JP2002519066A - ポリケチド、その調製及びそれに用いる物質 - Google Patents

ポリケチド、その調製及びそれに用いる物質

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ラウレンツ ケレンベルガー，ヨハネス
フランシス リードレイ，ピーター
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ジョネル ステュズマン−イングウォール，キム
アラステア アーバイン マッカーサー，ハミッシュ
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バイオティカ テクノロジー リミティド
ファイザー・インク
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Abstract

(57)【要約】 Ｉ型ポリケチドシンターゼの少くとも部分をコードする核酸分子であって、還元に関連する酵素をコードする１又は複数のＰＫＳ遺伝子の代りに複数の制限酵素部位を有するポリリンカーを有し、且つ場合によりそのポリリンカー内に組み込まれた１又は複数の還元酵素をコードする核酸を更に有する前記核酸分子。本核酸分子を組み込んだプラスミド、本プラスミドをトランスフェクトした宿主細胞、及びこれらに関与する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ポリケチド、その調製、及びその使用のための物質に関する。
【０００２】 ポリケチドは、多数の様々な構造からなる天然産物のクラスであり、抗生物活
性又はその他の医薬特性を有する多数の化合物、例えばエリスロマイシン、テト
ラサイクリン、ラパマイシン、アベルメクチン、ポリエーテルイオノフォア及び
ＦＫ５０６を含む。
【０００３】 特に、ポリケチドは、ストレプトミセス菌及び類縁の放線菌類により多量に生
産される。これは、脂肪酸生合成の場合と類似して、アシルチオエステルの段階
的縮合の繰り返しによって合成される。天然ポリケチドにおけるより大きな構造
多様性は、「開始材」又は「延長材」単位として（通常）アセテート又はプロピ
オネートを選択すること、及び、各縮合後に見られるβ−ケト基の様々な度合の
プロセシングから生じる。プロセシング過程の例には、β−ヒドロキシアシル−
への還元、還元後の２−エノイル−への脱水化、及び飽和アシルチオエステルへ
の完全な還元がある。また、これらのプロセシング過程により生じる立体構造は
、鎖延長の各サイクル毎に特定される。
【０００４】 ポリケチドの生合成は、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）として知られる一群
の鎖形成酵素により開始される。放線菌類では２つのポリケチドシンターゼのク
ラスが報告されている。しかし本発明の対象である新規なポリケチド及び方法は
主にＩ型ＰＫＳに関し、これはマクロライド系のエリスロマイシン、ラパマイシ
ン及びアベルメクチンのためのＰＫＳである。Ｉ型ＰＫＳは、ポリケチド鎖延長
の各サイクルのために種々の組すなわち「モジュール」の酵素を有する（Cortes
, J. et al. Nature (1990) 348 : 176-178 ; Donadio, S. ed al. Science (19
91) 252 : 675-679 ; MacNeil, D.J. et al. Gene (1991) 115 : 119-125 ; Sch
wecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92 : 7839-7843 、及び
本明細書の図１、又はWO98/01546の図２ａ及び３）。一方II型ＰＫＳは、芳香族
化合物のためのシンターゼであり、鎖延長のために一組の酵素活性のみを有する
。これらは適宜、連続サイクルにおいて再使用される。
【０００５】 完全な還元を指令する完全なモジュールは、延長材単位のローディングのため
に、ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）ドメイン；アシルキャリアータンパ
ク質ドメイン（ＡＣＰ）；アシル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（
ＡＴ）ドメイン；並びに、β−ケト基のプロセシング完了のために、ケトレダク
ターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）及びエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ド
メインを有する。これらのドメインは酵素活性を有するので、本文ではこれらを
「酵素」と称するが、これは、その他のＰＫＳドメインとの構造上の関係につい
て何かを意味するものではない。同様に、これらのドメインをコードする核酸配
列を「遺伝子」と称するが、これは、ＰＫＳの種々のドメインのための個別の調
節領域の存在やその他のことについて何にかを意味するものではない。
【０００６】 本発明は特に、ポリケチドを調製するための方法に関し、この方法は、Ｉ型ポ
リケチドシンターゼ遺伝子クラスターの選択されたモジュールの還元ループ（Ａ
Ｔの最後からＡＣＰの最初までのセグメントであり、ＫＲ、ＫＲとＤＨ、又はＫ
ＲとＤＨとＥＲのいずれかを含有する）を、同一の又は異なるＰＫＳ遺伝子クラ
スターに由来する等価セグメントにより、あるいは、変異した又は合成したセグ
メントにより置換して、その結果、予想可能な方法で、種々の程度の還元及び／
又は立体化学を有するポリケチドを生産する新規なハイブリッドポリケチドシン
ターゼを作成することによる。
【０００７】 誤解を避けるために、本文中の用語「延長モジュール」は、ポリケチド鎖延長
の１サイクルに関与する酵素活性を各々有する一組のＩ型ＰＫＳのドメインを指
す。より詳しくは、延長モジュールはＫＳ，ＡＴ、還元ループ（ＫＲ，ＤＨ及び
ＥＲの１つ以上を含有する）、及びＡＣＰを含んで成る。
【０００８】 まれに、還元ループはその他のドメインを含んでもよい。例えば、混合された
ＰＫＳ及びポリペプチドシンターゼを有するエルシニア菌は、メチルトランスフ
ェラーゼドメインを有する。
【０００９】 ＤＥＢＳ１ＴＥのモジュール２の還元ループを、（Ｉ型の）エリスロマイシン
ＰＫＳ遺伝子のモジュール３の等価セグメントにより置換して、S. coelicolor
CH999 で発現させると、トリケチドケトラクトンを生じることが報告されている
（Bedford, D. et al. Chemistry and Biology (1996) 3 : 827-831)。
【００１０】 同様に、ＤＥＢＳ１ＴＥにおいてモジュール２の還元ループを、エリスロマイ
シンＰＫＳのモジュール５の等価セグメントにより置換して、S. coelicolor CH
999 に発現させると、予想した構造及び立体化学を有するトリケチドラクトンを
生じる（McDaniel, R. et al. Chemistry and Biology (1997) 4 : 667-674）。
反対に、エリスロマイシンＰＫＳのモジュール６の還元ループを用いて同じ実験
を行うと、ケトラクトンのみが単離された（McDaniel, R. et al. Chemistry an
d Biology (1997) 4 : 667-674）。
【００１１】 別の実験では、ｅｒｙ遺伝子のローディングドメイン、第一、第二及び第三延
長モジュール、並びにＴＥを含有するトリモジュール系においてモジュール２の
還元ループを、ＫＲ及びＤＨドメインを含有するラパマイシンＰＫＳのモジュー
ル４の等価セグメントにより置換して、S. coelicolor CH999 に発現させると、
予想された二重結合を有するテトラケチドを生じることが示めされている（McDa
niel, R. et al. J. Am. Chem. Soc. (1997) 119 : 4309-4310）。同一系におい
てモジュール２の還元ループを、ＫＲ，ＤＨ及びＥＲドメインを含有するラパマ
イシンＰＫＳのモジュール１の等価セグメントにより置換して、S. coelicolor
CH999 に発現させると、予想されたＣ−５における酸化レベルを有するテトラケ
チドを生じた（Kao, C.M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1997) 119 : 11339-1134
0)。反対に、エリスロマイシンＰＫＳ遺伝子のモジュール４の対応セグメントを
用いた場合、相当な位置に二重結合を有するポリケチドのみが認められ、予想通
りに、完全な還元は認められなかった（Kao, C.M. et al. J. Am. Chem. Soc. (
1997) 119 : 11339-11340）。
【００１２】 ２つの類似の実験では、前記トリモジュール系のモジュール２の還元ループを
、ＫＲ及び不活性ＤＨドメインを有するラパマイシンＰＫＳのモジュール２の対
応セグメントにより、そしてｒａｐＰＫＳのモジュール４のＫＲドメイン（ｒａ
ｐモジュール４の還元ループはＫＲ及びＤＨドメインを有する）により置換した
。両構成体が、Ｃ−３における立体化学の異なるトリケチドラクトンを生じるこ
とが報告されている（Kao, C.M. et al. J. Am. Chem. Soc. (1998) 120 : 2478
-2479)。
【００１３】 前記の全ての例では、ＤＮＡ断片を連結するために、同一の制限部位、Ｐｓｔ
Ｉ及びＸｂａＩが用いられた（ＰｓｔＩ部位の位置は、下記の系において用いら
れたＰｓｔＩ部位と同じであり、ＸｂａＩ部位は、Ｂｓｕ３６Ｉ部位の位置と同
じである）。
【００１４】 ＤＥＢシンターゼの構造のためのモデルが提唱されていて、そこでは、還元ド
メインは、ＫＳ，ＡＴ及びＡＣＰドメインにより形成されたコアの外側に位置す
るループを形成した（Staunton et al. Nature structural biology (1996) 3 :
188-192）。更に、ＤＥＢＳ１は、前記ドメインの境界を示す特定位置において
タンパク質分解酵素により加水分解されることが見つかった（Aparicio, J.F. e
t al. J. Biol. Chem. (1994) 269 : 8524-8528)。これらのタンパク質分解部位
は、主にリンカー領域内に認められ、従ってこれらの部位の極近傍において断片
を連結することが理想的であろう。この例はWO98/01546に記載されている。
【００１５】 一つの点として、本発明は、Ｉ型ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）の少くとも
部分をコードする核酸（特にＤＮＡ）であって、前記部分が延長モジュールの少
くとも部分を含有し、そして当核酸が、還元に関与する酵素をコードする１又は
複数の遺伝子の代りに、複数制限酵素部位を有するポリリンカーを有する前記核
酸を提供する。
【００１６】 別の点として、本発明は、Ｉ型ポリケチドシンターゼを少くとも部分をコード
する核酸（特にＤＮＡ）であって、前記部分が延長モジュールの少くとも部分を
含有し、そして当核酸が、ＡＴ（の少くとも部分）をコードする核酸を、ＡＣＰ
（の少くとも部分）をコードする核酸に接続する複数制限酵素部位を有するポリ
リンカーを有する前記核酸を提供する。
【００１７】 前記核酸は、追加の核酸を有してもよく、それは、１又は複数の還元酵素をコ
ードするものであり、以下に詳しく述べる通り前記ポリリンカー内に挿入される
。この様な挿入は、好ましくは、２つの制限酵素によるポリリンカー含有核酸の
消化の後に行われる。挿入部位の選択を行うために、当ポリリンカーは、好まし
くは少くとも３つの制限部位、より好ましくは少くとも４つ、更に好ましくは少
くとも６つ又は８つの制限部位を含む。
【００１８】 当ポリリンカーは、Ｉ型ＰＫＳをコードする核酸内に外来（通常は合成の）核
酸を導入することにより、あるいは、Ｉ型ＰＫＳをコードする核酸に存在する配
列を工学的に修飾することにより提供され得る。例えば後者を達成するために、
欠損する還元酵素をコードする配列が通常その上流及び／又は下流（好ましくは
両方）に存在するであろう配列内に、特には、その還元酵素と隣接ドメインとの
間のポリペプチドリンカーをコードする配列内に、制限部位を工学的に（例えば
部位特異的変異誘発により）作成し得る。
【００１９】 当ポリリンカーは、望ましくは、下記の制限部位：ＡｖｒII，ＢｇｌII，Ｓｎ
ａＢＩ，ＰｓｔＩ，ＳｐｅＩ，ＮｓｉＩ，Ｂｓｕ３６Ｉ，ＮｈｅＩ及びＨｐａＩ
の中から少くとも数個を有する。より望ましくは、当ポリリンカーは前記部位の
中から少くとも４個を有する。
【００２０】 好ましくは、当ポリリンカー内に含まれる制限部位の少くとも数個が、挿入さ
れる側の核酸の残りの部分において存在しない。望ましくは、当ポリリンカー内
に含まれる制限部位の少くとも数個が、他の（好ましくはＩ型の）ＰＫＳの還元
酵素をコードする天然の核酸配列においてまれであるか、又は存在しない。望ま
しくは、当制限部位の少くとも２個が、ＰＫＳの還元酵素をコードする既知の核
酸配列の少くとも約半分、より望ましくは少くとも約４分の３において存在しな
い。ＰＫＳ遺伝子はＧ及びＣ残基が豊富である傾向にあるので、好ましくは当制
限部位はＡ及びＴが豊富である。
【００２１】 望ましくは、本発明の核酸は、ローディングモジュール及び／又は１又は複数
の延長モジュールをコードする。ローディングモジュールの多様性に関する詳細
は、本出願人により１９９９年６月２９日に出願された係属中の国際特許出願「
Polyketides and their synthesis 」に開示されている。
【００２２】 別の点として、本発明は、一般的には前記通りの核酸であるが、ポリリンカー
内に挿入された１又は複数の還元酵素（例えばＫＲ及び／又はＤＨ及び／又はＥ
Ｒ）をコードする核酸を更に有する前記核酸を提供する。挿入された核酸は、ポ
リリンカーが挿入された核酸のものと同一のポリケチドシンターゼに由来するが
、異なる延長モジュールに由来する１又は複数の還元酵素をコードするものでよ
い。あるいは、挿入された核酸は、異なる天然のＰＫＳ又は脂肪酸シンターゼに
由来する１又は複数の還元酵素をコードする外来性のものでよく、あるいは合成
のものでよく、あるいはＰＫＳ又は脂肪酸シンターゼの１又は複数の還元酵素を
コードする天然の核酸を変異修飾したものでよい。好ましくは、挿入された核酸
は、同一の又は別のＩ型ＰＫＳ又は脂肪酸シンターゼに由来する１又は複数の還
元酵素をコードするものであり、しかしあるいはII型ＰＫＳ又は脂肪酸シンター
ゼに由来する１又は複数の還元酵素をコードするものでよい。
【００２３】 多数の例のＩ型ＰＫＳをコードする遺伝子の配列が決定されており、これらの
配列は、公的に利用可能なＤＮＡ及びタンパク質の配列デーダベース、例えばGe
nbank, EMBL及びSwissprotに公開されている。その中でも、例えばエリスロマイ
シン（Cortes, J. et al. Nature (1990) 348 : 176-178 ; アクセス番号X62569
, Donadio, S. et al. Science (1991) 252 : 675-679 ; アクセス番号M63677)
; ラパマイシン（Schwecke, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92
: 7839-7843 ; アクセス番号X86780) ; リファマイシン（August et al. (1998
) ; アクセス番号AF040570) ; 及びチロシン（tylosin)(Eli Lily、アクセス番
号U78289）の合成を各々支配するＰＫＳの配列が入手可能である。更に、本明細
書の図７は、S. avermitilis由来のアベルメクチンＰＫＳの最初の２つのモジュ
ールをコードする核酸配列を示している。これを、実施例のいくつかで用いた挿
入体のための代替源として用い得る。
【００２４】 異なるＩ型ＰＫＳの対応ドメイン又はモジュールをコードする核酸間の総配列
類似性は十分に高く、そして異なるＩ型ＰＫＳのドメイン構成は、異なるポリケ
チド生産微生物間で非常に一致しており、本発明の新規なハイブリッドポリケチ
ドシンターゼを得るための方法は、一般に、全ての天然のＩ型ＰＫＳ分子及びそ
の誘導体に適用され得ることは、当業者に明白である。
【００２５】 別の点として、本発明は、前記の観点において明記した核酸を含むベクター、
例えばプラスミド又はファージ（好ましくはプラスミド）、並びにこの様な核酸
又は構成体によりトランスフェクトされた宿主細胞（特にストレプトミセス菌種
）を提供する。
【００２６】 更に別の点として、本発明は、前記の宿主細胞により発現することが可能なポ
リケチドシンターゼを提供する。この様なポリケチドシンターゼを、望むなら、
通常の方法によりその宿主細胞から単離することができるが、通常は単離しない
ことが好ましい。
【００２７】 別の点として、本発明は、前記の通りに、ポリリンカー内に、還元酵素をコー
ドする核酸を挿入することによって、新規な機能性ＰＫＳ及びそれをコードする
核酸を創作する方法、並びに前記ＰＫＳにより生産された新規なポリケチドを提
供する。
【００２８】 更に別の点として、本発明は、前記の観点において明記した物質及び方法を用
いて、特定のポリケチドを特異的又は選択的に生産するための新規な方法を提供
する。例えば、本発明は、直接的な発酵行程によりＣ２２−Ｃ２３ジヒドロアベ
ルメクチン、例えばイベルメクチン（実施例２５及び２６参照）、及びＢ２アベ
ルメクチンを実質的に含まないＢ１アベルメクチン（実施例２７及び２８参照）
を生産する方法を提供する。
【００２９】 別の点として、本発明は、新規なポリケチド、及びポリケチドの新規な立体異
性体、例えば、１又は複数の実施例の記載通りに生産された特定のポリケチドを
提供する。
【００３０】 ＤＥＢＳ１ＴＥ系（Cortes J. et al. (1995) 268 : 1487-1489)においてエリ
スロマイシンＰＫＳ遺伝子のモジュール２の還元ループの交換を可能にするため
に、モジュール２の還元ループの代りにポリリンカー（複数クローニング部位（
ｍｃｓ））が挿入されていて、その結果、ＫＳ，ＡＴ及びＡＣＰを含有する最小
モジュールが形成されている。（この系は依然として機能的であり、ケトラクト
ンを生産する（実施例２及び４参照）。前記ｍｃｓは、９個の制限酵素のために
唯一の制限部位を有する。
【００３１】 これらの新しい制限部位は、ポリケチドシンターゼがタンパク質分解酵素によ
って加水分解される部位の近傍のリンカー領域をコードするＤＮＡ内に部分的に
位置する（前記参照）。当制限酵素のいくつかは、相同性の低い領域をコードす
るＤＮＡ内に存在し、一方その他は、高度に保存された領域をコードするＤＮＡ
内に位置する（図１）。酵素ＡｖｒII，ＢｇｌII，Ｂｓｕ３６Ｉ及びＮｈｅＩの
ための制限部位の導入により、ＤＥＢＳのモジュール２のアミノ酸配列は変化し
ない。その他の５個の酵素（ＳｎａＢＩ，ＰｓｔＩ，ＳｐｅＩ，Ｎｓｉ，Ｈｐａ
Ｉ）の場合、そのアミノ酸配列が変化する（図２）。これらの変化は、当タンパ
ク質の活性に影響しない（実施例６参照）。
【００３２】 ２つの前記制限酵素が同じ塩基をカバーするので、異なるｍｃｓを有する２つ
のプラスミド（ｐＪＬＫ１１４及びｐＪＬＫ１１７）を構築することが決定され
た。 ｍｃｓを用いることにより、還元ループの各側に単一の制限部位が存在する場
合に比べて以下の長所が提供される。
【００３３】 １）当ＤＮＡ断片を連結するために適する位置（異なる２０個の組合せ）を、異
なる還元ループ毎に選択することができ、従ってアミノ酸配列における望ましく
ない変化が回避される。 ２）ループ内を切断する酵素を回避することができる。 ３）ループの挿入を、多様な組み合せの（コンビナトリアルな）方法で行い得る
。
【００３４】 本発明者は、同一のポリリンカーを含有する核酸と、１又は複数の還元酵素を
コードする同一の核酸とを用いることにより、１又は複数の還元酵素をコードす
る核酸が、ポリリンカー内の異なる部位に挿入された場合、異なる結果が得られ
得るという驚くべき事実を見い出した。
【００３５】 例えば、実施例７及び８では、第二延長モジュールの結果として当ポリケチド
鎖の完全な還元を達成するために、ラパマイシンモジュール１３の還元ループを
、ｅｒｙモジュール２内に挿入した。希望のトリケチドラクトン生産物が良好な
収率で得られた。しかし実施例３７及び３８では、ｒａｐモジュール１３の同一
還元ループ、又は同一組のドメインを、実施例７及び８の記載通りに、ｅｒｙモ
ジュール２内の本質的に同一な位置に、ただし当ポリリンカーの異なる制限部位
（ＢｇｌII及びＮｓｉＩの代りにＡｖｒII及びＨｐａＩ）を用いて挿入したとこ
ろ、有意な量の副産物が得られた。この様な副産物には、Ｃ−３がケト又はヒド
ロキシのいずれかであるトリケチドラクトンが含まれた。このことは、還元ルー
プの交換のために用いる部位を単に変えることによって、希望産物を得るか、そ
れとも不完全な還元による産物と希望産物との望ましくない混合物を得るかとい
う違いが生じたことを示す。
【００３６】 同様に、実施例３１及び３２では、ｅｒｙモジュール２の還元ループの代りに
、アベルメクチンモジュール１の還元ドメインを挿入するためにＰｓｔＩ及びＢ
ｓｕ３６Ｉ部位を用いた場合（プラスミドｐＧＭＳ２）、予想された産物が生産
されたが、実質的な量のケトラクトンも生産された。実施例２９及び３０の実験
では、ＢｇｌII及びＮｈｅＩ部位を用いた場合（プラスミドｐＪＬＫ３０）、ケ
トラクトン副産物がほとんど生産されなかった。しかし各々の場合で、ラクトン
の量は同程度であった。
【００３７】 実施例２９及び３０と全く同様にして、実施例１４で、同じＢｇｌII及びＮｈ
ｅＩ部位を用いて、チロシンモジュール１の還元ループによりｅｒｙモジュール
２の還元ループを置換した場合（プラスミドｐＪＬＫ３５）、実施例３０及び３
２の場合と同一の目的トリケチドラクトンが、いくらかのケトラクトンを伴うが
、より高収率で生産された。このことは、異なる還元ループが異なる制限部位内
に最も有益に挿入され得ることを示す。
【００３８】 実施例３３及び３４では、ＢｇｌII及びＮｈｅＩ部位を用いてアベルメクチン
モジュール２の還元ドメインを挿入した場合（プラスミドｐＪＬＫ３１）、期待
された産物が主な産物として生産された。実施例３５及び３６では、ＳｎａＢＩ
及びＢｓｕ３６Ｉ部位を用いた場合（プラスミドｐＧＭＳ４）、微量のトリケチ
ドラクトン混合物しか得られなかった。
【００３９】 従って本発明は、特定の還元ループを特定のＰＫＳに挿入して、希望した予想
産物が得られない場合に、ポリリンカー内の異なる部位に対する制限酵素を利用
して、挿入部位を単に調整するという機会を提供する。前記の実施例の比較によ
って示された通り、この様な再調整がポリケチド合成の結果及び収率に激的に影
響を与え得る。
【００４０】実施例１ プラスミドｐＪＬＫ１１４の作成 プラスミドｐＪＬＫ１１４は、ｐＣＪＲ２４を基にしたプラスミドであり、ｅ
ｒｙローディングモジュール、ｅｒｙＰＫＳの第一及び第二延長モジュール、並
びにｅｒｙ鎖停止チオエステラーゼを含んで成るＰＫＳ遺伝子を有する。ただし
アシルトランスフェラーゼの最後と、第二のｅｒｙ延長モジュールのＡＣＰの最
初との間のＤＮＡセグメントが、制限酵素ＡｖｒII，ＢｇｌII，ＳｎａＢＩ，Ｐ
ｓｔＩ，ＳｐｅＩ，ＮｓｉＩ，Ｂｓｕ３６Ｉ及びＨｐａＩの制限部位を有する合
成オリゴヌクレオチドリンカーによって置換されている。このプラスミドを、以
下の通りにいくつかの中間プラスミドを介して作成した（図３）。
【００４１】 プラスミドｐＪＬＫ０２の作成 S. erythraeaのｅｒｙＡＩ遺伝子の約１．４７kbp のＤＮＡ断片を、下記の合
成オリゴヌクレオチド： ５′-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-３′及び ５′-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-３′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＮＴＥＰ２（Oliynyk, M. et al., Ch
emistry and Biology (1996) 3 : 833-839 ; WO98/01546)を鋳型としてＰＣＲに
より増幅した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから
、ＳｍａＩ切断により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したプラ
スミドｐＵＣ１８に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント
化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを
検査した。制限パターン及びＤＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＪＬＫ
０２を同定した。
【００４２】 プラスミドｐＪＬＫ０３の作成 S. erythraeaのｅｒｙＡＩ遺伝子の約１．１２kbp のＤＮＡ断片を、下記の合
成オリゴヌクレオチド： ５′-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-３′及び ５′-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC-３′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＮＴＥＰＨを鋳型としてＰＣＲにより
増幅した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、Ｓ
ｍａＩ切断により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１
８に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限
パターン及びＤＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＪＬＫ０３を同定した
。
【００４３】 プラスミドｐＪＬＫ０４の作成 プラスミドｐＪＬＫ０２をＰｓｔＩ及びＨｐａＩで切断し、そしてその１．４
７kbp 挿入体を、ＰｓｔＩ及びＨｐａＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ０３に連
結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０
Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パター
ンにより、希望のプラスミドｐＪＬＫ０４を同定した。
【００４４】 プラスミドｐＪＬＫ０５の作成 プラスミドｐＪＬＫ０１（PCT/GB97/01819）をＰｓｔＩ及びＡｖｒIIで切断し
、その４６０bp挿入体を、ＰｓｔＩ及びＡｖｒIIで切断したプラスミドｐＪＬＫ
０４に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌
ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制
限パターンにより、希望のプラスミドｐＪＬＫ０５を同定した。
【００４５】 プラスミドｐＪＬＫ０７の作成 プラスミドｐＪＬＫ０５をＳｃａＩ及びＸｂａＩで切断し、プラスミドｐＮＴ
ＥＰ２をＮｄｅＩ及びＳｃａＩで切断し、そしてこれらの２つの断片を、Ｎｄｅ
Ｉ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＣＪＲ２４に連結した。この連結混合液
を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そ
して各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンにより、希望のプラス
ミドｐＪＬＫ０７を同定した。
【００４６】 プラスミドｐＪＬＫ１１４の作成 ２つの合成オリゴヌクレオチドＰｌｆ及びＰｌｂ（図４）をＴＥ緩衝液に各々
溶解した。１０μｌの各溶液（０．５nmol／μｌ）を混合し、そして２分間６５
℃に加熱し、それから室温までゆっくりと冷却した。プラスミドｐＪＬＫ０７を
ＡｖｒII及びＨｐａＩで切断し、そしてアニールしたオリゴヌクレオチドに連結
した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ
細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターン
により、希望のプラスミドｐＪＬＫ１１４を同定した。
【００４７】実施例２ S. erythraea ＪＣ２／ｐＪＬＫ１１４の作成のためのプラスミドｐＪＬＫ１１
４の使用、及びＴＫＬ誘導体の生産 約５μｇのプラスミドｐＪＬＫ１１４を用いて、S. erythraea菌のＪＣ２株（
NCIMB40802として寄託された菌株、WO98/01546）のプロトプラストを形質転換し
、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した。いくつかのコロニー
から総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーションで分析することに
より、当プラスミドがＴＥ遺伝子内に組み込まれたことを確認した。ＪＣ２／ｐ
ＪＬＫ１１４を、５０μｇ／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ３アガー（５
．０ｇグルコース、５０．０ｇ ＭＤ３０Ｅマルトデキストリン、２５．０ｇ
Ａｒｋａｓｏｙ大豆粉、３．０ｇ糖蜜（ビート）、０．２５ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 、
２．５ｇ ＣａＣＯ3 、２２．０ｇアガー、及び１Ｌにするための蒸留水、pH＝
７．０）上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2
分（５００μｌ）をホモジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２
０μｌのギ酸の混合液により抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により
取り除き、その残査をメタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式
質量分析により分析した。主要産物は、（４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２，
４−ジメチル−３−オキソ−ｎ−ヘキサン酸−δ−ラクトン及び（４Ｓ，５Ｒ）
−５−ヒドロキシ−２，４−ジメチル−３−オキソ−ｎ−ヘプタン酸−δ−ラク
トンと同定された。
【００４８】
【化１】
【００４９】実施例３ プラスミドｐＪＬＫ１１７の作成 プラスミドｐＪＬＫ１１７は、ｐＣＪＲ２４を基にしたプラスミドであり、ｅ
ｒｙローディングモジュール、ｅｒｙＰＫＳの第一及び第二延長モジュール、並
びにｅｒｙ鎖停止チオエステラーゼを含んで成るＰＫＳ遺伝子を有する。ただし
アシルトランスフェラーゼの最後と、第二のｅｒｙ延長モジュールのＡＣＰの最
初との間のＤＮＡセグメントが制限酵素ＡｖｒII，ＢｇｌII，ＳｎａＢＩ，Ｐｓ
ｔＩ，ＳｐｅＩ，ＮｓｉＩ，Ｂｓｕ３６Ｉ及びＨｐａＩの制限部位を有する合成
オリゴヌクレオチドリンカーによって置換されている。このプラスミドを、以下
の通りにいくつかの中間プラスミドを介して作成した（図３）。
【００５０】 プラスミドｐＪＬＫ１１５の作成 プラスミドｐＪＬＫ１１４をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断し、その約９．９kb
p の挿入体を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＵＣ１８に連結し
た。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細
胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンに
より、希望のプラスミドｐＪＬＫ１１５を同定した。
【００５１】 プラスミドｐＪＬＫ１１６の作成 プラスミドｐＪＬＫ１３（PCT/GB97/01819）をＢｓｕ３６Ｉ及びＸｂａＩで切
断し、その約１．１kbp 断片を、Ｂｓｕ３６Ｉ及びＸｂａＩで切断したプラスミ
ドｐＪＬＫ１１５に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント
化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを
検査した。制限パターンにより、希望のプラスミドｐＪＬＫ１１６を同定した。
【００５２】 プラスミドｐＪＬＫ１１７の作成 プラスミドｐＪＬＫ１１６をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断し、その９．９kbp
断片を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＣＪＲ２４に連結した。
この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を
形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンにより
、希望のプラスミドｐＪＬＫ１１７を同定した。
【００５３】実施例４ S. erythraea ＪＣ２／ｐＪＬＫ１１７の作成のためのプラスミドｐＪＬＫ１１
７の使用、及びＴＫＬ誘導体の生産 約５μｇのプラスミドｐＪＬＫ１１７を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロ
トプラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離し
た。いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼー
ションで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認
した。ＪＣ２／ｐＪＬＫ１１７を、５０μｇ／mlのチオストレプトンを含有する
ＳＭ３アガー上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１
cm2 分（０．５ml）をホモジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び
２０μｌのギ酸の混合液により抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発によ
り取り除き、その残査をメタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射
式質量分析により分析した。主要産物は、（４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ−２
，４−ジメチル−３−オキソ−ｎ−ヘキサン酸−δ−ラクトン及び（４Ｓ，５Ｒ
）−５−ヒドロキシ−２，４−ジメチル−３−オキソ−ｎ−ヘプタン酸−δ−ラ
クトンと同定された。
【００５４】
【化２】
【００５５】実施例５ プラスミドｐＪＬＫ２５の作成 プラスミドｐＪＬＫ２５は、ｐＪＬＫ１１４を基にしたプラスミドであり、た
だしエリスロマイシンＰＫＳ遺伝子の第二モジュールの還元ループをコードする
ＤＮＡ断片がｍｃｓ内に挿入されている。このプラスミドを以下の通りに、いく
つかの中間プラスミドを介して作成した。
【００５６】 プラスミドｐＪＬＫ１１８の作成 S. erythraeaのｅｒｙＡＩ遺伝子のモジュール２の還元ループをコードする約
１．４kbp のＤＮＡ断片を、下記の合成オリゴヌクレオチド： ５′-ATACTAGTCCTCGTGACGAGCTCGACGG-３′及び ５′-TAATGCATCCGGTTCTCCGGCCCGCTCGCT-３′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＮＴＥＰ２を鋳型としてＰＣＲにより
増幅した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、Ｓ
ｍａＩ切断により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１
８に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限
パターン及びＤＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＪＬＫ１１８を同定し
た。
【００５７】 プラスミドｐＪＬＫ２３の作成 プラスミドｐＪＬＫ１１８をＳｐｅＩ及びＮｓｉＩで切断し、その約１．４kb
p 断片を、ＳｐｅＩ及びＮｓｉＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１１５に連結し
た。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細
胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンに
より希望のプラスミドｐＪＬＫ２３を同定した。
【００５８】 プラスミドｐＪＬＫ２５の作成 プラスミドｐＪＬＫ２３をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断し、その約１１．２kb
p 断片を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＣＪＲ２４に連結した
。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞
を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンによ
り希望のプラスミドｐＪＬＫ２５を同定した。
【００５９】実施例６ S. erythraea ＪＣ２／ｐＪＬＫ２５の作成のためのプラスミドｐＪＬＫ２５の
使用、及びトリケチドの生産 約５μｇのプラスミドｐＪＬＫ２５を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロト
プラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した
。いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認し
た。ＪＣ２／ｐＪＬＫ２５を、５０μｇ／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ
３アガー上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2
分（０．５ml）をホモジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２０
μｌのギ酸の混合液により抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により取
り除き、その残査をメタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式質
量分析により分析した。主要産物は、（標準物質との比較により）（２Ｒ，３Ｓ
，４Ｓ，５Ｒ）−５，３−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−ｎ−ヘキサン酸δ
−ラクトン及び（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５，３−ジヒドロキシ−２，４−
ジメチル−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトンと同定された。
【００６０】
【化３】
【００６１】実施例７ プラスミドｐＪＬＫ２８の作成 プラスミドｐＪＬＫ２８は、ｐＪＬＫ１１７を基にしたプラスミドであり、た
だしｒａｐＰＫＳのモジュール１３の還元ループをコードするＤＮＡ断片がｍｃ
ｓ内に挿入されている。このプラスミドを以下の通りにいくつかの中間体プラス
ミドを介して作成した（図５）。
【００６２】 プラスミドｐＪＬＫ１２０の作成 S. hygroscopicusのｒａｐＣ遺伝子のモジュール１３の還元ループをコードす
る約３．２kbp のＤＮＡセグメントを、下記の合成オリゴヌクレオチド： ５′-TAAGATCTTCCGACCTACGCCTTCCAAC-３′及び ５′-TAATGCATCGACCTCGTTGCGTGCCGCGGT-３′ をプライマーとして、そしてコスミドｃｏｓ３１（Schwecke, T. et al. (1995)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 7839-7843）を鋳型としてＰＣＲにより増幅
した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、Ｓｍａ
Ｉ切断により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したプラスミドｐ
ＵＣ１８に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大
腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した
。制限パターン及びＤＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＪＬＫ１２０を
同定した。
【００６３】 プラスミドｐＪＬＫ２８の作成 プラスミドｐＪＬＫ１２０をＢｇｌII及びＮｓｉＩで切断し、その約３．２kb
p 断片を、ＢｇｌII及びＮｓｉＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１１７に連結し
た。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細
胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンに
より希望のプラスミドｐＪＬＫ２８を同定した。
【００６４】実施例８ ＪＣ２／ｐＪＬＫ２８の作成のためのプラスミドｐＪＬＫ２８の使用、及びトリ
ケチドの生産 約５μｇのプラスミドｐＪＬＫ２８を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロト
プラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した
。いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認し
た。ＪＣ２／ｐＪＬＫ２８を、５０μｇ／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ
３アガー上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2
分（０．５ml）をホモジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２０
μｌのギ酸の混合液により抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により取
り除き、その残査をメタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式質
量分析により分析した。主要産物は、（標準物質との比較により）（２Ｒ，４Ｓ
，５Ｒ）−２，４−ジメチル−５−ヒドロキシ−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン及
び（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４−ジメチル−５−ヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸
δ−ラクトンと同定された。
【００６５】
【化４】
【００６６】実施例９ プラスミドｐＪＬＫ４１の作成 プラスミドｐＪＬＫ４１は、ｐＪＬＫ１１７を基にしたプラスミドであり、た
だしｅｒｙＰＫＳのモジュール４の還元ループをコードするＤＮＡ断片がｍｃｓ
内に挿入されている。このプラスミドを以下の通りにいくつかの中間体プラスミ
ドを介して作成した。
【００６７】 プラスミドｐＪＬＫ３２．３の作成 S. erythraeaのｅｒｙＡII遺伝子のモジュール４の還元ループをコードする約
３．２kbp のＤＮＡセグメントを、下記の合成オリゴヌクレオチド： ５′-ATAGATCTGCCTACGTACCCGTTCGAACACCAGCGCTTC-３′及び ５′-ATCCTCAGGTTCGGCCCTGCCGCCTCGGCCTGCCCGGCGGCGCGCAGCTT-３′ をプライマーとして、そしてコスミドｃｏｓ４Ｂ（エリスロマイシンＰＫＳを有
するコスミド）を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼで処理してから、ＳｍａＩ切断により線状化し、そしてア
ルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に連結した。この連結混合液を用い
て、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各
コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターン及びＤＮＡ配列決定により、
希望のプラスミドｐＪＬＫ３２．３を同定した。
【００６８】 プラスミドｐＪＬＫ３８の作成 プラスミドｐＪＬＫ３２．３をＢｇｌII及びＢｓｕ３６Ｉで切断し、その約３
．２kbp 断片を、ＢｇｌII及びＢｓｕ３６Ｉで切断したプラスミドｐＪＬＫ１１
６に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限
パターンにより希望のプラスミドｐＪＬＫ３８を同定した。
【００６９】 プラスミドｐＪＬＫ４１の作成 プラスミドｐＪＬＫ３８をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断し、その約１３kbp 断
片を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＣＪＲ２４に連結した。こ
の連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形
質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンにより、
希望のプラスミドｐＪＬＫ４１を同定した。
【００７０】実施例１０ ＪＣ２／ｐＪＬＫ４１の作成のためのプラスミドｐＪＬＫ４１の使用、及びトリ
ケチドの生産 約５μｇのプラスミドｐＪＬＫ４１を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロト
プラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した
。いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認し
た。ＪＣ２／ｐＪＬＫ４１を、５０μｇ／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ
３アガー上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2
分（０．５ml）をホモジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２０
μｌのギ酸の混合液により抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により取
り除き、その残査をメタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式質
量分析により分析した。主要産物は、（標準物質との比較により）（２Ｓ，４Ｓ
，５Ｒ）−２，４−ジメチル−５−ヒドロキシ−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン及
び（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４−ジメチル−５−ヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸
δ−ラクトンと同定された。
【００７１】
【化５】
【００７２】実施例１１ プラスミドｐＪＬＫ２９の作成 プラスミドｐＪＬＫ２９は、ｐＪＬＫ１１７を基にしたプラスミドであり、た
だしｒａｐＰＫＳのモジュール１０の還元ループをコードするＤＮＡ断片がｍｃ
ｓ内に挿入されている。このプラスミドを、以下の通りにいくつかの中間プラス
ミドを介して作成した（図５）。
【００７３】 プラスミドｐＪＬＫ１２１．１の作成 S. hygroscopicusのｒａｐＢ遺伝子のモジュール１０の還元ループをコードす
る約２．２kbp のＤＮＡ断片を、下記の合成オリゴヌクレオチド： ５′-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-３′及び ５′-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-３′ をプライマーとして、そしてコスミドｃｏｓ２６（Schwecke, T. et al. (1995)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 7839-7843）をＳｃａＩ及びＳｐｈＩで切断
して得られた約７kbp 断片を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物
をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、ＳｍａＩ切断により線状化し
、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に連結した。この連結混
合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し
、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターン及びＤＮＡ配列決
定により、希望のプラスミドｐＪＬＫ１２１．１を同定した。
【００７４】 プラスミドｐＪＬＫ２９の作成 プラスミドｐＪＬＫ１２１．１をＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断し、その約２．
２kbp 断片を、ＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１１７に連
結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０
Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パター
ンにより、希望のプラスミドｐＪＬＫ２９を同定した。
【００７５】実施例１２ S. erythraea ＪＣ２／ｐＪＬＫ２９の作成のためのプラスミドｐＪＬＫ２９の
使用、及びトリケチドの生産 約５μｇのプラスミドｐＪＬＫ２９を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロト
プラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した
。いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認し
た。凝集を減らすために単一のスプリングを有する２５０mlのフラスコ内で、Ｊ
Ｃ２／ｐＪＬＫ２９を、５μｇ／mlチオストレプトンを含有する３０mlのＳＭ３
培地に接種し、３０℃で３００ｒｐｍで撹拌した。８日後、このブロスを遠心し
、その上清をpH３に調整し、そして等量のエチルアセテートで３回抽出した。こ
の溶媒を流し捨て、そして蒸発により取り除き、その残査をメタノール中に溶解
し、そしてＨＰＬＣ及び電荷噴射式質量分析により分析し、そしてトリメチルシ
リル−ジアゾメタンによるメチルエステルへの変換後にＧＣ／ＭＳにより分析し
た。主要産物は、（標準物質との比較により）（４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシ
−２，４−ジメチル−ｎ−ヘキセ−２−ン酸及び（４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキ
シ−２，４−ジメチル−ｎ−ヘプタ−２−ン酸と同定された。
【００７６】
【化６】
【００７７】実施例１３ プラスミドｐＪＬＫ３５の作成 プラスミドｐＪＬＫ３５は、ｐＪＬＫ１１７を基にしたプラスミドであり、た
だしチロシンＰＫＳのモジュール１の還元ループをコードするＤＮＡ断片がｍｃ
ｓ内に挿入されている。このプラスミドを以下の通りにいくつかの中間体プラス
ミドを介して作成した（図５）。
【００７８】 プラスミドｐＪＬＫ３３．１の作成 S. fradiaeのチロシンＰＫＳ遺伝子のモジュール１の還元ループをコードする
約１．６kbp のＤＮＡセグメントを、下記の合成オリゴヌクレオチド： ５′-TAAGATCTCCCTACGTACCCCTTCAACCAC-３′及び ５′-GCTAGCCGCCGCGCCAGCTCGGGC-３′ をプライマーとして、そしてコスミド６Ｔ（チロシン生産ＰＫＳ遺伝子を有する
コスミド）を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼで処理してから、ＳｍａＩ切断により線状化し、そしてアルカ
リホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に連結した。この連結混合液を用いて、
電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロ
ニー内のプラスミドを検査した。制限パターン及びＤＮＡ配列決定により、希望
のプラスミドｐＪＬＫ３３．１を同定した。
【００７９】 プラスミドｐＪＬＫ３５の作成 プラスミドｐＪＬＫ３３．１をＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断し、その約１．６
kbp の断片を、ＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１１７に連
結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０
Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パター
ンにより希望のプラスミドｐＪＬＫ３５を同定した。
【００８０】実施例１４ S. erythraea ＪＣ２／ｐＪＬＫ３５の作成のためのプラスミドｐＪＬＫ３５の
使用、及びトリケチドの生産 約５μｇのプラスミドｐＪＬＫ３５を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロト
プラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した
。いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認し
た。ＪＣ２／ｐＪＬＫ３５を、５０μｇ／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ
３アガー上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2
分（０．５ml）をホモジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２０
μｌのギ酸の混合液により抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により取
り除き、その残査をメタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式質
量分析により分析した。主要産物は、（標準物質との比較により）（２Ｒ，３Ｒ
，４Ｓ，５Ｒ）−５，３−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−ｎ−ヘキサン酸δ
−ラクトン及び（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５，３−ジヒドロキシ−２，４−
ジメチル−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトンと同定された。
【００８１】
【化７】
【００８２】実施例１５ プラスミドｐＲＩＦ７の作成 プラスミドｐＲＩＦ７は、ｐＪＬＫ１１７を基にしたプラスミドであり、ただ
しリファマイシンＰＫＳのモジュール７の還元ループをコードするＤＮＡ断片が
ｍｃｓ内に挿入されている。このプラスミドを以下の通りにいくつかの中間体プ
ラスミドを介して作成した（図５）。
【００８３】 プラスミドｐＲＩＦ７の作成 Amycolatopsis mediterraneiのリファマイシンＰＫＳ遺伝子のモジュール７の
還元ループをコードする約２．１kbp のＤＮＡセグメントを、下記の合成オリゴ
ヌクレオチド： ５′-CCTACGTACGCCTTCGACCACCAGCACTT-３′及び ５′-CGGCTAGCGGGCGTTCCAGGCCGCCGTCCT をプライマーとして、そしてコスミド６（アクセス番号AF040570の番号に従って
、35727から76199までのコスミド）を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。このＰ
ＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、ＳｍａＩ切断により
線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に連結した。こ
の連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形
質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターン及びＤＮ
Ａ配列決定により、希望のプラスミドｐＵＣＲＩＦ７を同定した。
【００８４】 プラスミドｐＲＩＦ７の作成 プラスミドｐＵＣＲＩＦ７をＳｎａＢＩ及びＮｈｅＩで切断し、その約２．１
kbp の断片を、ＳｎａＢＩ及びＮｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１１７に
連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１
０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パタ
ーンにより希望のプラスミドｐＲＩＦ７を同定した。
【００８５】実施例１６ S. erythraea ＪＣ２／ｐＲＩＦ７の作成のためのプラスミドｐＲＩＦ７の使用
、及びトリケチドの生産 約５μｇのプラスミドｐＲＩＦ７を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロトプ
ラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した。
いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーショ
ンで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認した
。ＪＣ２／ｐＲＩＦ７を、５０μｇ／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ３ア
ガー上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2 分を
ホモジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２０μｌのギ酸の混合
液により抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により取り除き、その残査
をメタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式質量分析により分析
した。主要産物は、（標準物質との比較により）（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−
５，３−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン及び（
２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５，３−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−ｎ−ヘ
プタン酸δ−ラクトンが同定された。
【００８６】
【化８】
【００８７】実施例１７ プラスミドｐＪＬＫ５２の作成 プラスミドｐＪＬＫ５２は、ｐＪＬＫ３５を基にしたプラスミドであり、ｅｒ
ｙローディングモジュール、ｅｒｙクラスターの第一、第二及び第三延長モジュ
ール、並びにｅｒｙ鎖停止チオエステラーゼを含んで成るＰＫＳ遺伝子を有する
。ただしアシルトランスフェラーゼの最後と、第二のｅｒｙ延長モジュールのＡ
ＣＰの最初との間のＤＮＡセグメントが、チロシンＰＫＳのモジュール１の等価
セグメントによって置換されている。このプラスミドを、以下の通りにいくつか
の中間プラスミドを介して作成した。
【００８８】 プラスミドｐＪＬＫ５０の作成 S. erythraeaのエリスロマイシンＰＫＳ遺伝子クラスターのモジュール２のＡ
ＣＰの最初からモジュール３のＡＣＰの最初までのＤＮＡ断片をコードする約６
．１kbp のＤＮＡ断片を、下記の合成オリゴヌクレオチド： ５′-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-３′及び ５′-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-３′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＢＡＭ２５を鋳型としてＰＣＲにより
増幅した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、Ｓ
ｍａＩ切断により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１
８に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌Ｄ
Ｈ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限
パターン及びＤＮＡ配列決定により希望のプラスミドｐＪＬＫ５０を同定した。
【００８９】 プラスミドｐＪＬＫ５２の作成 プラスミドｐＪＬＫ５０をＮｈｅＩで切断し、その約６．１kbp の挿入体を、
ＮｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ３５に連結した。この連結混合液を用い
て、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各
コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンにより希望のプラスミドｐＪ
ＬＫ５２を同定した。
【００９０】実施例１８ S. erythraea ＮＲＲＬ２３３８／ｐＪＬＫ５２の作成のためのプラスミドｐＪ
ＬＫ５２の使用、及びテトラケチド及びマクロライドの生産 約５μｇのプラスミドｐＪＬＫ５２を用いて、S. erythraea菌のＮＲＲＬ２３
３８株のプロトプラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロ
ニーを単離した。いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイ
ブリダイゼーションで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれ
たことを確認した。５μｇ／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ３培地にS. e
rythraea ＮＲＲＬ２３３８／ｐＪＬＫ５２を接種し、７〜１２日間２８〜３０
℃で増殖させた。その後、このブロスを遠心して、その上清のpHをpH＝９．５に
調整した。次にこの上清を、等量のエチルアセテートで３回抽出し、そしてその
溶媒を蒸発により取り除いた。その残査をメタノール中に溶解し、ＧＣ／ＭＳ，
ＨＰＬＣ／ＭＳ及びＭＳ−ＭＳにより分析した。テトラケチドをＧＣ／ＭＳによ
り同定した。主要成分は、下記のものであった。
【００９１】
【化９】
【００９２】 下記のマクロライドを、ＨＰＬＣ／ＭＳ，ＭＳ−ＭＳ及び１Ｈ−ＮＭＲにより
同定した（これは、ＰＫＳ後の酵素による不完全なプロセシング産物に伴うもの
であった）。
【化１０】
【００９３】実施例１９ プラスミドｐＪＬＫ５３の作成 プラスミドｐＪＬＫ５３は、ｐＪＬＫ２８を基にしたプラスミドであり、ｅｒ
ｙローディングモジュール、ｅｒｙクラスターの第一、第二及び第三延長モジュ
ール、並びにｅｒｙ鎖停止チオエステラーゼを含んで成るＰＫＳ遺伝子を有する
。ただしアシルトランスフェラーゼの最後と、第二のｅｒｙ延長モジュールのＡ
ＣＰの最初との間のＤＮＡセグメントが、ラパマイシンＰＫＳのモジュール１３
の等価セグメントによって置換されている。このプラスミドを、以下の通りに作
成した。
【００９４】 プラスミドｐＪＬＫ５０をＮｈｅＩで切断し、その６．１kbp の挿入体を、Ｎ
ｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ２８に連結した。この連結混合液を用いて
、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コ
ロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンにより希望のプラスミドｐＪＬ
Ｋ５３を同定した。
【００９５】実施例２０ S. erythraea ＮＲＲＬ２３３８／ｐＪＬＫ５３の作成のためのプラスミドｐＪ
ＬＫ５３の使用、及びＴＫＬ誘導体の生産 約５μｇのプラスミドｐＪＬＫ５３を用いて、S. erythraea ＮＲＲＬ２３３
８のプロトプラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニー
を単離した。いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリ
ダイゼーションで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたこ
とを確認した。５μｇ／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ３培地にS. eryth
raea ＮＲＲＬ２３３８／ｐＪＬＫ５３を接種し、７〜１０日間２８〜３０℃で
増殖させた。その後、このブロスを遠心して、その上清のpHをpH＝９．５に調整
した。次にこの上清を、等量のエチルアセテートで３回抽出し、そしてその溶媒
を蒸発により取り除いた。その残査をメタノール中に溶解し、ＧＣ／ＭＳ，ＨＰ
ＬＣ／ＭＳ及びＭＳ−ＭＳにより分析した。テトラケチドをＧＣ／ＭＳにより同
定した。主要成分は、下記のものであった。
【００９６】
【化１１】
【００９７】 下記のマクロライドを、ＨＰＬＣ／ＭＳ，ＭＳ−ＭＳ及び１Ｈ−ＮＭＲにより
同定した（これは、ＰＫＳ後の酵素による不完全なプロセシング産物に伴うもの
であった）。
【化１２】
【００９８】実施例２１ プラスミドｐＪＬＫ５４の作成 プラスミドｐＪＬＫ５４は、ｐＪＬＫ２９を基にしたプラスミドであり、ｅｒ
ｙローディングモジュール、ｅｒｙクラスターの第一、第二及び第三延長モジュ
ール、並びにｅｒｙ鎖停止チオエステラーゼを含んで成るＰＫＳ遺伝子を有する
。ただしアシルトランスフェラーゼの最後と、第二のｅｒｙ延長モジュールのＡ
ＣＰの最初との間のＤＮＡセグメントが、ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０
の等価セグメントによって置換されている。このプラスミドを、以下の通りに作
成した。
【００９９】 プラスミドｐＪＬＫ５０をＮｈｅＩで切断し、その６．１kbp の挿入体を、Ｎ
ｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ２９に連結した。この連結混合液を用いて
、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コ
ロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンにより希望のプラスミドｐＪＬ
Ｋ５４を同定した。
【０１００】実施例２２ S. erythraea ＮＲＲＬ２３３８／ｐＪＬＫ５４の作成のためのプラスミドｐＪ
ＬＫ５４の使用、及びテトラケチド誘導体及びマクロライドの生産 約５μｇのプラスミドｐＪＬＫ５４を用いて、S. erythraea ＮＲＲＬ２３３
８のプロトプラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニー
を単離した。いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリ
ダイゼーションで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたこ
とを確認した。５μｇ／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ３培地にS. eryth
raea ＮＲＲＬ２３３８／ｐＪＬＫ５４を接種し、７〜１０日間２８〜３０℃で
増殖させた。その後、このブロスを遠心して、その上清のpHをpH＝９．５に調整
した。次にこの上清を、等量のエチルアセテートで３回抽出し、そしてその溶媒
を蒸発により取り除いた。その残査をメタノール中に溶解し、ＧＣ／ＭＳ，ＨＰ
ＬＣ／ＭＳ及びＭＳ−ＭＳにより分析した。テトラケチドをＧＣ／ＭＳにより同
定した。主要成分は、下記のものであった。
【０１０１】
【化１３】
【０１０２】 下記のマクロライドを、ＨＰＬＣ／ＭＳ，ＭＳ−ＭＳ及び１Ｈ−ＮＭＲにより
同定した（これは、ＰＫＳ後の酵素による不完全なプロセシング産物に伴うもの
であった）。
【化１４】
【０１０３】アベルメクチン 実施例２３ ｐＪＬＫ１３６の作成 プラスミドｐＪＬＫ１３６は、ｐＷＨＭ３を基にしたプラスミドであり、アベ
ルメクチンＰＫＳ遺伝子のモジュール２の還元ループの上流及び下流のフランキ
ング領域、並びにこれらの２つの断片を接続するｍｃｓ内に挿入されたエリスロ
マイシン耐性遺伝子を含有する。プラスミドｐＷＨＭ３は、Vara J et al, J Ba
cteriol 1989, 171 : 5872-5881 に記載されている。このプラスミドｐＪＬＫ１
３６を、以下の通りにいくつかの中間プラスミドを介して作成した（図６）。
【０１０４】 ｐＪＬＫ１３０の作成 S. avermitilisのアベルメクチンＰＫＳ遺伝子のモジュール２の還元ループの
上流領域をコードする約２．４kbp のＤＮＡセグメントを、以下の合成オリゴヌ
クレオチド： 5′-GACGCCGAATTCTTCGGCATCAGCCCCCGCGAAG-3′及び 5′-GAGCTAGCAGGTGGGGAGATCTAGGTGGGTGTGGGTGTGGGGTTGGTTGTGGTGGTGGGTGTA-3′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＩＧ２２（Galloway, I.S. (1998) Th
esis, University of Cambridge, UK)を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。この
ＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、ＳｍａＩ切断によ
り線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に連結した。
この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を
形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターン及びＤ
ＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＪＬＫ１３０を同定した。
【０１０５】 ｐＪＬＫ１３１の作成 S. avermitilisのモジュール２の還元ループの下流領域をコードするアベルメ
クチンＰＫＳ遺伝子の約２．０kbp のＤＮＡセグメントを、以下の合成オリゴヌ
クレオチド： ５′-GCCCGGCTAGCCGGCCAGACACACGAACAACAGC-３′及び ５′-GGGAATTCCTCGAGGATGACGTGGGCGTTGGTGC-３′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＩＧ２５（Galloway, I.S. (1998) Th
esis, University of Cambridge, UK)を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。この
ＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、ＳｍａＩ切断によ
り線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に連結した。
この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を
形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターン及びＤ
ＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＪＬＫ１３１を同定した。
【０１０６】 プラスミドｐＪＬＫ１３２の作成 プラスミドｐＪＬＫ１３０をＮｈｅＩ及びＸｂａＩで切断し、その約２．４kb
p の挿入体を、ＮｈｅＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１３１に連
結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０
Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パター
ンにより希望のプラスミドｐＪＬＫ１３２を同定した。
【０１０７】 プラスミドｐＪＬＫ１３３の作成 プラスミドｐＪＬＫ１１７をＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断し、その約０．１kb
p の挿入体を、ＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１３２に連
結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０
Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パター
ンにより、希望のプラスミドｐＪＬＫ１３３を同定した。
【０１０８】 ｐＪＬＫ１３４の作成 S. erythraeaのエリスロマイシン遺伝子クラスターのエリスロマイシン耐性を
コードする約１．９kbp のＤＮＡセグメントを、下記の合成オリゴヌクレオチド
： ５′-TAAGATCTAGCGCTCCGAGGTTCTTGCCCG-３′及び ５′-ATGCTAGCCTACCGCTGCCCGGGTCCGCCG-３′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＲＨ３（Dhillon, N, et al. Molecul
ar Microbiology (1989) 3 : 1405-1414）を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。
このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、ＳｍａＩ切断
により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に連結し
た。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細
胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターン及
びＤＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＪＬＫ１３４を同定した。
【０１０９】 プラスミドｐＪＬＫ１３５の作成 プラスミドｐＪＬＫ１３４をＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断し、その約１．９kb
p の挿入体を、ＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１３３に連
結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０
Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パター
ンにより希望のプラスミドｐＪＬＫ１３５を同定した。
【０１１０】 プラスミドｐＪＬＫ１３６の作成 プラスミドｐＪＬＫ１３５をＥｃｏＲＩで切断し、その約６．３kbp の挿入体
を、ＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＷＨＭ３に連結した。この連結混合液を
用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そし
て各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンにより希望のプラスミド
ｐＪＬＫ１３６を同定した。
【０１１１】実施例２４ プラスミドｐＪＬＫ１３６の使用 約１０μｇのプラスミドｐＪＬＫ１３６を用いて、S. avermitilis (MacNeil,
D.J. and Klapko, C.M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2 : 209
-218)のプロトプラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン及びエリ
スロマイシン耐性コロニーを単離した。選択した各コロニーを非選択性液体培地
中で４回サブ培養し、そしてプロトプラストの調製及び再生を行った（MacNeil
T. et al J. Bacteriol. (1993) 175 : 2552-2563 に記載の培地）。チオストレ
プトン感受性及びエリスロマイシン耐性コロニーを単離し、そしてサザンブロッ
トハイブリダイゼーションにより特性の分析を行った。１つのこの様なコロニー
をS. avermitilis／ＪＬＫ１と称した。
【０１１２】実施例２５ プラスミドｐＪＬＫ１３７の作成 プラスミドｐＪＬＫ１２０をＢｇｌII及びＮｓｉＩで切断し、その約３．２kb
p の挿入体を、ＢｇｌII及びＮｓｉＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１３３に連
結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０
Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パター
ンにより希望のプラスミドｐＪＬＫ１３７を同定した。
【０１１３】 プラスミドｐＪＬＫ１３８の作成 プラスミドｐＪＬＫ１３７をＥｃｏＲＩで切断し、その約７．６kbp の挿入体
を、ＥｃｏＲＩで切断し、そしてアルカリホスファターゼで処理したプラスミド
ｐＷＨＭ３に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した
大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査し
た。制限パターンにより希望のプラスミドｐＪＬＫ１３８を同定した。
【０１１４】実施例２６ プラスミドｐＪＬＫ１３８の使用 約１０μｇのプラスミドｐＪＬＫ１３８を用いて、S. avermitilis (MacNeil,
D.J. and Klapko, C.M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2 : 209
-218)のプロトプラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン及びエリ
スロマイシン耐性コロニーを単離した。選択した各コロニーを非選択性液体培地
中で４回サブ培養し、そしてプロトプラストの調製及び再生を行った（MacNeil
T. et al J. Bacteriol. (1993) 175 : 2552-2563 に記載の培地）。チオストレ
プトン及びエリスロマイシン感受性コロニーを単離し、そしてサザンブロットハ
イブリダイゼーションにより特性の分析を行った。S. avermitilis／ｐＪＬＫ１
３８の１つのコロニーを液体培地に接種した（Pang, C-H. et al J. of Antibio
tics (1995) 48 : 59-66に記載の発酵）。その培養液を集め、そして前記文献（
Pang, C-H. et al J. of Antibiotics (1995) 48 : 59-66）の記載通りに産物を
単離且つ精製した。この産物をＨＰＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ−ＮＭＲにより分析し、
そして下記の化合物が同定された。
【０１１５】
【化１５】
【０１１６】実施例２７ プラスミドｐＪＬＫ１３９の作成 プラスミドｐＪＬＫ１２１．１をＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断し、その２．２
kbp の断片を、ＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１３３に連
結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０
Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パター
ンにより希望のプラスミドｐＪＬＫ１３９を同定した。
【０１１７】 プラスミドｐＪＬＫ１４０の作成 プラスミドｐＪＬＫ１３９をＥｃｏＲＩで切断し、その約６．６kbp の挿入体
を、ＥｃｏＲＩで切断し、そしてアルカリホスファターゼで処理したプラスミド
ｐＷＨＭ３に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した
大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査し
た。制限パターンにより希望のプラスミドｐＪＬＫ１４０を同定した。
【０１１８】実施例２８ プラスミドｐＪＬＫ１４０の使用 約１０μｇのプラスミドｐＪＬＫ１４０を用いて、S. avermitilis (MacNeil,
D.J. and Klapko, C.M. Journal of Industrial Microbiology (1987) 2 : 209
-218)のプロトプラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン及びエリ
スロマイシン耐性コロニーを単離した。選択した各コロニーを非選択性液体培地
中で４回サブ培養し、そしてプロトプラストの調製及び再生を行った（MacNeil
T. et al J. Bacteriol. (1993) 175 : 2552-2563 に記載の培地）。チオストレ
プトン及びエリスロマイシン感受性コロニーを単離し、そしてサザンブロットハ
イブリダイゼーションにより特性の分析を行った。S. avermitilis／ｐＪＬＫ１
４０の１つのコロニーを液体培地に接種した（Pang, C-H. et al J. of Antibio
tics (1995) 48 : 59-66に記載の発酵）。その培養液を集め、そして前記文献（
Pang, C-H. et al J. of Antibiotics (1995) 48 : 59-66）の記載通りに産物を
単離且つ精製した。この産物をＨＰＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ−ＮＭＲにより分析し、
そして下記の化合物が同定された。
【０１１９】
【化１６】
【０１２０】実施例２９ プラスミドｐＪＬＫ３０の作成 ｐＪＬＫ３０は、ｐＪＬＫ１１７を基にしたプラスミドであり、ただしアベル
メクチンＰＫＳのモジュール１の還元ループをコードするＤＮＡが、制限部位Ｂ
ｇｌII及びＮｈｅＩを介してポリリンカー内に挿入されている。このプラスミド
を、いくつかの中間プラスミドを介して作成した。
【０１２１】 プラスミドｐＩＧ６７の作成 S. avermitilisのアベルメクチンＰＫＳ遺伝子のモジュール１の還元ループを
コードする約１．７kbp のＤＮＡセグメントを、下記の合成オリゴヌクレオチド
： ５′-CCTAGATCCGCCCACCTACCCCTTCCAACACCAG-３′及び ５′-TGGGCTAGCGTTTTGTGCAACTCCGCCGGTGGAGTG-３′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＴ７−７内に挿入されたアベルメクチ
ンＰＫＳの最初の２つのモジュールを有するプラスミドｐＩＧ１５５、又はStre
ptomyces avermitilisの染色体ＤＮＡのいずれかを鋳型としてＰＣＲにより増幅
した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、Ｓｍａ
Ｉ切断により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に
連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１
０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パタ
ーン及びＤＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＩＧ６７を同定した。
【０１２２】 プラスミドｐＪＬＫ３０の作成 プラスミドｐＩＧ６７をＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断し、その１．７kbp 断片
を、ＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１１７に連結した。こ
の連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形
質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンにより、
希望のプラスミドｐＪＬＫ３０を同定した。
【０１２３】実施例３０ S. erythraea ＪＣ２／ｐＪＬＫ３０の作成のためのプラスミドｐＪＬＫ３０の
使用、及びトリケチドの生産 約５mgのプラスミドｐＪＬＫ３０を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロトプ
ラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した。
いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーショ
ンで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認した
。ＪＣ２／ｐＪＬＫ３０を、５０mg／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ３ア
ガー上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2 分を
ホモジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２０mlのギ酸の混合液
により抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により取り除いた。その残査
をメタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式質量分析により分析
した。主要産物は、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５，３−ジヒドロキシ−２，
４−ジメチル−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン及び（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−
５，３−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン（合計
２５mg／ｌ）と同定された。対応する３−ケトラクトンのほとんどいずれも検出
されなかった。
【０１２４】実施例３１ プラスミドｐＧＭＳ２の作成 ｐＧＭＳ２は、ｐＪＬＫ１１７を基にしたプラスミドであり、ただしアベルメ
クチンＰＫＳのモジュール１の還元ループをコードするＤＮＡが、制限部位Ｐｓ
ｔＩ及びＢｓｕ３６Ｉを介してポリリンカー内に挿入されている。このプラスミ
ドを、いくつかの中間プラスミドを介して作成した。
【０１２５】 プラスミドｐＩＧ６８の作成 S. avermitilisのアベルメクチンＰＫＳ遺伝子のモジュール１の還元ループを
コードする約１．７kbp のＤＮＡセグメントを、下記の合成オリゴヌクレオチド
： ５′-TGGCTGCAGAGCTCACAGCCGGGTGCCGGATCCGGTT-３′及び ５′-TTTCCTCAGGTCCGCCGGTGGAGTGGGGCGCTGGAC-３′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＴ７−７内に挿入されたアベルメクチ
ンＰＫＳの最初の２つのモジュールを有するプラスミドｐＩＧ１５５、又はStre
ptomyces avermitilisの染色体ＤＮＡのいずれかを鋳型としてＰＣＲにより増幅
した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、Ｓｍａ
Ｉ切断により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に
連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１
０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パタ
ーン及びＤＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＩＧ６８を同定した。
【０１２６】 プラスミドｐＧＭＳ１の作成 プラスミドｐＩＧ６８をＰｓｔＩ及びＢｓｕ３６Ｉで切断し、その約１．７kb
p の断片を、ＰｓｔＩ及びＢｓｕ３６Ｉで切断したプラスミドｐＪＬＫ１１６に
連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１
０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パタ
ーンにより希望のプラスミドｐＧＭＳ１を同定した。
【０１２７】 プラスミドｐＧＭＳ２の作成 プラスミドｐＧＭＳ１をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断し、その約１１．５kbp
の断片を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＣＪＲ２４に連結した
。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞
を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンによ
り希望のプラスミドｐＧＭＳ２を同定した。
【０１２８】実施例３２ S. erythraea ＪＣ２／ｐＧＭＳ２の作成のためのプラスミドｐＧＭＳ２の使用
、及びトリケチドの生産 約５mgのプラスミドｐＧＭＳ２を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロトプラ
ストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した。い
くつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーション
で分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認した。
ＪＣ２／ｐＧＭＳ２を、５０μｇ／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ３アガ
ー上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2 分をホ
モジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２０mlのギ酸の混合液に
より抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により取り除いた。その残査を
メタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式質量分析により分析し
た。産物は、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５，３−ジヒドロキシ−２，４−ジ
メチル−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン及び（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５，３
−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン（合計１７mg
／ｌ）、並びにまた実質的な量の対応する３−ケトラクトン（５．５mg／ｌ）と
同定された。
【０１２９】
【化１７】
【０１３０】実施例３３ プラスミドｐＪＬＫ３１の作成 ｐＪＬＫ３１は、ｐＪＬＫ１１７を基にしたプラスミドであり、ただしアベル
メクチンＰＫＳのモジュール２の還元ループをコードするＤＮＡが、制限部位Ｂ
ｇｌII及びＮｈｅＩを介してポリリンカー内に挿入されている。このプラスミド
を、いくつかの中間プラスミドを介して作成した。
【０１３１】 プラスミドｐＩＧ６９の作成 S. avermitilisのアベルメクチンＰＫＳ遺伝子のモジュール２の還元ループを
コードする約２．４kbp のＤＮＡセグメントを、下記の合成オリゴヌクレオチド
： ５′-CCTAGATCTCCCCACCTACCCCTTCCAACACCACCACTACTG-３′及び ５′-CCGGCTAGCCGGGCGTGCAGCTGGGCGCCGTTGTCCGCAC-３′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＴ７−７内に挿入されたアベルメクチ
ンＰＫＳの最初の２つのモジュールを有するプラスミドｐＩＧ１５５、又はStre
ptomyces avermitilisの染色体ＤＮＡのいずれかを鋳型としてＰＣＲにより増幅
した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、Ｓｍａ
Ｉ切断により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に
連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１
０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パタ
ーン及びＤＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＩＧ６９を同定した。
【０１３２】 プラスミドｐＪＬＫ３１の作成 プラスミドｐＩＧ６９をＢｇｌII、ＮｈｅＩ及びＤｒａＩで切断し、その２．
４kbp 断片を、ＢｇｌII及びＮｈｅＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１１７に連
結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０
Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パター
ンにより、希望のプラスミドｐＪＬＫ３１を同定した。
【０１３３】実施例３４ S. erythraea ＪＣ２／ｐＪＬＫ３１の作成のためのプラスミドｐＪＬＫ３１の
使用、及びトリケチドの生産 約５mgのプラスミドｐＪＬＫ３１を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロトプ
ラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した。
いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーショ
ンで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認した
。ＪＣ２／ｐＪＬＫ３１を、５０mg／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ３ア
ガー上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2 分を
ホモジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２０mlのギ酸の混合液
により抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により取り除いた。その残査
をメタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式質量分析により分析
した。主要産物は、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５，３−ジヒドロキシ−２，
４−ジメチル−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン及び（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−
５，３−ジヒドロキシ−２，４−ジメチル−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン（合計
３０mg／Ｌ）と同定された。
【０１３４】
【化１８】
【０１３５】実施例３５ プラスミドｐＧＭＳ４の作成 ｐＧＭＳ４は、ｐＪＬＫ１１７を基にしたプラスミドであり、ただしアベルメ
クチンＰＫＳのモジュール２の還元ループをコードするＤＮＡが、制限部位Ｓｎ
ａＢＩ及びＢｓｕ３６Ｉを介してポリリンカー内に挿入されている。このプラス
ミドを、いくつかの中間プラスミドを介して作成した。
【０１３６】 プラスミドｐＩＧ７０の作成 S. avermitilisのアベルメクチンＰＫＳ遺伝子のモジュール２の還元ループを
コードする約２．４kbp のＤＮＡセグメントを、下記の合成オリゴヌクレオチド
： ５′-CCCTACGTACCCCTTCCAACACCACTACTGGCTCGAAAG-３′及び ５′-GGCCCTCAGGTGGGCGCCGTTGTCCGCACCACCGGTA-３′ をプライマーとして、そしてプラスミドｐＴ７−７内に挿入されたアベルメクチ
ンＰＫＳの最初の２つのモジュールを有するプラスミドｐＩＧ１５５、又はStre
ptomyces avermitilisの染色体ＤＮＡのいずれかを鋳型としてＰＣＲにより増幅
した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、Ｓｍａ
Ｉ切断により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したｐＵＣ１８に
連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１
０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パタ
ーン及びＤＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＩＧ７０を同定した。
【０１３７】 プラスミドｐＧＭＳ３の作成 プラスミドｐＩＧ７０をＳｎａＢＩ，Ｂｓｕ３６Ｉ及びＤｒａＩで切断し、そ
の２．４kbp 断片を、ＳｎａＢＩ及びＢｓｕ３６Ｉで切断したプラスミドｐＪＬ
Ｋ１１６に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大
腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した
。制限パターンにより希望のプラスミドｐＧＭＳ３を同定した。
【０１３８】 プラスミドｐＧＭＳ４の作成 プラスミドｐＧＭＳ２をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断し、その約１２．４kbp
の断片を、ＮｄｅＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＣＪＲ２４に連結した
。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞
を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンによ
り希望のプラスミドｐＧＭＳ４を同定した。
【０１３９】実施例３６ S. erythraea ＪＣ２／ｐＧＭＳ４の作成のためのプラスミドｐＧＭＳ４の使用
、及びトリケチドの生産 約５mgのプラスミドｐＧＭＳ４を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロトプラ
ストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した。い
くつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーション
で分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認した。
ＪＣ２／ｐＧＭＳ４を、５０mg／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ３アガー
上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2 分をホモ
ジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２０mlのギ酸の混合液によ
り抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により取り除いた。その残査をメ
タノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式質量分析により分析した
。微量の推定上のトリケチド産物のみが検出された。
【０１４０】実施例３７ プラスミドｐＪＬＫ２７の作成 プラスミドｐＪＬＫ２７は、ｐＪＬＫ１１４を基にしたプラスミドであり、た
だしｒａｐＰＫＳのモジュール１３の還元ループをコードするＤＮＡ断片がｍｃ
ｓ内に挿入されている。このプラスミドを以下の通りにいくつかの中間体プラス
ミドを介して作成した。
【０１４１】 プラスミドｐＪＬＫ１２０ａの作成 S. hygroscopicusのｒａｐＣ遺伝子のモジュール１３の還元ループをコードす
る約３．２kbp のＤＮＡセグメントを、下記の合成オリゴヌクレオチド： ５′-TACCTAGGCACCACCACAACCCGGGTA-３′及び ５′-TACAATTGGCCCGCGAGTCCCCGACGCT-３′ をプライマーとして、そしてコスミドｃｏｓ３１（Schwecke, T. et al. (1995)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 7839-7843）を鋳型としてＰＣＲにより増幅
した。このＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理してから、Ｓｍａ
Ｉ切断により線状化し、そしてアルカリホスファターゼで処理したプラスミドｐ
ＵＣ１８に連結した。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大
腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した
。制限パターン及びＤＮＡ配列決定により、希望のプラスミドｐＪＬＫ１２０ａ
を同定した。
【０１４２】 プラスミドｐＪＬＫ２７の作成 プラスミドｐＪＬＫ１２０ａをＡｖｒII及びＨｐａＩで切断し、その３．２kb
p 断片を、ＡｖｒII及びＨｐａＩで切断したプラスミドｐＪＬＫ１１４に連結し
た。この連結混合液を用いて、電気的にコンピテント化した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細
胞を形質転換し、そして各コロニー内のプラスミドを検査した。制限パターンに
より、希望のプラスミドｐＪＬＫ２７を同定した。
【０１４３】実施例３８ ＪＣ２／ｐＪＬＫ２７の作成のためのプラスミドｐＪＬＫ２７の使用、及びトリ
ケチドの生産 約５mgのプラスミドｐＪＬＫ２７を用いて、S. erythraea ＪＣ２のプロトプ
ラストを形質転換し、そして安定なチオストレプトン耐性コロニーを単離した。
いくつかのコロニーから総ＤＮＡを得て、サザンブロットハイブリダイゼーショ
ンで分析することにより、当プラスミドがＴＥ内に組み込まれたことを確認した
。ＪＣ２／ｐＪＬＫ２７を、５０mg／mlのチオストレプトンを含有するＳＭ３ア
ガー上にまき、そして１２日間３０℃で増殖させた。このプレートの１cm2 分を
ホモジナイズし、そして１．２mlのエチルアセテート及び２０mlのギ酸の混合液
により抽出した。この溶媒を流し捨て、そして蒸発により取り除き、その残査を
メタノール中に溶解し、そしてＧＣ／ＭＳ及び電荷噴射式質量分析により分析し
た。主要産物は、（標準物質との比較により）（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４−
ジメチル−５−ヒドロキシ−ｎ−ヘキサン酸δ−ラクトン及び（２Ｒ，４Ｓ，５
Ｒ）−２，４−ジメチル−５−ヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン（合計
４１mg／ｌ）と同定され、それと共に、いくつかの対応する３−ケトラクトン（
合計１２mg／ｌ）及び３−ヒドロキシラクトン（合計２．８mg）が同定された。
【０１４４】
【化１９】
【０１４５】 本文中で参照した全ての文献及び配列寄託を、明確且つ個別に本明細書に引用
により組み込む。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｐ 19/62 19/62 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 リードレイ，ピーター フランシス イギリス国，ケンブリッジ シービー２ ２ビーエイチ，クラレンドン ロード 17 (72)発明者 ストーントン，ジェイムズ イギリス国，ケンブリッジ シービー２ ２イーティー，ポーソン ロード 29 (72)発明者 ステュズマン−イングウォール，キム ジ ョネル アメリカ合衆国，コネチカット 06333， イースト ライム，ボストン ポスト ロ ード 547 (72)発明者 マッカーサー，ハミッシュ アラステア アーバイン アメリカ合衆国，コネチカット 06335， ゲイルズ フェリー，フィーサント ラン ドライブ 19 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 BA10 BA80 CA04 CA07 CA10 DA06 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AF41 CA21 CC24 DA02 4B065 AA26X AA50Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA28 CA29 CA34 CA44 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA11 DA89 EA29 FA74

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｉ型ポリケチドシンターゼの少くとも部分をコードする核酸
    分子であって、前記部分が延長モジュールの少くとも部分を含有し、そして前記
    核酸が還元に関与する酵素をコードする１又は複数の遺伝子の代りに、複数の制
    限酵素部位を有するポリリンカーを有する、前記核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記ポリリンカーが、前記延長モジュール内に通常は含くま
    れている還元に関与する酵素をコードする全遺伝子の代りに存在する、請求項１
    に記載の核酸。
  3. 【請求項３】 Ｉ型ポリケチドシンターゼの少くとも部分をコードする核酸
    であって、前記部分が延長モジュールの少くとも部分を含有し、前記核酸が、複
    数の制限酵素部位を有するポリリンカーを有し、そのポリリンカーにより、アシ
    ルトランスフェラーゼ酵素の少くとも部分をコードする核酸が、アシルキャリア
    ータンパク質の少くとも部分をコードする核酸に接続される、前記核酸。
  4. 【請求項４】 前記ポリリンカー内に含くまれる少くともいくつかの制限部
    位が、Ｉ型ポリケチドシンターゼをコードする核酸内に存在しない、請求項１〜
    ３のいずれかに記載の核酸。
  5. 【請求項５】 前記ポリリンカー内に含くまれる少くともいくつかの制限部
    位が、Ｉ型ポリケチドシンターゼの還元酵素をコードする天然の核酸内にまれで
    あるか、又は存在しない、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸。
  6. 【請求項６】 前記ポリリンカーが、以下の制限部位：ＡｖｒII，ＢｇｌII
    ；ＳｎａＢＩ；ＰｓｔＩ；ＳｐｅＩ；ＮｓｉＩ；Ｂｓｕ３６Ｉ；ＮｈｅＩ；及び
    ＨｐａＩの中の少くともいくつかを含んでいる、請求項１〜５のいずれかに記載
    の核酸。
  7. 【請求項７】 更にローディングモジュールをコードする、請求項１〜６の
    いずれかに記載の核酸。
  8. 【請求項８】 更に１又は複数の別の延長モジュールをコードする、請求項
    １〜７のいずれかに記載の核酸。
  9. 【請求項９】 更に前記ポリリンカー内に組み込まれた核酸配列を有し、そ
    の組み込まれた核酸が１又は複数の還元酵素をコードする、請求項１〜８のいず
    れかに記載の核酸。
  10. 【請求項１０】 前記の１又は複数の還元酵素が、β−ケトレダクターゼ、
    デヒドラターゼ及び／又はエノイルレダクターゼである、請求項９に記載の核酸
    。
  11. 【請求項１１】 前記の１又は複数の還元酵素が、少くともβ−ケトレダク
    ターゼを含んでいる、請求項１０に記載の核酸。
  12. 【請求項１２】 前記の１又は複数の還元酵素の少くとも１つが、前記のＩ
    型ポリケチドシンターゼの少くとも部分と同一のポリケチドシンターゼ内の異な
    る延長モジュールに由来する、請求項１０又は１１に記載の核酸。
  13. 【請求項１３】 前記の１又は複数の還元酵素の少くとも１つが、異なるポ
    リケチドシンターゼに由来する、請求項１０〜１２のいずれかに記載の核酸。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸を含んでいるベク
    ター。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸又はベクターによ
    りトランスフェクト、形質転換又は結合された宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 ストレプトミセス菌種の細胞である、請求項１５に記載の
    宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 Ｓ．エリスラエ（S. erythraea）又はＳ．アベルミチリス
    （S. avermitilis）の細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
  18. 【請求項１８】 新規なポリケチドシンターゼをコードする核酸を生産する
    ための方法であって、下記の過程を含んで成る前記方法： ｉ）請求項１〜８のいずれかに記載の核酸を用意すること；及び ii）前記核酸内に、少くとも１つの還元酵素をコードする核酸配列を組み込むこ
    と。
  19. 【請求項１９】 前記の少くとも１つの還元酵素をコードする核酸配列が、
    請求項９〜１３のいずれかに記載されたものである、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ポリケチドを含んでいる発酵産物を生産するための方法で
    あって、請求項１５に記載の宿主細胞を培養する過程を含んで成る前記方法。
  21. 【請求項２１】 他のマクロライドを実質的に含くまないで、Ｃ２２−Ｃ２
    ３ジヒドロアベルメクチンを含んでいる発酵産物。
  22. 【請求項２２】 前記ジヒドロアベルメクチンがイベルメクチンである、請
    求項２１に記載の発酵産物。
  23. 【請求項２３】 Ｂ２アベルメクチンを実質的に含くまないで、Ｂ１アベル
    メクチンを含んでいる発酵産物。
  24. 【請求項２４】 下記の過程を含んで成る、ポリケチドを生産するための方
    法： ｉ）請求項２０の方法により得られる発酵産物、又は請求項２１〜２３のいずれ
    かに記載の発酵産物を用意すること；及び ii）前記発酵産物からポリケチドを少くとも部分的に精製すること。
  25. 【請求項２５】 前記ポリケチドがアベルメクチンである、請求項２４に記
    載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記アベルメクチンがＢ１アベルメクチンである、請求項
    ２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記アベルメクチンがＢ１アベルメクチンである、請求項
    ２５に記載の方法。
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