CN106480121A - 一种利用展青霉菌发酵生产灰黄霉素的培养基和培养方法 - Google Patents

一种利用展青霉菌发酵生产灰黄霉素的培养基和培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用展青霉菌发酵生产灰黄霉素的培养基和培养方法，本发明确认了展青霉菌发酵生产灰黄霉素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。利用本发明提供的培养基配方和发酵控制工艺，能够提高灰黄霉素发酵单位，降低发酵成本，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现灰黄霉素稳定、高效的生产。

Description

一种利用展青霉菌发酵生产灰黄霉素的培养基和培养方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种利用展青霉菌发酵生产灰黄霉素的培养基和培养方法。
背景技术
灰黄霉素是青霉菌发酵液的菌丝体中分离得到的一种含有氯的次级代谢产物。它是属于非多烯类的抗真菌抗生素。灰黄霉素于1958年开始用于医学临床，主要用于治疗皮肤浅层丝状真菌感染，尤其是对小芽孢菌、红色癣菌具有良好的抑制效果。在农业上，灰黄霉素也被用于真菌病害防治。
目前，国内采用发酵模式生产灰黄霉素，其存在的主要问题有以下几点：
1 工业化大生产发酵水平较低，其发酵水平维持在25000ug/ml左右。
2 国内缺少关于规模化大生产春雷霉素完整的发酵工艺文献报道，并且相关的文献报道以试验为主，不能够为大生产模式提供有效地技术支持。
3 春雷霉素大生产发酵周期长，超过了260h左右，能耗比较高。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种可有效提高发酵单位，降低能耗，缩短发酵周期，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现灰黄霉素稳定、高效生产的利用展青霉菌发酵生产灰黄霉素的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产灰黄霉素的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种利用展青霉菌发酵生产灰黄霉素的培养基，其特征在于包括种子培养基和发酵培养基，其中
所述种子培养基的组成为：
葛根粉7～11g/L、大力士甜高粱12～16g/L、葡萄糖5～9g/L、白酒糟6～10g/L、玉米浆11～15ml/L、鱼粉10～14g/L、棉籽油8～12ml/L、硫酸铵0.4～0.8g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述发酵培养基的组成为：
葛根粉9～14g/L、大力士甜高粱14～18g/L、葡萄糖7～11g/L、白酒糟8～12g/L、玉米浆13～17ml/L、鱼粉12～16g/L、棉籽油11～15ml/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙2～6g/L；磷酸二氢钾0.05～0.09g/L、硫酸镁0.03～0.07g/L、硫酸亚铁0.006～0.01g/L、氯化钠0.04～0.08g/L。
一种利用上述培养基发酵生产灰黄霉素的培养方法，其特征在于工艺步骤为：
1） 种子培养：首先将种子培养基灭菌并冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的展青霉菌母瓶发酵液接入种子培养基中进行种子培养，至菌体浓度32～34%、培养时间40～45h移种；
2） 发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度35～39%、发酵周期不超过250h，化学效价＞30000ug/ml时终止发酵。
所述种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮20～40mg/L、还原糖2～4g/100ml；
所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮40～60mg/L、还原糖4～6g/100ml。
所述培养好的展青霉菌母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20～30%；镜检无杂菌。
所述种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：30～50m3/h；搅拌转速60～80r/min。
所述发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7，
b 温度：培养温度28～29℃，
c 搅拌转速：转速控制在100～120r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa，
e pH控制：发酵过程中pH控制在6～7，
f 空气流量：200～300m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前90h内，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补糖、补水、补硫酸铵和pH控制，其中
a 补糖工艺控制：
发酵100～200h，当还原糖含量＜2g/100ml时，补入糊精，控制发酵液中还原糖含量为2.0～2.5g/100ml，
发酵201 h～发酵结束，当还原糖含量＜1.5g/100ml，补入糊精，控制发酵液中还原糖含量为1.5～2.0g/100ml；
b补水工艺控制：
发酵前80h不用进行补水，
发酵81～200h，当菌体浓度高于45%时，加入灭菌水，控制发酵液菌体浓度在40～45%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵201h～发酵结束，当菌体浓度高于40%时，加入灭菌水，控制发酵液菌体浓度在35～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制：
发酵前80h，pH不进行控制，
发酵81～200h，当pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氢氧化钠，调节pH至6～7，当pH＞7，采用流加法加入30%的盐酸溶液，调节pH至6～7；
d 补硫酸铵：
在发酵120h和200h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。
本发明的技术优势体现在：
1 本发明确认了展青霉菌发酵生产灰黄霉素的种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。
2 本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了灰黄霉素最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产灰黄霉素，其发酵单位达到30000ug/ml以上，同国内技术相比，发酵单位提高了20%以上；发酵周期控制在250h以内，降低了发酵能耗。
3 本发明培养基中加入白酒糟，因其含有丰富的氨基酸和促生长因子，可以部分替代鱼粉，降低了生产成本。
4 本发明培养基中加入葛根粉代替淀粉，降低了发酵液的黏度，避免了高温灭菌过程中出现的糊化现象，减少了毒性物质的释放；葛根粉中的碳水化合物含量达到了88%，能够满足灰黄霉素生物合成中所需的乙酸用量。
5 本发明适用于工业化规模化发酵生产灰黄霉素。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用：生产使用的菌种来源为展青霉菌母瓶发酵液。母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20～30%；镜检无杂菌。
葛根淀粉来源：将块状葛根送入碎解机中碎解。碎解机的筛网孔径选取2-3毫米规格即可。
白酒糟：白酒发酵的副产物，蛋白含量应＞14%，水分含量＜1.5%。
实施例1
种子培养：种子培养基体积10m3。
葛根粉70kg、大力士甜高粱120kg、葡萄糖50kg、白酒糟60 kg、玉米浆110L、鱼粉100 kg、棉籽油80L、硫酸铵4kg、轻质碳酸钙10kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至20℃，并用无菌空气保压，培养基灭菌后质量为：氨基氮20mg/L、还原糖2g/100ml。然后在火焰保护下，将已经培养好的展青霉菌母瓶发酵液按照30L的接种量接入种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：30m3/h；搅拌转速60r/min。至菌体浓度32%、培养时间40h移种。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
葛根粉900kg、大力士甜高粱1400kg、葡萄糖700kg、白酒糟800 kg、玉米浆1300L、鱼粉1200kg、棉籽油1100L、硫酸铵50kg、轻质碳酸钙200kg；磷酸二氢钾5kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁0.6kg、氯化钠4kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却至20℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮40mg/L、还原糖4g/100ml。然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.9；
b 温度：培养温度28～29℃，
c 搅拌转速：转速控制在100r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa，
e pH控制：发酵过程中pH控制在6～7，
f 空气流量：200m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前90h内，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度35%、发酵周期不超过241h，化学效价30127ug/ml。实施例2
种子培养：种子培养基体积10m3。
葛根粉80kg、大力士甜高粱130kg、葡萄糖60kg、白酒糟70 kg、玉米浆120L、鱼粉110 kg、棉籽油90L、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙20kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至21℃，并用无菌空气保压，培养基灭菌后质量为：氨基氮25mg/L、还原糖2.5g/100ml。然后在火焰保护下，将已经培养好的展青霉菌母瓶发酵液按照32L的接种量接入种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：35m3/h；搅拌转速65r/min。至菌体浓度32.5%、培养时间41h移种。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
葛根粉1000kg、大力士甜高粱1500kg、葡萄糖800kg、白酒糟900 kg、玉米浆1400L、鱼粉1300kg、棉籽油1200L、硫酸铵60kg、轻质碳酸钙300kg；磷酸二氢钾6kg、硫酸镁4kg、硫酸亚铁0.7kg、氯化钠5kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却至21℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮45mg/L、还原糖4.5g/100ml。然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.7；
b 温度：培养温度28～29℃，
c 搅拌转速：转速控制在105r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa，
e pH控制：发酵过程中pH控制在6～7；
f 空气流量：220m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前90h内，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度36%、发酵周期不超过242h，化学效价30291ug/ml。
实施例3
种子培养：种子培养基体积10m3。
葛根粉90kg、大力士甜高粱140kg、葡萄糖70kg、白酒糟80 kg、玉米浆130L、鱼粉120 kg、棉籽油100L、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙30kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至22℃，并用无菌空气保压，培养基灭菌后质量为：氨基氮30mg/L、还原糖3g/100ml。然后在火焰保护下，将已经培养好的展青霉菌母瓶发酵液按照35L的接种量接入种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：40m3/h；搅拌转速70r/min。至菌体浓度33%、培养时间43h移种。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
葛根粉1100kg、大力士甜高粱1600kg、葡萄糖900kg、白酒糟1000 kg、玉米浆1500L、鱼粉1400kg、棉籽油1300L、硫酸铵70kg、轻质碳酸钙400kg；磷酸二氢钾7kg、硫酸镁5kg、硫酸亚铁0.8kg、氯化钠6kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却至23℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮50mg/L、还原糖5g/100ml。然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.5，
b 温度：培养温度28～29℃，
c 搅拌转速：转速控制在110r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa，
e pH控制：发酵过程中pH控制在6～7，
f 空气流量：250m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前90h内，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度37%、发酵周期不超过245h，化学效价30374ug/ml。
实施例4
种子培养：种子培养基体积10m3。
葛根粉100kg、大力士甜高粱150kg、葡萄糖80kg、白酒糟90 kg、玉米浆140L、鱼粉130 kg、棉籽油110L、硫酸铵7kg、轻质碳酸钙40kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至24℃，并用无菌空气保压，培养基灭菌后质量为：氨基氮35mg/L、还原糖3.5g/100ml。然后在火焰保护下，将已经培养好的展青霉菌母瓶发酵液按照38L的接种量接入种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：45m3/h；搅拌转速75r/min。至菌体浓度33.5%、培养时间44h移种。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
葛根粉1200kg、大力士甜高粱1700kg、葡萄糖1000kg、白酒糟1100 kg、玉米浆1600L、鱼粉1500kg、棉籽油1400L、硫酸铵80kg、轻质碳酸钙500kg；磷酸二氢钾8kg、硫酸镁6kg、硫酸亚铁0.9kg、氯化钠7kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却至24℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮55mg/L、还原糖5.5g/100ml。然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.3，
b 温度：培养温度28～29℃，
c 搅拌转速：转速控制在115r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa，
e pH控制：发酵过程中pH控制在6～7，
f 空气流量：280m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前90h内，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度37%、发酵周期不超过245h，化学效价30304ug/ml。实施例5
种子培养：种子培养基体积10m3。
葛根粉140kg、大力士甜高粱160kg、葡萄糖90kg、白酒糟100kg、玉米浆150L、鱼粉140kg、棉籽油120L、硫酸铵8kg、轻质碳酸钙50kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至25℃，并用无菌空气保压，培养基灭菌后质量为：氨基氮40mg/L、还原糖4g/100ml。然后在火焰保护下，将已经培养好的展青霉菌母瓶发酵液按照40L的接种量接入种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：50m3/h；搅拌转速80r/min。至菌体浓度34%、培养时间45h移种。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
葛根粉1300kg、大力士甜高粱1800kg、葡萄糖1100kg、白酒糟1200 kg、玉米浆1700L、鱼粉1600kg、棉籽油1500L、硫酸铵90kg、轻质碳酸钙600kg；磷酸二氢钾9kg、硫酸镁7kg、硫酸亚铁1kg、氯化钠8kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却至25℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮60mg/L、还原糖6g/100ml。然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.1，
b 温度：培养温度28～29℃，
c 搅拌转速：转速控制在120r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa，
e pH控制：发酵过程中pH控制在6～7，
f 空气流量：300m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前90h内，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度37%、发酵周期不超过245h，化学效价30127ug/ml。
对比实施例（培养工艺及控制参数依据实施例3）
种子培养：种子培养基体积10m3。
大米粉90kg、葡萄糖70kg、花生饼粉80 kg、玉米浆130L、黄豆饼粉120 kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙30kg。
首先将种子培养基灭菌并冷却至22℃，并用无菌空气保压，培养基灭菌后质量为：氨基氮18mg/L、还原糖2g/100ml。然后在火焰保护下，将已经培养好的展青霉菌母瓶发酵液按照35L的接种量接入种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：40m3/h；搅拌转速70r/min。至菌体浓度30%、培养时间44h移种。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
大米粉1100kg、葡萄糖900kg、花生饼粉800kg、玉米浆1200L、黄豆饼粉1000kg、硝酸钠50kg、轻质碳酸钙400kg；磷酸二氢钾7kg、硫酸镁5kg、硫酸亚铁0.8kg、氯化钠6kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却至23℃，并用无菌空气保压，发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮37mg/L、还原糖3.8g/100ml。然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6.5，
b 温度：培养温度28～29℃，
c 搅拌转速：转速控制在110r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa，
e pH控制：发酵过程中pH控制在6～7，
f 空气流量：250m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前90h内，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
发酵培养结束，菌体浓度35%、发酵周期不超过264h，化学效价24761ug/ml。
上述实施例1-5中，发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补糖、补水、补硫酸铵和pH控制，其中
a 补糖工艺控制：
发酵100～200h，当还原糖含量＜2g/100ml时，补入糊精，控制发酵液中还原糖含量为2.0～2.5g/100ml，
发酵201 h～发酵结束，当还原糖含量＜1.5g/100ml，补入糊精，控制发酵液中还原糖含量为1.5～2.0g/100ml；
b补水工艺控制：
发酵前80h不用进行补水，
发酵81～200h，当菌体浓度高于45%时，加入灭菌水，控制发酵液菌体浓度在40～45%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵201h～发酵结束，当菌体浓度高于40%时，加入灭菌水，控制发酵液菌体浓度在35～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制：
发酵前80h，pH不进行控制，
发酵81～200h，当pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氢氧化钠，调节pH至6～7，当pH＞7，采用流加法加入30%的盐酸溶液，调节pH至6～7；
d 补硫酸铵：
在发酵120h和200h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。

Claims (7)

1.一种利用展青霉菌发酵生产灰黄霉素的培养基，其特征在于包括种子培养基和发酵培养基，其中
所述种子培养基的组成为：
葛根粉7～11g/L、大力士甜高粱12～16g/L、葡萄糖5～9g/L、白酒糟6～10g/L、玉米浆11～15ml/L、鱼粉10～14g/L、棉籽油8～12ml/L、硫酸铵0.4～0.8g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述发酵培养基的组成为：
葛根粉9～14g/L、大力士甜高粱14～18g/L、葡萄糖7～11g/L、白酒糟8～12g/L、玉米浆13～17ml/L、鱼粉12～16g/L、棉籽油11～15ml/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙2～6g/L；磷酸二氢钾0.05～0.09g/L、硫酸镁0.03～0.07g/L、硫酸亚铁0.006～0.01g/L、氯化钠0.04～0.08g/L。
2.一种利用权利要求1所述培养基发酵生产灰黄霉素的培养方法，其特征在于工艺步骤为：
1） 种子培养：首先将种子培养基灭菌并冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的展青霉菌母瓶发酵液接入种子培养基中进行种子培养，至菌体浓度32～34%、培养时间40～45h移种；
2） 发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20～25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度35～39%、发酵周期不超过250h，化学效价＞30000ug/ml时终止发酵。
3.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮20～40mg/L、还原糖2～4g/100ml；
所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮40～60mg/L、还原糖4～6g/100ml。
4.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述培养好的展青霉菌母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20～30%；镜检无杂菌。
5.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述种子培养条件为：罐压0.03～0.06MPa；罐温28～29℃；空气流量：30～50m3/h；搅拌转速60～80r/min。
6.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7，
b 温度：培养温度28～29℃，
c 搅拌转速：转速控制在100～120r/min，
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa，
e pH控制：发酵过程中pH控制在6～7，
f 空气流量：200～300m3/h，
h 溶氧控制：
发酵前90h内，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～发酵结束：溶氧控制在30%以上。
7.按照权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补糖、补水、补硫酸铵和pH控制，其中
a 补糖工艺控制：
发酵100～200h，当还原糖含量＜2g/100ml时，补入糊精，控制发酵液中还原糖含量为2.0～2.5g/100ml，
发酵201 h～发酵结束，当还原糖含量＜1.5g/100ml，补入糊精，控制发酵液中还原糖含量为1.5～2.0g/100ml；
b补水工艺控制：
发酵前80h不用进行补水，
发酵81～200h，当菌体浓度高于45%时，加入灭菌水，控制发酵液菌体浓度在40～45%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵201h～发酵结束，当菌体浓度高于40%时，加入灭菌水，控制发酵液菌体浓度在35～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制：
发酵前80h，pH不进行控制，
发酵81～200h，当pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氢氧化钠，调节pH至6～7，当pH＞7，采用流加法加入30%的盐酸溶液，调节pH至6～7；
d 补硫酸铵：
在发酵120h和200h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。
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