CN105624240B - 一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种春雷霉素发酵培养基，其中，所述发酵培养基中含有吐温80和消泡剂，其中，所述消泡剂为有机硅类消泡剂和/或聚醚类消泡剂。本发明所提供的春雷霉素发酵培养基通过吐温80、消泡剂与培养基原料的协同作用显著的降低了液体发酵过程中泡沫的产生量，从而提高了氧的传递效率，更好的避免了大量泡沫所造成的逃液及染菌的发生，利用本发明所提供的发酵培养基和培养方法能够显著提高春雷霉素的发酵产量。

Description

一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体的，涉及一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法。

背景技术

在利用微生物进行发酵生产的过程中，培养体系中可能会产生大量泡沫，泡沫产生的原因大致可以归结为通气搅拌、培养基配比、菌种特性、接种量和灭菌质量等。泡沫对发酵的不良影响包括：发酵罐的装料系数减少，氧传递效率降低，容易造成逃液，增加染菌机会导致菌体代谢异常等。因此抑制泡沫的量是保证正常发酵的基本条件。工业上一般使用添加有消泡剂的发酵培养基来抑制泡沫的产生量，本发明的发明人在利用小金色链霉菌菌株进行春雷霉素发酵生产的实践中发现，现有的添加有消泡剂(例如，环氧乙烷环氧丙烷聚合物、硬质酰胺和乳化硅油)的发酵培养基难以对泡沫的产生进行有效的抑制，制约了春雷霉素发酵产量的提高。

因此有必要提供一种新的具有优异泡沫抑制效果的含有消泡剂的发酵培养基以提高发酵的效率和产量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的春雷霉素发酵生产中存在的上述缺陷，提供一种能够对春雷霉素发酵培养过程中的泡沫产生进行有效抑制的发酵培养基以及一种能够提高春雷霉素产量的发酵方法。

为此，本发明提供了一种春雷霉素发酵培养基，所述发酵培养基中含有吐温80和消泡剂，其中，所述消泡剂为有机硅类消泡剂和/或聚醚类消泡剂。

吐温80为一种表面活性剂，有报道表明吐温80具有一定的增加细胞通透性的效果，本申请的发明人将吐温80应用于春雷霉素发酵培养基中与消泡剂进行复配使用，通过二者的协同作用实现对泡沫的抑制。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述聚醚类消泡剂为GPE型聚醚类消泡剂或者GPES型聚醚类消泡剂；优选的，为了获得更好的与吐温80的协同抑泡效果，所述聚醚类消泡剂为GPES型聚醚类消泡剂。

在本发明所提供的发酵培养基中，所述消泡剂可以通过购买市售商品的方式获得，可选的，所述有机硅类消泡剂可以为二甲基硅油类消泡剂，GPE型聚醚类消泡剂可以为甘油聚氧丙烯聚氧乙烯醚类消泡剂，GPES型聚醚类消泡剂可以为甘油聚环氧丙烷类消泡剂。

可选的，所述发酵培养基中吐温80的含量为0.15-0.25g/L，消泡剂的含量为0.2-0.3g/L。

可选的，为了获得最佳的减少泡沫产生的效果，所述发酵培养基中吐温80的含量为0.18-0.22g/L，消泡剂的含量为0.22-0.28g/L。优选的情况下，所述发酵培养基中吐温80的含量为0.2g/L，消泡剂的含量为0.25g/L。

在本发明所提供的发酵培养基中，还含有有机碳源和有机氮源，其中，所述有机碳源可以为葡萄糖、玉米淀粉和麦芽糊精中的一种或多种，所述有机氮源为豆饼粉、棉籽饼粉和玉米浆水解液中的一种或多种。优选的情况下，有机碳源为玉米淀粉，有机氮源为豆饼粉。

在本发明的一种更优选的实施方式中，所述发酵培养基中还含有：玉米淀粉22-28g/L，豆饼粉50-60g/L，氯化钠2.5-3.5g/L，磷酸二氢钾0.08-0.12g/L，豆油10-14mL/L，淀粉酶0.15-0.25g/L。

发明人在生产实践中发现，本发明所提供的发酵培养基中含有上述浓度的各原料并与吐温80和消泡剂进行复配使用后，发酵培养40h后泡沫的产生量显著低于其他配比方式，发酵过程结束后春雷霉素的产量更高。特别优选的，玉米淀粉的用量为25g/L，豆饼粉的用量为55g/L，氯化钠的用量为3g/L，磷酸二氢钾的用量为0.1g/L，豆油的用量为12mL/L，淀粉酶的用量为0.2g/L。

可选的，所述发酵培养基的pH为7.0-7.5。

本发明还提供了一种发酵培养基的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将玉米淀粉、豆饼粉、氯化钠、磷酸二氢钾、豆油和淀粉酶与水进行第一接触后获得发酵混合物一；

步骤二：将所述发酵混合物一与消泡剂进行第二接触后获得发酵混合物二；

步骤三：将所述发酵混合物二与吐温80进行第三接触，调节pH值至7.0-7.5获得发酵培养基。

本发明还提供了一种发酵生产春雷霉素的方法。

可选的，所述方法使用的发酵菌株为放线菌科放线菌属的小金色链霉菌(Streptomyces microaureus)菌株保藏编号ACCC40060(购于中国农业微生物菌种保藏管理中心)。

可选的，所述发酵生产春雷霉素的方法包括以下步骤：

按2-3％的接种量将小金色链霉菌种子液接种于发酵培养基中，在温度28℃、压力0.5-0.6Mpa、溶氧量25-30％、转速300-500rpm的条件下进行液体发酵获得发酵产物。

可选的，本发明所提供的方法还可以包括对所述发酵产物进行离心分离收集发酵清液，利用草酸将所述发酵清液的pH值调节至2-4，再浓缩获得春雷霉素含量为1-3％的春雷霉素水剂或者通过喷雾干燥的方式获得春雷霉素粉剂。

其中所述小金色链霉菌种子在接种于发酵培养基前可以经过以下活化步骤：将小金色链霉菌菌株接种于斜面培养基中，在28℃下培养13-15天，挑取长势饱满的菌落接种于母瓶培养基中，在28℃下以220rpm的转速培养40-50个小时获得小金色链霉菌种子。

其中，斜面培养基的组成成分可以为：胰蛋白胨3g/L，豆饼粉10g/L，甘油10mL/L，氯化钠3g/L，碳酸钙2g/L，琼脂粉25g/L。

母瓶培养基的组成成分可以为：葡萄糖5g/L，豆饼粉15g/L，玉米油6mL/L，牛肉膏10g/L，氯化钠0.3g/L，磷酸二氢钾1g/L。

本发明所提供的春雷霉素发酵培养基通过吐温80、消泡剂与培养基原料的协同作用显著的降低了液体发酵过程中泡沫的产生量，从而提高了氧的传递效率，更好的避免了大量泡沫所造成的逃液及染菌的发生，利用本发明所提供的发酵培养基和培养方法能够显著提高春雷霉素的发酵产量。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出进是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。

以下实施例中，斜面培养基和发酵培养基的配方为：

斜面培养基组成：胰蛋白胨3g/L，豆饼粉10g/L，甘油10mL/L，氯化钠3g/L，碳酸钙2g/L，琼脂粉25g/L，pH值自然，121℃、30min灭菌。

母瓶培养基组成：葡萄糖5g/L，豆饼粉15g/L，玉米油6mL/L，牛肉膏10g/L，氯化钠0.3g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH值自然，121℃、30min灭菌。

以下实施例中所使用的小金色链霉菌(Streptomyces microaureus)菌株保藏编号ACCC40060，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。

小金色链霉菌的活化步骤为：将小金色链霉菌菌株接种于斜面培养基中，在28℃下培养14天，挑取长势饱满的菌落接种于母瓶培养基中，在28℃下以220rpm的转速培养45个小时获得小金色链霉菌种子。

二甲基硅油购自郑州恒利化工有限公司。

甘油聚氧丙烯聚氧乙烯醚购自武汉大华伟业化工有限公司。

甘油聚环氧丙烷购自东莞市德丰消泡剂有限公司。

以下实施例中所使用的各原料和设备均可以通过购买市售产品的方式获得。

实施例1-9

实施例1-11用于说明本发明所提供的发酵培养基。

根据表1中所给出的各原料的配比方式按照以下步骤配制发酵培养基：

将玉米淀粉、豆饼粉、氯化钠、磷酸二氢钾、豆油和淀粉酶与水按比例混合均匀后加入消泡剂混匀获得混合物，再在混合物中添加吐温80混匀后调节pH值至7.0获得发酵培养基1-11。

其中实施例1-7中所使用的消泡剂为甘油聚环氧丙烷。

实施例8和9中所使用的消泡剂为二甲基硅油。

实施例10和11中所使用的消泡剂为甘油聚氧丙烯聚氧乙烯醚。

对比例1

按照与实施例1相同的方法和原料配比制备对照发酵培养基12，区别仅在于，培养基中不添加吐温80。

对比例2

按照与实施例1相同的方法和原料配比制备对照发酵培养基13，区别仅在于，培养基中不添加吐温80和消泡剂。

对比例3

按照与实施例1相同的方法和原料配比制备对照发酵培养基14，区别仅在于，将消泡剂替换为等质量的乳化硅油。

对比例4

按照与实施例1相同的方法和原料配比制备对照发酵培养基15，区别仅在于，玉米淀粉的用量为20g/L，豆饼粉的用量为45g/L，氯化钠的用量为2g/L，磷酸二氢钾的用量为0.07/L，豆油的用量为9mL/L，淀粉酶的用量为0.14g/L。

表1

测试例1-15

实施例1-15用于说明本发明所提供的发酵生产春雷霉素的方法。

按3％的接种量将小金色链霉菌种子液分别接种于实施例1-11制备的发酵培养基1-11以及对比例1-4中制备的对照发酵培养基12-15中，在温度28℃、压力0.5Mpa、溶氧量25％、转速400rpm的条件下进行液体发酵，并在发酵的第40和120小时观察记录发酵罐中泡沫的产生情况，结果记录在表2中。共发酵168h获得发酵产物，对各发酵产物进行离心分离(4000rpm，15min)收集发酵清液，测定发酵清液中春雷霉素的效价(生测法)，结果记录在表2中。

表2

培养基	第40小时泡沫高度(cm)	第120小时泡沫高度(cm)	效价μg/mL
				1	泡沫高度1，基本无泡沫	基本无泡沫	40500
2	泡沫高度1，基本无泡沫	基本无泡沫	40350
				3	泡沫高度1.5，基本无泡沫	基本无泡沫	40100

4	泡沫高度2，少量泡沫	泡沫高度1.5，基本无泡沫	38000
				5	泡沫高度2.5，少量泡沫	泡沫高度1，基本无泡沫	37300
6	泡沫高度2，少量泡沫	基本无泡沫	37600
				7	泡沫高度2，少量泡沫	基本无泡沫	37450
8	泡沫高度4，少量泡沫	泡沫高度2，少量泡沫	36190
				9	泡沫高度3.5，少量泡沫	泡沫高度为2，少量泡沫	36280
10	泡沫高度4，少量泡沫	泡沫高度3，少量泡沫	35800
				11	泡沫高度4，少量泡沫	泡沫高度3，少量泡沫	35660
12	泡沫高度7.5，大量泡沫	泡沫高度6，大量泡沫	32300
				13	泡沫高度10，大量泡沫	泡沫高度为12，大量泡沫	32080
14	泡沫高度8，大量泡沫	泡沫高度为6，较多泡沫	34160
				15	泡沫高度8，大量泡沫	泡沫高度为6，,较多泡沫	34260

从表2中的数据可以看出，与对比例1-4所制备的发酵培养基相比，本发明所提供的发酵培养基在春雷霉素的发酵过程中能够显著降低泡沫的产生量，具有优异的抑制泡沫产生的效果。

将培养基1-3与培养基4、5进行对比可以看出，当发酵培养基中吐温80和消泡剂的浓度在本发明的优选范围内时，对泡沫的抑制效果更好。

将培养基1-3与培养基6、7进行对比可以看出，当玉米淀粉的用量为25g/L，豆饼粉的用量为55g/L，氯化钠的用量为3g/L，磷酸二氢钾的用量为0.1g/L，豆油的用量为12mL/L，淀粉酶的用量为0.2g/L时与吐温80和消泡剂配合使用获得的发酵培养基的抑泡效果更好。

将培养基1与培养基8-11进行对比可以看出，当将GPES型聚醚类消泡剂中的甘油聚环氧丙烷与吐温80复配使用时，能取得最好的泡沫抑制效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种春雷霉素发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中含有吐温80和消泡剂，其中，所述消泡剂为选自二甲基硅油消泡剂、甘油聚氧丙烯聚氧乙烯醚消泡剂、甘油聚环氧丙烷消泡剂中的一种；

所述发酵培养基中吐温80的含量为0.15-0.25g/L，消泡剂的含量为0.2-0.3g/L；

所述发酵培养基中还含有：玉米淀粉22-28g/L，豆饼粉50-60g/L，氯化钠2.5-3.5g/L，磷酸二氢钾0.08-0.12g/L，豆油10-14mL/L，淀粉酶0.15-0.25g/L。

2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基中吐温80的含量为0.18-0.22g/L，消泡剂的含量为0.22-0.28g/L。

3.根据权利要求1或2所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基的pH为7.0-7.5。

4.权利要求1-3中任意一项所述的发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将玉米淀粉、豆饼粉、氯化钠、磷酸二氢钾、豆油和淀粉酶与水进行第一接触后获得发酵混合物一；

步骤二：将所述发酵混合物一与消泡剂进行第二接触后获得发酵混合物二；

步骤三：将所述发酵混合物二与吐温80进行第三接触，调节pH值至7.0-7.5获得发酵培养基。

5.一种利用权利要求1-3中任意一项所述的发酵培养基发酵生产春雷霉素的方法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所使用的发酵菌株为小金色链霉菌(Streptomyces microaureus)，保藏编号：ACCC40060。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

按2-3％的接种量将小金色链霉菌种子液接种于发酵培养基中，在温度28℃、压力0.5-0.6Mpa、溶氧量25-30％、转速300-500rpm的条件下进行液体发酵获得发酵产物，液体发酵的时间为160-168小时。