CN105441505A - 一种头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的新型培养基和培养方法 - Google Patents

一种头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的新型培养基和培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的新型培养基和培养方法,利用本发明中提供的培养基配方和发酵控制工艺,能够提高丝裂霉素发酵单位,缩短发酵周期,降低发酵成本,并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响,保证其供应充足,实现丝裂霉素稳定、高效的生产。

Description

一种头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的新型培养基和培养方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域,特别是涉及一种头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的新型培养基和培养方法。
背景技术
丝裂霉素(Mitomycin)是一种广谱抗肿瘤抗生素,自1956年Hata第一个从头状链霉菌的培养液中分离到丝裂霉素开始,由于它特殊的抗肿瘤作用引起人们广泛的关注。
目前,国内丝裂霉素的发酵生产采用二发酵模式,存在的主要问题有以下几点:
1丝裂霉素发酵水平较低,一般控制在800u/ml左右。
2国内外针对丝裂霉素的生产工艺文献资料报道得较少。
3发酵生产丝裂霉素的培养基中加入葡萄糖,经高温灭菌,易导致部分葡萄糖碳化,降低总糖含量,影响发酵液质量。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷,提供一种发酵工艺简单,有效提高发酵单位,同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响,降低生产成本,且原辅料来源不受环境影响,保证其供应充足,实现丝裂霉素稳定、高效生产的头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产丝裂霉素的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为:
一种头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的培养基,包括种子培养基和发酵培养基,其特征在于
所述种子培养基的组成为:甘露醇4~8g/L、甘蔗糖蜜8~12g/L、麦芽糖5~9g/L、麦芽糖酶0.02~0.06g/L、蚕蛹粉4~8g/L、玉米浆10~14ml/L、玉米蛋白粉3~7g/L、硫酸铵3~7g/L、轻质碳酸钙1~5g/L;
所述发酵培养基组成为:甘露醇4~8g/L、甘蔗糖蜜11~15g/L、麦芽糖9~13g/L、麦芽糖酶0.04~0.08g/L、蚕蛹粉6~10g/L、玉米浆15~19ml/L、玉米蛋白粉5~9g/L、硫酸铵4~8g/L、轻质碳酸钙3~7g/L、磷酸镁0.2~0.6g/L、氯化钠0.3~0.7g/L、硫酸亚铁0.01~0.05g/L、聚醚改性硅油0.03~0.07ml/L、维生素B60.05~0.09g/L、泛酸0.01~0.05g/L、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯0.5~1g/L。
一种利用上述培养基生产丝裂霉素的培养方法,其特征在于所述工艺步骤为:
1)种子培养:首先将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.5~0.9L/m3的接种量接入该种子培养基中进行种子培养,至菌体浓度35~40%、pH值6~7、培养时间40~50h时移种;
2)发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在9~11%,至菌体浓度35~40%、还原糖<2.0g/L、氨基氮<15mg/100ml、化学效价>1300u/mL、pH6.0~7.5、培养时间200~220h时终止发酵。
灭菌后的种子培养基的质量要求:氨基氮40~60mg/100ml、还原糖50~70g/L、pH:6.5~7.5;
灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮70~80mg/100ml、还原糖70~90g/L、pH:6~7。
所述培养好的母瓶发酵液质量要求为:pH6~8;菌体浓度10~20%;镜检无杂菌;摇瓶发酵单位800~1000u/ml。
所述种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h,采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:30~50m3/h;搅拌转速70~80r/min。
所述发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃;
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:150~200m3/h;61~170h:250~300m3/h;171h~发酵结束:100~150m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
在发酵过程中采用流加法进行补料,补料包括补蛋白胨、补水、补糖和pH控制,其中
a补蛋白胨工艺控制:
发酵前60h不用进行补油,
发酵时间在61~170h,当氨基氮含量低于40mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨基氮为40~60mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量,
发酵时间在171~200h,当氨基氮含量低于20mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨基氮含量为20~40mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量,
发酵时间在201h~发酵结束,当氨基氮含量低于10mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨基氮含量为10~15mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量;
b补水工艺控制:
发酵前60h不用进行补水,
发酵时间在61~120h,当菌体浓度高于45%,加入灭菌水,要求控制发酵液菌体浓度在40~45%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度,
发酵时间在121~200h,当菌体浓度高于40%,加入灭菌水,要求控制发酵液菌体浓度在35~40%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度,
发酵时间在201h~发酵结束,当菌体浓度高于35%,加入灭菌水,要求控制发酵液菌体浓度在30~35%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度;
c补入麦芽糖控制:
发酵前60h,还原糖含量不进行控制,
发酵61h至120h:还原糖含量<50g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还原糖的含量控制在50~55g/L,
发酵121h至200h:还原糖含量<30g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还原糖的含量控制在30~35g/L,
发酵201h至发酵结束:还原糖含量<5g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还原糖的含量控制在5~10g/L。
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶,其浓度控制在0.001~0.003%。
本发明的技术优势体现在:
1本发明确认了种子培养基、发酵培养碳源、氮源和最佳配伍比例。
2本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述,确认了丝裂霉素最佳的发酵工艺和控制参数。达到的技术效果为发酵单位在1300u/ml以上。
3采用麦芽糖代替葡萄糖,经高温灭菌后,不影响培养基质量。
4本发明适用于企业规模化发酵生产丝裂霉素,能够满足年产100kg丝裂霉素生产需求。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明,应该理解的是,实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用头状链霉菌:母瓶发酵液质量要求为:pH6~8;菌体浓度10~20%;镜检无杂菌;摇瓶发酵单位800~1000u/ml。
实施例1
种子培养:种子罐有效体积为1m3
种子培养基的组成为:甘露醇4kg、甘蔗糖蜜8kg、麦芽糖5kg、麦芽糖酶0.02kg、蚕蛹粉4kg、玉米浆10L、玉米蛋白粉3kg、硫酸铵3kg、轻质碳酸钙1kg。灭菌后的种子培养基的质量:氨基氮42/100ml、还原糖51g/L、pH:7.4。
将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.5L/m3的接种量接入该种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h,采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:30m3/h;搅拌转速70r/min。至菌体浓度35%、pH6.8、培养时间40h时移种。
发酵培养:发酵罐有效体积为10m3
发酵培养基组成为:甘露醇40kg、甘蔗糖蜜110kg、麦芽糖90kg、麦芽糖酶0.4kg、蚕蛹粉60kg、玉米浆150L、玉米蛋白粉50kg、硫酸铵40kg、轻质碳酸钙30kg、磷酸镁2kg、氯化钠3kg、硫酸亚铁0.1kg、聚醚改性硅油0.3L、维生素B60.5kg、泛酸0.1kg、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯5kg。先将发酵培养基灭菌,灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮70mg/100ml、还原糖71g/L、pH:6.9。发酵培养基冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在9%。
发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃。
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:150m3/h;61~170h:250m3/h;171h~发酵结束:100m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵培养结束,菌体浓度35%、还原糖1.8g/L、氨基氮14mg/100ml、化学效价1304u/mL、pH6.1、培养时间200h。
实施例2
种子培养:种子罐有效体积为1m3
种子培养基的组成为:甘露醇5kg、甘蔗糖蜜9kg、麦芽糖6kg、麦芽糖酶0.03kg、蚕蛹粉5kg、玉米浆11L、玉米蛋白粉4kg、硫酸铵4kg、轻质碳酸钙2kg。灭菌后的种子培养基的质量:氨基氮45/100ml、还原糖56g/L、pH:7.2;
将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.6L/m3的接种量接入该种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h,采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:35m3/h;搅拌转速72r/min。至菌体浓度36%、pH6.7、培养时间42h时移种。
发酵培养:发酵罐有效体积为10m3
发酵培养基组成为:甘露醇50kg、甘蔗糖蜜120kg、麦芽糖100kg、麦芽糖酶0.5kg、蚕蛹粉70kg、玉米浆160L、玉米蛋白粉60kg、硫酸铵50kg、轻质碳酸钙40kg、磷酸镁3kg、氯化钠4kg、硫酸亚铁0.2kg、聚醚改性硅油0.4L、维生素B60.6kg、泛酸0.2kg、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯6kg。先将发酵培养基灭菌,灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮73mg/100ml、还原糖76g/L、pH:6.7。发酵培养基冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在9.5%。
发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃。
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:160m3/h;61~170h:260m3/h;171h~发酵结束:110m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵培养结束,菌体浓度36%、还原糖1.7g/L、氨基氮13mg/100ml、化学效价1326u/mL、pH6.3、培养时间205h。
实施例3
种子培养:种子罐有效体积为1m3
种子培养基的组成为:甘露醇6kg、甘蔗糖蜜10kg、麦芽糖7kg、麦芽糖酶0.04kg、蚕蛹粉6kg、玉米浆12L、玉米蛋白粉5kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙3kg。灭菌后的种子培养基的质量:氨基氮51/100ml、还原糖61g/L、pH:7.0;
将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.7L/m3的接种量接入该种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h,采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:40m3/h;搅拌转速75r/min。至菌体浓度37%、pH6.5、培养时间45h时移种。
发酵培养:发酵罐有效体积为10m3
发酵培养基组成为:甘露醇60kg、甘蔗糖蜜130kg、麦芽糖110kg、麦芽糖酶0.6kg、蚕蛹粉80kg、玉米浆170L、玉米蛋白粉70kg、硫酸铵60kg、轻质碳酸钙50kg、磷酸镁4kg、氯化钠5kg、硫酸亚铁0.3kg、聚醚改性硅油0.5L、维生素B60.7kg、泛酸0.3kg、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯7kg。先将发酵培养基灭菌,灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮75mg/100ml、还原糖82g/L、pH:6.5。发酵培养基冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在10%。
发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃。
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:170m3/h;61~170h:270m3/h;171h~发酵结束:120m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵培养结束,菌体浓度37%、还原糖1.5g/L、氨基氮11mg/100ml、化学效价1412u/mL、pH6.5、培养时间210h。
实施例4
种子培养:种子罐有效体积为1m3
种子培养基的组成为:甘露醇7kg、甘蔗糖蜜11kg、麦芽糖8kg、麦芽糖酶0.05kg、蚕蛹粉7kg、玉米浆13L、玉米蛋白粉6kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙4kg。灭菌后的种子培养基的质量:氨基氮54/100ml、还原糖66g/L、pH:6.7;
将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.8L/m3的接种量接入该种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h,采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:45m3/h;搅拌转速78r/min。至菌体浓度38%、pH6.3、培养时间47h时移种。
发酵培养:发酵罐有效体积为10m3
发酵培养基组成为:甘露醇70kg、甘蔗糖蜜140kg、麦芽糖120kg、麦芽糖酶0.7kg、蚕蛹粉90kg、玉米浆180L、玉米蛋白粉80kg、硫酸铵70kg、轻质碳酸钙60kg、磷酸镁5kg、氯化钠6kg、硫酸亚铁0.4kg、聚醚改性硅油0.6L、维生素B60.8kg、泛酸0.4kg、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯8kg。先将发酵培养基灭菌,灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮78mg/100ml、还原糖86g/L、pH:6.2。发酵培养基冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在10.5%。
发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃。
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:180m3/h;61~170h:280m3/h;171h~发酵结束:130m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵培养结束,菌体浓度39%、还原糖1.4g/L、氨基氮10mg/100ml、化学效价1384u/mL、pH6.3、培养时间215h。
实施例5
种子培养:种子罐有效体积为1m3
种子培养基的组成为:甘露醇8kg、甘蔗糖蜜12kg、麦芽糖9kg、麦芽糖酶0.06kg、蚕蛹粉8kg、玉米浆14L、玉米蛋白粉7kg、硫酸铵7kg、轻质碳酸钙5kg。灭菌后的种子培养基的质量:氨基氮59mg/100ml、还原糖70g/L、pH:6.5。
将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.9L/m3的接种量接入该种子培养基中进行种子培养。
种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h,采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:50m3/h;搅拌转速80r/min。至菌体浓度40%、pH6.1、培养时间50h时移种。
发酵培养:发酵罐有效体积为10m3
发酵培养基组成为:甘露醇80kg、甘蔗糖蜜150kg、麦芽糖130kg、麦芽糖酶0.8kg、蚕蛹粉100kg、玉米浆190L、玉米蛋白粉90kg、硫酸铵80kg、轻质碳酸钙70kg、磷酸镁6kg、氯化钠7kg、硫酸亚铁0.5kg、聚醚改性硅油0.7L、维生素B60.9kg、泛酸0.5kg、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯9kg。先将发酵培养基灭菌,灭菌后的发酵培养基的质量:氨基氮80mg/100ml、还原糖90g/L、pH:6.0。发酵培养基冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在11%。
发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃。
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:200m3/h;61~170h:300m3/h;171h~发酵结束:150m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
发酵培养结束,菌体浓度40%、还原糖1.3g/L、氨基氮8mg/100ml、化学效价1317u/mL、pH6.0、培养时间220h。
在上述实施例1-5中,在发酵过程中需要进行补料。补料采用流加法,补料包括补蛋白胨、补水和补麦芽糖,其中
a补蛋白胨工艺控制:
发酵前60h不用进行补油,
发酵时间在61~170h,当氨基氮含量低于40mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨基氮为40~60mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量,
发酵时间在171~200h,当氨基氮含量低于20mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨基氮含量为20~40mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量,
发酵时间在201h~发酵结束,当氨基氮含量低于10mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨基氮含量为10~15mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量;
b补水工艺控制:
发酵前60h不用进行补水,
发酵时间在61~120h,当菌体浓度高于45%,加入灭菌水,要求控制发酵液菌体浓度在40~45%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度,
发酵时间在121~200h,当菌体浓度高于40%,加入灭菌水,要求控制发酵液菌体浓度在35~40%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度,
发酵时间在201h~发酵结束,当菌体浓度高于35%,加入灭菌水,要求控制发酵液菌体浓度在30~35%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度;
c补入麦芽糖控制:
发酵前60h,还原糖含量不进行控制,
发酵61h至120h:还原糖含量<50g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还原糖的含量控制在50~55g/L,
发酵121h至200h:还原糖含量<30g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还原糖的含量控制在30~35g/L,
发酵201h至发酵结束:还原糖含量<5g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还原糖的含量控制在5~10g/L。
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶,其浓度控制在0.001~0.003%。

Claims (7)

1.一种头状链霉菌发酵生产丝裂霉素的新型培养基,包括种子培养基和发酵培养基,其特征在于
所述种子培养基的组成为:甘露醇4~8g/L、甘蔗糖蜜8~12g/L、麦芽糖5~9g/L、麦芽糖酶0.02~0.06g/L、蚕蛹粉4~8g/L、玉米浆10~14ml/L、玉米蛋白粉3~7g/L、硫酸铵3~7g/L、轻质碳酸钙1~5g/L;
所述发酵培养基组成为:甘露醇4~8g/L、甘蔗糖蜜11~15g/L、麦芽糖9~13g/L、麦芽糖酶0.04~0.08g/L、蚕蛹粉6~10g/L、玉米浆15~19ml/L、玉米蛋白粉5~9g/L、硫酸铵4~8g/L、轻质碳酸钙3~7g/L、磷酸镁0.2~0.6g/L、氯化钠0.3~0.7g/L、硫酸亚铁0.01~0.05g/L、聚醚改性硅油0.03~0.07ml/L、维生素B60.05~0.09g/L、泛酸0.01~0.05g/L、氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯0.5~1g/L。
2.一种利用权利要求1所述培养基生产丝裂霉素的培养方法,其特征在于所述工艺步骤为:
1)种子培养:首先将种子培养基灭菌并冷却至25~30℃,并用无菌空气保压,然后在火焰保护下,将已经培养好的头状链霉菌母瓶发酵液按照0.5~0.9L/m3的接种量接入该种子培养基中进行种子培养,至菌体浓度35~40%、pH值6~7、培养时间40~50h时移种;
2)发酵培养:先将发酵培养基灭菌,冷却至20~25℃,并用无菌空气保压,然后将培养好的种子液移入发酵培养基进行发酵培养,移种比例控制在9~11%,至菌体浓度35~40%、还原糖<2.0g/L、氨基氮<15mg/100ml、化学效价>1300u/mL、pH6.0~7.5、培养时间200~220h时终止发酵。
3.按照权利要求2所述的培养方法,其特征是:
灭菌后的种子培养基的质量要求:氨基氮40~60mg/100ml、还原糖50~70g/L、pH:6.5~7.5;
灭菌后的发酵培养基的质量要求:氨基氮70~80mg/100ml、还原糖70~90g/L、pH:6~7。
4.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述培养好的母瓶发酵液质量要求为:pH6~8;菌体浓度10~20%;镜检无杂菌;摇瓶发酵单位800~1000u/ml。
5.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述种子培养条件为:罐压0.03~0.05MPa;罐温28~29℃;空气流量:0~10h,采用空气搅拌代替机械搅拌;11h~移种:30~50m3/h;搅拌转速70~80r/min。
6.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于所述发酵培养条件为:
a温度:采用变温控制方法,0~60h:培养温度29~30℃;61~170h:培养温度28~29℃;171~发酵培养结束,培养温度26~27℃;
b搅拌转速:采用变频搅拌控制方法,0~60h:转速控制在90r/min;61~170h:转速控制在120r/min;171h~发酵结束:转速控制在80r/min;
c压力控制:罐压0.05~0.06MPa;
dpH控制:发酵过程中pH控制在6~7;
e空气流量:0~60h:150~200m3/h;61~170h:250~300m3/h;171h~发酵结束:100~150m3/h;
f溶氧控制:
发酵前60h内,不控制溶氧;
61~170h,溶氧控制在30%以上;
171~发酵结束:溶氧控制在40%以上。
7.按照权利要求2所述的培养方法,其特征在于在发酵过程中采用流加法进行补料,补料包括补蛋白胨、补水、补糖和pH控制,其中
a补蛋白胨工艺控制:
发酵前60h不用进行补油,
发酵时间在61~170h,当氨基氮含量低于40mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨基氮为40~60mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量,
发酵时间在171~200h,当氨基氮含量低于20mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨基氮含量为20~40mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量,
发酵时间在201h~发酵结束,当氨基氮含量低于10mg/100ml,补入蛋白胨,控制氨基氮含量为10~15mg/100ml,每隔6~8h检测发酵液氨基氮含量;
b补水工艺控制:
发酵前60h不用进行补水,
发酵时间在61~120h,当菌体浓度高于45%,加入灭菌水,要求控制发酵液菌体浓度在40~45%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度,
发酵时间在121~200h,当菌体浓度高于40%,加入灭菌水,要求控制发酵液菌体浓度在35~40%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度,
发酵时间在201h~发酵结束,当菌体浓度高于35%,加入灭菌水,要求控制发酵液菌体浓度在30~35%,每隔6~8h检测发酵液菌体浓度;
c补入麦芽糖控制:
发酵前60h,还原糖含量不进行控制,
发酵61h至120h:还原糖含量<50g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还原糖的含量控制在50~55g/L,
发酵121h至200h:还原糖含量<30g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还原糖的含量控制在30~35g/L,
发酵201h至发酵结束:还原糖含量<5g/L时,补入已灭菌的麦芽糖溶液,使还原糖的含量控制在5~10g/L;
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶,其浓度控制在0.001~0.003%。
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