CN105400759B - 直投式凝乳酶制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种直投式凝乳酶制剂的制备方法,所述直投式凝乳酶制剂由保藏编号为CCTCC M 2015633的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)发酵培养制备得到,包括格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的活化、种子液的制备、发酵培养以及直投式凝乳酶制剂的制备的步骤。该方法制备得到的直投式凝乳酶制剂活性高(1230SU/g以上)、稳定性好,制备过程简单、成本低。本发明的直投式凝乳酶制剂可用于制备发酵乳制品。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域,特别是涉及一种直投式凝乳酶制剂及其制备方法。
背景技术
凝乳酶是乳酪生产中的关键酶,传统上利用牛犊第四胃(皱胃)提取制作,随着乳酪产业不断扩大,单纯靠宰杀幼畜的方法来生产凝乳酶已经不能满足现代工业对凝乳酶的需求。研究者已经开始从其他动物、植物和微生物中寻求凝乳酶来源。微生物来源广泛及其生长特性使得微生物凝乳酶具有广阔的发展前景。目前关于微生物凝乳酶主要是利用真菌生产凝乳酶,而关于细菌生产的凝乳酶的研究较少。但细菌液体发酵生产凝乳酶具有生长周期短、生产成本低、易于控制生长条件等诸多优点,近几年得到研究者更多的关注。
发明内容
基于此,本发明的目的之一在于提供一种直投式凝乳酶制剂的制备方法。
实现上述发明目的的具体技术方案如下:
一种直投式凝乳酶制剂的制备方法,所述直投式凝乳酶制剂由保藏编号为CCTCCM 2015633的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)发酵培养制备得到,包括以下步骤:
(1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)在琼脂-营养肉汤斜面培养基上活化;
(2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于培养基中进行培养,得格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液;
(3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养;
(4)直投式凝乳酶制剂的制备:在步骤(3)的发酵培养基中加入糖类保护剂,冷冻干燥,即得直投式凝乳酶制剂。
在其中一些实施例中,步骤(3)所述的发酵培养基的成分为:5~30wt%的脱脂乳,0~5wt%的葡萄糖、乳糖、果糖或蔗糖,0~5wt%的酵母粉、蛋白胨、氯化铵或硫酸铵,余量为蒸馏水。
在其中一些实施例中,步骤(3)所述的发酵培养基的成分为:10wt%的脱脂乳,1wt%的葡萄糖,2wt%的蛋白胨,余量为蒸馏水。
在其中一些实施例中,步骤(1)所述琼脂-营养肉汤斜面培养基中琼脂的含量为2wt%,活化时间为20h~50h,温度为25℃~48℃。
在其中一些实施例中,步骤(2)所述培养基为M17培养基,培养温度为28℃~48℃,培养时间为10h~50h,转速为100rpm~280rpm。
在其中一些实施例中,步骤(3)将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为1%~10%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养,发酵培养的温度为28℃~48℃,时间为24h~156h,转速为100rpm~280rpm。
在其中一些实施例中,步骤(3)将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为1%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养,发酵培养的温度为28℃,时间为144h,转速为240rpm。
在其中一些实施例中,步骤(4)所述加入糖类保护剂为加入0.5~5wt%的海藻糖和/或0.5~5wt%的乳糖,冷冻干燥的时间为20h~28h。
本发明的另一目的在于提供一种直投式凝乳酶制剂。
具体技术方案如下:
一种直投式凝乳酶制剂,由上述制备方法制备而得。
本发明的另一目的在于提供上述直投式凝乳酶制剂的应用。
具体技术方案如下:
上述直投式凝乳酶制剂在制备发酵乳制品中的应用。
本发明的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)已于2015年10月22号保藏于武汉大学保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC,地址:武汉市武昌珞珈山),保存期为三十年,保藏编号CCTCC M 2015633。
本发明筛选得到一种格氏乳球菌(Lactococcus garvieae),其保藏编号为CCTCCM 2015633,进而利用该格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)进行发酵培养制备直投式凝乳酶制剂。本发明的直投式凝乳酶制剂的制备方法制备得到的凝乳酶制剂活性高(1230SU/mg以上)、热稳定性与酸碱稳定性均很好,制备过程简单、成本低。本发明的直投式凝乳酶制剂可用于制备发酵乳制品。
附图说明
图1为实施例1的直投式凝乳酶制剂的热稳定性研究图。
图2为实施例1的直投式凝乳酶制剂的酸碱稳定性研究图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
以下实施例中,未注明具体条件的实验方法,按本领域内常规方法和条件进行。格式乳球菌(Lactococcus garvieae)保藏在武汉大学保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏日期2015年10月22日,保藏编号CCTCC M2015633。
实施例1
本实施例的一种直投式凝乳酶制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于2wt%的琼脂-营养肉汤中进行活化,活化温度为28℃,时间为48h;
(2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于M17培养基中培养12h,培养温度为28℃,转速为100rpm,得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液;
(3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为1%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养144h,培养温度为28℃,转速为100rpm;所述发酵培养基的成分为:10wt%的脱脂乳,1wt%的葡萄糖,2wt%蛋白胨,余量为蒸馏水;
(4)直投式凝乳酶制剂的制备:在步骤(3)的发酵培养基中加入2wt%的海藻糖和0.1wt%的乳糖,冷冻干燥24h,即得所述直投式凝乳酶制剂,其凝乳酶活性为1560SU/g。
凝乳酶活性测定方法:将直投式凝乳酶制剂用蒸馏水配制成10mg/mL的酶液。用0.01mol/L氯化钙溶液配制12wt%的脱脂奶粉溶液,室温放置40min后使用,当天配制。取5mL 12wt%的脱脂奶粉溶液在35℃水浴锅中保温10min,加0.05mL酶液,立即摇匀,开始计时,把试管倾斜45°,旋转试管,观察壁上出现絮状沉淀时为凝乳终点,记录凝乳时间。40min凝固1m L脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位(Soxhlet unit,SU)。按下式计算凝乳酶活力:MCE=2400*V1*N/(T*V2),式中:MCE为凝乳酶活力/(SU/m L);V1为脱脂奶粉溶液体积/m L;t为凝乳时间/s;V2为加酶体积/m L;n为稀释倍数。
实施例2
(1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于2wt%的琼脂-营养肉汤中进行活化,活化温度为45℃,时间为48h;
(2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于M17培养基中培养48h,培养温度为45℃,转速为240rpm,得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液;
(3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为10%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养24h,培养温度为45℃,转速为240rpm;所述发酵培养基的成分为:10wt%的脱脂乳,1wt%的葡萄糖,2wt%蛋白胨,余量为蒸馏水;
(4)直投式凝乳酶制剂的制备:在步骤(3)的发酵培养基中加入2wt%的海藻糖和0.1wt%的乳糖,冷冻干燥24h,即得所述直投式凝乳酶制剂,其凝乳酶活性为1540SU/g,(测定方法同实施例1)。
实施例3
(1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于2wt%的琼脂-营养肉汤中进行活化,活化温度为28℃,时间为24h;
(2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于M17培养基中培养12h,培养温度为28℃,转速为240rpm,得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液;
(3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为1%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养144h,培养温度为32℃,转速为240rpm;所述发酵培养基的成分为:5wt%的脱脂乳,1wt%的葡萄糖,余量为蒸馏水;
(4)直投式凝乳酶制剂的制备:在步骤(3)的发酵培养基中加入2wt%的海藻糖和0.1wt%的乳糖,冷冻干燥24h,即得所述直投式凝乳酶制剂,其凝乳酶活性为1440SU/g,(测定方法同实施例1)。
实施例4
(1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于2%的琼脂-营养肉汤中进行活化,活化温度为28℃,时间为24h;
(2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于M17培养基中培养12h,培养温度为28℃,转速为240rpm,得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液;
(3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为1%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养144h,培养温度为32℃,转速为240rpm;所述发酵培养基的成分为:5wt%的脱脂乳,1wt%的葡萄糖,2wt%蛋白胨,余量为蒸馏水;
(4)直投式凝乳酶制剂的制备:在步骤(3)的发酵培养基中加入2wt%的海藻糖和0.1wt%的乳糖,冷冻干燥24h,即得所述直投式凝乳酶制剂,其凝乳酶活性为1480SU/g,(测定方法同实施例1)。
实施例5
(1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于2wt%的琼脂-营养肉汤中进行活化,活化温度为28℃,时间为24h;
(2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于M17培养基中培养12h,培养温度为28℃,转速为240rpm,得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液;
(3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为1%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养144h,培养温度为32℃,转速为240rpm;所述发酵培养基的成分为:20wt%的脱脂乳,余量为蒸馏水;
(4)直投式凝乳酶制剂的制备:在步骤(3)的发酵培养基中加入2wt%的海藻糖和0.1wt%的乳糖,冷冻干燥24h,即得所述直投式凝乳酶制剂,其凝乳酶活性为1230SU/g,(测定方法同实施例1)。
实施例6
取实施例1的直投式凝乳酶制剂配置成10mg/mL的酶液,将适量酶液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、45℃、55℃、65℃、70℃处理60min后,迅速取出在冰浴中降温,然后在35℃水浴中保持10min,以凝乳活力为指标测定凝乳酶在不同的温度条件下的稳定性。结果如图1所示(凝乳酶活性测定方法同实施例1),经不同温度条件下处理过后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的直投式凝乳酶制剂的凝乳酶活性变化不大,在1400SU/g~1565SU/g,当处理温度超过50℃后,凝乳酶活性才略有下降。因此格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)的直投式凝乳酶制剂的凝乳酶具有较好的热稳定性。
实施例7
取实施例1的直投式凝乳酶制剂配置成10mg/mL的酶液,用浓度为0.1mol/L的NaOH溶液和0.1mol/L的HCl溶液将酶液的p H值分别调整为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,然后一起置于4℃避光保存24h后,再将酶液pH值调整至原酶液p H值,在35℃水浴中稳定10min后测定凝乳酶的凝乳时间(测定方法同实施例1),以原酶液的凝乳时间为对照测定实施例1的直投式凝乳酶制剂的凝乳酶在不同的p H值条件的活力变化情况。结果如图2所示,经不同pH条件下处理过后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的直投式凝乳酶制剂的凝乳酶活性变化不大,在1420SU/g~1565SU/g,当p H超过10以后,凝乳酶活性才略有下降。因此格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的直投式凝乳酶制剂的凝乳酶具有较好的酸碱稳定性。
实施例8
取实施例中1中的直投式凝乳酶制剂1mg,添加于1L含2.5wt%蔗糖的无菌纯牛奶中,4.5h后即获得淡酸、凝块细腻且较结实的甜凝乳食品。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种直投式凝乳酶制剂的制备方法,其特征在于,直投式凝乳酶制剂由保藏编号为CCTCC M 2015633的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)发酵培养制备得到,包括以下步骤:
(1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)在琼脂-营养肉汤斜面培养基上活化;
(2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于培养基中进行培养,得格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液;
(3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养;所述的发酵培养基的成分为:5~30wt%的脱脂乳,1~5wt%的葡萄糖、乳糖、果糖或蔗糖,0~5wt%的酵母粉、蛋白胨、氯化铵或硫酸铵,余量为蒸馏水;
(4)直投式凝乳酶制剂的制备:在步骤(3)的发酵培养基中加入糖类保护剂,冷冻干燥,即得直投式凝乳酶制剂。
2.根据权利要求1所述的直投式凝乳酶制剂的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的发酵培养基的成分为:10wt%的脱脂乳,1wt%的葡萄糖,2wt%的蛋白胨,余量为蒸馏水。
3.根据权利要求1-2任一项所述的直投式凝乳酶制剂的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述琼脂-营养肉汤斜面培养基中琼脂的含量为2wt%,活化时间为20h~50h,温度为25℃~48℃。
4.根据权利要求1-2任一项所述的直投式凝乳酶制剂的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述培养基为M17培养基,培养温度为28℃~48℃,培养时间为10h~50h,转速为100rpm~280rpm。
5.根据权利要求1-2任一项所述的直投式凝乳酶制剂的制备方法,其特征在于,步骤(3)将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为1%~10%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养,发酵培养的温度为28℃~48℃,时间为24h~156h,转速为100rpm~280rpm。
6.根据权利要求5所述的直投式凝乳酶制剂的制备方法,其特征在于,步骤(3)将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为1%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养,发酵培养的温度为28℃,时间为144h,转速为240rpm。
7.根据权利要求1-2任一项所述的直投式凝乳酶制剂的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述加入糖类保护剂为加入0.5~5wt%的海藻糖和/或0.5~5wt%的乳糖,冷冻干燥的时间为20h~28h。
8.一种直投式凝乳酶制剂,其特征在于,由权利要求1-7任一项所述的制备方法制备而得。
9.权利要求8所述的直投式凝乳酶制剂在制备发酵乳制品中的应用。
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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