CN113396976B - 一种副干酪乳杆菌发酵乳(粉)及其制备方法与在改善肠屏障受损中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵乳制品领域，特别是涉及一种副干酪乳杆菌发酵乳(粉)及其制备方法与在改善肠屏障受损中的应用。本发明提供副干酪乳杆菌CGMCCNo.20045在制备发酵乳制品中的用途，所述发酵乳制品为用于改善肠屏障受损的保健食品。本发明所提供的副干酪乳杆菌CGMCCNO.20045、并进一步提供了通过及制备的发酵乳制品，所提供的发酵乳制品对高脂饮食引起的肠屏障受损有积极的改善和修复作用，其具体表现为增加结肠内腔厚度、增强结肠上皮细胞间连接的规则、完整和紧密性，具有良好的产业化前景。
Description
技术领域
本发明涉及发酵乳制品领域，特别是涉及一种副干酪乳杆菌发酵乳(粉)及其制备方法与在改善肠屏障受损中的应用。
背景技术
近年来，随着中国经济的飞速发展，人们的生活条件发生了极大的改善，尤其是饮食方面，更是越来越欧美化，如炸鸡、可乐等高热量高脂肪的食物在我们的生活中随处可见。然而，消费者们并不知道，这些食物除了给他们带来美味的体验外，长期、过度食用此类食物还可能伴有各种潜在的危害。高脂饮食通过降低编码肠紧密连接相关蛋白(如Claudin-1和occludin)的基因表达使肠道通透性增高，从而导致肠屏障的完整性遭到破坏，继而激活机体的非特异性免疫引起慢性轻度炎症，可能导致肠道菌群失调，引起肠炎等肠道症状。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌发酵乳(粉)及其制备方法与在改善肠屏障受损中的应用，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种副干酪乳杆菌，其保藏号为CGMCC No.20045。
本发明另一方面提供上述的副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途。
在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品为用于改善肠屏障受损的保健食品，优选的，所述发酵乳制品为用于改善高脂饮食相关的肠屏障受损的保健食品。
在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品选自发酵乳、乳粉中的一种或多种的组合。
本发明另一方面提供一种副干酪乳杆菌发酵乳制品，由上述的副干酪乳杆菌制备获得。
本发明另一方面提供一种副干酪乳杆菌发酵乳制品的制备方法，所述制备方法包括：
将接种有上述的副干酪乳杆菌的脱脂乳进行发酵处理。
在本发明一些实施方式中，所述制备方法还包括：
将发酵所得发酵产物进行干燥处理。
在本发明一些实施方式中，，所述发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量为1×107～5×107CFU/mL，优选为2×107～4×107CFU/mL，更优选为2.8×107CFU/mL～3.2×107CFU/mL；
和/或，所述发酵处理中，脱脂乳为脱脂乳粉的水溶液，按质量百分比计，所述脱脂乳粉的水溶液中，脱脂乳粉所占的质量百分比为3％～12％；
和/或，所述发酵处理中，发酵温度为26℃～42℃，优选为30℃～40℃，更优选为36℃～38℃，发酵时间为6h～18h，优选为9～15h，更优选为11～13h；
和/或，所述发酵处理为厌氧发酵处理。
在本发明一些实施方式中，所述发酵乳制品选自发酵乳、发酵乳粉中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，所述发酵乳中的副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的活菌数＞8×108CFU/mL；
和/或，所述发酵乳粉中的副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的活菌数＞8×109CFU/g。
附图说明
图1显示为本发明实施例7中结肠病理切片及内腔厚度的结果示意图。
图2显示为本发明实施例7中结肠病理切片及内腔厚度的结果示意图。
图3显示为本发明实施例7中结肠上皮细胞间的粘附状态示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
本发明第一方面提供一种副干酪乳杆菌，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.20045。本申请发明人经过大量筛选研究，发现通过副干酪乳杆菌CGMCC No.20045制备的乳制品，对高脂饮食引起的肠屏障受损有积极的改善和修复作用，其具体表现为增加结肠内腔厚度、增强结肠上皮细胞间连接的规则、完整和紧密性等功能，从而提供了副干酪乳杆菌CGMCC No.20045或通过其制备的发酵乳制品在制备保健食品的用途。
本发明第二方面提供本发明第一方面所提供的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)在制备发酵乳制品中的用途。如上所述，上述副干酪乳杆菌CGMCC No.20045可以被用于制备发酵乳制品，这些发酵乳制品可以被用于改善肠屏障的保健食品，尤其可以是用于改善高脂饮食相关的肠屏障受损(例如，可以是显著增加结肠内腔厚度、增强结肠上皮细胞间连接的规则、完整和紧密性等)的保健食品。这些发酵乳制品通常可以是发酵乳、乳粉等。
本发明第三方面提供一种副干酪乳杆菌发酵乳制品，由本发明第一方面所提供的副干酪乳杆菌制备获得。
本发明第四方面提供一种副干酪乳杆菌发酵乳制品的制备方法，所述制备方法包括：将接种有本发明第一方面所提供的副干酪乳杆菌的脱脂乳进行发酵处理。本领域技术人员可选择合适的方法将接种有本发明第一方面所提供的副干酪乳杆菌的脱脂乳进行发酵处理。
上述制备方法中，还可以包括：将发酵所得发酵产物进行干燥处理。发酵获得打得发酵产物或发酵乳制品通常可以是发酵乳，进一步进行干燥以后，即可提供发酵乳粉。合适的对发酵产物进行干燥的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是冻干等。
上述制备方法中，发酵制备过程中的工艺参数会对发酵产物产生微妙的作用，合适的制备工艺可以使得制备获得的产品具有更佳的效果。例如，发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量可以为1×107～5×107CFU/mL、1×107～1.5×107CFU/mL、1.5×107～2×107CFU/mL、2×107～2.5×107CFU/mL、2.5×107～2.8×107CFU/mL、2.8×107～3×107CFU/mL、3×107～3.2×107CFU/mL、3.2×107～3.5×107CFU/mL、3.5×107～4×107CFU/mL、4×107～4.5×107CFU/mL、或4.5×107～5×107CFU/mL，优选为2×107～4×107CFU/mL，更优选为2.8×107CFU/mL～3.2×107CFU/mL；再例如，发酵处理中，脱脂乳为脱脂乳粉的水溶液，按质量百分比计，所述脱脂乳粉的水溶液中，脱脂乳粉所占的质量百分比可以为3％～12％、3％～4％、4％～5％、5％～6％、6％～7％、7％～8％、8％～9％、9％～10％、10％～11％、或11％～12％；再例如，发酵处理中，发酵温度可以为26℃～42℃、26℃～28℃、28℃～30℃、30℃～32℃、32℃～34℃、34℃～36℃、36℃～37℃、37℃～38℃、38℃～40℃、或40℃～42℃，优选为30℃～40℃，更优选为36℃～38℃，发酵时间可以为6h～18h、6h～7h、7h～8h、8h～9h、9h～10h、10h～11h、11h～12h、12h～13h、13h～14h、14h～15h、15h～16h、16h～17h、或17h～18h，优选为9～15h，更优选为11～13h；再例如，发酵处理可以为厌氧发酵处理。由本发明所提供的相关实施例可知，在优选发酵参数的范围之外时，副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045在脱脂乳中的增殖效果明显下降，而在优选范围之内时，接种量、脱脂乳浓度、发酵温度和时间相互影响，使得副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045发酵乳(粉)中活菌数量更高，从而使代谢产生的可协助改善高脂饮食引发的肠屏障受损的物质的合成量大幅增加。例如，在接种量过少时，菌种繁殖速度慢，使得最终获得的发酵乳(粉)中活菌数量低于优选的接种量范围。
上述制备方法中，如上所述，发酵乳制品可以是发酵乳、发酵乳粉等。发酵乳制品中，通常需要具有一定量的活菌数。例如，在发酵乳中的副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的活菌数＞8×108CFU/mL。再例如，在发酵乳粉中的副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的活菌数＞8×109CFU/g。
本发明提供了副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045、并进一步提供了通过其制备的发酵乳制品，所提供的发酵乳制品对高脂饮食引起的肠屏障受损有积极的改善和修复作用，其具体表现为增加结肠内腔厚度、增强结肠上皮细胞间连接的规则、完整和紧密性，具有良好的产业化前景。
下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：
副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045：将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(购买自Merck Co.，美国)，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入10mLMRS液体培养基(购买自Merck Co.，美国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基(购买自Merck Co.，美国)，37℃厌氧培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为1×109CFU/mL。
(b)脱脂乳的制备：
将质量百分比为8％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需脱脂乳。
2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备
将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045种子以接种量3％(v/v，种子液占发酵液的体积百分比，下同)无菌接种于8％(w/w，质量百分比，下同)脱脂乳，37℃厌氧培养12h得发酵乳a，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉A。
实施例2
1、材料与方法：
(a)种子(发酵菌种)的制备：
同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：
将质量百分比为12％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得脱脂乳。
2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备
将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045种子以接种量1％(v/v)无菌接种于12％(w/w)脱脂乳，42℃厌氧培养18h得发酵乳b，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉B。
实施例3
1、材料与方法：
(a)种子(发酵菌种)的制备：
同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：
将质量百分比为3％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得脱脂乳。
2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备：
将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045种子以接种量5％(v/v)无菌接种于3％(w/w)脱脂乳，26℃厌氧培养6h得发酵乳c，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉C。
实施例4
1、材料与方法：
(a)种子(发酵菌种)的制备：
同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：
将质量百分比为10％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得脱脂乳。
2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备
将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045种子以接种量4％(v/v)无菌接种于含10％(w/w)脱脂乳，40℃厌氧培养15h得发酵乳d，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉D。
实施例5
1、材料与方法
(a)种子(发酵菌种)的制备：
同实施例1。
(b)脱脂乳的制备：将质量百分比为5％的脱脂乳粉与蒸馏水混匀，充分溶解后，在115℃下灭菌12min，冷却至室温，即得脱脂乳。
2、副干酪乳杆菌发酵乳(粉)的制备：
将副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045种子以接种量2％(v/v)无菌接种于5％(w/w)脱脂乳，30℃厌氧培养9h得发酵乳e，也可再进一步经冻干后得发酵乳粉E。
实施例6
发酵乳(粉)活菌检测
对上述实施例1-5所制备的副干酪乳杆菌发酵乳产品a、b、c、d和e、发酵乳粉产品A、B、C、D和E进行活菌计数，结果如表1所示。
表1副干酪乳杆菌发酵乳(粉)活菌计数结果
如表所示，通过本发明技术方案中的方法所制得的副干酪乳杆菌发酵乳中活菌数量稳定保持在8×108CFU/mL以上，所制得的副干酪乳杆菌发酵乳粉中活菌数量稳定保持在8×109CFU/g以上。
实施例7
副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045发酵乳粉对高脂饮食引起的肠屏障受损的改善作用的测定：
建立动物模型：购买SPF级4周龄的雌性成年C57BL/6小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，饲喂高脂饲料(60％脂肪含量)8周。
动物实验：选取达到高血糖标准的小鼠20只，每组10只随机分为2组(模型对照组、发酵乳粉干预组)。根据表2所示方法，向各组饲喂对应饲料，并用发酵乳粉复原液(由实施例4中方法制备的发酵乳粉按配制而成)或空白样品(实施例4中配制的10％脱脂乳)灌胃(0.375g/Kg·d)，直至4周后将小鼠处死，取结肠组织进行后续检测。
表2实验动物分组与灌胃方法
表3各项检测指标和方法
结肠病理切片及内腔厚度的结果如图1和图2所示。模型对照组小鼠的结肠内腔厚度(180～420μm)显著低于经副干酪乳杆菌发酵乳粉干预后的结肠内腔厚度(300～430μm)，说明副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045发酵乳粉的干预对高脂饮食引起的结肠组织损伤具有一定的改善作用。
结肠上皮细胞间的粘附状态如图3所示。发酵乳粉干预组的结肠上皮细胞间的粘附效果比模型对照组更规则、更完整，而且胞间的桥粒连接蛋白(图中黑框圈出的部分)更大。将按与发酵乳粉活菌数等量换算的发酵乳样品用于上述干预实验以后，效果与发酵乳粉干预效果相当。上述结果说明副干酪乳杆菌发酵乳(粉)对高脂饮食引起的结肠组织上皮细胞间粘附缺陷有明显的修复作用。
实施例8
将实施例1中的接种量，脱脂乳浓度，培养温度以及发酵时间逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的副干酪乳杆菌发酵乳粉，各组所得发酵乳粉中活菌数如表4所示。
表4不同方法制备所得副干酪乳杆菌发酵乳粉中活菌数
从表4所示的结果中可以得出，将所述发酵乳粉的制备方法中接种量，脱脂乳浓度，培养温度以及发酵时间调整到优选范围之外的时候，副干酪乳杆菌CGMCC NO.20045依然可以在脱脂乳中得到部分增殖生长，但是其增殖效果明显下降，因此所制备得到的发酵乳粉中活菌数量远远低于优选范围内制备的发酵乳粉，从而影响其积极调控高脂饮食引起的肠屏障受损的物质的大量合成。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
分类命名：副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei
保藏单位全称及简称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年06月08日
保藏编号：CGMCC No.20045
Claims (11)
1.一种副干酪乳杆菌，其保藏号为CGMCC No. 20045。
2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌在制备发酵乳制品中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述发酵乳制品选自发酵乳、乳粉中的一种或多种的组合。
4.一种副干酪乳杆菌发酵乳制品，由权利要求1所述的副干酪乳杆菌制备获得。
5.一种副干酪乳杆菌发酵乳制品的制备方法，所述制备方法包括：
将接种有如权利要求1所述的副干酪乳杆菌的脱脂乳进行发酵处理。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：
将发酵所得发酵产物进行干燥处理。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量为1×107～5×107 CFU/mL；
和/或，所述发酵处理中，脱脂乳为脱脂乳粉的水溶液，按质量百分比计，所述脱脂乳粉的水溶液中，脱脂乳粉所占的质量百分比为3%～12%；
和/或，所述发酵处理中，发酵温度为26℃～42℃，发酵时间为6h～18h；
和/或，所述发酵处理为厌氧发酵处理。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量为2×107～4×107 CFU/mL；
和/或，所述发酵处理中，发酵温度为30℃～40℃，发酵时间为9～15 h。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵处理中，副干酪乳杆菌的接种量为2.8×107 CFU/mL～3.2×107 CFU/mL；
和/或，所述发酵处理中，发酵温度为36℃～38℃，发酵时间为11～13 h。
10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵乳制品选自发酵乳、发酵乳粉中 的一种或多种的组合。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述发酵乳中的副干酪乳杆菌CGMCCNO. 20045的活菌数＞8×108 CFU/mL；
和/或，所述发酵乳粉中的副干酪乳杆菌CGMCC NO. 20045的活菌数＞8×109 CFU/g。
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