CN106011201A - 一种小金色放线菌发酵生产春雷霉素的培养基和培养方法 - Google Patents

一种小金色放线菌发酵生产春雷霉素的培养基和培养方法 Download PDF

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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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Abstract

本发明涉及一种小金色放线菌发酵生产春雷霉素的培养基和培养方法，本发明确认了小金色放线菌发酵生产春雷霉素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。特别是培养基中添加了油泥，降低了碳源棉籽油的使用量；发酵培养基中加入发酵豆腐干渣，降低了蚕蛹油的用量。利用本发明中提供的培养基配方和发酵控制工艺，能够提高春雷霉素发酵单位，降低发酵成本，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现春雷霉素稳定、高效的生产。

Description

一种小金色放线菌发酵生产春雷霉素的培养基和培养方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种小金色放线菌发酵生产春雷霉素的培养基和培养方法。
背景技术
春雷霉素是一种由链霉菌产生的弱碱性抗菌素，因其产生菌在培养基中分泌金黄色素，故命名为小金色链霉素。春雷霉素是农医两用抗菌素。
目前，国内春雷霉素的发酵生产采用三级发酵模式，该方式存在的主要问题有以下几点：
1 工业化大生产发酵水平较低，其发酵水平维持在10000-12000u/L左右。
2 国内缺少春雷霉素完整的发酵工艺文献报道，并且相关的文献报道以试验为主，不能够为大生产模式提供有效地技术支持。
3 春雷霉素大生产发酵周期长，一般在170h左右，能耗高。
4 春雷霉素发酵生产成本较高，产品缺乏市场竞争力。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种发酵工艺简单，有效提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现春雷霉素稳定、高效生产的小金色放线菌发酵生产春雷霉素的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产春雷霉素的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种小金色放线菌发酵生产春雷霉素的培养基和培养方法，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基的组成为：
棉籽油4～8ml/L、油泥3～7g/L、淀粉7～11g/L、棉籽饼粉11～15g/L、蚕蛹油4～8ml/L、玉米浆11-15ml/L、硫酸铵0.4～0.8g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述二级种子培养基的组成为：
棉籽油7～12ml/L、油泥3～7g/L、淀粉11～15g/L、棉籽饼粉13～15g/L、花生饼粉11～15g/L、蚕蛹油6～10ml/L、玉米浆13-17ml/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述发酵培养基的组成为：
棉籽油9～13ml/L、油泥4～8g/L、淀粉13～17g/L、棉籽饼粉14～18g/L、花生饼粉15～19g/L、蚕蛹油8～12ml/L、发酵豆腐干渣3-7g/L、玉米浆16-20ml/L、硫酸铵0.6～1g/L、轻质碳酸钙2～6g/L、磷酸二氢钾0.07～0.11g/L、硫酸镁0.02～0.06g/L、硫酸镍0.006～0.01g/L、氯化钠0.02～0.06g/L、聚醚改性硅油0.5～0.9ml/L、月桂醇聚氧乙烯醚 0.01～0.05g/L。
所述油泥是指加工菜籽油时的沉淀物。
一种利用上述培养基发酵生产春雷霉素的培养方法，其特征在于工艺步骤为：
1） 一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小金色放线菌母瓶发酵液按照2～3L/m3的接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度28～32%、培养时间22～24h移种；
2） 二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度35～39%、培养时间20～22h时移入发酵培养基；
3） 发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度35～39%、发酵周期不超过160h，化学效价＞15000u/ml终止发酵。
所述一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮30～40mg/L、溶磷120～140ug/ml、脂肪6～8g/L；
所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮40～50mg/L、溶磷100～120ug/ml、脂肪9～11g/L；
所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮50～60mg/L、溶磷30～50ug/ml、脂肪14～16g/L。
所述培养好的小金色放线菌母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20～30%；镜检无杂菌。
所述一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：20～40m3/h；搅拌转速60～80r/min。
所述二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量40～60m3/h；搅拌转速70～90r/min。
所述发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7；
b 温度：培养温度27～28℃，
c 搅拌转速：转速控制在110-120r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：200～300m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前60h内，不控制溶氧，
61～140h，溶氧控制在40%以上，
141～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
在发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补菜籽油、补水、补硫酸铵、补蚕蛹油和pH控制，其中
a 补菜籽油工艺控制：
发酵时间60～100h，当脂肪含量低于5g/L时，补入菜籽油，控制发酵液中脂肪含量在5～7g/L，
发酵时间101～140h，当脂肪含量低于2g/L时，补入菜籽油，控制发酵液中含量在2～3g/L；
b补水工艺控制：
发酵前60h不用进行补水，
发酵时间在61～100h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～45%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在101h～发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制工艺：
发酵前60h，pH不进行控制，
发酵时间在61～120h，若pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氢氧化钠，调节pH至6～8，若pH＞8，采用流加法加入30%的硫酸溶液，调节pH至6～8，
d 补入蚕蛹油：
发酵前60h，氨基氮含量不进行控制，
发酵时间61h～100h，当氨基氮含量低于30mg/L，补入已灭菌的蚕蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在30～40mg/L，
发酵时间101h至发酵结束，当氨基氮含量低于5mg/L，补入已灭菌的蚕蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在5～10mg/L；
e 补硫酸铵：
在发酵80h和120h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。
本发明的技术优势体现在：
1 本发明确认了小金色放线菌发酵生产春雷霉素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。特别是培养基中添加了油泥，降低了碳源棉籽油的使用量；发酵培养基中加入发酵豆腐干渣，降低了蚕蛹油的用量。培养基中的碳源、氮源含有春雷霉素生物合成过程中所需的关键物质，保证了春雷霉素的发酵技术效果。
2 本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了春雷霉素最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产春雷霉素，其发酵单位达到15000u/ml以上，同国内技术相比，发酵单位提高了20%以上；发酵周期控制在160h以内，降低了发酵能耗。
3 本发明适用于工业化规模化发酵生产春雷霉素。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用小金色放线菌：生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20～30%；镜检无杂菌。
发酵豆腐干渣来源：宁夏金夏食品有限公司。发酵豆腐渣干为豆腐生产后的残渣的发酵产物。目前，各种食品厂糟渣特别是豆腐渣含有丰富的营养，被处理之后利用具有很大的经济效益。发酵过程中分泌与合成的大量活菌、蛋白质、氨基酸、各种生化酶、促生长因子等营养与激素类物质。
所述油泥是指加工菜籽油时的沉淀物。
实施例1
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基：
棉籽油4L、油泥3kg、淀粉7 kg、棉籽饼粉11kg、蚕蛹油4L、玉米浆11L、硫酸铵0.4 kg、轻质碳酸钙1kg。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至20℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮30mg/L、溶磷120ug/ml、脂肪6g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的小金色放线菌母瓶发酵液按照2/m3的接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：20m3/h；搅拌转速60r/min；至菌体浓度28%、培养时间22h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基：
棉籽油70L、油泥30 kg、淀粉110 kg、棉籽饼粉130kg、花生饼粉110 kg、蚕蛹油60L、玉米浆130L、硫酸铵5 kg、轻质碳酸钙10kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至20℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮40mg/L、溶磷100ug/ml、脂肪9g/L。二级种子培养条件：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量40m3/h；搅拌转速70r/min；将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度35%、培养时间20h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基：
棉籽油900L、油泥400kg、淀粉1300kg、棉籽饼粉1400kg、花生饼粉1500 kg、蚕蛹油800L、发酵豆腐干渣300kg、玉米浆1600L、硫酸铵60kg、轻质碳酸钙200kg、磷酸二氢钾7kg、硫酸镁2kg、硫酸镍0.6kg、氯化钠2kg、聚醚改性硅油50L、月桂醇聚氧乙烯醚1kg。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮50mg/L、溶磷30ug/ml、脂肪14g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7；
b 温度：培养温度27～28℃，
c 搅拌转速：转速控制在110r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：200m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前60h内，不控制溶氧，
61～140h，溶氧控制在40%以上，
141～发酵结束：溶氧控制在30%以上
发酵结束，菌体浓度35%、发酵周期154h、化学效价15085u/ml。
实施例2
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基：
棉籽油5L、油泥4kg、淀粉8kg、棉籽饼粉12kg、蚕蛹油5L、玉米浆12L、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙2kg。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至21℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮32mg/L、溶磷126ug/ml、脂肪6.5g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的小金色放线菌母瓶发酵液按照2.2/m3的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：25m3/h；搅拌转速65r/min；至菌体浓度29%、培养时间22.5h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基：
棉籽油80L、油泥40 kg、淀粉120 kg、棉籽饼粉140kg、花生饼粉120 kg、蚕蛹油70L、玉米浆140L、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙20kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至20℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮43mg/L、溶磷107ug/ml、脂肪9.6g/L。二级种子培养条件：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量45m3/h；搅拌转速75r/min；将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度36%、培养时间20.5h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基：
棉籽油1000L、油泥500kg、淀粉1400kg、棉籽饼粉1500kg、花生饼粉1600 kg、蚕蛹油900L、发酵豆腐干渣400 kg、玉米浆1700L、硫酸铵70kg、轻质碳酸钙300kg、磷酸二氢钾8kg、硫酸镁3kg、硫酸镍0.7kg、氯化钠3kg、聚醚改性硅油60L、月桂醇聚氧乙烯醚2kg。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至21℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮52mg/L、溶磷36ug/ml、脂肪14.4g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7；
b 温度：培养温度27～28℃，
c 搅拌转速：转速控制在113r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：230m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前60h内，不控制溶氧，
61～140h，溶氧控制在40%以上，
141～发酵结束：溶氧控制在30%以上
发酵结束，菌体浓度36%、发酵周期155h、化学效价15132u/ml。
实施例3
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基：
棉籽油6L、油泥5kg、淀粉9kg、棉籽饼粉13kg、蚕蛹油6L、玉米浆13L、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙3kg。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至22℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮35mg/L、溶磷131ug/ml、脂肪7.1g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的小金色放线菌母瓶发酵液按照2.5/m3的接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：30m3/h；搅拌转速70r/min；至菌体浓度30%、培养时间23h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基：
棉籽油90L、油泥50 kg、淀粉130 kg、棉籽饼粉150kg、花生饼粉130 kg、蚕蛹油80L、玉米浆150L、硫酸铵7kg、轻质碳酸钙30kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至22℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮45mg/L、溶磷111ug/ml、脂肪10g/L。二级种子培养条件：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量50m3/h；搅拌转速80r/min；将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度37%、培养时间21h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基：
棉籽油1100L、油泥600kg、淀粉1500kg、棉籽饼粉1600kg、花生饼粉1700 kg、蚕蛹油1000L、发酵豆腐干渣500 kg、玉米浆1800L、硫酸铵80kg、轻质碳酸钙400kg、磷酸二氢钾9kg、硫酸镁4kg、硫酸镍0.8kg、氯化钠4kg、聚醚改性硅油70L、月桂醇聚氧乙烯醚3kg。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至22℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮55mg/L、溶磷41ug/ml、脂肪15.1g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7；
b 温度：培养温度27～28℃，
c 搅拌转速：转速控制在113r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：250m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前60h内，不控制溶氧，
61～140h，溶氧控制在40%以上，
141～发酵结束：溶氧控制在30%以上
发酵结束，菌体浓度37%、发酵周期156h、化学效价15216u/ml。
实施例4
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基：
棉籽油7L、油泥6kg、淀粉10kg、棉籽饼粉14kg、蚕蛹油7L、玉米浆14L、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙4kg。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至24℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮37mg/L、溶磷136ug/ml、脂肪7.5g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的小金色放线菌母瓶发酵液按照2.7/m3的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：35m3/h；搅拌转速75r/min；至菌体浓度31%、培养时间23.5h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基：
棉籽油100L、油泥60 kg、淀粉140 kg、棉籽饼粉160kg、花生饼粉140 kg、蚕蛹油90L、玉米浆160L、硫酸铵8kg、轻质碳酸钙40kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至24℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮47mg/L、溶磷116ug/ml、脂肪10.4g/L。二级种子培养条件：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量55m3/h；搅拌转速85r/min；将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度38%、培养时间21.5h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基：
棉籽油1200L、油泥700kg、淀粉1600kg、棉籽饼粉1700kg、花生饼粉1800 kg、蚕蛹油1100L、发酵豆腐干渣600 kg、玉米浆1900L、硫酸铵90kg、轻质碳酸钙500kg；磷酸二氢钾10kg、硫酸镁5kg、硫酸镍0.9kg、氯化钠5kg、聚醚改性硅油80L、月桂醇聚氧乙烯醚4kg。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至24℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮57mg/L、溶磷46ug/ml、脂肪15.5g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7；
b 温度：培养温度27～28℃，
c 搅拌转速：转速控制在113r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：270m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前60h内，不控制溶氧，
61～140h，溶氧控制在40%以上，
141～发酵结束：溶氧控制在30%以上
发酵结束，菌体浓度38%、发酵周期157h、化学效价15183u/ml。
实施例5
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基：
棉籽油8L、油泥7kg、淀粉11kg、棉籽饼粉15kg、蚕蛹油8L、玉米浆15L、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙5kg。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至25℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮40mg/L、溶磷140ug/ml、脂肪8g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的小金色放线菌母瓶发酵液按照3/m3的接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：40m3/h；搅拌转速80r/min；至菌体浓度32%、培养时间24h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基：
棉籽油110L、油泥70 kg、淀粉150 kg、棉籽饼粉170kg、花生饼粉150 kg、蚕蛹油100L、玉米浆170L、硫酸铵9kg、轻质碳酸钙50kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至25℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮50mg/L、溶磷120ug/ml、脂肪11g/L。二级种子培养条件：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量60m3/h；搅拌转速90r/min；将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度39%、培养时间22h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基：
棉籽油1300L、油泥800kg、淀粉1700kg、棉籽饼粉1800kg、花生饼粉1900 kg、蚕蛹油1200L、发酵豆腐干渣700 kg、玉米浆2000L、硫酸铵100kg、轻质碳酸钙600kg；磷酸二氢钾11kg、硫酸镁6kg、硫酸镍1kg、氯化钠6kg、聚醚改性硅油90L、月桂醇聚氧乙烯醚5kg。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至25℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮60mg/L、溶磷50ug/ml、脂肪20g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7；
b 温度：培养温度27～28℃，
c 搅拌转速：转速控制在113r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：300m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前60h内，不控制溶氧，
61～140h，溶氧控制在40%以上，
141～发酵结束：溶氧控制在30%以上
发酵结束，菌体浓度39%、发酵周期159h、化学效价15073u/ml。
上述实施例1-5的发酵过程中，根据检测情况，采用流加法进行补料，补料包括补菜籽油、补水、补硫酸铵、补蚕蛹油和pH控制，其中
其中
a 补菜籽油工艺控制：
发酵时间60～100h，当脂肪含量低于5g/L时，补入菜籽油，控制发酵液中脂肪含量在5～7g/L，
发酵时间101～140h，当脂肪含量低于2g/L时，补入菜籽油，控制发酵液中含量在2～3g/L；
b补水工艺控制：
发酵前60h不用进行补水，
发酵时间在61～100h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～45%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在101h～发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制工艺：
发酵前60h，pH不进行控制，
发酵时间在61～120h，若pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氢氧化钠，调节pH至6～8，若pH＞8，采用流加法加入30%的硫酸溶液，调节pH至6～8，
d 补入蚕蛹油：
发酵前60h，氨基氮含量不进行控制，
发酵时间61h～100h，当氨基氮含量低于30mg/L，补入已灭菌的蚕蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在30～40mg/L，
发酵时间101h至发酵结束，当氨基氮含量低于5mg/L，补入已灭菌的蚕蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在5～10mg/L；
e 补硫酸铵：
在发酵80h和120h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。
对比实施例（培养工艺及控制参数依据实施例3）
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基：
玉米油7L、玉米淀粉6kg、黄豆饼粉13kg、麦芽提取物6 kg、蛋白胨15kg、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙3kg。
一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至22℃，并用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮42mg/L、溶磷154ug/ml、脂肪9.4g/L。然后在火焰保护下，将已经培养好的小金色放线菌母瓶发酵液按照2.5/m3的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：30m3/h；搅拌转速70r/min；至菌体浓度28%、培养时间26h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基：
玉米油80L、玉米淀粉65kg、黄豆饼粉140kg、麦芽提取物70kg、蛋白胨160kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙40kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至22℃，并用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量：氨基氮57.8mg/L、溶磷131ug/ml、脂肪12.7g/L。二级种子培养条件：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量50m3/h；搅拌转速80r/min；将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度36%、培养时间23h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基：
玉米油900L、玉米淀粉780kg、黄豆饼粉1500kg、麦芽提取物800kg、蛋白胨1700kg、硫酸铵60kg、轻质碳酸钙400kg。磷酸二氢钾9kg、硫酸镁4kg、氯化钠4kg、消泡剂硅油60L。
发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至22℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量：氨基氮60.2mg/L、溶磷89ug/ml、脂肪18.3g/L。然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7；
b 温度：培养温度27～28℃，
c 搅拌转速：转速控制在113r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：250m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前60h内，不控制溶氧，
61～140h，溶氧控制在40%以上，
141～发酵结束：溶氧控制在30%以上
发酵结束，菌体浓度35%、发酵周期162h、化学效价10480u/ml。

Claims (9)

1.一种小金色放线菌发酵生产春雷霉素的培养基和培养方法，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基的组成为：
棉籽油4～8ml/L、油泥3～7g/L、淀粉7～11g/L、棉籽饼粉11～15g/L、蚕蛹油4～8ml/L、玉米浆11-15ml/L、硫酸铵0.4～0.8g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述二级种子培养基的组成为：
棉籽油7～12ml/L、油泥3～7g/L、淀粉11～15g/L、棉籽饼粉13～15g/L、花生饼粉11～15g/L、蚕蛹油6～10ml/L、玉米浆13-17ml/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述发酵培养基的组成为：
棉籽油9～13ml/L、油泥4～8g/L、淀粉13～17g/L、棉籽饼粉14～18g/L、花生饼粉15～19g/L、蚕蛹油8～12ml/L、发酵豆腐干渣3-7g/L、玉米浆16-20ml/L、硫酸铵0.6～1g/L、轻质碳酸钙2～6g/L、磷酸二氢钾0.07～0.11g/L、硫酸镁0.02～0.06g/L、硫酸镍0.006～0.01g/L、氯化钠0.02～0.06g/L、聚醚改性硅油0.5～0.9ml/L、月桂醇聚氧乙烯醚 0.01～0.05g/L。
2.按照权利要求1所述的培养基，其特征在于所述油泥是指加工菜籽油时的沉淀物。
3.一种利用权利要求1或2所述培养基发酵生产春雷霉素的培养方法，其特征在于工艺步骤为：
1） 一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的小金色放线菌母瓶发酵液按照2～3L/m3的接种量接入一级种子培养基中进行一级种子培养，至菌体浓度28～32%、培养时间22～24h移种；
2） 二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度35～39%、培养时间20～22h时移入发酵培养基；
3） 发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度35～39%、发酵周期不超过160h，化学效价＞15000u/ml终止发酵。
4.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮30～40mg/L、溶磷120～140ug/ml、脂肪6～8g/L；
所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮40～50mg/L、溶磷100～120ug/ml、脂肪9～11g/L；
所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮50～60mg/L、溶磷30～50ug/ml、脂肪14～16g/L。
5.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述培养好的小金色放线菌母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20～30%；镜检无杂菌。
6.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：20～40m3/h；搅拌转速60～80r/min。
7.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量40～60m3/h；搅拌转速70～90r/min。
8.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7；
b 温度：培养温度27～28℃，
c 搅拌转速：转速控制在110-120r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：200～300m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前60h内，不控制溶氧，
61～140h，溶氧控制在40%以上，
141～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
9.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补菜籽油、补水、补硫酸铵、补蚕蛹油和pH控制，其中
a 补菜籽油工艺控制：
发酵时间60～100h，当脂肪含量低于5g/L时，补入菜籽油，控制发酵液中脂肪含量在5～7g/L，
发酵时间101～140h，当脂肪含量低于2g/L时，补入菜籽油，控制发酵液中含量在2～3g/L；
b补水工艺控制：
发酵前60h不用进行补水，
发酵时间在61～100h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～45%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在101h～发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制工艺：
发酵前60h，pH不进行控制，
发酵时间在61～120h，若pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氢氧化钠，调节pH至6～8，若pH＞8，采用流加法加入30%的硫酸溶液，调节pH至6～8，
d 补入蚕蛹油：
发酵前60h，氨基氮含量不进行控制，
发酵时间61h～100h，当氨基氮含量低于30mg/L，补入已灭菌的蚕蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在30～40mg/L，
发酵时间101h至发酵结束，当氨基氮含量低于5mg/L，补入已灭菌的蚕蛹油溶液，使氨基氮的含量控制在5～10mg/L；
e 补硫酸铵：
在发酵80h和120h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。
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