CN1687403A - 产伊维菌素的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产伊维菌素的工程菌及其构建方法与应用，其目的是涉及一种产伊维菌素的工程菌及其构建方法与其在生产伊维菌素中的应用。该工程菌是将阿维链霉菌的阿维菌素聚酮合酶DH2－KR2结构域的编码基因替换为聚酮合酶DH－ER－KR结构域编码基因得到的重组菌。本发明的基因工程菌可直接用于伊维菌素的发酵生产，并可避免复杂的分离提纯阿维菌素B1和将阿维菌素B1化学还原成伊维菌素的工艺，同时不必再从发酵液中除去有毒的寡霉素，使生产成本大幅降低。

Description

产伊维菌素的工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵及基因工程领域的一种产伊维菌素的工程菌及其构建方法与应用，特别是涉及一种产伊维菌素的工程菌及其构建方法与其在生产伊维菌素中的应用。

背景技术

伊维菌素(ivermectins)，又称C-22，23双氢阿维菌素B1，是迄今为止发现的最有效、应用最广泛的杀虫抗生素。它是阿维菌素(avermectins)B1在C-22，23位上用化学方法加氢还原的产物(其中C-22，23双氢阿维菌素B1a的含量大于80％，而C-22，23双氢阿维菌素B1b的含量小于20％)。与传统的化学杀虫剂相比，阿维菌素和伊维菌素具有广谱、高效、安全、无残留、无副作用的特点，且不易产生耐药性，与其它杀虫剂无交叉抗性，在医药、农业和畜牧业生产上均具有良好的应用价值和广阔的市场前景。

阿维菌素是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵时产生的一组结构相似的物质。它们属于十六元环大环内酯类抗生素，并表现出高效、低毒、广谱的杀线虫和节肢动物类寄生虫的活性。这类物质的结构通式如下(式1)：

在位置C-22和C-23之间的键表示单键或双键。当表示单键时，Y可以是氢或羟基，当为双键时Y仅表示氢。R₁可以是甲氧基或羟基，R₂是异丙基或仲丁基。为表示上述结构变化的特性，已分离出来的天然物质的名称如表1所示：

表1从阿维链霉菌发酵产物中分离的具有式1结构通式的天然物质

		R1	R2	Y
					阿维菌素	A1a	甲氧基	仲丁基	22，23双键
	A1b	甲氧基	异丙基	22，23双键
						A2a	甲氧基	仲丁基	羟基
	A2b	甲氧基	异丙基	羟基
						B1a	羟基	仲丁基	22，23双键
	B1b	羟基	异丙基	22，23双键
						B2a	羟基	仲丁基	羟基
	B2b	羟基	异丙基	羟基
					伊维菌素	B1a	羟基	仲丁基5	22，23单键，氢
	B1b	羟基	异丙基3X	22，23单键，氢

与阿维菌素相比，伊维菌素具有相同的杀虫活性，但毒性低2-3倍，更安全，主要制备成针剂用于防治家畜的各种体内、外寄生虫病(吸虫和绦虫除外)和治疗人体盘尾丝虫病。阿维链霉菌只合成阿维菌素，不能合成伊维菌素。迄今为止，国内外报道的伊维菌素生产均是用化学法对阿维菌素B1进行加氢选择性还原得到的。化学法半合成伊维菌素需要从阿维链霉菌的发酵液中分离、提纯阿维菌素B1和将阿维菌素B1还原成伊维菌素的工艺，由于阿维菌素B1在C-22，23位双键的选择性还原需要昂贵的氯化铑做催化剂，因此生产成本很高，仅还原一项，生产每公斤伊维菌素的成本就高达1000元左右。此外，阿维链霉菌除了产生阿维菌素外，还产生寡霉素(oligomycin)。而寡霉素是哺乳动物细胞氧化磷酸化的抑制剂，毒性很高，因此必须再通过分离提纯把它从发酵液中除去。

Ikeda等利用同位素标记前体结合分析突变株积累中间产物的策略，已基本阐明阿维菌素生物合成的全过程，并于1999年完成了阿维菌素生物合成基因簇的序列和功能分析(Ikeda H，Nonomiya T，Usami M，et al.Organization of the biosyntheticgene cluster for the polyketide anthelmintic macrolide avermectin inStreptomyces avermitilis.Proc Natl Acad Sci USA.1999，96(17)：9509-9514.)。阿维菌素的生物合成可分为3个阶段：(1)首先在阿维菌素聚酮合酶(AVES)的作用下形成起始糖苷配基6，8a-闭联-6，8a-脱氧-5-氧阿维菌素糖苷配基(6，8a-seco-6，8a-deoxy-5-oxoavermectin aglycons)；(2)起始糖苷配基经过一系列的修饰产生阿维菌素糖苷配基；(3)阿维菌素糖苷配基由脱氧胸苷二磷酸(dTDP)-齐墩果糖在C13和C4′位进行O-糖基化形成阿维菌素。阿维菌素的起始糖苷配基是通过在起始单位(2-甲基丁酸或异丁酸)上按P-A-A-A-A-P-P-A-P-A-P-A(P代表丙酸盐，A代表乙酸盐)的顺序添加12个延伸单位缩合而成，整个过程由阿维菌素聚酮合酶催化完成。

阿维菌素的生物合成基因簇结构示意图如图1所示，该基因簇全长82kb，共有18个开放阅读框架。基因簇内部的60kb片段含有4个大的开放阅读框架，因转录方向相反被分成两组：aveA1-aveA2和aveA3-aveA4，它们分别编码4个多功能蛋白AVES1，AVES2，AVES3和AVES4，共同组成阿维菌素聚酮合酶。该聚酮合酶由12个模块组成，含有55个活性位点。模块1、4、5和10中的酶域相同，都由酮酯酰基合酶(ketosynthase，KS)、酰基转移酶(acyl transferase，AT)、酰基载体蛋白(acyl carrier protein，ACP)和酮基还原酶(ketoreductase，KR)组成；模块3和11中只有KS、AT、ACP；模块2、6、7、8、9和12中除KS、AT、KR、ACP外，还有脱水酶(dehydratase，DH)结构域，但模块7中的DH和模块10中的KR是没有活性的。模块2中的DH在脱水酶共有的活性位点HxxxGxxxxP有一个错配的氨基酸(P突变为S)，似乎只有部分活性。在所有的模块中都没有烯基还原酶(enoyl reductase，ER)结构域，这与阿维菌素糖苷配基中没有完全饱和的β-碳链是对应的。与红霉素聚酮合酶相同，在AVES1的N端也有一个负载域，包括两个活性位点AT和ACP，在AVES4的C端有一个硫酯酶(thioesterase，TE)域。每个模块负责一步掺入前体如乙酸或丙酸的聚合反应及β-酮基的还原，最后所形成的聚酮在TE的作用下从聚酮合酶(PKS)上释放出来成环内酯化。阿维菌素PKS的基因结构及其产物预测示意图如图2所示。

起始糖苷配基合成后要经过一系列的修饰才能形成阿维菌素糖苷配基，包括呋喃环的闭合，C-5位酮基的还原和甲基化。C-6和C-8a间呋喃环的闭合是由aveE编码的细胞色素P450羟化酶催化完成。aveC基因编码的AveC的功能目前仍不清楚，aveC基因突变株仅产阿维菌素“2”组分(C-22，23位为CH₂-CHOH)，但AveC的氨基酸序列与PKS或脂肪酸合酶(FAS)中的脱水酶的氨基酸序列之间没有同源性。C-5位的酮基还原是由aveF编码的C5-酮基还原酶催化的。aveD编码C5-O-甲基转移酶，该基因负责将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到阿维菌素“B”组分的C-5位羟基上而形成阿维菌素“A”组分。aveB(aveBI-aveBVIII)是一套涉及合成和转移齐墩果二糖的基因，aveR是阿维菌素生物合成全基因簇的正调控基因。

在伊维菌素的生产过程中，一个重要的瓶颈就是阿维菌素B1的C-22，23位双键的选择性还原。阿维菌素的大环内酯结构属于聚酮体，聚酮体中β-酮基的还原程度通常取决于相应模块中酶域的组成，要使β-酮基还原成亚甲基需要所有的还原酶域：首先由KR催化β-酮基还原成羟基；接着由DH催化羟基形成甲烯基；最后在ER的作用下将双键还原成饱和烃键。根据聚酮体合成反应步骤与其PKS基因结构之间的一一对应关系，阿维菌素C-22，23位的还原程度由AVES1模块2上的还原酶域DH和KR(DH2-KR2)决定，KR2将C-23位的β-酮基还原成羟基后，在DH2的作用下脱水形成双键，最后的产物即为B1组分；如果DH不起作用，则最终形成的产物C-23位保持羟基即为B2组分，因此推测阿维菌素B1组分和B2组分的共存可能是由于DH2的不完全活性造成。对阿维菌素PKS的结构域进行氨基酸序列分析，分析结果表明模块2含有一个完全活性的KR和一个不完全活性的DH，DH2在脱水酶共有的活性位点HxxxGxxxxP中有一个氨基酸发生改变(P变为S)，这可能导致了DH2只有部分活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种产伊维菌素的工程菌及其构建方法。

本发明所提供的产伊维菌素的工程菌，是将阿维链霉菌的阿维菌素聚酮合酶DH2-KR2结构域的编码基因替换为聚酮合酶DH-ER-KR结构域编码基因得到的重组菌。

所述聚酮合酶DH-ER-KR结构域编码基因来自于能合成I型聚酮合酶的链霉菌，且该聚酮合酶含有完整的β-酮基还原酶域(包含DH、ER和KR结构域)，如委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)的苦霉素(pikromycin)PKS、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的红霉素(erythromycin)PKS、阿维链霉菌的寡霉素PKS、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的雷帕霉素(rapamycin)PKS、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的泰勒菌素(tylosin)PKS、Streptomycescaelestis的niddamycin PKS、抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)的竹桃霉素(oleandomycin)PKS，优选为委内瑞拉链霉菌(ATCC 15493)的苦霉素PKS。

本发明的第二个目的是提供一种上述产伊维菌素的工程菌的构建方法。

本发明所提供的产伊维菌素的工程菌的构建方法，是构建含有阿维链霉菌的阿维菌素聚酮合酶DH2-KR2结构域编码基因的5’端和3’端旁侧序列和聚酮合酶DH-ER-KR结构域编码基因的基因取代载体，将基因取代载体转化阿维链霉菌，得到含有基因取代载体的阿维链霉菌的转化子，转化子经高温诱导得到单交换突变株，再将单交换突变株经传代后获得发生了同源双交换的重组阿维链霉菌；所述基因取代载体中阿维菌素聚酮合酶DH2-KR2结构域编码基因的5’端旁侧序列、聚酮合酶DH-ER-KR结构域编码基因和阿维菌素聚酮合酶DH2-KR2结构域编码基因的3’端旁侧序列按上述顺序且以相同方向顺次连接。

用于构建基因取代载体的出发载体可为任意一种大肠杆菌-链霉素穿梭载体，如pKC1139、pKC505、pIJ653、pIJ8154，优选为pKC1139。

以pKC1139为出发载体构建的基因取代载体为pXL211。

将基因取代载体转化阿维链霉菌的方法优选为PEG介导的原生质体转化法，为提高转化效率，可先用提自大肠杆菌的取代载体转化弱限制修饰作用的变铅青链霉菌TK54的原生质体，然后从中提取质粒再转化阿维链霉菌的原生质体；但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如热激法、电转化法、接合转化法等。

对转化子进行高温诱导的条件为将转化子涂布于含8-12μg/mL安普霉素的YMS平板上，在34-39℃下培养7-10天。

将单交换突变株进行传代的培养基为无抗生素的YMS培养基。

一种伊维菌素的生产方法，是发酵上述重组阿维链霉菌得到伊维菌素。

本发明将不产寡霉素只产阿维菌素B的阿维链霉菌的阿维菌素聚酮合酶(PKS)中不完全活性的DH2结构域用来自于其它I型PKS中完全活性的DH和ER取代，在阿维菌素聚酮体合成过程中，C-22，23位的CH₂-CHOH在完全活性的DH和ER作用下还原成饱和烃键，则最终产物将是C-22，23双氢阿维菌素B1(即伊维菌素)。本发明构建的重组阿维链霉菌基因工程菌可直接用于伊维菌素的发酵生产，且不再产生有毒的寡霉素，从而免去复杂的分离提纯阿维菌素B1和将阿维菌素B1化学还原成伊维菌素的工艺，在保证产品的质量和安全性的前提下，使生产成本大幅降低。

附图说明

图1为阿维菌素生物合成基因簇结构示意图

图2为阿维菌素PKS的基因结构及其产物预测示意图

图3为基因取代载体pXL211的构建流程图

图4为取代载体pXL211与阿维链霉菌Olm73-12染色体的同源双交换示意图

图5A为阿维链霉菌Olm73-12发酵产物的HPLC分析图谱

图5B为取代突变株Ive12-4发酵产物的HPLC分析图谱

图6A为取代突变株Ive14-5发酵产物的LC/MS分析色谱图(正离子流图)

图6B为取代突变株Ive14-5发酵产物的LC/MS分析质谱图(ES+)

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、产伊维菌素菌株的获得

一、PCR扩增aveDH2-KR2两侧的5’-flanking和3’-flanking DNA片段以及pikDH4-ER4-KR4片段

1、引物设计

根据阿维链霉菌的阿维菌素PKS中DH2-KR2结构域编码区的DNA序列，设计二对引物分别用于合成AVES1(GenBank号：AB032367)中DH2-KR2结构域的编码区域(用“aveDH2-KR2”表示)两侧的DNA片段，分别命名为5’-flanking DNA片段和3’-flanking DNA片段，引物序列如下：

用于扩增长度为1.22kb的aveDH2-KR2的5’-flanking DNA片段的引物序列：

Primer 1(正向引物)：5′-ATA AGATCTGACCTCGCGGATGTCGGATAC-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Bgl II识别位点)

Primer 2(反向引物)：5′-ATA ACGCGTAGGTGGGGAGGTCGAGGTG-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Mlu I识别位点)

用于扩增长度为1.36kb的aveDH2-KR2的3’-flanking DNA片段的引物序列：

Primer 3(正向引物)：5′-ATA ATGCATTGGCCCTCTTCGATGCGG-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Nsi I识别位点)

Primer 4(反向引物)：5′-TAT AAGCTTGATAGTGATCGCAGGGCCTTCG-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)

根据委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae，保藏号：ATCC 15439)的苦霉素(pikromycin)PKS中DH4-ER4-KR4结构域编码区的DNA序列(GeneBank号：AF079138，以下用“pikDH4-ER4-KR4”表示)设计一对引物，引物序列如下：用于扩增长度为3.27kb的pikDH4-ER4-KR4片段的引物序列：

Primer 5(正向引物)：5’-ATA ACGCGTTCCAGACCGAGCGCTACTGG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Mlu I识别位点)

Primer 6(反向引物)：5’-ATA ATGCATCCTCGCTGTCCATGGGCGTC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nsi I识别位点)

2、PCR扩增aveDH2-KR2两侧的5’-flanking和3’-flanking DNA片段以及pikDH4-ER4-KR4片段

以不产寡霉素而仅产阿维菌素B的阿维链霉菌Olm73-12(构建方法参考文献“Zhang XiaoLin，Chen Zhi，Zhao JinLei，et al.Deletion analysis of oligomycinPKS genes(olmA)in Streptomyces avermitilis.Chinese Science Bulletin.2004，49(4)：350-354.”)的基因组DNA为模板，分别在引物对1(Primer 1和Primer 2)和引物对2(Primer 3和Primer 4)的引导下，用Stratagene公司的pfuUltra DNA聚合酶PCR扩增aveDH2-KR2两侧的5’-flanking和3’-flanking DNA片段。PCR扩增条件为：先95℃ 5分钟；再96℃ 1分钟，65℃ 30秒，72℃ 1分钟，共25个循环；最后72℃ 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，分别在1.22kb和1.36kb处出现一条预期的特异性条带，将1.22kb和1.36kb的目的条带回收后，分别与载体pMD18-T(TaKaRa公司)进行连接，将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，在含有40μL(20mg/mL)X-Gal、4μL(200mg/mL)IPTG和100μg/mL安普霉素的LB平板(胰蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂20g，加蒸馏水至1L，调pH至7.2)上37℃培养12-20小时，挑取白色单菌落，提取质粒后用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行酶切验证，选取外源片段插入方向与lacZα方向相同的重组质粒，将含有长度为1.22kb外源片段的重组质粒命名为pXL5’flank，将含有长度为1.36kb外源片段的重组质粒命名为pXL3’flank。

以委内瑞拉链霉菌(ATCC 15439)的基因组DNA为模板，用Stratagene公司产的pfuUltra DNA聚合酶，在引物对3(Primer5和Primer 6)的引导下，PCR扩增，PCR扩增条件为：先95℃ 5分钟；再96℃ 1分钟，67℃ 30秒，72℃ 3分钟，共25个循环；最后72℃ 10分钟。反应结束后，对PCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，在3.27kb处出现一条预期的特异性条带，将该目的条带回收后，与载体pMD18-T(TaKaRa公司)进行连接，用上述同样方法进行筛选和酶切验证后得到外源片段插入方向与lacZα方向相同的正确的重组质粒，命名为pXLpikAII。

分别对上述pXL5’flank，pXL3’flank和pXLpikAII三个质粒进行测序，测序结果表明所扩增的5’-flanking和3’-flanking DNA片段以及pikDH4-ER4-KR4片段与报道的序列完全相同，可进行下述基因取代载体的构建。

二、基因取代载体pXL211的构建

基因取代载体pXL211的构建流程如图3所示，具体方法为：用限制性内切酶HindIII和Nsi I双酶切步骤1获得的质粒pXL3’flank，对酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收1.36kb的3’-flanking DNA片段，并将其克隆到经同样酶双酶切的质粒pXLpikAII中，得到一新的重组质粒载体，命名为pXLpikAII/3’flank。对质粒pXL5’flank用限制性内切酶Mlu I和BglII进行双酶切，对酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收1.22kb的5’-flanking DNA片段，并将其与经限制性内切酶Mlu I和BamH I双酶切的质粒载体pXLpikAII/3’flank连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子，提取质粒用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行酶切验证，可得到2.69kp和5.85kp的酶切片段的为构建正确的重组质粒，命名为pXL5’flank/pikAII/3’flank。在pXL5’flank/pikAII/3’flank中5’-flankDNA、pikDH4-ER4-KR4和3’-flank DNA片段被以相同的方向顺次连接起来。然后用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切质粒pXL5’flank/pikAII/3’flank，对酶切产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，回收5.85kb的目的片段，将其与经同样酶双酶切的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139(Bierman M，Logan R，O’Brien K，et al.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Esherichia colito Streptomyces spp.Gene，1992，116：43-49.)连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，挑取白色单菌落提取质粒，用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行酶切验证，可得到6.5kp和5.85kp酶切片段的为可用于双交换的基因取代载体，命名为pXL211(pKC1139::5’flank+pikDH4-ER4-KR4+3’flank)。

三、阿维链霉菌基因取代突变株的获得

1、将基因取代载体pXL211转化阿维链霉菌

原生质体再生培养基R2YE的配制：蔗糖103g，K₂SO₄ 0.25g，MgCl₂·6H₂O 10.12g，葡萄糖10g，酪蛋白氨基酸0.1g，酵母膏5g，加蒸馏水至800mL，称2g琼脂粉放入250mL三角瓶中，加入80mL上述溶液，115℃灭菌20分钟；使用前将培养基融化后，在每瓶中加入已灭菌的下述溶液：KH₂PO₄(0.5％)1mL，CaCl₂·2H₂O(3.68％)8mL，L-proline(20％)1.5mL，TES缓冲液(5.73％，pH7.2)10mL，微量元素溶液*0.2mL，NaOH(1N)(无需灭菌)0.5mL；*微量元素溶液(1L)：ZnCl₂ 40mg，FeCl₃·6H₂O 200mg，CuCl₂·2H₂O 10mg，MnCl₂·4H₂O 10mg，Na₂B₄O₇·10H₂O 10mg，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 10mg)。

为提高转化效率，可先用提自大肠杆菌的穿梭质粒转化弱限制修饰作用的变铅青链霉菌TK54(Kieser T，Bibb MJ，Butter MJ，Chater KF，Hopwood DA.2000.PracticalStreptomyces Genetics.Norwich UK：The John Innes Foundation)的原生质体，然后从中提取质粒转化阿维链霉菌，则转化效率至少可提高10倍。具体方法为：先用上述获得的质粒pXL211转化变铅青链霉菌TK54的原生质体，在原生质体再生培养基R2YE平板上30℃培养14小时后，将1mL含3000μg安普霉素的水溶液涂布于平板上，继续培养7天后，挑取转化子，提取质粒，用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行酶切验证，可得到6.5kp和5.85kp酶切片段的证明为阳性克隆。

再用提自变铅青链霉菌的质粒pXL211转化阿维链霉菌Olm73-12的原生质体，涂于已吹干的原生质体再生培养基RM14(用0.1M的MES缓冲液(pH6.5)代替5.73％的TES缓冲液，蔗糖浓度为20％，其它成分同R2YE培养基)平板上，于28℃培养16-18小时后，将1mL含1500μg安普霉素的水溶液涂布于平板上，继续培养10天，长出的菌落即为含有质粒pXL211的转化子。

阿维链霉菌Olm73-12在RM14再生培养基上不产孢，需挑取转化子在阿维链霉菌固体产孢培养基YMS(酵母膏4g，可溶性淀粉4g，麦芽膏10g，CoCl₂·6H₂O 5mg，琼脂20g，加蒸馏水至1L，调pH至7.2)平板上培养以恢复产孢。随机挑取8个转化子接种于含10μg/mL安普霉素的YMS培养基上，28℃培养7天后，均长出成熟的灰色孢子。将长好的孢子接于含5μg/mL安普霉素的改良YEME培养基(蔗糖200g或250g，葡萄糖10g，酵母膏3g，细菌蛋白胨5g，麦芽膏3g，加蒸馏水至1L，115℃灭菌20min；灭菌后每L培养基中加入2mL 2.5M的MgCl₂；制备原生质体时，还需加甘氨酸至终浓度为0.5％)中，28℃振荡培养48小时后，提取质粒，用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行酶切验证，可得到6.5kp和5.85kp的酶切片段，与步骤二的质粒pXL211的酶切验证结果完全相同，表明质粒载体pXL211在阿维链霉菌Olm73-12中可稳定自我复制，未发生进一步的重组。

2、阿维链霉菌基因取代突变株的获得

分别收集步骤1获得的8个经酶切验证正确的转化有基因取代载体pXL211的阿维链霉菌Olm73-12转化子的孢子，制成孢子悬液，以每培养皿约100个孢子的量涂布于含有10μg/mL安普霉素的YMS平板上，置于28℃培养72小时，当菌落长到直径约2mm左右，即将形成气生菌丝时，将平板移至39℃培养7天进行高温诱导质粒消除，一些菌落上出现扇形生长，这些抗安普霉素的菌落即为单交换突变株(取代载体被整合到宿主菌的染色体上)。这是因为pKC1139为温敏型的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，当温度高于34℃时不能自我复制，因此在含有安普霉素的YMS培养基上无法生长；只有当重组质粒pXL211所携带的5’-flanking DNA片段或3’-flanking DNA片段与阿维链霉菌Olm73-12染色体上的同源区段发生同源重组，并通过单交换整合到染色体上的菌株才能表达安普霉素的抗性基因，从而在含有安普霉素的YMS培养基上生长。将在39℃下长出的抗安普霉素的单交换突变株在不添加抗生素的YMS平板上传代，共转接4次后，筛选安普霉素敏感的双交换重组体(双交换示意图如图4所示)。挑取其中8株菌，与阿维链霉菌Olm73-12一起在改良YEME培养基中28℃振荡培养48小时，均未能从中提取出质粒，表明重组质粒pXL211已被消除。单交换突变株经无抗YMS平板传代后筛选到的安普霉素敏感的菌株可能是已发生了双交换的阿维链霉菌取代突变株，也可能是取代载体又被从染色体上全部切除而发生了回复突变的菌株，因此还需进一步验证。

3、取代突变株的PCR验证

提取8株突变株的总DNA，用引物对3(Primer5和Primer 6)可扩增出3.27kbDNA片段的可能为发生了双交换的阿维链霉菌基因取代突变株。

为了进一步验证pikDH4-ER4-KR4在阿维链霉菌突变株染色体上发生取代的位置是否正确，根据取代区域aveDH2-KR2两侧序列设计引物(Primer 7和Primer 8)扩增自取代区域起始位点上游51bp至结束位点下游455bp的DNA片段。出发菌株Olm73-12的扩增产物应为2.82kb，而取代突变株的扩增产物应为3.78kb。

Primer 7(正向引物)：5’-ACCCACCACGACAACCAACCC-3’(距置换区域起始位点上游51bp)

Primer 8(反向引物)：5’-ACAGCGTTGTCCGGTTGTGGC-3’(距置换区域结束位点下游455bp)

以突变株的总DNA为模板，用引物对4(Primer7和Primer 8)扩增出3.78kb DNA片段的突变株可能为正确的取代突变株。选取3个可扩出3.78kbDNA片段的突变株，将3.78kbDNA片段回收后，连于载体pMD18-T上进行测序，结果表明该片段的序列与已知序列相同，没有发生突变或重组，表明在这3个突变株的染色体上已经发生了正确的基因取代，取代区域两侧的序列也没有发生改变。

四、阿维链霉菌基因取代突变株发酵产物的HPLC分析

1、阿维链霉菌基因取代突变株的摇瓶发酵

种子培养基：可溶性淀粉30g，麦芽膏2g，大豆蛋白胨2g，CoCl₂·6H₂O 5mg，加蒸馏水至1L，调pH至7.0-7.2。

发酵培养基：可溶性淀粉50g，酵母粉12g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，KCl 4g；CaCO₃ 2g，CoCl₂·6H₂O 5mg，加蒸馏水至1L，调pH至7.0-7.2。

将步骤三获得的发生了双交换的阿维链霉菌基因取代突变株与出发菌株阿维链霉菌Olm73-12(对照)进行摇瓶发酵。发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于YMS培养基上，28℃培养7-10天，待长出丰富的灰色孢子后接种于种子培养基(装量为100mL/500mL三角瓶)中，28℃摇床培养24小时(转速180rpm，偏心距4.0cm)。按5％接种量接种于发酵培养基(装量均为100mL/500mL三角瓶)中，28℃培养8-10天(转速180rpm，偏心距4.0cm)，放瓶，用HPLC法筛选产伊维菌素的基因工程菌株。

2、发酵产物的HPLC分析

1)样品处理：取1.0mL发酵液，加入4.0mL甲醇，浸泡30分钟以上，每隔10分钟振荡一次，4000g离心10分钟，取上清液进样分析；

2)HPLC分析条件：C₁₈反相柱，柱长150mm，柱内径4.6mm，柱温40℃，流动相为甲醇-水(85∶15)，流速1.0mL/min，进样体积10μL，波长为246nm，仪器为Waters^TM600高效液相色谱仪；

3)标准品：阿维菌素B1标准品(含97％的阿维菌素B1a和3％的阿维菌素B1b)和伊维菌素均购自山东齐发药业有限公司。将它们分别用甲醇配成浓度为100μg/mL的溶液。

HPLC分析结果如图5A和图5B所示，出发菌株阿维链霉菌Olm73-12产生阿维菌素B的4个组分，即B1a，B1b，B2a和B2b，阿维菌素的总产量为1537μg/mL，其中B1的产量为740μg/mL；发生了双交换的阿维链霉菌基因取代突变株中，除了产生阿维菌素B1a和B2a，还产生了一个新组分(Ive)，其保留时间和峰型与C22，23双氢阿维菌素B1a(伊维菌素B1a)标准品的一致，初步推测该组分有可能是伊维菌素B1a，伊维菌素B1a的产量很低，大约为1-4μg/mL，阿维菌素B1a和B2a的产量同样也很低，仅为出发菌株的0.5-2％。将3株产伊维菌素的基因工程菌分别命名为Ive12-4，Ive14-1和Ive14-5。

五、产伊维菌素的基因工程菌株发酵产物的LC/MS分析

将阿维链霉菌基因工程菌株的发酵液用等体积的甲醇浸泡30分钟，每隔10分钟振荡一次，离心后，取上清夜与伊维菌素标准品一起进行LC/MS分析。

仪器：Waters 2690型高效液相色谱系统，Waters micromass ZQ2000质谱检测器；

色谱条件：采用Waters C₁₈色谱柱(2.1×150mm，3.5μm)，柱温40℃，流动相为乙腈∶甲醇∶水＝62∶18∶20，流速为0.2mL/min，检测波长为246nm，进样量为20μL；

质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，正离子检测(ES⁺)，电离电压为3.0KV，离子源温度为110℃，锥孔电压为55V-35V同时采集，去溶剂气(N₂)流量为310L/Hr；

标准品：伊维菌素标准品(购自山东齐发药业有限公司，含有质量百分含量大于95％的C-22，23双氢阿维菌素B1a和小于5％的C-22，23双氢阿维菌素B1b)，用甲醇配成浓度为1μg/mL的溶液。

LC/MS分析结果如图6A和图6B(由上至下锥孔电压(Cone voltage)依次为55V，45V，35V，25V)所示，表明Ive14-5发酵产物中有一个组分(组分I)的保留时间(21.51min)与伊维菌素B1a标准品(21.25min)的相同(图6A)，该组分所对应的正离子质谱图给出了m/z为897([M+Na]⁺)的离子峰，与伊维菌素B1a标准品的m/z相同，所以该组分的分子量为874，与计算值和文献报道的伊维菌素B1a的分子量一致。此外，在图6B中还可以看到m/z为569，551，307的碎片离子峰，在不同的锥孔电压下Ive14-5中组分I的碎片峰与伊维菌素B1a标准品的保持一致，因此可以确定Ive14-5发酵产物中的组分I为伊维菌素B1a。

六、产伊维菌素基因工程菌株的稳定性考察

将阿维链霉菌基因工程菌株Ive14-1，Ive14-5和Ive12-4分别在无抗YMS平板上连续转接5次后，用HPLC法检测发酵产物，工程菌Ive14-1，Ive14-5，Ive12-4仍然产生伊维菌素B1a，阿维菌素B1a和B2a组分，发酵单位也未发生变化，表明这3个基因工程菌株在遗传上是稳定的。

Claims (10)

1、一种产伊维菌素的工程菌，是将阿维链霉菌的阿维菌素聚酮合酶DH2-KR2结构域的编码基因替换为聚酮合酶DH-ER-KR结构域编码基因得到的重组菌。

2、根据权利要求1所述的产伊维菌素的工程菌，其特征在于：所述聚酮合酶DH-ER-KR结构域编码基因来自于委内瑞拉链霉菌、红色糖多孢菌、阿维链霉菌、吸水链霉菌、弗氏链霉菌、Streptomyces caelestis或抗生链霉菌。

3、根据权利要求2所述的产伊维菌素的工程菌，其特征在于：所述链霉菌为委内瑞拉链霉菌ATCC 15493。

4、一种权利要求1或2或3所述的产伊维菌素的工程菌的构建方法，是构建含有阿维链霉菌的阿维菌素聚酮合酶DH2-KR2结构域编码基因的5’端和3’端旁侧序列和聚酮合酶DH-ER-KR结构域编码基因的基因取代载体，将基因取代载体转化阿维链霉菌，得到含有基因取代载体的阿维链霉菌的转化子，转化子经高温诱导得到单交换突变株，再将单交换突变株经传代后，得到发生了同源双交换的重组阿维链霉菌；所述基因取代载体中阿维菌素聚酮合酶DH2-KR2结构域编码基因的5’端旁侧序列、聚酮合酶DH-ER-KR结构域编码基因和阿维菌素聚酮合酶DH2-KR2结构域编码基因的3’端旁侧序列按上述顺序且以相同方向顺次连接。

5、根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述用于构建基因取代载体的出发载体为大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139、pKC505、pIJ653或pIJ8154。

6、根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述用于构建基因取代载体的出发载体为pKC1139。

7、根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述基因取代载体为pXL211。

8、根据权利要求4或5或6或7所述的构建方法，其特征在于：所述将基因取代载体转化阿维链霉菌的方法为PEG介导的原生质体转化法。

9、根据权利要求4或5或6或7所述的构建方法，其特征在于：所述对转化子进行高温诱导挑选单交换突变株的条件为将转化子涂布于含8-12μg/mL安普霉素的YMS平板上，在34-39℃下培养7-10天；将单交换突变株进行传代的培养基为无抗生素的YMS培养基。

10、一种伊维菌素的生产方法，是发酵权利要求1或2或3所述的重组阿维链霉菌得到伊维菌素。

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