CN1316002A - 聚酮化合物、其制备和其中所用的材料 - Google Patents
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Abstract
提供核酸分子,该核酸分子编码Ⅰ型聚酮化合物合酶的至少一部分并具有一个含多个限制酶切位点的多接头来取代编码与还原相关的酶的一个或多个基因,任选地还包括掺入所述多接头中的核酸,所述其它核酸编码一种或多种还原酶;提供掺入这种核酸的质粒、用这类质粒转染的宿主细胞;与其相关的方法。
Description
本发明涉及聚酮化合物、其制备和其中所用的材料。
聚酮化合物是一大类结构多样的天然产物,包括具有抗生素特性或其它药理学特性的许多化合物,诸如红霉素、四环素、雷帕霉素、除虫菌素、聚醚实电解质和FK506。
特别是,链霉菌属(Streptomyces)细菌和相关的放线菌大量产生聚酮化合物。通过以类似于脂肪酸生物合成的方式重复分步缩合酰基硫酯,合成聚酮化合物。由于选择(通常的)乙酸酯或丙酸酯作为“起子”单位或“延伸”单位,以及在每次缩合后观察到的β-酮基的不同加工程度,因而导致了在天然聚酮化合物发现的更大的结构多样性。加工步骤的实例包括还原为β-羟酰基-、还原后脱水为2-烯酰-、以及完全还原为饱和酰基硫酯。这些加工步骤的立体化学结果对于每个链延伸循环也是特化的。
聚酮化合物的生物合成由一组称为聚酮化合物合酶(PKS)的链形成酶引发。对于放线菌已经描述了两类聚酮化合物合酶。然而,为本发明主题的新的聚酮化合物和方法主要涉及Ⅰ型PKS,其代表为大环内酯红霉素、雷帕霉素和除虫菌素的PKS。Ⅰ型PKS含有一组或一个“组件(module)”聚酮化合物链延伸的每个循环的不同酶。(Cortes,J.等Nature(1990)348:176-178;Donadio,S.等Science(1991)252:675-679;MacNeil,D.J.等Gene(1992)115:119-125;Schwecke,T.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:7839-7843并参见例如本文图1或WO98/01546的图2a和图3);而Ⅱ型PKS以芳族化合物的合酶为代表,仅含有单组链延伸的酶活性,它们在连续的循环中被再使用。
支配完全还原的一个完整组件含有一个酮脂酰(ketoacyl)-ACP合酶(KS)结构域;一个酰基载体蛋白结构域(ACP);一个酰基-CoA:ACP酰基转移酶(AT),用于所述延伸单位的装载;和一个酮还原酶(ketoreductase)(KR)、一个脱水酶(DH)和一个烯酰还原酶(ER)结构域,用于完成β-酮基的加工。由于这些结构域有酶活性,因此它们在本文中也被称为“酶”,尽管这并不意味着它们与其它PKS结构域有任何其结构关系。同样,编码这类结构域的核酸序列也可以被称为“基因”,尽管这并不意味着PKS的不同结构域的独立调节区存在或不存在。
本发明尤其涉及制备聚酮化合物的方法,即通过将Ⅰ型聚酮化合物合酶基因簇的选定组件中的还原性回折(reductive loop)(从AT末端至ACP开始的区段,或者包含一个KR,或者包含一个KR和一个DH,或者包含一个KR、一个DH和一个ER)用得自相同或不同PKS基因簇的等同区段、或突变或合成区段取代,藉此产生新的杂种聚酮化合物合酶,所述合酶以可预测的方式产生具有不同还原程度和/或立体化学的聚酮化合物,来制备聚酮化合物。
为避免疑问,本文所用的术语“延伸组件”是指一组Ⅰ型PKS结构域,每个结构域均具有酶活性,参与一个循环的聚酮化合物链延伸。更具体地讲,一个延伸组件包括KS、AT、一个还原性回折(包括一个或多个KR、DH和ER)和ACP。
罕见的是,所述还原性回折可以包括其它结构域。例如耶尔森氏菌(yersinabacter),它具有一个混合的PKS和多肽合酶,同时具有一个甲基转移酶结构域。
已经报道了,用(Ⅰ型)红霉素PKS基因组件3的等同区段取代DEBS1TE中组件2的还原性回折,当在天蓝色链霉菌(S.coelicolor)CH999中表达时,产生三酮化合物酮内酯(ketolactone)(Bedford,D.等Chemistry and Biology(1996)3:827-831)。
同样,用红霉素PKS基因组件5的等同区段取代DEBS1TE中组件2的还原性回折,当在天蓝色链霉菌CH999中表达时,产生具有预期结构和立体化学的三酮化合物内酯(McDaniel,R.等Chemistry andBiology(1997)4:667-674)。相反,当用红霉素PKS基因组件6的还原性回折进行同一实验时,仅能分离到一种酮内酯(McDaniel,R.等Chemistry and Biology(1997)4:667-674)。
在一个进一步的实验中,已经表明,也可以用雷帕霉素PKS组件4(包含一个KR和一个DH结构域)的等同区段取代一种三组件系统(包含装载结构域组件、第一延伸组件、第二延伸组件和第三延伸组件和ery基因的TE)中组件2的还原性回折,当在天蓝色链霉菌CH999中表达时,产生具有预测双键的四酮化合物(tetraketide)(McDaniel,R.等J.Am.Chem.Soc.(1997)119:4309-4310)。在同一系统中,已经用雷帕霉素PKS组件1(包含一个KR、一个DH和一个ER结构域)的等同区段取代组件2的还原性回折,当在天蓝色链霉菌CH999中表达时,产生具有预测氧化水平的四酮化合物(Kao,C.M.等J.Am.Chem.Soc.(1997)19:11339-11340)。相反,当用红霉素PKS基因组件4的相应区段时,仅能够观察到在相关位置上具有一个双键的聚酮化合物,而不是像预测的那样,产生完全还原的聚酮化合物(Kao,C.M.等J.Am.Chem.Soc.(1997)119:11339-11340)。
在两个相似的实验中,已经用雷帕霉素PKS组件2(包含一个KR和一个无活性DH结构域)的相应区段以及用rap PKS组件4的KR结构域(rap组件4的还原性回折含有一个KR和一个DH结构域)取代了所述三组件系统中组件2的还原性回折。据报道,这两个构成物均产生在C-3具有不同立体化学的三酮化合物内酯(Kao,C.M.等J.Am.Chem.Soc.(1998)120:2478-2479)。
在所有上述实例中,已经用相同的限制位点PstⅠ和XbaⅠ来连接所述DNA片段(PstⅠ位点的位置与下述系统中所用的PstⅠ位点相同,而XbaⅠ位点与所述Bsu36Ⅰ位点的位置相同)。
已经提出了一种DEB合酶结构的模型,其中所述还原性结构域形成位于KS、AT和ACP结构域所形成的核心之外的一个回折(Staunton等,Nature Structural biology(1996)3:188-192)。另外,已经发现,DEBS1在标志所述结构域边界的特定位置被蛋白水解酶水解(Aparicio,J.F.等,J.Biol.Chem.(1994)269:8524-8528)。这些蛋白水解位点主要见于接头区,因此看来理想的是将所述片段紧邻这些位点连接。其实例记载在WO98/01546中。
一方面,本发明提供编码Ⅰ型聚酮化合物合酶(PKS)的至少一部分的核酸(特别是DNA),所述部分包含至少部分延伸组件,其中所述核酸具有一个有多个限制酶切位点的多接头来取代编码与还原相关的酶的一个或多个基因。
另一方面,本发明提供编码Ⅰ型聚酮化合物合酶(PKS)的至少一部分的核酸(特别是DNA),所述部分包含至少部分延伸组件,其中所述核酸具有一个有多个限制酶切位点的多接头,该多接头将编码AT(至少其一部分)的核酸连接至编码ACP(至少其一部分)的核酸。
这类核酸可以如以下更详细描述的、在所述多接头中插入另外的核酸,所述另外的核酸编码一种或多种还原酶。最好是在用两种限制酶消化所述含多接头的核酸后,进行这种插入。为了提供对插入位点的选择,所述多接头优选包括至少三个限制位点,更优选至少4个,再更优选至少6个或8个限制位点。
通过将外源(通常是合成的)核酸引入编码Ⅰ型PKS的核酸中,可以提供缩多接头,或可以通过将编码Ⅰ型PKS的现有核酸序列工程改造,可以提供所述多接头。例如,为了完成后一点,可以将限制位点工程改造(例如通过定点诱变)到通常没有还原酶编码序列之处的上游和/或下游(最好是这两者),特别是工程改造到编码所述还原酶和相邻结构域之间的多肽接头的序列中。
所述多接头理想的是包括至少以下限制位点中的某些位点:AvrⅡ、BglⅡ、SnaBⅠ、PstⅠ、SpeⅠ、NsiⅠ、Bsu361、NheⅠ和HpaⅠ。更理想的是所述多接头包括这些位点中的至少四个位点。
最好是,在多接头中含有的限制位点中的至少某些位点在其加入的核酸的其余部分中不存在。最好是,包括在所述多接头中的至少某些所述位点在天然存在的、编码其它(最好是Ⅰ型)PKS的还原酶的核酸序列中是不常见的,或缺乏这些位点。理想的是,在编码PKS还原酶的已知核酸序列的至少约一半、更优选至少约3/4中,没有两个所述位点。所述限制位点最好富含A和T残基,因为PKS基因往往富含G和C残基。
理想的是,本发明的核酸编码一个装载组件和/或一个或多个延伸组件。可以在我们于1999年6月29日提交的题为“聚酮化合物及其合成”的同时待审的国际专利申请找到涉及装载组件变种的更详细的细节。
另一方面,本发明提供一般如上所述、但在所述多接头中插入编码一种或多种还原酶(例如KR和/或DH和/或ER)的另外核酸的核酸。所述插入的核酸可以编码聚酮化合物合酶的一种或多种还原酶,所述聚酮化合物合酶与多接头所插入其中的核酸的聚酮化合物合酶相同,但却来自一个不同的延伸组件。或者,所插入的核酸可以是外源的,编码来自不同的天然PKS或脂肪酸合酶的一种或多种还原酶,或可以是合成的,或可以从天然存在的、编码PKS或脂肪酸合酶的一种或多种还原酶的核酸突变而来。所插入的核酸最好编码来自同一种或另一种Ⅰ型PKS或脂肪酸合酶的一种或多种还原酶,但另一方面,它可以编码来自Ⅱ型PKS或脂肪酸合酶的一种或多种还原酶。
已经对编码Ⅰ型PKS的很多实例的基因进行了测序,这些序列公开于公众可得的DNA和蛋白质序列数据库中,所述数据库包括Genbank、EMBL和Swissprot。例如,其中可得到分别支配红霉素(Cortes,J.等Nature(1990)348:176-178;登录号X62569;Donadio,S.等Science(1991)252:675-679;登录号M63677)、雷帕霉素(Schwecke,T.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:7839-7843;登录号X86780)、利福霉素(August等(1998);登录号AF040570)和泰乐霉素(Eli Lily,登录号U78289)的PKS的序列。此外,本文的图7显示了编码除虫链霉菌(S.avermitilis)除虫菌素PKS的最初的两个组件的核酸序列;这种序列可以用作某些实施例中所用插入片段的替代来源。
对于本领域技术人员而言,很显然,编码相当结构域或不同Ⅰ型PKS组件的核酸之间的总序列相似性足够高,并且不同Ⅰ型PKS的结构域组构在不同的产生聚酮化合物的微生物之间是如此的一致,以致于获得本发明所述的新的杂种聚酮化合物的方法将普遍适用于所有天然组件的Ⅰ型PKS或其衍生物。
再一方面,本发明提供包含上述方面限定的核酸的载体,诸如质粒或噬菌体(最好是质粒),并提供用这类核酸或构成物转染的宿主细胞(特别是链霉菌属细菌)。
又一方面,本发明提供可由如上限定的宿主细胞表达的聚酮化合物合酶。这类聚酮化合物合酶如有需要,可以用常规方法从宿主细胞中分离出来,尽管通常最好不这样做。
其它方面,本发明提供通过将编码还原酶的核酸插入如上所述的多接头中、创造新的功能型PKS和编码其的核酸的方法;并提供用这类PKS产生的新的聚酮化合物。
再一方面,本发明提供用前述方面限定的材料和方法特异性或优先产生特定聚酮化合物的新方法。例如,本发明提供通过定向发酵产生C22-C23二氢除虫菌素例如双氢除虫菌素(参见例如实施例25和26)和基本上不含B2除虫菌素的B1除虫菌素(参见例如实施例27和28)的方法。
另一方面,本发明提供新的聚酮化合物和聚酮化合物的新的立体异构体,例如按照一个或多个实施例产生的特定聚酮化合物。
为了能够交换DEBS1TE系统(Cortes,J.等(1995)268:1487-1489)中红霉素PKS基因组件2中的还原性回折,插入一种多接头(多克隆位点(mcs))来取代组件2的还原性回折,由此产生包含一个KS、一个AT和一个ACP的最小组件。(该系统仍有功能,并且产生一种酮内酯(参见实施例2和4)。)所述mcs含有9种限制酶的唯一识别位点。
这些新的限制位点部分位于蛋白水解酶水解聚酮化合物合酶的位置附近的编码多接头区的DNA中(参看上文)。尽管其中某些所述限制位点位于同源性低的DNA编码区,但其它限制位点位于编码高度保守区的DNA中(图1)。AvrⅡ、BglⅡ、Bsu36Ⅰ和NheⅠ酶的识别位点的引入,不改变DEBS组件2的氨基酸序列。在其它5种情况下(SnaBⅠ、PstⅠ、SpeⅠ、Nsi、HpaⅠ),所述氨基酸序列改变(图2)。这些改变不影响该蛋白的活性(参见实施例6)。
因为其中两个所述位点含有相同的碱基,所以决定构建含不同mcs的两种质粒(pJLK114和pJLK117)。
应用mcs提供优于在所述还原性回折两边各有一个单一限制位点的以下优点:
1)对于每种不同的还原性回折,可以选择连接所述DNA片段(20种不同的组合)的合适位置,由此避免所述氨基酸序列中的不适宜的改变
2)可以避免在所述回折中切割的酶;和
3)可以以组合方式进行回折的插入。
本发明人的其它以外的发现是:采用含同一多接头的核酸和编码一种或多种还原酶的同一种核酸,当编码一种或多种还原酶的所述核酸在所述多接头中的不同位点插入时,可以获得不同结果。
例如,在实施例7和8中,将雷帕霉素组件13的还原性回折插入ery组件2中,由于所述第二延伸组件而导致所述聚酮化合物链的完全还原。以良好的得率获得所需的三酮化合物内酯产物。然而,在实施例37和38中,除了使用所述多接头的不同限制位点(使用AvrⅡ和HpaⅠ,代替BglⅡ和NsiⅠ)之外,将来自rap组件13的同一还原性回折或同一组结构域插入与实施例7和8基本相同ery组件2的位置中,获得大量的副产物。这类副产物包括其中C-3或者为酮基或者为羟基的三酮化合物内酯,表明仅仅改变用于交换所述还原性回折的位点,导致获得所需产物和获得不需要的所需产物与不完全还原产物的混合物之间的差异。
同样,在实施例31和32中,当用PstⅠ和Bsu36Ⅰ位点插入除虫菌素组件1的还原性结构域(质粒pGMS2)来取代ery组件2的还原性回折时,产生预期的产物,但也产生大量的酮内酯。在实施例29和30的实验中,当使用BglⅡ和NheⅠ位点(质粒pJLK30)时,几乎不产生任何酮内酯副产物,尽管在所有情况下内酯的量在相似范围内。
完全与实施例29和30类似,在实施例14中当使用相同位点BglⅡ和NheⅠ,用泰乐霉素组件1的还原性回折(质粒pJLK35)取代ery组件2的还原性回折时,产生的靶三酮化合物内酯与实施例30和32相同,但得率高得多,尽管伴随有某些酮内酯,这表明不同的还原性回折可能最好插入不同的限制位点。
在实施例33和34中,当使用BglⅡ和NheⅠ位点插入除虫菌素组件2的还原性结构域(质粒pJLK31)时,产生作为主产物的预期产物。在实施例35和36中,当使用SnaⅠ和Bsu36Ⅰ位点(质粒pGMS4)时,仅能够获得痕量的三酮化合物内酯混合物。
因此,如果当将特定还原性回折插入特定PKS中不能获得所需的预期产物时,本发明则提供了利用在多接头中具有其位点的不同限制酶来简单地调节插入位点的可能。正如上述比较实施例证明的,这种再调节可以显著影响聚酮化合物合成的结果和得率。实施例1质粒pJLK114的构建
pPFL114是一种基于pCJR24的质粒,含有一个PKS基因,所述基因含有ery装载组件、eryPKS的第一和第二延伸组件以及ery链终止硫酯酶,只是酰基转移酶的末端和所述第二ery延伸组件的ACP开始处之间的DNA区段,已经被含有以下限制酶识别位点的合成寡核苷酸接头取代:AvrⅡ、BglⅡ、SnaBⅠ、PstⅠ、SpeⅠ、NsiⅠ、Bsu36Ⅰ和HpaⅠ。如下通过几种中间质粒构建该质粒(图3)。质粒pJLK02的构建
使用以下合成的寡核苷酸:5’-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3’和5’-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3’,使用质粒pNTEP2(Oliynyk,M.等,Chemistry and Biology(1996)3:833-839;WO98/01546)作为模板,通过PCR扩增红色糖多孢菌(S.erythraea)eryAⅠ基因的约1.47kbp DNA片段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过其限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK02。质粒pJLK03的构建
使用以下合成的寡核苷酸:5’-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3’和5’-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC’,使用质粒pNTEPH作为模板,通过PCR扩增红色糖多孢菌eryAI基因的约1.12kbp DNA片段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK03。质粒pJLK04的构建
用PstⅠ和HpaⅠ消化质粒pJLK02,将1.47kbp插入片段与已经用PstⅠ和HpaⅠ消化的质粒pJLK03连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK04。质粒pJLK05的构建
用PstⅠ和AvrⅡ消化质粒pJLK01(PCT/GB97/01819),将460 bp插入片段与已经用PstⅠ和AvrⅡ消化的质粒pJLK04连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK05。质粒pJLK07的构建
用ScaⅠ和XbaⅠ消化质粒pJLK05,用NdeⅠ和ScaⅠ消化质粒pNTEP2,将这两种片段与用NdeⅠ和XbaⅠ消化的质粒pCJR24连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK07。质粒pJLK114的构建
将两种合成的寡核苷酸P1f和P1b(图7)分别溶于TE缓冲液中。将每种溶液(0.5nmol/μl)各10μl)混合并加热2分钟至65C,然后缓慢冷却至室温。质粒pJLK07用AvrⅡ和HpaⅠ消化,与所述退火的寡核苷酸连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK114。实施例2用质粒pJLK114构建红色糖多孢菌JC2/JLK114并产生TKL衍生物
用约5μg质粒pJLK114转化红色糖多孢菌JC2的原生质体(菌株的保藏号为NCIMB 40802,WO98/01546),并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入TE基因中。将JC2/pJLK114平板接种到含有50μg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂(5.0g葡萄糖、50.0g MD30E麦芽糊精、25.0g Arkasoy大豆粉、3.0g糖蜜(甜菜)、0.25g K2HPO4、2.5gCaCO3、22.0g琼脂,加蒸馏水至1升 pH=7.0)上,让其于30℃生长12天。将1cm2(500μl)的所述平板匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20μl甲酸的混合物萃取。倾析溶剂并蒸发溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定为:(4S,5R)-5-羟基-2,4-二甲基-3-氧代-正己酸-δ-内酯和(4S,5R)-5-羟基-2,4-二甲基-3-氧代-正庚酸-δ-内酯。实施例3质粒pJLK117的构建
pJLK117是一种基于pCJR24的质粒,含有一个PKS基因,所述基因含有ery装载组件、eryPKS的第一和第二延伸组件以及ery链终止硫酯酶,只是酰基转移酶的末端和所述第二ery延伸组件的ACP开始处之间的DNA区段,已经被含有以下限制酶识别位点的合成寡核苷酸接头取代:AvrⅡ、BglⅡ、SnaBⅠ、PstⅠ、SpeⅠ、NsiⅠ、Bsu36Ⅰ和NheⅠ。
如下通过几种中间质粒构建该质粒(图3)。质粒pJLK115的构建
用NdeⅠ和XbaⅠ消化质粒pJLK114,将约9.9kbp插入片段与已经用NdeⅠ和XbaⅠ消化的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK115。质粒pJLK116的构建
用Bsu36Ⅰ和XbaⅠ消化质粒pJLK13(PCT/GB97/01819),将1.1kbp片段与已经用Bsu36Ⅰ和XbaⅠ消化的质粒pJLK115连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK116。质粒pJLK117的构建
用NdeⅠ和XbaⅠ消化质粒pJLK116,将9.9 kbp片段与已经用NdeⅠ和XbaⅠ消化的质粒pCJR24连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK117。实施例4用质粒pJLK117构建红色糖多孢菌JC2/JLK117并产生TKL衍生物
用约5μg质粒pJLK117转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。将JC2/pJLK117平板接种到含有50μg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20μl甲酸的混合物萃取。倾析溶剂并蒸发溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定为:(4S,5R)-5-羟基-2,4-二甲基-3-氧代-正己酸-δ-内酯和(4S,5R)-5-羟基-2,4-二甲基-3-氧代-正庚酸-δ-内酯。实施例5质粒pJLK25的构建
pJLK25是一种基于pJLK114的质粒,只是已经在mcs中插入了编码红霉素PKS基因第二组件的还原性回折的DNA片段。
如下通过几种中间质粒构建该质粒。质粒pJLK118的构建
使用合成寡核苷酸:5’-ATACTAGTCCTCGTGACGAGCTCGACGG-3’和5’-TAATGCATCCGGTTCTCCGGCCCGCTCGCT-3’作为引物,使用pNTEP2作为模板,通过PCR扩增编码组件2的还原性回折的红色糖多孢菌eryAⅠ基因的约1.4kbp DNA片段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK118。质粒pJLK23的构建
用SpeⅠ和NsiⅠ消化质粒pJLK118,将1.4kbp片段与已经用SpeⅠ和NsiⅠ消化的质粒pJLK115连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK23。质粒pJLK25的构建
用NdeⅠ和XbaⅠ消化质粒pJLK23,将约11.2kbp片段与已经用NdeⅠ和XbaⅠ消化的质粒pCJR24连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过其限制图谱鉴定所需质粒pJLK25。实施例6用质粒pJLK25构建红色糖多孢菌JC2/pJLK25并产生三酮化合物
用约5μg质粒pJLK25转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。将JC2/pJLK25平板接种到含有50μg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20μl甲酸的混合物萃取。倾析溶剂并蒸发溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定(与真实物质比较)为:(2R,3S,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正己酸-δ-内酯和(2R,3S,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正庚酸-δ-内酯。实施例7质粒pJLK28的构建
pJLK28是一种基于pJLK117的质粒,只是已经在mcs中插入了编码rap PKS基因组件13的还原性回折的DNA片段。如下通过几种中间质粒构建该质粒(图5)。质粒pJLK120的构建
使用合成的寡核苷酸:5’-TAAGATCTTCCGACCTACGCCTTCCAAC-3’和5’-TAATGCATCGACCTCGTTGCGTGCCGCGGT-3’作为引物,使用粘粒cos 31(Schwecke,T.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7839-7843)作为模板,通过PCR扩增编码组件13的还原性回折的吸水链霉菌(S.hygroscopicus)rapC基因的约3.2kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK120。质粒pJLK28的构建
用BglⅡ和NsiⅠ消化质粒pJLK120,将3.2 kbp片段与已经用BglⅡ和NsiⅠ消化的质粒pJLK117连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK28。实施例8用质粒pJLK28构建JC2/JLK28和三酮化合物的生产
用约5μg质粒pJLK28转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。将JC2/pJLK28平板接种到含有50μg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20μl甲酸的混合物萃取。倾析并蒸发溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定(与真实物质比较)为:(2R,4S,5R)-2,4-二甲基-5-羟基-正己酸δ-内酯和(2R,4S,5R)-2,4-二甲基-5-羟基-正庚酸δ-内酯。实施例9质粒pJLK41的构建
pJLK41是一种基于pJLK117的质粒,只是已经在mcs中插入了编码eryPKS基因组件4的还原性回折的DNA片段。如下通过几种中间质粒构建该质粒(图5)。质粒pJLK32.3的构建
使用合成寡核苷酸:5’-ATAGATCTGCCTACGTACCCGTTCGAACACCAGCGCTTC-3’和5’-ATCCTCAGGTTCGGCCCTGCCGCCTCGGCCTGCCCGGCGGCGCGCAGCTT-3’作为引物,使用粘粒cos4B(含有红霉素PKS的粘粒)作为模板,通过PCR扩增编码组件4还原性回折的红色糖多孢菌eryAⅡ基因的约3.2kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK32.3。质粒pJLK38的构建
用BglⅡ和Bsu36Ⅰ消化质粒pJLK32.3,将3.2kbp片段与已经用BglⅡ和Bsu36Ⅰ消化的质粒pJLK116连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK38。质粒pJLK41的构建
用NdeⅠ和XbaⅠ消化质粒pJLK38,将约13kbp片段与已经用NheⅠ和XbaⅠ消化的质粒pCJR24连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK41。实施例10用质粒pJLK41构建JC2/JLK41并产生三酮化合物
用约5μg质粒pJLK41转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。将JC2/pJLK41平板接种到含有50μg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板培养物匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20μl甲酸的混合物萃取。倾析并蒸发溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定(通过与真实物质比较)为:(2S,4S,5R)-2,4-二甲基-5-羟基-正己酸δ-内酯和(2S,4S,5R)-2,4-二甲基-5-羟基-正庚酸δ-内酯。实施例11质粒pJLK29的构建
pJLK29是一种基于pJLK117的质粒,只是编码rap PKS组件10的还原型回折(loop)的DNA片段已经插入mcs中。如下通过几种中间质粒构建该质粒(图5)。质粒pJLK121.1的构建
使用以下合成的寡核苷酸:5’-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3’和5’-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3’,使用通过用ScaⅠ和SphⅠ消化粘粒cos 26(Schwecke,T.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7839-7843)获得的约2.2kbp区段作为模板,通过PCR扩增编码组件10的还原性回折的吸水链霉菌rapB基因的约2.2kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK121.1。质粒pJLK29的构建
用BglⅡ和NheⅠ消化质粒pJLK121.1,将2.2kbp片段与已经用BglⅡ和NheⅠ消化的质粒pJLK117连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序鉴定所需质粒pJLK121.1。质粒pJLK29的构建
用BglⅡ和NheⅠ消化质粒pJLK121.1,将2.2kbp片段与已经用BglⅡ和NheⅠ消化的质粒pCJR117连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK29。实施例12用质粒pJLK29构建红色糖多孢菌JC2/JLK29并产生三酮化合物
用约5μg质粒pJLK29转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。用JC2/pJLK29接种在250ml烧瓶中含有5μg/ml硫链丝菌肽的30ml SM3培养基上,以单弹簧减少聚集,以300rpm于30℃振摇。8天后,将肉汤离心,将上清液调至pH3,用等体积乙酸乙酯萃取3次。通过蒸发除去溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经HPLC和电喷雾质谱法并在用三甲基甲硅烷基-重氮甲烷转化为甲酯后用GC/MS分析。主产物鉴定(与真实物质比较)为:(4S,5R)-5-羟基-2,4-二甲基-正己-2-烯酸和(4S,5R)-2,4-二甲基10-正庚-2-烯酸。实施例13质粒pJLK35的构建
质粒pJLK35是一种基于pJLK117的质粒,只是已经在mcs中插入了编码泰乐霉素PKS组件1的还原性回折的DNA片段。如下通过几种中间质粒构建该质粒(图5)。质粒pJLK33.1的构建
使用合成寡核苷酸:5’-TAAGATCTCCCTACGTACCCCTTCAACCAC-3’和5’-GCTAGCCGCCGCGCCAGCTCGGGC-3’作为引物,使用粘粒6T(含有产生泰乐霉素的PKS基因的粘粒)作为模板,通过PCR扩增编码组件1还原性回折的弗氏链霉菌(S.fradiae)泰乐霉素PKS基因的约1.6kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK33.1。质粒pJLK35的构建
用BglⅡ和NheⅠ消化质粒pJLK33.1,将1.6 kbp片段与已经用BglⅡ和NheⅠ消化的质粒pJLK117连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK35。实施例14用质粒pJLK35构建红色糖多孢菌JC2/JLK35并产生三酮化合物
用约5μg质粒pJLK35转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。将JC2/pJLK35平板接种到含有50μg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板培养物匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20μl甲酸的混合物萃取。倾析并蒸发溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定(与真实物质比较)为:(2R,3R,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正己酸δ-内酯和(2R,3R,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正庚酸δ-内酯。实施例15质粒pRIF7的构建
质粒pRIF7是一种基于pJLK117的质粒,只是已经在mcs中插入了编码利福霉素PKS组件7的还原性回折的DNA片段。如下通过几种中间质粒构建该质粒(图5)。质粒pUCRIF7的构建
使用合成寡核苷酸:5’-CCTACGTACGCCTTCGACCACCAGCACTT-3’和5’-CGGCTAGCGGGCGTTCCAGGCCGCCGTCCT-3’作为引物,使用粘粒6 (根据登录号AF040570的编号,于35727开始并越过76199的粘粒)作为模板,通过PCR扩增编码组件7还原性回折的地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)利福霉素PKS基因的约2.1kbpDNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pUCRIF7。质粒pRIF7的构建
用SnaBⅠ和NheⅠ消化质粒pUCRIF7,将2.1kbp片段与已经用SnaBⅠ和NheⅠ消化的质粒pJLK117连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pRIF7。实施例16用质粒pRIF7构建红色糖多孢菌JC2/RIF7并产生三酮化合物
用约5μg质粒pRIF7转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。将JC2/pRIF7平板接种到含有50μg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板培养物匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20μl甲酸的混合物萃取。倾析并蒸发去除溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定(与真实物质比较)为:(2S,3S,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正己酸δ-内酯和(2R,3R,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正庚酸δ-内酯。实施例17质粒pJLK52的构建
pJLK52是一种基于pJLK35的质粒,含有一个PKS基因,所述PKS基因包含ery装载组件、ery基因簇的第一、第二和第三延伸组件和ery链终止硫酯酶,只是所述第二ery延伸组件的酰基转移酶末端和ACP开始之间的DNA区段,已经用泰乐霉素PKS组件1的等同区段取代。
如下通过几种中间质粒构建该质粒。质粒pJLK50的构建
使用合成寡核苷酸:5’-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3’和5’-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3’作为引物,使用质粒pBAM25作为模板,通过PCR扩增红色糖多孢菌红霉素PKS基因簇编码从组件2的ACP开始至组件3的ACP开始的DNA片段的约6.1kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK50。质粒pJLK52的构建
用NheⅠ消化质粒pJLK50,将6.1kbp插入片段与已经用NheⅠ消化的质粒pJLK35连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK52。实施例18用质粒pJLK52构建红色糖多孢菌NRRL2338/JLK52并产生四酮化合物和大环内酯
用约5μg质粒pJLK52转化红色糖多孢菌NRRL2338的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。用红色糖多孢菌NRRL2338/pJLK52接种在含有5μg/ml硫链丝菌肽的SM3培养基上,让其于28-30℃生长7-12天。此后将肉汤离心,并将上清液的pH调至pH=9.5。然后上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次,并蒸发除去溶剂。将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS、HPLC/MS和MS-MS分析。通过GC/MS鉴定四酮化合物。主要组分为
质粒pJLK53是一种基于pJLK28的质粒,含有一个PKS基因,所述PKS基因包含ery装载组件、ery基因簇的第一、第二和第三延伸组件和ery链终止硫酯酶,只是所述第二ery延伸组件的酰基转移酶末端和ACP开始之间的DNA区段,已经用雷帕霉素PKS组件13的等同区段取代。如下构建该质粒。
用NheⅠ消化质粒pJLK50,将6.1kbp插入片段与已经用NheⅠ消化的质粒pJLK28连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK53。实施例20用质粒pJLK53构建红色糖多孢菌NRRL2338/JLK53并产生TKL衍生物
用约5μg质粒pJLK53转化红色糖多孢菌NRRL2338的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。用红色糖多孢菌NRRL2338/pJLK53接种在含有5μg/rml硫链丝菌肽的SM3培养基上,让其于28-30℃生长7-12天。此后将肉汤离心,并将上清液的pH调至pH=9.5。然后上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次,并蒸发除去溶剂。将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS、HPLC/MS和MS-MS分析。通过GC/MS鉴定四酮化合物。主要组分为
质粒pJLK54是一种基于pJLK29的质粒,含有一个PKS基因,所述基因含有ery装载组件、ery基因簇的第一、第二和第三延伸组件以及ery链终止硫酯酶,只是所述第二ery延伸组件的酰基转移酶的末端和ACP开始处之间的DNA区段,已经被雷帕霉素PKS组件10的等同区段取代。
如下构建该质粒。
用NheⅠ消化质粒pJLK50,将6.1kbp插入片段与已经用NheⅠ消化的质粒pJLK29连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK54。实施例22用质粒pJLK54构建红色糖多孢菌NRRL2338/JLK54并产生四酮化合物衍生物和大环内酯
用约5μg质粒pJLK54转化红色糖多孢菌NRRL2338的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。用红色糖多孢菌NRRL2338/pJLK54接种在含有5μg/ml硫链丝菌肽的SM3培养基上,让其于28-30℃生长7-12天。此后将肉汤离心,并将上清液的pH调至pH=9.5。然后上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次,并蒸发除去溶剂。将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS、HPLC/MS和MS-MS分析。通过GC/MS鉴定四酮化合物。主要组分为
除虫菌素实施例23质粒pJLK136的构建
质粒pJLK136是一种基于pWHM3的质粒,包含除虫菌素PKS基因组件2还原性回折的上游和下游侧翼区以及红霉素抗性基因,所述红霉素抗性基因插入连接这两个片段的mcs中。质粒pWHM3描述于VaraJ等,JBacteriol1989,171:5872-5881。如下通过几种中间质粒构建质粒pJLK136(图6)。质粒pJLK130的构建
使用合成寡核苷酸:5’-GACGCCGAATTCTTCGGCATCAGCCCCCGCGAAG-3’和5’-GAGCTAGCAGGTGGGGAGATCTAGGTGGGTGTGGGTGTGGGGTTGGTTGTGGTGGTGGGTGTA-3’作为引物,使用质粒pIG22(GalloWay,I.S.(1 998)Thesis,University of Cambridge,UK)作为模板,通过PCR扩增编码组件2还原性回折上游区的除虫链霉菌除虫菌素PKS基因的约2.4kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK130。pJLK131的构建
使用合成寡核苷酸:5’-GCCCGGCTAGCCGGCCAGACACACGAACAACAGC-3’和5’-GGGAATTCCTCGAGGATGACGTGGGCGTTGGTGC-3’作为引物,使用质粒pIG25(Galloway,I.S.(1998)Thesis,University ofCambridge,UK)作为模板,通过PCR扩增编码组件2还原性回折上游区的除虫链霉菌除虫菌素PKS基因的约2.0kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK131。质粒pJLK132的构建
用NheⅠ和XbaⅠ消化质粒pJLK130,将约2.4kbp插入片段与已经用NheⅠ和XbaⅠ消化的质粒pJLK131连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK132。质粒pJLK133的构建
用BglⅠ和NheⅠ消化质粒pJLK117,将约0.1kbp插入片段与已经用BglⅠ和NheⅠ消化的质粒pJLK132连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK133。质粒pJLK134的构建
使用合成寡核苷酸:5’-TAAGATCTAGCGCTCCGAGGTTCTTGCCCG-3’和5’-ATGCTAGCCTACCGCTGCCCGGGTCCGCCG-3’作为引物,使用质粒pRH3(Dhillon,N.等Molecular Microbiology(1989)3:1405-1414)作为模板,通过PCR扩增编码红霉素抗性的红色糖多孢菌红霉素PKS基因簇的约1.9kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK134。质粒pJLK135的构建
用BglⅠ和NheⅠ消化质粒pJLK134,将约1.9kbp插入片段与已经用BglⅠ和NheⅠ消化的质粒pJLK133连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK135。质粒pJLK136的构建
用EcoRⅠ消化质粒pJLK135,将约6.3kbp插入片段与已经用EcoRⅠ消化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pWHM3连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK136。实施例24质粒pJLK136的应用
用约10μg质粒pJLK136转化除虫链霉菌的原生质体(MacNeil,D.J.和Klapko,C.M.Joumal of Industrial Microbiology(1987)2:209-218),并分离稳定的硫链丝菌肽和红霉素抗性菌落。选择各个菌落,并将其在非选择性液体培养基中传代4次,然后制备原生质体并再生(按照MacNeil T.等J.Bacteriol.(1993)175:2552-2563的培养基)。分离出硫链丝菌肽敏感性和红霉素抗性菌落,并经DNA印迹杂交鉴定。一个这样的菌落被命名为除虫链霉菌/JLK1。实施例25质粒pJLK137的构建
用BglⅠ和NsiⅠ消化质粒pJLK120,将约3.2kbp插入片段与已经用BglⅠ和NsiⅠ消化的质粒pJLK133连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK137。质粒pJLK138的构建
用EcoRⅠ消化质粒pJLK137,将约7.6kbp插入片段与已经用EcoRⅠ消化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pWHM3连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK138。实施例26质粒pJLK138的应用
用约10μg质粒pJLK138转化除虫链霉菌的原生质体(MacNeil,D.J.和Klapko,C.M.Journal of Industrial Microbiology(1987)2:209-218),并分离稳定的硫链丝菌肽和红霉素抗性菌落。选择各个菌落,并将其在非选择性液体培养基中传代4次,然后制备原生质体并再生(按照MacNeil T等J.Bacteriol.(1993)175:2552-2563的培养基)。分离出硫链丝菌肽和红霉素敏感性菌落,并经DNA印迹杂交鉴定。用一个除虫链霉菌/pJLK138菌落接种到液体培养基(按照Pang,C-H.等J.ofAntibiotics(1995)48:59-66所述进行发酵)。收获培养物,分离产物,并按文献中所述进行纯化(Pang,C-H.等J.of Antibiotics(1995)48:59-66)。产物经HPLC/MS和1H-NMR分析,可以鉴定出以下化合物:实施例27质粒pJLK139的构建
用BglⅠ和NheⅠ消化质粒pJLK121.1,将2.2kbp片段与已经用BglⅠ和NheⅠ消化的质粒pJLK133连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK139。质粒pJLK140的构建
用EcoRⅠ消化质粒pJLK139,将约6.6kbp插入片段与已经用EcoRⅠ消化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pWHM3连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK140。实施例28质粒pJLK140的应用
用约10μg质粒pJLK140转化除虫链霉菌的原生质体(MacNeil,D.J.和Klapko,C.M.Journal of Industrial Microbiology(1987)2:209-218),并分离稳定的硫链丝菌肽和红霉素抗性菌落。挑选单个菌落,并将其在非选择性液体培养基中传代4次,然后制备原生质体并再生(按照MacNeil T.等J.Bacteriol.(1993)175:2552-2563的培养基)。分离出硫链丝菌肽和红霉素敏感性菌落,并经DNA印迹杂交鉴定。用一个除虫链霉菌/pJLK140菌落接种液体培养基(按照Pang,C-H.等J.ofAntibiotics(1995)48:59-66所述进行发酵)。收获培养物,分离产物,并按文献中所述进行纯化(Pang,C-H.等J.of Antibiotics(1995)48:59-66)。产物经HPLC/MS和1H-NMR分析,可以鉴定出以下化合物:实施例29质粒pJLK30的构建
pJLK30是一种基于pJLK117的质粒,只是已经采用限制位点BglⅡ和NheⅠ,将编码除虫菌素PKS组件1还原性回折的DNA插入所述多接头中。如下通过几种中间质粒构建该质粒。质粒pIG67的构建
使用以下合成寡核苷酸:5’-CCTAGATCCGCCCACCTACCCCTTCCAACACCAG-3’和5’-TGGGCTAGCGTTTTGTGCAACTCCGCCGGTGGAGTG-3’作为引物,使用质粒pIG155(含有克隆到质粒pT7-7中的除虫菌素PKS的前两个组件)或者除虫链霉菌染色体DNA作为模板,通过PCR扩增编码组件1还原性回折的除虫链霉菌除虫菌素PKS基因的约1.7kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pIG67。质粒pJLK30的构建
用BglⅡ和NheⅠ消化质粒pIG67,将1.7kbp片段与已经用BglⅡ和NheⅠ消化的质粒pJLK117连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK30。实施例30用质粒pJLK30构建红色糖多孢菌JC2/JLK30并产生三酮化合物
用约5mg质粒pJLK30转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。用红色糖多孢菌JC2/pJLK30平板接种到含有50mg/ml硫链丝菌肽的SM3培养基上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板培养物匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20ml甲酸的混合物萃取。倾析并蒸发溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定为(2R,3R,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正己酸δ-内酯和(2R,3R,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正庚酸δ-内酯(总共25mg/l)。几乎不能检测到相应的3-酮内酯。实施例31质粒pGMS2的构建
pGMS2是一种基于pJLK117的质粒,只是已经采用限制位点PstⅠ和Bsu36Ⅰ,将编码除虫菌素PKS组件1还原性回折的DNA插入所述多接头中。如下通过几种中间质粒构建该质粒。质粒pIG68的构建
使用以下合成寡核苷酸:5’-TGGCTGCAGAGCTCACAGCCGGGTGCCGGATCCGGTT-3’和5’-TTTCCTCAGGTCCGCCGGTGGAGTGGGGCGCTGGAC-3’作为引物,使用质粒pIG155(含有克隆到质粒pT7-7中的除虫菌素PKS的前两个组件)或者除虫链霉菌染色体DNA作为模板,通过PCR扩增编码组件1还原性回折的除虫链霉菌除虫菌素PKS基因的约1.7kbp DNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pIG68。质粒pGMS1的构建
用PstⅠ和Bsu36Ⅰ消化质粒pIG68,将1.7kbp片段与已经用PstⅠ和Bsu36Ⅰ消化的质粒pJLK116连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pGMS1。质粒pGMS2的构建
用NdeⅠ和XbaⅠ消化质粒pGMS1,将约11.5kbp片段与已经用NdeⅠ和XbⅠ消化的质粒pCJL4连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pGMS2。实施例32用质粒pGMS2构建红色糖多孢菌JC2/pGMS2并产生三酮化合物
用约5mg质粒pGMS2转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。用红色糖多孢菌JC2/pGMS2平板接种到含有50μg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂培养基上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板培养物匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20ml甲酸的混合物萃取。倾析并蒸发溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定为(2R,3R,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正己酸δ-内酯和(2R,3R,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正庚酸δ-内酯(总共17mg/l),也鉴定出大量的相应的3-酮内酯(5.5mg/l)。实施例33质粒pJLK31的构建
pJLK31是一种基于pJLK117的质粒,只是已经采用限制位点BglⅡ和NheⅠ,将编码除虫菌素PKS组件2还原性回折的DNA插入所述多接头中。如下通过几种中间质粒构建该质粒。质粒pIG69的构建
使用以下合成寡核苷酸:5’-CCTAGATCTCCCCACCTACCCCTTCCAACACCACCACTACTG-3’和5’-CCGGCTAGCCGGGCGTGCAGCTGGGCGCCGTTGTCCGCAC-3’作为引物,使用质粒pIG155(含有克隆到质粒pT7-7中的除虫菌素PKS的前两个组件)或者除虫链霉菌染色体DNA作为模板,通过PCR扩增编码组件2还原性回折的除虫链霉菌除虫菌素PKS基因的约2.4kbpDNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pIG69。质粒pJLK31的构建
用BglⅡ、NheⅠ和DraⅠ消化质粒pIG69,将2.4kbp片段与已经用BglⅡ和NheⅠ消化的质粒pJLK117连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK31。实施例34用质粒pJLK31构建红色糖多孢菌JC2/JLK31并产生三酮化合物
用约5mg质粒pJLK31转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。用红色糖多孢菌JC2/pJLK31平板接种到含有50mg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂培养基上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板培养物匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20ml甲酸的混合物萃取。倾析并蒸发溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定为:(2R,3R,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正己酸δ-内酯和(2R,3R,4S,5R)-5,3-二羟基-2,4-二甲基-正庚酸δ-内酯(总共30mg/l)。实施例35质粒pGMS4的构建
pGMS4是一种基于pJLK117的质粒,只是已经采用限制位点SnaBⅠ和Bsu36Ⅰ,将编码除虫菌素PKS组件2还原性回折的DNA插入所述多接头中。如下通过几种中间质粒构建该质粒。质粒pIG70的构建
使用以下合成寡核苷酸:5’-CCCTACGTACCCCTTCCAACACCACTACTGGCTCGAAAG-3’和5’-GGCCCTCAGGTGGGCGCCGTTGTCCGCACCACCGGTA-3’作为引物,使用质粒pIG155(含有克隆到质粒pT7-7中的除虫菌素PKS的前两个组件)或者除虫链霉菌染色体DNA作为模板,通过PCR扩增编码组件2还原性回折的除虫链霉菌除虫菌素PKS基因的约2.4 kbpDNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pIG70。质粒pGMS3的构建
用SnaⅠ、Bsu36Ⅰ和DraⅠ消化质粒pIG70,将2.4kbp片段与已经用SnaⅠ和Bsu36Ⅰ消化的质粒pJLK116连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pGMS3。质粒pGMS4的构建
用NdeⅠ和XbaⅠ消化质粒pGMS2,将约12.4kbp片段与已经用NdeⅠ和XbaⅠ消化的质粒pCJR24连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pGMS4。实施例36用质粒pGMS4构建红色糖多孢菌JC2/GMS4并产生三酮化合物
用约5mg质粒pGMS4转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。用红色糖多孢菌JC2/pGMS4平板接种到含有50mg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂培养基上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板培养物匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20ml甲酸的混合物萃取。倾析并蒸发溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。仅检测到痕量推定的三酮化合物产物。实施例37质粒pJLK27的构建
质粒pJLK27是一种基于pJLK114的质粒,只是已经将编码rapPKS组件13还原性回折的DNA片段插入mcs中。如下通过几种中间质粒构建该质粒。质粒pJLK120a的构建
使用以下合成寡核苷酸:5’-TACCTAGGCACCACCACAACCCGGTA-3’和5’-TACAATTGGCCCGCGAGTCCCCGACGCT-3’作为引物,使用粘粒cos31(Schwecke,T等,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7839-7843)作为模板,通过PCR扩增编码组件13还原性回折的吸水链霉菌rapC基因的约3.2kbpDNA区段。所述PCR产物用T4多核苷酸激酶处理,然后与已经通过用SmaⅠ消化线性化、然后用碱性磷酸酶处理的质粒pUC18连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱和DNA测序分析鉴定所需质粒pJLK120a。质粒pJLK27的构建
用AvrⅡ和HpaⅠ消化质粒pJLK120a,将3.2kbp片段与已经用AvrⅡ和HpaⅠ消化的质粒pJLK114连接。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH10B细胞,检查各个菌落的质粒内容。通过限制图谱鉴定所需质粒pJLK27。实施例38用质粒pJLK27构建红色糖多孢菌JC2/JLK27并产生三酮化合物
用约5mg质粒pJLK27转化红色糖多孢菌JC2的原生质体,并分离稳定的硫链丝菌肽抗性菌落。从几个菌落中获得总DNA,并经DNA印迹杂交分析,以证实该质粒已经整合入所述TE中。用JC2/pJLK27平板接种到含有50mg/ml硫链丝菌肽的SM3琼脂培养基上,让其于30℃生长12天。将1cm2(0.5ml)的所述平板培养物匀浆,并用1.2ml乙酸乙酯和20ml甲酸的混合物萃取。倾析并蒸发去除溶剂,将残余物溶于甲醇中,并经GC/MS和电喷雾质谱法分析。主产物鉴定(与真实物质比较)为:(2R,4S,5R)-2,4-二甲基-5-羟基-正己酸δ-内酯和(2R,4S,5R)-2,4-二甲基-5-羟基-正庚酸δ-内酯(总共41mg/1),也鉴定出一定的相应的3-酮内酯(总共12mg/1)和3-羟基内酯(总共2.8mg)。
本文提及的所有文献和序列保存物均通过引用直接独立结合到本文中。
Claims (27)
1.编码Ⅰ型聚酮化合物合酶的至少一部分的核酸分子,所述部分包括一个延伸组件的至少一部分,其中所述核酸具有一个有多个限制酶切位点的多接头来取代编码与还原相关的酶的一个或多个基因。
2.根据权利要求1的核酸,其中所述多接头取代编码与还原相关的酶、通常包括在所述延伸组件中的所有基因。
3.编码Ⅰ型聚酮化合物合酶的至少一部分的核酸分子,所述部分包括一个延伸组件的至少一部分,其中所述核酸具有一个有多个限制酶切位点的多接头,所述多接头将编码酰基转移酶的至少一部分的核酸连接至编码酰基载体蛋白的至少一部分的核酸。
4.根据任一前述权利要求的核酸,其中包括在所述多接头中的所述限制位点的至少一些限制位点在所述Ⅰ型聚酮化合物合酶的编码核酸中不存在。
5.根据任一前述权利要求的核酸,其中包括在所述多接头中的所述限制位点的至少一些限制位点在编码Ⅰ型聚酮化合物合酶的还原酶的天然存在的核酸中不常见或不存在。
6.根据任一前述权利要求的核酸,其中所述多接头包括以下限制位点中的至少某些位点:AvrⅡ、BgⅢ、SnaBⅠ、PstⅠ、SpeⅠ、NsiⅠ、Bsu361、NheⅠ和HpaⅠ。
7.根据任一前述权利要求的核酸,其还编码一个装载组件。
8.根据任一前述权利要求的核酸,其还编码一个或多个其它延伸组件。
9.根据任一前述权利要求的核酸,它还包括掺入所述多接头中的核酸序列,所述掺入核酸编码一种或多种还原酶。
10.根据权利要求9的核酸,其中所述一种或多种还原酶为β-酮基还原酶(ketoreductase)、脱水酶和/或烯酰基还原酶。
11.根据权利要求10的核酸,其中所述一种或多种还原酶至少包括一种β-酮基还原酶。
12.根据权利要求10或权利要求11的核酸,其中所述一种或多种还原酶的至少一种来自与所述至少一部分Ⅰ型聚酮化合物合酶相同的聚酮化合物合酶的不同延伸组件。
13.根据权利要求10-12中任一项的核酸,其中所述一种或多种还原酶的至少一种来自不同的聚酮化合物合酶。
14.包含任一前述权利要求中限定的核酸的载体。
15.用任一前述权利要求限定的核酸或载体转染、转化或结合的宿主细胞。
16.根据权利要求15的宿主细胞,其为链霉菌属细菌细胞。
17.根据权利要求16的宿主细胞,其为红色糖多孢菌或除虫链霉菌细胞。
18.产生编码新型聚酮化合物合酶的核酸的方法,所述方法包括以下步骤:
ⅰ. 提供在权利要求1-8的任一项中限定的核酸;和
ⅱ.将编码至少一种还原酶的核酸序列掺入到所述核酸中。
19.根据权利要求18的方法,其中所述编码至少一种还原酶的核酸序列同权利要求9-13的任一项中限定。
20.生产含聚酮化合物的发酵产品的方法,所述方法包括培养在权利要求15中限定的宿主细胞的步骤。
21.含C22-C23二氢除虫菌素、基本上不含其它大环内酯的发酵产品。
22.根据权利要求21的发酵产品,其中所述二氢除虫菌素为双氢除虫菌素。
23含B1除虫菌素、基本上不含B2除虫菌素的发酵产品。
24.生产聚酮化合物的方法,该方法包括以下步骤:
ⅰ.提供通过权利要求20的方法产生的发酵产品或根据权利要求21-23中任一项的发酵产品;和
ⅱ.从所述发酵产品中至少部分纯化聚酮化合物。
25.根据权利要求24的方法,其中所述聚酮化合物为除虫菌素。
26.根据权利要求25的方法,其中所述除虫菌素为B1除虫菌素。
27.根据权利要求25的方法,其中所述除虫菌素为B1除虫菌素。
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Cited By (1)
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Families Citing this family (16)
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4199569A (en) * | 1977-10-03 | 1980-04-22 | Merck & Co., Inc. | Selective hydrogenation products of C-076 compounds and derivatives thereof |
DE69023036T2 (de) * | 1989-03-31 | 1996-06-13 | Merck & Co Inc | Klonierung von Streptomyces avermitilis Genen zur Biosynthese von Avermectin und Verfahren zu ihrer Verwendung. |
NZ240150A (en) * | 1990-10-15 | 1993-07-27 | Merck & Co Inc | Fermentation medium and its use in the production of ivermectin derivatives |
JP2000511063A (ja) * | 1996-07-05 | 2000-08-29 | バイオティカ テクノロジー リミティド | ポリケチド類及びそれらの合成 |
GB9814006D0 (en) * | 1998-06-29 | 1998-08-26 | Biotica Tech Ltd | Polyketides and their synthesis |
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2001
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- 2001-07-16 HK HK01104953A patent/HK1034535A1/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN106916836A (zh) * | 2015-12-24 | 2017-07-04 | 武汉臻智生物科技有限公司 | 化合物的生物合成基因簇及其应用 |
CN106916836B (zh) * | 2015-12-24 | 2022-08-12 | 武汉合生科技有限公司 | 化合物的生物合成基因簇及其应用 |
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