱脂乳中，以只接种发酵剂而未接种实验菌的样品作为空白对照。
(10)分装：乳液分装于已灭菌的10ml离心管中，每管装7-8ml，不宜太满，太满容易导致发酵乳被污染。
(11)发酵：43℃恒温发酵，观察凝乳情况，定时测定发酵乳pH值，待样品pH值下降到接近4.5时，置于4℃冰箱，降温终止发酵。
(12)低温储藏：发酵乳产品置于4℃冰箱，储存待检测。
所述动物双歧杆菌对胃酸具有良好的耐受性。
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