CN105754921A - 一种产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产5酮基22,23双氢多拉菌素的基因工程菌及其制备方法和应用,该基因工程菌是是以产多拉菌素的阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069为出发菌株,将阿维菌素聚酮合酶中AveDH2KR2结构域的编码基因aveDH2KR2替换为Streptomyces bingchengsis米尔贝霉素聚酮合酶中MilDH2ER2KR2结构域的编码基因milDH2ER2KR2,然后再将AveF的编码基因aveF中断后而得到的基因工程菌。本发明的基因工程菌可直接用于5酮基22,23双氢多拉菌素的发酵生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌及其制备方法和应用
背景技术
阿维菌素(avermectin)是由阿维链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生的十六元环大环内酯类聚酮化合物,具有良好的杀螨和杀线虫活性。以阿维菌素为母体化合物进行结构改造,已形成了包括伊维菌素(Ivermectin)、多拉菌素(Doramectin)、塞拉菌素(Selamectin)和埃谱利诺菌素(Eprinomectin)等一系列的阿维菌素类药物,在杀虫活性和药物动力学特性方面有了进一步的提高和改善。阿维菌素类药物能有效地防治农业害虫及多种害螨,特别是对常用农药产生抗药性的害虫和害螨具有良好的防治效果,对作物相对安全,不伤害天敌,已被广泛用于农业害虫和害螨的防治。此外,阿维菌素类药物对人和动物的寄生线虫和节肢动物类寄生虫具有很好的驱杀活性,且具有广谱、高效和低毒等优点,已用于兽医临床和人类寄生虫的防治,是目前销售量最大的抗寄生虫药物。最近的研究显示,阿维菌素类药物对包括多重耐药性和广泛耐药性的结核分枝杆菌具有良好的抑制活性,同时对溃疡分枝杆菌也展现出较好的生物活性;此外,阿维菌素还可以和甲氧西林互动抗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,以上研究表明阿维菌素类药物在临床感染性疾病的防治方面应用潜力巨大。
2003年,科学家已完成了阿维菌素早期工业菌株Streptomyces avermitilis MA-4680的全基因组测序,阿维菌素生物合成基因簇及其合成和调控机制已逐步得到阐明。阿维菌素的生物合成分为三个阶段:(1)聚酮链的延伸。在阿维菌素聚酮合酶的作用下,以2-甲基丁酰辅酶A或异丁酰辅酶A为起始单元,然后由4个多功能模块聚酮合酶(AVES1、AVES2、AVES3和AVES4)添加5个甲基丙二酰辅酶A和7个丙二酰辅酶A形成聚酮链。不同的起始单元分别形成阿维菌素的“a”组分和“b”组分。(2)糖苷配基的形成。形成的聚酮链在AVES4中的TE结构域催化下形成环状,然后由AveC催化C22-C23之间的脱水和C17-C25螺缩醛酮的形成,脱水作用使C22-C23之间形成双键。根据C22-C23之间单键或双键将阿维菌素分为“1”组分和“2”组分,因此AveC是决定“1”组分和“2”组分比例的一个关键酶。AveC催化后分别由AveE催化C6和C8a间呋喃环的形成和由AveF催化C5酮基的还原,最后由AveD催化C5的O-甲基化,从而形成具有“A”和“B”组分的糖苷配基。(3)糖苷配基的糖基化 修饰。2个葡萄糖-1-磷酸由AveBII-VIII催化形成脱氧胸苷二磷酸-齐墩果糖,然后再由aveBI编码的糖基转移酶将脱氧胸苷二磷酸-齐墩果糖连接到阿维菌素糖苷配基的C13和C4′上形成阿维菌素。在对阿维菌素生物合成途径了解的基础上,通过对阿维菌素生物合成基因簇的改造已产生了一系列阿维菌素类结构类似物。对aveD基因的插入失活,阻断了C5-O-甲基转移酶的合成,并影响了与aveD共转录的aveF的表达,从而获得了合成C5-酮基阿维菌素的基因工程菌,所产生的C5-酮基阿维菌素可直接用于C5位结构修饰产生新的阿维菌素类化合物。将阿维菌素聚酮合酶模块2中的DH2-KR2用pikromycin聚酮合酶中模块4、寡霉素聚酮合酶中模块3或米尔贝霉素聚酮合酶中模块2的DH-ER-KR代替后,所构建的基因工程菌可产生C22-C23位是饱和单键的阿维菌素二代药物—伊维菌素。
塞拉菌素(selamectin)属于阿维菌素类药物,是一种半合成的单糖肟衍生物,化学名为5-肟基-22,23-双氢-25环己基阿维菌素B1单糖,兼具抗体内寄生虫和抗体外寄生虫双重作用的新型广谱抗寄生虫药物。塞拉菌素由美国辉瑞制药开发,并于1999年7月首次在英国上市,商品名Revolution。塞拉菌素在治疗犬和猫的蚤(猫栉首蚤和犬栉头蚤)、螨、蜱以及一些体内线虫(蛔虫和钩虫)的感染优于其它阿维菌素类药物,并且在防治犬、猫的犬恶丝虫感染有非常好的效果。由于塞拉菌素具有杀虫活性强和安全性高等优点,已先后被北美、欧洲、澳洲的跨国公司开发成宠物专用制剂并相继上市。目前,塞拉菌素主要以多拉菌素为起始原料通过化学合成的方法制备。如辉瑞公司的专利EP1003764B1以多拉菌素为原料,首先通过氢化反应把C22-C23位上的双键进行加成,然后把C5位羟基氧化成酮基形成5-酮基-22,23-双氢多拉菌素,最后把C5位酮基进行肟化同时脱去一分子糖得到塞拉菌素。多拉菌素是20世纪90年代开发的、继伊维菌素后的第三代阿维菌素类药物,是以环己羧酸为前体,通过阿维链霉菌的突变菌株发酵而产生。在该突变菌株中,由于bkd基因的突变失活,从而使得该菌株失去了形成阿维菌素起始单元2-甲基丁酰辅酶A和异丁酰辅酶A的能力。在向培养基中添加环己羧酸的情况下,阿维菌素聚酮合酶可利用环己羧酸辅酶A为前体,代替2-甲基丁酰辅酶A和异丁酰辅酶A,形成C25位为环己烷的多拉菌素。因此,以产生多拉菌素的阿维链霉菌为出发菌株,对阿维菌素合成基因簇进行特定的改造,在理论上可产生与多拉菌素C22-C23和C5位结构不同的5-酮基-22,23-双氢多拉菌素,进而直接以5-酮基-22,23-双氢多拉菌素为起始原料通过一步化学反应即可实现塞拉菌素的化学合成。
发明内容
本发明的目的是提供一种产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素(结构见图1)的基因工程菌及 其构建方法和应用。
本发明所提供一种产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌Streptomycesavermitilis Mil-AveF,以产多拉菌素的阿维链霉菌Streptomyces avermitilisNEAU1069为出发菌株,将阿维菌素聚酮合酶中AveDH2-KR2结构域的编码基因aveDH2-KR2替换为Streptomyces bingchengsis米尔贝霉素聚酮合酶中MilDH2-ER2-KR2结构域的编码基因milDH2-ER2-KR2,然后再将AveF的编码基因aveF中断后得到的基因工程菌Streptomycesavermitilis Mil-AveF。
所述的阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069由东北农业大学生物化工教研室提供,于2009年3月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏登记号为CGMCC2943;所述的冰城链霉菌Streptomyces bingchengsis由东北农业大学生物化工教研室提供,公开于中国专利申请CN101100651B中,于2006年6月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏登记号为CGMCC1734。
该基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF可以发酵生产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素。
本发明还提供了一种产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌的构建方法,包括以下步骤:
1)构建milDH2-ER2-KR2基因替换质粒,其含有aveDH2-KR2基因同源重组左臂、milDH2-ER2-KR2基因和aveDH2-KR2基因同源重组右臂;
2)将步骤1)所得的milDH2-ER2-KR2基因替换质粒转化宿主细胞,获得转化子;
3)将阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069作为受体,与步骤2)所述的转化子进行接合转移,挑取同源重组双交换子,即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil;
4)构建aveF基因中断质粒,其含有aveF基因同源重组左臂和aveF基因同源重组右臂;
5)将步骤4)所得的aveF基因中断质粒转化宿主细胞,获得转化子;
6)将步骤3)得到的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil作为受体,与步骤5)所述的转化子进行接合转移,挑取同源重组双交换子,即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换和aveF基因被中断的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF。
步骤1)中的aveDH2-KR2基因同源重组左臂片段的构建引物a1核苷酸序列如SEQID NO.1,引物a2核苷酸序列如SEQ ID NO.2。
步骤1)中的milDH2-ER2-KR2基因的引物b1核苷酸序列如SEQ ID NO.3,引物b2核苷酸序列如SEQ ID NO.4。
步骤1)中的aveDH2-KR2基因同源重组右臂片段的构建引物c1核苷酸序列如SEQID NO.5,引物c2核苷酸序列如SEQ ID NO.6。
步骤4)中aveF基因同源重组左臂片段的构建引物aveF-F1核苷酸序列如SEQ IDNO.7,引物aveF-R1核苷酸序列如SEQ ID NO.8。
步骤4)中aveF基因同源重组右臂片段的构建引物aveF-F2核苷酸序列如SEQ IDNO.9,引物aveF-R2核苷酸序列如SEQ ID NO.10。
步骤1)和步骤5)中所述宿主细胞为大肠杆菌ET12567。
本发明还提供了一种上述构建的基因工程菌用于制备5-酮基-22,23-双氢多拉菌素。
所述应用方法,步骤如下:包括培养产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌,从培养物中分离5-酮基-22,23-双氢多拉菌素。具体为:
1)构建milDH2-ER2-KR2基因替换质粒,其含有aveDH2-KR2基因同源重组左臂、milDH2-ER2-KR2和aveDH2-KR2基因同源重组右臂;
2)将步骤1)所得的milDH2-ER2-KR2基因替换质粒转化宿主细胞,获得转化子;
3)将阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069作为受体,与步骤2)所述的转化子进行接合转移,挑取同源重组双交换子,即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil;
4)构建aveF基因中断质粒,其含有aveF基因同源重组左臂和aveF基因同源重组右臂;
5)将步骤4)所得的aveF基因中断质粒转化宿主细胞,获得转化子;
6)将步骤3)得到的Streptomyces avermitilis Mil作为受体,与步骤5)所述的转化子进行接合转移,挑取同源重组双交换子,即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换 和aveF基因被中断的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF;
7)以Streptomyces avermitilis Mil-AveF发酵,从发酵液中分离提纯生产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素。
本发明的有益效果如下:
本发明通过对多拉菌素产生菌中阿维菌素生物合成基因簇的改造,构建了能够产生5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌,实现了直接通过微生物发酵的方法生产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素,所得到的5-酮基-22,23-双氢多拉菌素只需要经过一步化学反应就可得到塞拉菌素,从而将传统的塞拉菌素化学合成步骤由三步减少到一步,降低了生产成本,提高了生产效率,减少了化学合成对环境的负面影响。
附图说明
图1是多拉菌素和5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的化学结构;
图2是取代阿维菌素生物合成基因簇中aveDH2-KR2基因的质粒pER-4构建示意图;
图3是基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil的构建示意图,其中a为Streptomyces avermitilis Mil的构建策略示意图,b为Streptomyces avermitilis Mil的基因型验证图,泳道M为DNA marker,泳道1为基因工程菌Streptomyces avermitilisMil的PCR产物,泳道2为菌株Streptomyces bingchengsis的PCR产物,泳道3为菌株Streptomyces avermitilis NEAU1069的PCR产物;
图4是中断阿维菌素生物合成基因簇中aveF基因的质粒pER-aveF构建示意图;
图5是基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF的构建示意图,其中a为Streptomyces avermitilis Mil-AveF的构建策略示意图,b为Streptomyces avermitilisMil-AveF的基因型验证图,泳道M为DNA marker,泳道1为出发菌株Streptomycesavermitilis Mil-AveF的PCR产物,泳道2为基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil的PCR产物;
图6是基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil产生的22,23-双氢多拉菌素的MS图谱;
图7是基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF产生的5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的MS图谱。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温” 是指进行试验的操作间的温度,一般为25℃。
所使用的工具酶、DNA分子量标记、胶回收试剂盒、pUC19载体均购自大连宝生物公司,使用方法参考商品说明书。
大肠杆菌E coli DH5α、ET12567,购自上海鼎国生物技术有限责任公司。
引物由大连宝生物公司合成。
Streptomyces avermitilis NEAU1069和Streptomyces bingchengsis可从东北农业大学生物化工教研室取得。
质粒pKC1139为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒,阿普拉霉素抗性对大肠杆菌和链霉菌均有选择作用,链霉菌复制子为温敏型,温度高于34℃不能进行自主复制(参考文献Bierman M,Logan R,O′Brien K,et al.Plasmid cloning vectors for the conjugaltransfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp[J].Gene,1992,116:43-49)。
实施例1、基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil的构建
方法:
1、取代质粒pER-4的构建
利用引物a1(SEQ ID NO.1,5′-CCAAGCTTCCGCATTCATCTGCTCCG-3′,下划线为HindIII位点)和a2(SEQ ID NO.2,5′-GCTCTAGACCGGCTGCTGACACGTTGC-3′,下划线为XbaI位点)从Streptomyces avermitilis NEAU1069基因组上PCR扩增得到阿维菌素生物合成基因簇中编码DH2-KR2基因的同源重组左臂片段。
PCR反应的总体系为25μL,包括10×pfu Buffer 2.5μL,dNTP 2μL,Streptomycesavermitilis NEAU1069基因组DNA 1μL,引物a1和引物a2各2μL,pfu DNA聚合酶(5U/μL)2μL,DMSO 2.5μL,水6μL。反应条件为:98℃1min;98℃10s,61.3℃30s,72℃1min,30cycles;72℃10min。PCR产物上样电泳后,利用胶回收试剂盒回收长度为1106bp的目的条带。回收目的片段经HindIII和XbaI酶切后,与经HindIII和XbaI酶切后的pUC19载体连接。连接产物转化大肠杆菌JM109,涂布在含氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB固体培养基上于37℃过夜培养,挑取阳性单克隆,提取质粒,经酶切和测序验证,将测序正确的质粒命名为pER-1。
利用引物c1(SEQ ID NO.5,5′-GCTCTAGACGGCACCGACCACCGG-3′,下划线为XbaI位点)和c2(SEQ ID NO.6,5′-CGGAATTCCTGCTCCAGGTTCCATCCAC-3′,下划线为EcoRI位点)从Streptomyces avermitilis NEAU1069基因组上PCR扩增得到阿维菌素生物合成基因簇中编码DH2-KR2基因的同源重组右臂片段。
PCR反应的总体系为25μL,包括10×pfu Buffer 2.5μL,dNTP 2μL,Streptomycesavermitilis NEAU1069基因组DNA 1μL,引物c1和引物c2各2μL,pfu DNA聚合酶(5U/μL)2μL,DMSO 2.5μL,水6μL。反应条件为:98℃1min;98℃10s,60.6℃30s,72℃1.2min,30cycles;72℃10min。PCR产物上样电泳后,回收长度为1055bp的目的条带。回收目的片段经XbaI和EcoRI酶切后,与经XbaI和EcoRI酶切后的pER-1载体连接。连接产物转化大肠杆菌JM109,涂布在含氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB固体培养基上于37℃过夜培养,挑取阳性单克隆,提取质粒,经酶切和测序验证,将测序正确的质粒命名为pER-2。
利用引物b1(SEQ ID NO.3,5′-GCTCTAGACGCGGCGGAGCACCC-3′,下划线为XbaI位点)和b2(SEQ ID NO.4,5′-GCTCTAGATGCCCGGTCATGCCGCTGG-3′,下划线为XbaI位点)从Streptomyces bingchengsis基因组上PCR扩增得到米尔贝霉素生物合成基因簇中编码DH2-ER2-KR2基因片段。
PCR反应的总体系为25μL,包括10×pfu Buffer 2.5μL,dNTP 2μL,Streptomycesbingchengsis基因组DNA 1μL,引物b1和引物b2各2μL,pfu DNA聚合酶(5U/μL)2μL,DMSO2.5μL,水6μL。反应条件为:98℃1min;98℃10s,62.6℃30s,72℃1.2min,30cycles;72℃10min。PCR产物上样电泳后,回收长度为3120bp的目的条带。回收目的片段经XbaI酶切后,与经XbaI酶切后的pER-2载体连接。连接产物转化大肠杆菌JM109,涂布在含氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB固体培养基上于37℃过夜培养,挑取阳性单克隆,提取质粒,经酶切和测序验证,将测序正确的质粒命名为pER-3。
将pER-3用HindIII和EcoRI进行酶切,酶切产物上样电泳后,回收长度为5.27kb的目的条带,将回收片段与经HindIII和EcoRI酶切的pKC1139进行连接。连接产物转化大肠杆菌JM109,涂布在含阿普拉霉素(终浓度50μg/ml)的LB固体培养基上于37℃过夜培养,挑取阳性单克隆,提取质粒,经酶切和测序验证,将测序正确的质粒命名为pER-4。取代质粒pER-4的构建过程见图2。
2、基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil的构建
将pER-4质粒转化大肠杆菌ET12567,在含有阿普拉霉素(50μg/mL)的LB平板(参考文献萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M],第二版,北京:科学出版社,1992)上筛选转化子ET12567/pER-4。将转化子ET12567/pER-4接种于2mL LB液体培养基(含氯霉素25μg/mL,卡那霉素25μg/mL,阿普拉霉素25μg/mL),37℃振荡培养过夜。次日以1:100(V/V)的接种量转接于新鲜的LB(含氯霉素25μg/mL,卡那霉素25μg/mL, 阿普拉霉素25μg/mL)20mL,培养至OD600值0.4为佳。用50mL离心管离心去上清(Hitachi CR21G,转子R20A2,10,000r/min,15min),10mL新鲜LB洗涤细胞两次,最后用0.1倍体积LB培养基(2mL)悬浮。刮取Streptomyces avermitilis NEAU1069孢子制备浓度约为108个/mL的孢子悬液,离心后沉淀换用2×YT[2×YT培养基(g/L):胰蛋白胨16g,NaCl 5g,酵母提取物10g,pH7.0]培养基悬浮,取500μL于50℃水浴中热激10min。取500μL的ET12567/pER-4加入至500μL热激后的孢子悬液中,混合并轻摇。离心去除大部分上清,悬浮残余液体涂布MS平板(参考文献Kieser T,Bibb M.Practical Streptomyces Genetics[M].Norwich:The John InnesFoundation,2000),28℃倒置培养。16h后在平板上铺1mL含有0.5mg的萘啶酮酸及50μg阿普拉霉素的水溶液,液体被吸收后,继续于28℃倒置培养。挑取结合子单菌落于新鲜的MS平板上富集培养,该平板含有(1mg萘啶酮酸和50μg阿普拉霉素)/(mL培养基)。
选取较快长出孢子的上述所得的结合子进行温度诱导筛选及传代收集孢子,制备孢子悬液,以每培养皿约100个孢子涂布于MS平板(参考文献Kieser T,Bibb M.PracticalStreptomyces Genetics[M].Norwich:The John Innes Foundation,2000),该平板含有50μg阿普拉霉素/(mL培养基)的阿普拉霉素,28℃培养48h,观察有小菌落长出后转至39℃进行温度诱导。约7天后发现39℃培养下已长出大量的孢子。由于质粒pER-4含有pKC1139来源的温度敏感型复制子,在高于34℃不能独立复制,故在39℃生长的菌落应该是质粒进入菌体后通过与同源臂的交换整合入染色体的整合子。挑取整合子于无抗性的MS平板中28℃松弛培养,连续传代,促使其发生双交换。经连续传代培养后,挑取同一个单菌落分别在上述有阿普拉霉素抗性与无阿普拉霉素抗性的MS平板上培养,筛选在无抗性平板生长而在抗性平板上不生长的菌落即为发生双交换的克隆。
挑取10株以上筛选出的菌株,提取其基因组DNA进行PCR验证。上下游引物分别为V1(5'-ATGCCACCCTCGGGTCCCTC-3')和V2(5'-AAGGGCGGCTACGGCTACGA-3')。PCR反应条件为:98℃1min;98℃10s;58℃30s,72℃3min,30cycles;72℃10min。
同源重组示意图如图3a所示。只有质粒整合到基因组上发生双交换后,以V1和V2为引物、基因工程菌的基因组为模板PCR扩增,才能得到理论上大小为2.6kb的阳性条带,即获得阿维菌素生物合成基因簇中DH2-KR2基因被米尔贝霉素生物合成基因簇中DH2-ER2-KR2基因所取代的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil,而以V1和V2为引物、起始菌株Streptomyces avermitilis NEAU1069基因组为模板PCR扩增,不会得到任何条带(见图3b)。
实施例2、基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF的构建
1、敲除质粒pER-aveF的构建
利用引物aveF-F1(SEQ ID NO.7,5′-CCCAAGCTTGGGCCGAACTCTCGCTGTGCCGTG-3′,下划线为HindIII位点)和aveF-R1(SEQ ID NO.8,5′-GCTCTAGACGACATGAACCGCGCGATGCGCGA-3′,下划线为XbaI位点)从Streptomycesavermitilis NEAU1069基因组上PCR扩增得到阿维菌素生物合成基因簇中编码aveF基因的同源重组左臂片段。
PCR反应的总体系为25μL,包括10×pfu Buffer 2.5μL,dNTP 2μL,Streptomycesavermitilis NEAU1069基因组DNA 1μL,引物aveF-F1和引物aveF-R1各2μL,pfu DNA聚合酶(5U/μL)2μL,DMSO 2.5μL,水6μL。反应条件为:98℃1min;98℃30s,56℃30s,72℃1min,30cycles;72℃10min。PCR产物上样电泳后,回收长度为1189bp的目的条带。回收目的片段经HindIII和XbaI酶切后,与经HindIII和XbaI酶切后的pMD19-T载体连接。连接产物转化大肠杆菌JM109,涂布在含氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB平板上于37℃过夜培养,挑取阳性单克隆,提取质粒,经酶切和测序验证,将测序正确的质粒命名为pER-5。
利用引物aveF-F2(SEQ ID NO.9,5′-GCTCTAGACGACCGTTTCCGCGGCCGCCTTTTC-3′,下划线为XbaI位点)和aveF-R2(SEQ ID NO.10,5′-CGGGATCCGCGTCGCGGAGATGCGGAAGGTGGTT-3′,下划线为BamHI位点)从Streptomycesavermitilis NEAU1069基因组上PCR扩增得到阿维菌素生物合成基因簇中编码aveF基因的同源重组右臂片段。
PCR反应的总体系为25μL,包括10×pfu Buffer 2.5μL,dNTP 2μL,Streptomycesavermitilis NEAU1069基因组DNA 1μL,引物aveF-F2和引物aveF-R2各2μL,pfu DNA聚合酶(5U/μL)2μL,DMSO 2.5μL,水6μL。反应条件为:98℃1min;98℃10s,60.6℃30s,72℃1.2min,30cycles;72℃10min。PCR产物上样电泳后,回收长度为1130bp的目的条带。回收目的片段经BamHI和XbaI酶切后,与经BamHI和XbaI酶切后的pER-5载体连接。连接产物转化大肠杆菌JM109,涂布在含氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)的LB平板上于37℃过夜培养,挑取阳性单克隆,提取质粒,经酶切和测序验证,将测序正确的质粒命名为pER-6。
将pER-6用HindIII和BamHI进行酶切,酶切产物上样电泳后,回收长度为2.3kb的目的条带。将回收片段与经HindIII和BamHI酶切的pKC1139进行连接。连接产物转化大肠杆菌JM109,涂布在含阿普拉霉素(终浓度50μg/ml)的LB平板上于37℃过夜培养,挑取阳 性单克隆,提取质粒,经酶切和测序验证,将测序正确的质粒命名为pER-aveF。中断质粒pER-aveF的构建过程见图4。
2、基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF的构建
将pER-aveF质粒转化大肠杆菌ET12567,在含有阿普拉霉素(50μg/mL)的LB平板(参考文献萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M],第二版,北京:科学出版社,1992)上筛选转化子ET12567/pER-aveF。将转化子ET12567/pER-aveF接种于2mLLB液体培养基(含氯霉素25μg/mL,卡那霉素25μg/mL,阿普拉霉素25μg/mL),37℃振荡培养过夜。次日以1:100(V/V)的接种量转接于新鲜的LB(含氯霉素25μg/mL,卡那霉素25μg/mL,阿普拉霉素25μg/mL)20mL,培养至OD600值0.4为佳。用50mL离心管离心去上清(HitachiCR21G,转子R20A2,10,000r/min,15min),10mL新鲜LB洗涤细胞两次,最后用0.1倍体积LB培养基(2mL)悬浮。刮取Streptomyces avermitilis Mil孢子制备浓度约为108个/mL的孢子悬液,离心后沉淀换用2×YT[2×YT培养基(g/L):胰蛋白胨16g,NaCl 5g,酵母提取物10g,pH7.0]培养基悬浮,取500μL于50℃水浴中热激10min。取500μL的ET12567/pER-aveF加入至500μL热激后的孢子悬液中,混合并轻摇。离心去除大部分上清,悬浮残余液体涂布MS平板(参考文献Kieser T,Bibb M.Practical Streptomyces Genetics[M].Norwich:The JohnInnes Foundation,2000),28℃倒置培养。16h后在平板上铺1mL含有0.5mg的萘啶酮酸及50μg阿普拉霉素的水溶液,液体被吸收后,继续于28℃倒置培养。挑取结合子单菌落于新鲜的MS平板上富集培养,该平板含有(1mg萘啶酮酸和50μg阿普拉霉素)/(mL培养基)。
选取较快长出孢子的上述所得的结合子进行温度诱导筛选及传代收集孢子,制备孢子悬液,以每培养皿约100个孢子涂布于MS平板(参考文献Kieser T,Bibb M.PracticalStreptomyces Genetics[M].Norwich:The John Innes Foundation,2000),该平板含有50μg阿普拉霉素/(mL培养基)的阿普拉霉素,28℃培养48h,观察有小菌落长出后转至39℃进行温度诱导。约7天后发现39℃培养下已长出大量的孢子。由于质粒pER-aveF含有pKC1139来源的温度敏感型复制子,在高于34℃不能独立复制,故在39℃生长的菌落应该是质粒进入菌体后通过与同源臂的交换整合入染色体的整合子。挑取整合子于无抗性的MS平板中28℃松弛培养,连续传代,促使其发生双交换。经连续传代培养后,挑取同一个单菌落分别在有抗性与无抗性的MS平板上培养,筛选在无抗性平板生长而在抗性平板上不生长的菌落即为发生双交换的克隆。
挑取10株以上筛选出的菌株,提取其基因组DNA进行PCR验证。上下游引物分别为v1(5'-GGGCCGAACTCTCGCTGTGCCGTGG-3')和v2(5'-CGCGCCGCTCACTCGGCCGGCAGAT-3')。PCR反应的总体系为25μL,包括10×pfu Buffer 2.5μL,dNTP 2μL,基因组DNA 1μL,引物v1和引物v2各2μL,pfu DNA聚合酶(5U/μL)2μL,DMSO 2.5μL,水6μL。PCR反应条件为:98℃1min;98℃10s,58℃30s,72℃3min,30cycles;72℃10min。
同源重组示意图如图5a所示。只有质粒整合到基因组上发生双交换后,以v1和v2为引物、基因工程菌的基因组为模板PCR扩增,才能得到理论上大小为2151bp的阳性条带,即获得阿维菌素生物合成基因簇中aveF基因被中断的基因工程菌Streptomycesavermitilis Mil-AveF,而以v1和v2为引物、aveF未被中断的工程菌Streptomycesavermitilis Mil基因组为模板PCR扩增,则会扩增出大小为2615bp的aveF全长编码基因(见图5b)。将从aveF被中断的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF中扩增出的2151bp测序,结果证实该片段缺失了aveF基因内部463bp的核苷酸碱基。
实施例3、基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil和Streptomycesavermitilis Mil-AveF的发酵及目标化合物的MS鉴定
分别挑取原始菌株Streptomyces avermitilis NEAU1069,基因工程菌株Streptomyces avermitilis Mil和Streptomyces avermitilis Mil-AveF,分别于高氏一号斜面28℃培养,培养6天后,接种于种子培养基(玉米淀粉30.0,酵母提取物5.0,大豆蛋白胨2.0,CoCl2·6H2O 0.01(g/1000mL),pH7.0),然后置于28℃,250r/min条件下培养42h。取2.0mL的种子培养液转接于25mL的发酵培养基(葡萄糖0.5%,玉米淀粉10%,蛋白胨1%,棉籽饼粉1%,NaCl 0.1%,K2HPO4 0.2%,MgSO4·7H2O 0.1%,CaCO3 0.7%,pH7.2)中,28℃,250r/min培养10天。在发酵的第24h和168h时,分别向发酵培养基中加入终浓度为100mg/L和60mg/L的环己烷羧酸。
发酵结束后,将发酵液与等体积的甲醇混合浸泡12h,离心后取上清液在45℃减压条件下浓缩至油状浸膏,然后加入等体积的乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液在减压条件下浓缩后加入等体积的甲醇,然后将所得甲醇浸泡液进行LC/MS分析。
仪器:Waters Acquity UPLCTM型高效液相色谱系统,Waters Xevo TQD质谱检测器;
色谱条件:采用Waters C18色谱柱(2.1×150mm,3.5μm),柱温40℃,流动相为甲醇:水=80:20,流速为0.6ml/min,检测波长为246nm,进样量为10μl;
质谱条件:电喷雾电离源(ESI),正离子检测器(ES+),电离电压为3.5KV,离子源温度为450℃,锥孔电压为35V,去溶剂气(N2)流量为900L/Hr;
LC/MS分析结果如图6和图7所示。基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil与原始菌株Streptomyces avermitilis NEAU1069在液相色谱谱图上多出的化合物组分经MS分析后,在MS谱图上给出了m/z为924([M+Na]+)的离子峰,计算其分子量分别为901(图6),比多拉菌素的分子量大2,依据工程菌Streptomyces avermitilis Mil的构建策略,可以确定该组分为22,23-双氢多拉菌素(化学结构见图1)。基因工程菌Streptomycesavermitilis Mil-AveF与Streptomyces avermitilis Mil在液相色谱谱图上多出的化合物组分经MS分析后,在MS谱图上给出了m/z为922([M+Na]+)的离子峰,计算其分子量分别为899(图7),比22,23-双氢多拉菌素的分子量小2,依据工程菌Streptomyces avermitilisMil-AveF的构建策略,可以确定该组分为5-酮基-22,23-双氢多拉菌素(化学结构见图1)。
Claims (10)
1.一种产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌的制备方法,其特征在于:以产多拉菌素的阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069为出发菌株,将阿维菌素聚酮合酶中AveDH2-KR2结构域的编码基因aveDH2-KR2替换为Streptomyces bingchengsis米尔贝霉素聚酮合酶中MilDH2-ER2-KR2结构域的编码基因milDH2-ER2-KR2,然后再将AveF的编码基因aveF中断后得到的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
a)构建milDH2-ER2-KR2基因替换质粒,其含有aveDH2-KR2基因同源重组左臂、milDH2-ER2-KR2基因和aveDH2-KR2基因同源重组右臂;
b)将步骤a)所得的milDH2-ER2-KR2基因替换质粒转化宿主细胞,获得转化子;
c)将阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069作为受体,与步骤b)所述的转化子进行接合转移,挑取同源重组双交换子,即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil;
d)构建aveF基因中断质粒,其含有aveF基因同源重组左臂和aveF基因同源重组右臂;
e)将步骤d)所得的aveF基因中断质粒转化宿主细胞,获得转化子;
f)将步骤c)得到的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil作为受体,与步骤e)所述的转化子进行接合转移,挑取同源重组双交换子,即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换和aveF基因被中断的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a)中的aveDH2-KR2基因同源重组左臂片段的构建引物a1核苷酸序列如SEQ ID NO.1,引物a2核苷酸序列如SEQ IDNO.2。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a)中的milDH2-ER2-KR2基因的引物b1核苷酸序列如SEQ ID NO.3,引物b2核苷酸序列如SEQ ID NO.4。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a)中的aveDH2-KR2基因同源重组右臂片段的构建引物c1核苷酸序列如SEQ ID NO.5,引物c2核苷酸序列如SEQ IDNO.6。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤d)中aveF基因同源重组左臂片段的构建引物aveF-F1核苷酸序列如SEQ ID NO.7,引物aveF-R1核苷酸序列如SEQ IDNO.8;aveF基因同源重组右臂片段的构建引物aveF-F2核苷酸序列如SEQ ID NO.9,引物aveF-R2核苷酸序列如SEQ ID NO.10。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:步骤b)和步骤e)中所述宿主细胞为大肠杆菌ET12567。
8.一种权利要求1-7任一所述方法制备的产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌。
9.一种权利要求1-7任一所述的制备方法制备的基因工程菌在发酵生产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,具体步骤如下:
a)构建milDH2-ER2-KR2基因替换质粒,其含有aveDH2-KR2基因同源重组左臂、milDH2-ER2-KR2和aveDH2-KR2基因同源重组右臂;
b)将步骤a)所得的milDH2-ER2-KR2基因替换质粒转化宿主细胞,获得转化子;
c)将阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069作为受体,与步骤b)所述的转化子进行接合转移,挑取同源重组双交换子,即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil;
d)构建aveF基因中断质粒,其含有aveF基因同源重组左臂和aveF基因同源重组右臂;
e)将步骤d)所得的aveF基因中断质粒转化宿主细胞,获得转化子;
f)将步骤c)得到的Streptomyces avermitilis Mil作为受体,与步骤e)所述的转化子进行接合转移,挑取同源重组双交换子,即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换和aveF基因被中断的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF;
g)以Streptomyces avermitilis Mil-AveF发酵生产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素。
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