CN104673773A - 一种直投式凝乳酶制剂的制备方法及其产物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种直投式凝乳酶制剂的制备方法及其产物和应用，所述制备方法包括以下步骤：利用脱脂乳培养基培养类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)25℃～35℃，震荡培养24～120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。该制备方法创造性地使用脱脂乳作为基料来发酵，由于同样为乳源制品，因此所获得的凝乳酶可以直接应用于干酪的制备工艺，相比传统的凝乳酶制备方法，此法大幅简化了凝乳酶制剂的应用步骤，最大限度地保留了凝乳酶活力，从根本上避免了提取过程中的凝乳酶的酶活力损失，从而有效降低了凝乳酶制剂的生产与应用成本。

Description

一种直投式凝乳酶制剂的制备方法及其产物和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种直投式凝乳酶制剂的制备方法及其产物和应用。
背景技术
凝乳酶是干酪生产中的关键性酶，它对干酪的质构形成及特有风味的形成有非常重要的作用。国际市场上凝乳酶中动物来源的约占70％，微生物的占30％，随着干酪工业的不断发展，动物来源的凝乳酶已远不能满足生产需要，各国研究者不断地寻找新的来源。目前发现微生物可产生一定活力的凝乳酶主要是放线菌、细菌和霉菌等，包括放线菌中链霉菌属、小单孢菌属、马杜拉放线菌属、根霉、总状毛霉、微小毛霉、米黑毛霉、粟疫菌、寄生内座壳菌、易脆毛霉以及其他通过基因工程或辐照获得的高产凝乳酶的菌株等。
将筛选出的高产凝乳酶菌株通过优化培养条件后，确定较佳的凝乳酶提取的方法和条件，成为当今国内外凝乳酶研究的一个重要的方向。然而，目前国内微生物源凝乳酶需从发酵液提取获得后才能投入商业化应用，其提取方法主要涉及了硫酸铵分步法盐析、氯化钠盐析法以及乙醇分步提取法等，且提取的凝乳酶多集中于对毛霉相关研究，其纯化过程还需要通过层析柱处理，过程较为复杂且增大了凝乳酶的损失率。
目前我国对凝乳酶的研究较浅，生产干酪的凝乳酶主要依靠国外进口。只有少数科研单位对产凝乳酶的菌种及制备工艺进行了较系统的研究。中国专利申请(CN 103740618A)公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)，并将其中的模式菌株BD3526于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。中国专利申请(CN 103865842A)公开了类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株的麸皮培养物上清液具有凝乳酶活力，然而，麸皮原料作为一种小麦加工的副产品，目前尚无明确的产品标准，从而导致不同来源的麸皮发酵上清液中的凝乳酶活力高低不一，波动性极大，这给该类芽孢杆菌及其发酵产物的工业化应用带来了很大障碍。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前凝乳酶的天然来源和产量严重不足，而利用不同来源的麸皮培养基培养类芽孢杆菌所得上清液中的凝乳酶活力高低不一，波动性极大的技术问题，提供了一种直投式凝乳酶制剂的制备方法及其产物和应用。
本发明所述制备方法创造性地使用脱脂乳作为培养介质，将所得具有凝乳酶活力的发酵上清或其冻干制剂直接应用于干酪的制备工艺。相比传统制备方法，本发明公开的制备方法大幅简化了凝乳酶制剂的应用步骤，最大限度地保留了凝乳酶活力，从而有效降低了凝乳酶制剂的生产与应用成本。此外，与现有制备方法相比本发明方法使用的脱脂乳培养基成分性质明确，成分含量稳定，解决了由于发酵基料成分不稳定造成的所得凝乳酶的活性波动幅度极大的问题，为类芽孢杆菌及其发酵产物的工业化大规模生产以及在干酪制备中的应用提供了极大的保障。
尽管类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株的麸皮培养物上清液具有凝乳酶活力已有披露，但其凝乳酶活力因麸皮的不同产地或批次等因素会产生较大的波动。本发明人发现，该菌株的脱脂乳发酵液同样具有优良的凝乳酶活力，更重要的是，本发明所述的制备方法所用的发酵基料为脱脂乳时，该培养基的成分明确而且含量稳定，与麸皮培养基相比具有更稳定的凝乳酶产出效率，因此利用脱脂乳培养基发酵培养类芽孢杆菌所得发酵液上清或者冻干粉可直接应用于标准化程度较高的大规模工业化干酪生产制备工艺。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种直投式凝乳酶制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：利用脱脂乳培养类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)25℃～35℃，震荡培养20～120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。
其中所述类芽孢杆菌为产凝乳酶的类芽孢杆菌，较佳地为CGMCCNo.8333菌株。该类芽孢杆菌的模式菌株BD3526已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，它的分类命名是类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，其保藏编号为：CGMCC No.8333(具体内容请参见中国专利申请CN 103740618A)。
其中所述脱脂乳为本领域常规所述的脱脂乳，所述脱脂乳的制备方法为本领域常规的制备方法。其中所述脱脂乳更佳地是将鲜乳经过脱脂和除菌后制得的，所述脱脂的方法较佳地是将生鲜乳通过脂肪分离机处理，如离心等加工方式处理所得；更佳地是由脱脂乳粉加水还原制备得到。较佳地，所述脱脂乳由5％-15％的脱脂乳粉和补足至100％的水还原制得，更佳地，所述脱脂乳由6％-12％的脱脂乳粉和补足至100％的水还原制得，最佳地，所述脱脂乳由10％的脱脂乳粉和90％的水还原制得，所述百分比为质量百分比。
其中所述的培养的温度较佳地为28℃～35℃，更佳地为30℃；所述震荡培养的震荡速度较佳地为200rpm；震荡培养的时间较佳为24h～96h，更佳地为4288h～72h，最佳地为48h。
其中所述离心的温度较佳地为2℃～4℃，离心的速度较佳地为6000g～15,000g，离心的时间较佳地为5min～15min更佳地为10min。当离心速度过高，或者离心时间过长时，会显著降低所得凝乳酶制剂的活力，最终影响酶制剂的凝乳效果。
较佳地，所述制备方法还包括将所得上清液冷冻干燥的步骤，所述冷冻干燥较佳地为真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的温度较佳地为-44℃～-40℃。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：本发明所述制备方法所得的直投式凝乳酶制剂。本发明制备所得直投式凝乳酶制剂的凝乳酶活力更稳定，而且该直投式凝乳酶制剂的应用方法更为简单方便。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：本发明所述直投式凝乳酶制剂在制备凝乳酶中的应用。本发明所述凝乳酶的制备方法为本领域常规的凝乳酶制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四是：本发明所述直投式凝乳酶制剂在制备发酵乳制品中的应用。
本发明所述发酵乳制品为本领域常规发酵乳制品，较佳地包括发酵乳，乳酸菌饮料，干酪，酸乳粉，发酵乳酪等，更佳地为发酵乳酪，优选地为干酪。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、该制备方法创造性地使用脱脂乳作为培养来发酵类芽孢杆菌，由于同样为乳源制品，因此所获得的凝乳酶可以直接应用于干酪的制备工艺，相比传统的凝乳酶制备方法，此法大幅简化了凝乳酶制剂的应用步骤，最大限度地保留了凝乳酶活力，从根本上避免了提取过程中凝乳酶的酶活力损失，从而有效降低了凝乳酶制剂的生产与应用成本。
2、本发明的制备方法打破了传统凝乳酶制剂提取方法需要涉及硫酸铵、乙醇等化学试剂和有机溶剂的现状，所制备的酶制剂无任何试剂残留的风险，具有更可靠的食品安全性。
3、本发明的制备方法所使用培养基为成分明确，含量稳定的脱脂乳培养基，与常规的麸皮培养基制备方法相比，具有更稳定的凝乳酶活力，因而更适合标准化程度较高的大规模工业化干酪生产制备工艺。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，则为分析纯试剂，均购买自国药集团。
实施例1直投式凝乳酶制剂的制备方法
本发明所述菌株类芽孢杆菌BD3526已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。该菌株的分类命名是类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333，具体内容请参见中国专利申请(CN 103740618A)。
利用脱脂乳培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，脱脂乳培养基的成分为：脱脂乳的质量百分含量为15％，余量为水，温度35℃，摇床震荡的速度为300rpm，发酵培养时间120小时后，收集BD3526发酵液；于4℃，15,000g，5min条件下离心后收集得发酵上清液A，测定发酵上清液酶活力(SU/mg)。
凝乳酶活力(milk clotting activity,MCA)测定方法包括以下步骤：将脱脂乳粉(脱脂乳粉购买自fonterra公司)以10％(w/v)的比例配置成pH 6.0含有10mmol/L CaCl2的溶液，在35℃水浴中孵育10min后，取稀释的发酵上清液500μL加入至35℃的10mL上述方法配制的脱脂乳溶液中，每15s将样品取出并倾斜45℃观察样品组织状态，以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间。1个凝乳酶单位(Soxhlet unite，SU)定义为35℃，使1mL脱脂乳在40min发生凝乳所需的酶量。
T——凝乳时间，秒
VS——底物体积，mL
VE——酶液体积，mL
D——稀释倍率
经测定，发酵上清液A的凝乳酶活力为400SU/mL。
实施例2直投式凝乳酶制剂的制备方法
利用脱脂乳培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，脱脂乳培养基的成分为：脱脂乳的质量百分含量为10％，余量为水，温度30℃，摇床的震荡的速度为200rpm，发酵培养时间96小时后，收集BD3526发酵液；于3℃，10,000g，10min条件下离心后收集得发酵上清液B，利用实施例1所述测定发酵上清液酶活力(SU/mL)。
经测定，发酵上清液B的凝乳酶活力为500SU/mL。
实施例3直投式凝乳酶制剂的制备方法
利用脱脂乳培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，脱脂乳培养基的成分为：脱脂乳的质量百分含量为5％，余量为水，温度25℃，摇床的震荡的速度为100rpm，发酵培养时间24小时后，收集BD3526发酵液；于2℃，6,000g，15min条件下离心后收集得发酵上清液C，利用实施例1所述测定发酵上清液酶活力(SU/mL)。
经测定，发酵上清液C的凝乳酶活力为200SU/mL。
实施例4直投式凝乳酶冻干制剂的制备方法
取实施例1-3制备所得的发酵上清液A、B和C进行冷冻干燥，分别获得凝乳酶冻干制剂a、b和c。将冻干制剂用蒸馏水还原为冻干前的体积后进行凝乳酶活力测定，结果如表1所示。
表1不同凝乳酶冻干制剂的凝乳酶活力
实施例5直投式凝乳酶制剂的制备方法
利用脱脂乳培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，脱脂乳培养基的成分为：脱脂乳的质量百分含量为6％，余量为水，温度28℃，摇床的震荡的速度为100rpm，发酵培养时间20小时后，收集BD3526发酵液；于2℃，10,000g，5min条件下离心后收集得发酵上清液B，利用实施例1所述测定发酵上清液酶活力(SU/mL)。经测定，所得直投式凝乳酶制剂的凝乳酶活力为215SU/mL。
实施例6直投式凝乳酶制剂的制备方法
利用脱脂乳培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，脱脂乳培养基的成分为：脱脂乳的质量百分含量为5％，余量为水，温度35℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间72小时后，收集BD3526发酵液；于5℃，16,000g，15min条件下离心后收集得发酵上清液B，利用实施例1所述测定发酵上清液酶活力(SU/mL)，所得上清液真空冷冻干燥的温度为-40℃。经测定，所得直投式凝乳酶制剂的凝乳酶活力为240SU/mL。
实施例7直投式凝乳酶制剂的制备方法
利用脱脂乳培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，脱脂乳培养基的成分为：脱脂乳的质量百分含量为12％，余量为水，温度35℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48小时后，收集BD3526发酵液；于5℃，16,000g，10min条件下离心后收集得发酵上清液B，所得上清液真空冷冻干燥的温度为-44℃。利用实施例1所述测定发酵上清液酶活力(SU/mL)。经测定，所得直投式凝乳酶制剂的凝乳酶活力为280SU/mL。
效果实施例1发酵上清液的凝乳时间
新鲜牛奶过滤去除杂质，65℃保温30min，温度降至35℃，按体积比1：20向巴杀牛奶中加入上述实施例1～3制备所得的发酵上清液A、B、C，继续35℃保温观察牛奶的凝乳时间，如表2所示。
表2不同发酵液上清的牛奶凝乳时间
表2所示凝乳时间是直投式凝乳酶制剂的凝乳活力的直接反映，该结果显示本发明所得发酵液上清不仅具有较佳的凝乳酶活性，而且不同批次所得上清的凝乳酶活性较为稳定。
效果实施例2直投式凝乳酶制剂的凝乳时间
新鲜牛奶过滤去除杂质，65℃保温30min，温度降至35℃，以0.03g/L的添加量加入发酵剂(R-704，科.汉森)，35℃保温，当△pH＝0.2～0.3时，以0.01g/L的添加量加入上述实施例4制备所得的直投式凝乳酶制剂a、b和c，继续35℃保温观察牛奶的凝乳时间，如表3所示。
表3不同直投式凝乳酶制剂的牛奶凝乳时间
表3所示凝乳时间是直投式凝乳酶制剂的凝乳活力的直接反映，该结果显示本发明所得直投式凝乳酶制剂具有较佳的凝乳酶活性。
对比实施例1技术参数对所得凝乳酶制剂酶活力的影响效果
将实施例2所述直投式凝乳酶制剂制备方法中脱脂乳培养基配方中脱脂乳粉含量，类芽孢杆菌的培养温度，发酵时间以及发酵震荡的速度逐一进行调整，获得了一组不同制备方法所得直投式凝乳酶制剂，经检测各组的酶活如表4所示：
表4不同制备方法所得直投式凝乳酶制剂
从表4所示的结果中可以得出，将直投式凝乳酶制剂的制备方法中脱脂乳培养基配方中的脱脂乳粉含量，类芽孢杆菌的培养温度，其发酵时间以及发酵震荡速度等技术参数调整到本发明所述技术方案所述范围之外时，制备所得直投式凝乳酶制剂的凝乳酶活力会显著降低。
对比实施例2不同制备方法所得凝乳酶制剂酶活力的比较结果
常规的凝乳酶制备方法为：利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为2％，余量为水，装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48小时后，收集BD3526发酵液；于4℃，15000g，20min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比3:1(V/V)进行混合，混合均匀后于4℃静置1h。在4℃，15000g离心15min收集醇沉物质，将沉淀用0.02mol/L PBS溶解后，4℃，15000g条件下离心5min去除不溶物，取上清溶液进行冻干处理，最终获得类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。
表5显示了本发明与上述常规凝乳酶制备方法的关键性差异，不难发现，常规凝乳酶制备方法不但操作步骤繁琐，其提取过程还涉及了使用有机溶剂，而本发明所述制备方法步骤简单，可操作性更强，更重要的是本发明所述制备方法不涉及使用任何有机溶剂，无任何有毒有害试剂残留的风险，从而具备了更可靠的食品安全性。
表5与常规凝乳酶制备方法的比较
对比实施例3不同培养基所得凝乳酶制剂酶活性波动性的比较结果
根据对比例2所述的常规凝乳酶制备方法，分别采用购自不同地区的麸皮1，2和3(其中，麸皮1购自山东荷泽，淘宝店名：黄河滩农户人家，http://item.taobao.com/item.htm？spm＝a230r.1.14.34.6aY7qR&id＝23590856555&ns＝1&abbucket＝5#detail；麸皮2购自河南周口，淘宝店名：绿色食品农产品，http://item.taobao.com/item.htm？spm＝a230r.1.14.34.6aY7qR&id＝41876035188&ns＝1&abbucket＝5#detail；麸皮3购自陕西宝鸡，淘宝店名：真农真味，http://item.taobao.com/item.htm？spm＝a230r.1.14.45.6aY7qR&id＝39196619115&ns＝1&abbucket＝5#detail)进行凝乳酶的制备。
根据本发明实施例2所述方法，分别采用不同来源的脱脂乳粉1，2和3(其中，脱脂乳粉1购自fonterra公司；脱脂乳粉2购自新西兰米勒根斯食品集团有限公司；脱脂乳粉3购自Carifornia Dairies inc.USA)进行直投式凝乳酶制剂的制备。
按照前述检测方法分别测定不同培养基所制备的直投式凝乳酶制剂的酶活力，并计算标准差S，结果如表6所示。
表6不同培养基制备的凝乳酶制剂酶活性的波动性比较
表6显示了以不同来源的麸皮和脱脂乳为基料，经CGMCC No.8333菌株发酵产生的凝乳酶活力，通过标准差S的统计结果发现(标准差S值越小，波动性越小)，以麸皮为培养基获得的凝乳酶活力波动较大，而以脱脂乳为培养基发酵获得的凝乳酶的波动幅度显著降低，说明利用脱脂乳培养基所得凝乳酶制剂的酶活力更加稳定。
不难理解，凝乳酶制剂品质的稳定性是其成功商品化的关键保障，而凝乳酶活力的波动性直接决定了以其制备获得的干酪品质，因此，根据标准差S的结果比较后不难发现，以本发明所述制备方法所得直投式凝乳酶制剂的酶活力非常稳定，更有利于工业化生产以及大规模地应用在干酪制备产业中。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种直投式凝乳酶制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：利用脱脂乳培养类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)25℃～35℃，震荡培养20～120小时得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述类芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.8333；所述脱脂乳由5％-15％的脱脂乳粉和补足至100％的水还原制得，所述百分比为质量百分比。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂乳由6％-12％的脱脂乳粉和补足至100％的水还原制得，更佳地，所述脱脂乳由10％的脱脂乳粉和90％的水还原制得，所述百分比为质量百分比。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述震荡培养的温度为28℃～35℃，所述震荡培养的震荡速度为100r/min～300r/min，震荡培养的时间为24小时～96小时。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述震荡培养的温度为30℃；所述震荡培养的震荡速度为200rpm；所述震荡培养的时间为48～72小时，更佳地为48小时。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心的温度为2～4℃，离心的速度为6000g～15000g，离心的时间为5～15分钟。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所得上清液冷冻干燥的步骤，所述冷冻干燥较佳地为真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的温度较佳地为-44℃～-40℃。
8.如权利要求1～7任一项所述制备方法所得的直投式凝乳酶制剂。
9.如权利要求8所述的直投式凝乳酶制剂在制备凝乳酶中的应用。
10.如权利要求8所述的直投式凝乳酶制剂在制备发酵乳制品中的应用。
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