CN104561180A - 一种突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基及补料方法 - Google Patents
一种突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基及补料方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基和补料方法，包括种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述培养中含有玉米酒糟和低温压榨黄豆饼粉；发酵培养中含有玉米酒糟、低温压榨黄豆饼粉、聚苯乙烯非极性吸附树脂和非离子表面活性剂。本发明解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现多拉菌素稳定、高效的生产，同时利用该培养基和补料方法可提高发酵单位。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基及补料方法。
背景技术
多拉菌素是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物，由突变阿维链霉菌采用发酵模式进行生物合成，为阿维菌素第三代衍生物，与其它阿维菌素类产品比较，其抗寄生虫范围更广泛、杀虫活性更高，预防寄生虫再感染有效时间更长，被认为是最有开发潜力的兽用抗寄生虫新药。
目前，国内采用突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素，存在的主要问题是：
1发酵生产工艺变化不大，发酵技术水平维持在1000～1200u/ml，导致发酵整体产量较低。
2动物性氮源质量影响发酵液的质量和发酵效果。目前，国内发酵生产多拉菌素的培养基中加入蛋白胨或酵母提取物或选择两种或两种以上氮源同时加入，导致发酵后期剩余蛋白质较多，发酵液粘度较高，降低了提取收率。
3常规培养基中的速效碳源是葡萄糖，培养基灭菌过程中部分葡萄糖碳化，影响发酵液质量。
4多拉菌素的生产成本较高，其中氮源的成本占到发酵成本的30％左右。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料用量，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现多拉菌素稳定、高效生产的突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产多拉菌素的补料方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述种子培养基的组成为：麦芽糖10～20ml/L、混合淀粉30～40g/L、菜籽油5～10ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉20～30g/L、玉米酒糟15～25g/L、玉米蛋白粉15～20g/L、轻质碳酸钙1～5g/L、硫酸铵1～5g/L，麦芽糖酶0.01～0.05g/L；
所述发酵培养基的组成为：麦芽糖30～40ml/L、混合淀粉30～50g/L、菜籽油10～15ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉30～40g/L、玉米酒糟20～30g/L、玉米蛋白粉20～30g/L、磷酸二氢钾0.8～1.2g/L、轻质碳酸钙5～8g/L、硫酸铵3～7g/L、环己甲酸钠0.5～1.5g/L、硫酸镁0.2～0.6g/L、硫酸锌0.3～0.7g/L、聚乙二醇0.04～0.08ml/L，聚苯乙烯非极性吸附树脂2～6g/L，麦芽糖酶0.05～0.09g/L。
所述玉米酒糟的质量要求是：蛋白质含量在35％以上，水分含量控制在5％以内，80％的原料能够通过60目筛。
所述低温压榨一次黄豆饼粉质量要求是：黄豆在低于80℃的条件下压榨1次，要求其油含量控制在7～10％，蛋白质含量在45％以上，80％的原料能够通过80目筛。
所述混合淀粉是指在淀粉中加入其重量的0.003％的泛酸和0.005％的硫辛酸。
所述聚乙二醇为PEG-200或PEG-400或PEG-600。
利用上述培养基发酵生产多拉菌素的补料方法，其特征在于在发酵过程中进行补料，包括补油、补水、补糖、补碱和补氮源，其中
a 补油控制：采用流加法补菜籽油，
发酵前60h不用进行补油，
发酵61h～120h，期间控制脂肪含量在4～4.5％，当脂肪含量低于4％，补入菜籽油，当脂肪含量超过4.5％，则停止补油，补油量计算公式为：
补油量(L)＝(4.3-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积(L)，
发酵121h至～240h，脂肪含量控制在3～3.5％，当脂肪含量低于3％，补入油，当脂肪含量超过3.5％，则停止补油，补油量计算公式为：
补油量(L)＝(3.3-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积(L)，
发酵241h～发酵结束，脂肪含量控制在1～1.5％(补油吗)；
b 补水：
发酵前40h不用进行补水，
发酵41h～160h，当发酵液菌体浓度＞50％，采用流加法补水，控制菌体浓度40～50％，
发酵161h至发酵结束，当发酵液菌体浓度＞40％，控制菌体浓度35～40％；
c pH控制：
发酵前30h，pH不进行控制，
发酵31～80h，当发酵液的pH低于6.5，加入5～10％的氢氧化钠溶液控制其pH在6.5～7.0，
发酵81h至～200h，当发酵液的pH低于6.3，加入5～10％的氢氧化钠溶液控制其pH在6.3～6.5，
201h至发酵结束，pH不控制；
d 补入氮源：在发酵周期分别在60h和100h时补入5～10％的硫酸铵，其补入量为发酵液体积的2～2.5％；
e 补糖：
发酵前60h，不加入麦芽糖，
发酵61～120h，当还原糖含量＜4％，加入麦芽糖，当还原糖含量超过6％，则停止加入麦芽糖，补糖量(kg)＝(5-还原糖量)％×发酵液体积(L)，
发酵121h至200h，当还原糖含量＜2％，加入麦芽糖，当还原糖含量超过2.5％，则停止加入麦芽糖，补糖量(kg)＝(2.2-还原糖量)％×发酵液体积(L)，
发酵201h至发酵结束，不补入麦芽糖。
本发明的技术优势为：
1)发酵成本低。本发明使用玉米酒糟代替多拉菌素常规种子培养基、发酵培养基中的氮源，减少了蛋白胨或酵母提取物等用量，且由于玉米酒糟产量较大，市场价格较低，故而降低了生产成本，同时也避免因动物性氮源质量影响种子液和发酵液质量的不利因素。
2)本发明采用玉米酒糟代替了常规培养基中的蛋白胨和酵母提取物，满足了多拉菌素发酵培养过程中氨基酸的需求量。根据相关文献报道多拉菌素发酵所需的主要氨基酸分别是异亮氨酸。本发明发酵培养基中的蛋白质含量达到55％以上，异亮氨酸含量明显高于国内常规培养基配方，有利于改善突变阿维链霉菌菌丝形态，提高发酵液的质量和发酵技术水平。
不同原辅料的异亮氨酸含量对比表
| 内容 | 异亮氨酸mg/100mg |
| 玉米酒糟 | 5.21 |
| 酵母浸膏 | 2.11 |
| 蛋白胨 | 2.53 |
3)本发明发酵培养基中加入表面活性剂和大孔树脂，不仅改变了突变阿维链霉菌的通透性，而且改善气液表面状态以及发酵液的流动状态，有利于提高发酵技术水平。
4)采用该工艺发酵生产多拉菌素，适用于单罐发酵规模在10m3以上，发酵单位达到1500u/ml以上。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例中玉米酒糟的质量要求是：蛋白质含量在35％以上，水分含量控制在5％以内，80％的原料能够通过60目筛。
低温压榨一次黄豆饼粉质量要求是：黄豆在低于80℃的条件下压榨1次，要求其油含量控制在7～10％，蛋白质含量在45％以上。80％的原料能够通过80目筛。
种子培养工艺：
罐压0.02～0.04MPa；罐温27～29℃；空气流量60m3/h；搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间40～45h。种子培养结束，菌体浓度25～30％，无其它杂菌污染。
发酵培养工艺
先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。其移种量控制在6～8％。培养温度控制在27～29℃；搅拌转速120r/min；培养时间262～268h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；菌体浓度控制在30～35，空气流500～700m3/h。
实施例1
1m3种子罐培养
麦芽糖10L、混合淀粉30kg、菜籽油5L、低温压榨一次黄豆饼粉20kg、玉米酒糟15kg、玉米蛋白粉15kg、轻质碳酸钙1kg、硫酸铵1kg，麦芽糖酶0.01kg。
种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温27～29℃；空气流量60m3/h；搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间40h。种子培养结束，菌体浓度25％，无其它杂菌污染。
10m3发酵罐培养
麦芽糖300L、混合淀粉300kg、菜籽油100L、低温压榨一次黄豆饼粉300kg、玉米酒糟200kg、玉米蛋白粉200kg、磷酸二氢钾8kg、轻质碳酸钙50kg、硫酸铵30kg、环己甲酸钠5kg、硫酸镁2kg、硫酸锌3kg、PEG-2000.4L，聚苯乙烯非极性吸附树脂20kg，麦芽糖酶0.5kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。其移种量控制在6％。培养温度控制在27～29℃；搅拌转速120r/min；培养时间262h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流500m3/h。发酵培养结束，发酵单位1520u/ml。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例2
1m3种子罐培养
麦芽糖12L、混合淀粉32kg、菜籽油6L、低温压榨一次黄豆饼粉22kg、玉米酒糟18kg、玉米蛋白粉17kg、轻质碳酸钙2kg、硫酸铵2kg，麦芽糖酶0.02kg。
种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温27～29℃；空气流量60m3/h；搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间41h。种子培养结束，菌体浓度26％，无其它杂菌污染。
10m3发酵罐培养
麦芽糖320L、混合淀粉350kg、菜籽油110L、低温压榨一次黄豆饼粉320kg、玉米酒糟220kg、玉米蛋白粉230kg、磷酸二氢钾9kg、轻质碳酸钙60kg、硫酸铵40kg、环己甲酸钠8kg、硫酸镁3kg、硫酸锌4kg、PEG-4000.5L，聚苯乙烯非极性吸附树脂30kg，麦芽糖酶0.6kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。其移种量控制在6.5％。培养温度控制在27～29℃；搅拌转速120r/min；培养时间263h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流550m3/h。发酵培养结束，菌体浓度为32％，发酵单位1611u/ml。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例3
1m3种子罐培养
麦芽糖15L、混合淀粉35kg、菜籽油7L、低温压榨一次黄豆饼粉25kg、玉米酒糟20kg、玉米蛋白粉18kg、轻质碳酸钙3kg、硫酸铵3kg，麦芽糖酶0.03kg。
种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温27～29℃；空气流量60m3/h；搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间43h。种子培养结束，菌体浓度27％，无其它杂菌污染。
10m3发酵罐培养
麦芽糖350L、混合淀粉400kg、菜籽油120L、低温压榨一次黄豆饼粉350kg、玉米酒糟250kg、玉米蛋白粉250kg、磷酸二氢钾10kg、轻质碳酸钙65kg、硫酸铵50kg、环己甲酸钠10kg、硫酸镁4kg、硫酸锌5kg、PEG-6000.6L，聚苯乙烯非极性吸附树脂40kg，麦芽糖酶0.7kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。其移种量控制在7％。培养温度控制在27～29℃；搅拌转速120r/min；培养时间265h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流600m3/h。发酵培养结束，菌体浓度为33％，发酵单位1684u/ml。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例4
1m3种子罐培养
麦芽糖18L、混合淀粉37kg、菜籽油9L、低温压榨一次黄豆饼粉25kg、玉米酒糟23kg、玉米蛋白粉19kg、轻质碳酸钙4kg、硫酸铵4kg，麦芽糖酶0.04kg。
种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温27～29℃；空气流量60m3/h；搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间44h。种子培养结束，菌体浓度28％，无其它杂菌污染。
10m3发酵罐培养
麦芽糖380L、混合淀粉450kg、菜籽油140L、低温压榨一次黄豆饼粉380kg、玉米酒糟285kg、玉米蛋白粉280kg、磷酸二氢钾11kg、轻质碳酸钙70kg、硫酸铵60kg、环己甲酸钠12kg、硫酸镁5kg、硫酸锌6kg、PEG-4000.7L，聚苯乙烯非极性吸附树脂50kg，麦芽糖酶0.8kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。其移种量控制在7.5％。培养温度控制在27～29℃；搅拌转速120r/min；培养时间267h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流650m3/h。发酵培养结束，菌体浓度为34％，发酵单位1634u/ml。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例5
1m3种子罐培养
麦芽糖20L、混合淀粉40kg、菜籽油10L、低温压榨一次黄豆饼粉30kg、玉米酒糟25kg、玉米蛋白粉20kg、轻质碳酸钙5kg、硫酸铵5kg，麦芽糖酶0.05kg。
种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温27～29℃；空气流量60m3/h；搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间45h。种子培养结束，菌体浓度30％，无其它杂菌污染。
10m3发酵罐培养
麦芽糖400L、混合淀粉500kg、菜籽油150L、低温压榨一次黄豆饼粉400kg、玉米酒糟300kg、玉米蛋白粉300kg、磷酸二氢钾12kg、轻质碳酸钙80kg、硫酸铵70kg、环己甲酸钠15kg、硫酸镁6kg、硫酸锌7kg、PEG-2000.8L，聚苯乙烯非极性吸附树脂60kg，麦芽糖酶0.9kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。其移种量控制在8％。培养温度控制在27～29℃；搅拌转速120r/min；培养时间268h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流700m3/h。发酵培养结束，菌体浓度为35％，发酵单位1597u/ml。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
实施例6
1m3种子罐培养
麦芽糖10L、混合淀粉35kg、菜籽油8L、低温压榨一次黄豆饼粉30kg、玉米酒糟22kg、玉米蛋白粉15kg、轻质碳酸钙3kg、硫酸铵2kg，麦芽糖酶0.01kg。
种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温27～29℃；空气流量60m3/h；搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间45h。种子培养结束，菌体浓度30％，无其它杂菌污染。
10m3发酵罐培养
麦芽糖400L、混合淀粉300kg、菜籽油120L、低温压榨一次黄豆饼粉350kg、玉米酒糟300kg、玉米蛋白粉200kg、磷酸二氢钾1.0kg、轻质碳酸钙80kg、硫酸铵70kg、环己甲酸钠10kg、硫酸镁6kg、硫酸锌3.5kg、PEG-2000.4L，聚苯乙烯非极性吸附树脂40kg，麦芽糖酶0.9kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。其移种量控制在8％。培养温度控制在27～29℃；搅拌转速120r/min；培养时间268h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流700m3/h。发酵培养结束，菌体浓度为35％，发酵单位1597u/ml。
上述发酵过程中根据情况进行补料。
上述实施例1-6中补料控制按照下述方式实现：
a 补油控制：采用流加法补菜籽油。
脂肪控制：发酵培养基灭菌后脂肪控制在4～6％；发酵前60h，不控制脂发酵液中的肪含量。发酵61～120h，脂肪含量控制在4～4.5％；121h至～240h，脂肪含量控制在3～3.5％。241h～发酵结束，脂肪含量控制在1～1.5％。
发酵前60h不用进行补油，
发酵61h～120h：如果脂肪含量低于4％，补入菜籽油；如果脂肪含量超过4.5％，则停止补油。其计算公式为：
补油量(L)＝(4.3-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积(L)。
发酵121h至～240h：如果脂肪含量低于3％，补入油；如果脂肪含量超过3.5％，则停止补油。其计算公式为：
补油量(L)＝(3.3-脂肪含量-残油量)％×发酵液体积(L)。
b 补水：
发酵前40h不用进行补水，
发酵41h～160h：当发酵液菌体浓度＞50％，采用流加法补水，控制菌体浓度40～50％。
发酵161h至发酵结束：当发酵液菌体浓度＞40％，采用流加法补水，控制菌体浓度35～40％。
c pH控制：
发酵前30h，pH不进行控制。
发酵31～80h：如果发酵液的pH低于6.5，加入5～10％的氢氧化钠溶液控制其pH在6.5～7.0。
发酵81h至～200h：如果发酵液的pH低于6.3，加入5～10％的氢氧化钠溶液控制其pH在6.3～6.5。
发酵201h至发酵结束，pH不控制。
d 补入氮源：在发酵周期分别在60h和100h时补入5～10％的硫酸铵，其补入量为发酵液体积的2～2.5％。
e 补糖：
发酵前60h，不加入麦芽糖。
发酵61～120h，如果还原糖含量＜4％；加入麦芽糖；如果还原糖含量超过6％，则停止加入麦芽糖。其计算公式为：补糖量(kg)＝(5-还原糖量)％×发酵液体积(L)
发酵121h至200h，如果还原糖含量＜2％；加入麦芽糖；如果还原糖含量超过2.5％，则停止加入麦芽糖。其计算公式为：补糖量(kg)＝(2.2-还原糖量)％×发酵液体积(L)
201h至发酵结束，不补入麦芽糖。
对比实施例
种子培养：
在1m3一级种子罐中加入葡萄糖15kg、可溶性淀粉35kg、豆油10L、黄豆饼粉31kg、蛋白胨10kg、酵母粉15kg、轻质碳酸钙3kg、硫酸铵4kg。
首先将种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的突变阿维链霉菌母瓶发酵液接入种子罐进行培养，接种量为1L。种子培养过程中，罐压0.02～0.04MPa；罐温27～29℃；空气流量60m3/h；搅拌转速60～80r/min；pH6～8；培养时间42h。种子培养结束，菌体浓度22％，无其它杂菌污染。
发酵培养：
在10m3发酵罐中加入葡萄糖250kg、可溶性淀粉350kg、豆油30L、黄豆饼粉350kg、蛋白胨150kg、酵母粉130kg、磷酸二氢钾6kg、轻质碳酸钙50kg、硫酸铵45kg、环己甲酸钠3kg、硫酸镁3kg、硫酸锌5kg。
先将发酵培养基灭菌，冷却，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将种子液全部移入发酵罐进行培养。其移种量控制在8％。培养温度控制在27～29℃；搅拌转速120r/min；培养时间265h；发酵全程罐压控制在0.03～0.05MPa；发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌；空气流600m3/h。发酵培养结束，菌体浓度为32％，发酵单位1026u/ml。
Claims (6)
1. 一种突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基，包括种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述种子培养基的组成为：麦芽糖10～20ml/L、混合淀粉30～40g/L、菜籽油5～10ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉20～30g/L、玉米酒糟15～25g/L、玉米蛋白粉15～20g/L、轻质碳酸钙1～5g/L、硫酸铵1～5g/L，麦芽糖酶0.01～0.05g/L；
所述发酵培养基的组成为：麦芽糖30～40ml/L、混合淀粉30～50g/L、菜籽油10～15ml/L、低温压榨一次黄豆饼粉30～40g/L、玉米酒糟20～30g/L、玉米蛋白粉20～30g/L、磷酸二氢钾0.8～1.2g/L、轻质碳酸钙5～8g/L、硫酸铵3～7g/L、环己甲酸钠0.5～1.5g/L、硫酸镁0.2～0.6g/L、硫酸锌0.3～0.7g/L、聚乙二醇0.04～0.08ml/L，聚苯乙烯非极性吸附树脂2～6g/L，麦芽糖酶0.05～0.09g/L。
2. 按照权利要求1所述的突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基，其特征在于所述玉米酒糟的质量要求是：蛋白质含量在35%以上，水分含量控制在5%以内，80%的原料能够通过60目筛。
3. 按照权利要求1所述的突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基，其特征在于所述低温压榨一次黄豆饼粉质量要求是：黄豆在低于80℃的条件下压榨1次，要求其油含量控制在7～10%，蛋白质含量在45%以上，80%的原料能够通过80目筛。
4. 按照权利要求1所述的突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基，其特征在于所述混合淀粉是指在淀粉中加入其重量的0.003%的泛酸和0.005%的硫辛酸。
5. 按照权利要求1所述的突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基，其特征在于所述聚乙二醇为PEG-200或PEG-400或PEG-600。
6. 一种利用权利要求1-5所述培养基发酵生产多拉菌素的补料方法，其特征在于在发酵过程中进行补料，包括补油、补水、补糖、补碱和补氮源，其中
a 补油控制：采用流加法补菜籽油，
发酵前60h不用进行补油，
发酵61h～120h，期间控制脂肪含量在4～4.5%，当脂肪含量低于4%，补入菜籽油，当脂肪含量超过4.5%，则停止补油，补油量计算公式为：
补油量（L）=(4.3-脂肪含量-残油量)%×发酵液体积（L），
发酵121h至～240h，脂肪含量控制在3～3.5%，当脂肪含量低于3%，补入油，当脂肪含量超过3.5%，则停止补油，补油量计算公式为：
补油量（L）=(3.3-脂肪含量-残油量)%×发酵液体积（L），
发酵241h～发酵结束，脂肪含量控制在1～1.5%（补油吗）；
b 补水：
发酵前40h不用进行补水，
发酵41h～160h，当发酵液菌体浓度＞50%，采用流加法补水，控制菌体浓度40～50%，
发酵161h至发酵结束，当发酵液菌体浓度＞40%，控制菌体浓度35～40%；
c pH控制：
发酵前30h，pH不进行控制，
发酵31～80h，当发酵液的pH 低于6.5，加入5～10%的氢氧化钠溶液控制其pH 在6.5～7.0，
发酵81h至～200h，当发酵液的pH 低于6.3，加入5～10%的氢氧化钠溶液控制其pH 在6.3～6.5，
201h至发酵结束，pH不控制；
d 补入氮源：在发酵周期分别在60h和100h时补入5～10%的硫酸铵，其补入量为发酵液体积的2～2.5%；
e 补糖：
发酵前60h，不加入麦芽糖，
发酵61～120h，当还原糖含量＜4%，加入麦芽糖，当还原糖含量超过6%，则停止加入麦芽糖，补糖量（kg）=(5-还原糖量)%×发酵液体积（L），
发酵121h至200h，当还原糖含量＜2%，加入麦芽糖，当还原糖含量超过2.5%，则停止加入麦芽糖，补糖量（kg）=(2.2-还原糖量)%×发酵液体积（L），
发酵201h至发酵结束，不补入麦芽糖。
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