JP2003508050A - スピノシン生合成の酵素活性をコードする核酸 - Google Patents

スピノシン生合成の酵素活性をコードする核酸

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、スピノシン生合成の酵素活性をコードする核酸に関する。本発明は相当する酵素自体にも関する。さらに本発明は、スピノシン誘導体およびスピノシン前駆体の製造方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、スピノシン生合成の酵素活性をコードする核酸および関係する酵素
自体に関する。
【０００２】 スピノシンは、放線菌サッカロポリスポラ・スピノサ(Saccharopolyspora spi
nosa) から単離されたマクロライド化合物の新規の群を表す(Mertz and Yao, 19
90) 。これらは昆虫類の防除に使用される（WO97/00265号、WO94/20518号、WO93
/09126号、米国特許(US)第5670364 号、米国特許(US)第5362634 号、米国特許(U
S)第5227295 号、米国特許(US)第5202242 号) 。スピノシンは、強い殺虫活性を
示すがしかし抗細菌活性は示さず、このために、これらは殺虫活性はないが抗細
菌活性を有する慣用のマクロライド、例えばチロシン、スピラマイシンおよびエ
リスロマイシンと区別できる。
【０００３】 スピノシン構造は、１２員マクロライド環および５，６，５−シス−アンチ−
トランス−三環およびＤ−ホロサミン糖部分および２，３，４−トリ−Ｏ−メチ
ル−Ｌ−ラムノース糖部分を有する四環式ポリケチド骨格（アグリコン）から成
る(Kirst et al., 1991)。２０種以上の天然の種々のスピノシン誘導体、「Ａ８
３９４３」複合体がこれまで記載されている（WO97/00265号、WO94/20518号、WO
93/09126号）。これらの誘導体は、四環骨格上、ホロサミン糖部分上またはトリ
メチルラムノース糖部分の１個または数個のメチル基の置換が異なる。ホロサミ
ン糖部分を欠いた１７−シュードアグリコンが、同様にＳ．スピノサ培養ブロス
から単離された。
【０００４】 Ｓ．スピノサにより形成されたＡ８３５４３複合体の主要な成分は、生成物ス
ピノサド(Spinosad)の主要な成分である変種のスピノシンＡおよびスピノシンＤ
である（「農薬マニュアル」(Pesticide Manual, British Crop Protection Cou
ncil, 11th Ed. 1997, page 1272) およびDow Elanco trade magazine Down to
Earth, Vol. 52, No. 1, 1997 、および本明細書中に引用する文献参照）。
【０００５】 13Ｃ−標識酢酸、プロピオン酸、酪酸またはイソ酪酸の組込みに関する研究に
基づいて、Ａ８３５４３生合成がポリケチド生合成経路に従うことを示すことが
できた(Nakatsukasa et al., 1990)。ポリケチドは、短鎖酸構成ブロック、例え
ば酢酸、プロピオン酸または酪酸から、多機能酵素により合成、すなわち「ポリ
ケチド合成（ＰＫＳ）」される。これらは、関連する脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）
と同様に、ＣｏＡチオエステルとして活性化された構成ブロックの脱カルボキシ
ル化重縮合工程に触媒作用がある。ＦＡＳは、それぞれの縮合工程の後に、ケト
還元、脱水およびエノイル還元により、成長中のポリケチド鎖上に中間的に形成
されるβ−オキソエステルの完全な還元に触媒作用をするが、ＰＫＳは特定の還
元工程を不要とすることができる。モジュラータイプＩ ＰＫＳは、１個または
それより多い大型多官能性タンパク質の一つから成る。反対に、反復タイプＩＩ
ＰＫＳは、本質的に単官能性タンパク質からなる複合体である。
【０００６】 モジュラータイプＩ ＰＫＳの酵素活性は、「モジュール」に組み合わされる
ことができる。ここで、モジュールは、生合成伸長単位により成長するポリケチ
ド鎖の伸長に導く３個の酵素−触媒活性ドメインの列を有する。該ドメインは、
β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメイン、アシルトラン
スフェラーゼドメインおよびβ−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメ
インである。モジュールは、ケト還元酵素ドメイン、脱水酵素ドメイン、エノイ
ル還元酵素ドメインおよびチオエステラーゼドメインを有してもよい。生合成開
始における「負荷(loading) 」モジュールは、生合成の開始においては、該ドメ
インからアシルトランスフェラーゼドメインおよびβ−ケトアシル：アシルキャ
リヤータンパク質ドメインおよび同時に酵素的に不活性のβ−ケトアシル：アシ
ルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインのみを有することができる。ポリケチ
ド合成酵素ドメインは該酵素活性のそれぞれ一つを含んでなる。
【０００７】 スピノシンの強力な殺虫活性および注目すべき構造のために、これらの生合成
のための遺伝情報の解読に大きい興味を持たれた。
【０００８】 本発明は、スピノシンの生合成に関係する酵素活性をコードする少なくとも１
個の領域を含んでなる核酸に関する。
【０００９】 本発明は、その翻訳産物がスピノシンの生合成に関係するオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）のクラスターを提供する。これはさらに、スピノシン生合
成クラスターの外側約１２０ｋｂに位置しそしてその翻訳産物がラムノース糖の
生合成に関係する追加の遺伝子またはＯＲＦも提供する。
【００１０】 本発明の核酸は、具体的には、一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。好ましい態様は、ゲノムＤＮＡ断片およ
びｃＤＮＡである。
【００１１】 本明細書中に使用される用語「少なくとも１個の領域」は、本発明の核酸がス
ピノシンの生合成中の工程を遂行する個別の活性それぞれをコードする１種また
はそれ以上の配列を含んでなってもよいことを意味する。従って、スピノシン生
合成中で単一の酵素活性のみをコードする核酸も発明性があると考える。
【００１２】 本明細書中に使用される用語「酵素活性」は、本明細書中で研究された核酸か
ら出発して、まだ酵素の触媒性を発揮する完全な酵素の少なくともその部分を発
現可能なものを意味する。
【００１３】 本発明の核酸は、具体的には、ポリケチド合成酵素、メチルトランスフェラー
ゼ、エピメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、アミノトランスフェラーゼ
、ジメチルトランスフェラーゼ、還元酵素、脱水酵素および／または環化酵素の
酵素活性をコードする。
【００１４】 本発明の核酸は、好ましくはＳ．スピノサゲノムＤＮＡに相当するＤＮＡ断片
である。
【００１５】 本発明の核酸は、特に好ましくは、 （ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、９、１１、１３、１５、１７、１
９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４
３、４５、４７、４９、５１、５２または５４に記載の配列、 （ｂ）（ａ）項において定義した配列の全長中で少なくとも１４塩基対の部分配
列、 （ｃ）（ａ）項において定義した配列にハイブリダイズする配列、 （ｄ）（ａ）項において定義した配列に少なくとも７０％、好ましくは８０％、
特に好ましくは９０％一致する配列、 （ｅ）（ａ）項において定義した配列に相補的である配列、および （ｆ）遺伝暗号の縮重のために、（ａ）〜（ｄ）項において定義した配列と同じ
アミノ酸配列をコードする配列 から選択された少なくとも１個の配列を含んでなる。
【００１６】 本明細書中に使用される用語「ハイブリダイズ」は、一本鎖核酸分子が相補的
鎖と塩基対を形成される過程を表す。この方法で、例えば、系統分類的にＳ．ス
ピノサと関連しそしてスピノシン生合成が可能である生物体からのゲノムＤＮＡ
から出発し、Ｓ．スピノサから単離された断片と同じ性質を有するＤＮＡ断片を
単離することが可能である。
【００１７】 好ましいハイブリダイゼーション条件は下記である：ハイブリダイゼーション
溶液：５ｘＳＳＣ；ブロッキング剤(Roche Diagnostics GmbH, Mannhein, Germa
ny) １％；Ｎ−ラウロイルサルコシン０．１％；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）０．０２％；ハイブリダイゼーション温度６０℃；第一洗浄工程：２ｘＳＳ
Ｃ、６０℃；第二洗浄工程：２ｘＳＳＣ、６０℃；好ましい第二洗浄工程：０．
５ｘＳＳＣ、６０℃；特に好ましい第二洗浄工程：０．２ｘＳＳＣ、６０℃。
【００１８】 核酸の一致の程度は、好ましくはＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux et a
l., 1984) バージョン９．１からのＧＡＰプログラムの助けをかりて、標準条件
下で決定される。
【００１９】 特別の重点は、 （１）ホロサミンおよびトリメチルラムノース生合成中の工程をコードするすべ
ての配列、特には配列番号４および５１に記載の配列、または （２）ポリケチド合成工程をコードするすべての配列、特には配列番号５および
６に記載の配列、または （３）ホロサミン、トリメチルラムノースおよびポリケチド合成におけるすべて
の工程をコードするすべての配列、特には配列番号１、２、３および５１に記載
の配列 のいずれかを含んでなる核酸に置かれる。
【００２０】 従って、スピノシン生合成のためまたは以下に定義する前駆体の合成のために
必要なすべてのＤＮＡ配列が、単一ベクター上に位置してもよい。しかし、これ
らの核酸は、２個またはそれ以上のベクター上に存在しそして宿主細胞内で同時
または連続して発現されてもよい。
【００２１】 本発明の核酸のすべてのＯＲＦは、これら自体のプロモーターによりまたは非
相同プロモーターにより開始されてもよい。
【００２２】 本発明は、本発明の核酸の転写を本来的に、すなわち当初の生物体Ｓ．スピノ
サ中で制御をする調節領域にも関する。
【００２３】 本明細書中に使用される用語「調節領域」は、プロモーター、レプレッサーま
たは活性化因子結合部位、レプレッサーまたは活性化因子配列、およびターミネ
ーターに関連する。この用語は、同様に、本来的に存在する、すなわち当初の生
物体Ｓ．スピノサ中に存在する遺伝的可動性因子もさらに含む。このような遺伝
的可動性因子は、転位可能または可動性の因子またはこれらの機能性部分、ＩＳ
因子またはその他の挿入因子であってもよい。この用語は、さらに、本来的に、
すなわち当初の生物体Ｓ．スピノサ中に存在する増幅可能なＤＮＡ因子（ＤＮＡ
の増幅可能単位、ＡＵＤ;Fishman and Hershberger, 1983）も含む。本発明は、
これらの調節領域と、相互に、または非相同ＤＮＡ断片、例えばプロモーター、
レプレッサーまたは活性化因子結合部位、転位可能、可動性または導入可能因子
とのあらゆる組み合わせにも関する。
【００２４】 本発明は、さらに、本発明の少なくとも１個の核酸および非相同プロモーター
を含んでなるＤＮＡ構築物に関する。
【００２５】 本明細書中に使用される用語「非相同プロモーター(heterologous promoter)
」は、当初の生物体内の相当する遺伝子（ＯＲＦ）の発現を制御しないプロモー
ターに関する。
【００２６】 非相同プロモーターの選択は、原核もしくは真核細胞または細胞を含まない系
が発現のために使用されるかどうかに依存する。非相同プロモーターの好ましい
例は、ベクターｐＩＪ７０２からのｍｅｌ遺伝子のプロモーターである(The Joh
n Innes Foundatioon, Norwich, UK, 1985) 。非相同発現は、例えば本来的なス
ピノシン産生体と比較して増加したスピノシン産生を達成するために使用しても
よい。
【００２７】 本発明は、さらに、少なくとも１個の本発明の核酸を含むベクターに関する。
使用してもよいベクターは、すべてのファージ、プラスミド、ファジェミド(pha
gemid)、ファスミド(phasmid) 、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、人工染色
体または分子生物学研究所で使用される粒子ボンバードメントに適する粒子であ
る。
【００２８】 ＢＡＣベクターが好ましい。ＢＡＣ（細菌人工染色体）ベクターは、大型ＤＮ
Ａ断片のクローニングのために開発された(Shizuya et al., 1992)。これらは因
子Ｆ起源の単一コピープラスミドであり、これらは１２０キロ塩基対（ｋｂ）の
平均的大きさのＤＮＡ断片を内包することができる。これらは大腸菌(Escherich
ia coli)中で複製できる。ＢＡＣベクターｐＢｅｌｏＢＡＣ１１(Kim et al., 1
996)は、クローニング部位に近接するＴ７およびＳＰ６プロモーターを有しそし
て配列決定プライマーのためおよびＲＮＡ転写物を作製するための開始領域とし
て使用できる。
【００２９】 特に好ましくは、本発明が関係しそしてドイツ微生物および細胞培養物集積所
有限会社(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（Ｄ
ＳＭＺ）, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Brunswick)) に、ブダペスト条約(Bud
apest Treaty) の要求に従って、１９９９年８月１８日付けで寄託番号(deposit
ion number) ＤＳＭ１３０１０、ＤＳＭ１３０１１およびＤＳＭ１３０１２とし
て寄託されたＢＡＣシャトルベクターである。
【００３０】 寄託されたＢＡＣシャトルクローンＰ１１／Ｇ６、Ｐ８／Ｇ１１およびＰ１１
／Ｂ１０は、いずれも少なくとも大きさ１００ｋｂのＳ．スピノサＤＮＡ断片を
有する。クローンＰ１１／Ｇ６およびＰ１１／Ｂ１０は、いずれも、配列番号４
に記載の核酸配列の一部分および配列番号５および６に記載の隣接する完全核酸
配列および配列番号６に記載のヌクレオチド配列に３’隣接するＤＮＡ領域も有
する（図７）。クローンＰ８／Ｇ１１は、配列番号６に記載の核酸配列の一部分
、配列番号５および４に記載の完全核酸配列および配列番号４に記載の配列に３
’隣接するＤＮＡ領域も有する（図７）。
【００３１】 同様にスピノシン産生に適するベクターは、ＰＡＣベクターおよび大型ＤＮＡ
断片、特には３０ｋｂより大きく、好ましくは４０ｋｂより大きく、特に好まし
くは６０ｋｂより大きいこれらのＤＮＡの非相同宿主細胞内への転移を可能とし
、ここでの外来ＤＮＡの確立を確実にするするすべての他の機能的に等価のベク
ターでもある。シャトルベクターへ変性され、例えば、グラム陰性細菌例えば大
腸菌およびグラム陽性細菌例えばストレプトミセスの両方の内でプラスミド複製
を可能とするこれらのＢＡＣ、ＰＡＣおよび機能性に等価のベクターの使用が好
ましい。このような好ましいシャトルベクターは、慣用のベクター、例えばコス
ミドベクター内にクローンできずそして非相同宿主例えば放線菌類、例えばスト
レプトミセス中に転移できない大きさのＤＮＡ断片を有してもよい。後者のベク
ターは、形質転換、接合、エレクトロポレーション、プロトプラスト形質転換に
よりまたはその他の適合する方法の両方により転移されてもよい。これらのシャ
トルベクターを、グラム陰性またはグラム陽性細菌の非相同集団内、グラム陽性
とグラム陰性細菌との間、細菌とアーキアとの間および原核生物と真核生物との
間に接合により転移することも優れた方法で可能である。非相同宿主、例えばス
トレプトミセス内に転移されたＢＡＣ、ＰＡＣまたは機能的に等価のシャトルベ
クターは、自律的に複製または宿主ゲノム内に組み込まれてもよい。後者の組込
みは、相同組換えを介して、ΦＣ３１組込み機構(Hopwood et al., 1985)を介し
て、ｐＳＡＭ２(Smokvina et al., 1990; WO95/16046号) −決定機能に依存する
位置−特異性組換えを介してまたはミニサークル(mini-circle) −媒介機能(Mot
amedi et al., 1995; WO96/00282号) を介して遂行してもよい。
【００３２】 このようなシャトルベクターは、一次および二次代謝物の特異性生合成経路の
発現を可能とし、これらは単一組換えベクターを非相同的に特に適合する宿主細
胞内に転移することによる異常に大きいＤＮＡ領域により決定される。従って、
放線菌類のような生物体、例えばストレプトミセス内で、単一組換えシャトルベ
クターを転移することにより、スピノシン生合成のために同定されたクラスター
を発現することが可能である。この生合成クラスターの大きさのために、スピノ
シン生合成の該非相同発現は、単一コスミドベクターを用いては不可能である。
本発明の核酸を有する組換えＢＡＣ、ＰＡＣまたは機能的に等価のシャトルベク
ターの転移は、株Ｓ．スピノサ中または増加したスピノシン形成を有する誘導変
異体中のスピノシン産生と比較して、著しい増加をもたらすことができる。さら
に、非相同宿主細胞内に転移した後、これらの生合成および改変能力を使用する
目的で、スピノシンまたはスピノシンの生合成前駆体の著しい改変を達成するた
めに、スピノシン生合成をコードするこのようなシャトルベクターの使用が可能
である。これは、単一組換えベクターを非相同宿主細胞内に転移することにより
新規のスピノシン誘導体を産生することも可能とする。
【００３３】 さらに、単一組換えシャトルベクターの部分として二次代謝物のクローニング
した生合成経路を遺伝的変性するためのこのようなシャトルベクターの使用が可
能である。このような変性は、例えば大腸菌宿主内で、例えばｒｅｃＡ遺伝子産
物またはｒｅｃＥおよびｒｅｃＴ遺伝子産物の関与下での組換えイベントを用い
て遂行してもよい(Muyrers et al., 1999)。さらに、生体外の方法、例えば鋳型
作製系(Finnzymes, FIN-02201, Espoo, Finland)またはトランスポゾン系(Epice
ntre Technologies, Biozym Diagnostika GmbH, Oldendorf, Germany) によりこ
のようなベクターを変性することが可能である。変性された生合成経路をコード
するこのようなシャトルベクターは、変性された二次代謝物を産生するために適
合する宿主細胞内に転移してもよい。同様に、該シャトルベクターは、引き続い
て適合する宿主細胞内に転移された後に改変スピノシンの産生のために使用する
ために、本発明の核酸を改変するために使用されてもよい。
【００３４】 本発明の核酸の部分は、２個またはそれ以上のベクター、例えば、コスミドベ
クターの成分として、たがいに組み合って、スピノシンまたはスピノシン前駆体
、例えばシュードアグリコン(pseudoaglycone)またはスピノシンアグリコンの生
合成のために適する遺伝情報を決定してもよい。組換えベクターのこのような組
み合わせは、Ｓ．スピノサ以外の生物体内でのスピノシン産生を達成するために
使用してもよい。特に適合する宿主内での発現の場合に、これは、Ｓ．スピノサ
または誘導された産生促進変異体と比較してスピノシン産生に著しい増加をもた
らしてもよい。さらに該ベクター組み合わせの個別の組換えベクター内の本発明
の核酸を、宿主細胞内のスピノシン誘導体の非相同産生が可能となるように改変
することも可能である。さらに、組換えベクターのこのような組み合わせは、非
相同宿主内へのその転移により、宿主の内在酵素系を使用して新規のスピノシン
誘導体を形成するために適するであろう。
【００３５】 本発明は、本発明の少なくとも１種の核酸を含む宿主細胞にも関する。適合す
る宿主細胞は、原核細胞、好ましくは放線菌類、特に好ましくはストレプトミセ
ス、および真核細胞、例えば哺乳類細胞、植物細胞または酵母細胞の両方である
。
【００３６】 特別の方法において、本発明の核酸は、植物細胞内に転移されそしてそこで発
現されることができる。これは、植物−保護性、殺虫性スピノシンまたはその誘
導体を産生するトランスジェニック植物の作製を可能とする。本発明の核酸は、
慣用の方法、なかでも粒子ボンバードメントにより植物細胞または植物細胞培養
物内に転移されてもよい。
【００３７】 本発明は、さらに本発明の核酸によりコードされるポリペプチドに関する。本
発明のポリペプチドは、スピノシン生合成工程に触媒作用を有する完全酵素を構
成してもよい。しかし、本発明は、関連酵素の完全アミノ酸配列の一部分のみを
有するポリペプチドも含む。
【００３８】 本明細書中に使用される用語「部分配列」は、このように相当する完全酵素の
活性をまだ発揮できるポリペプチドまたは酵素的な活性ドメインのアミノ酸配列
に関する。
【００３９】 以下において、本発明の好ましい核酸およびポリペプチドを適当な配列番号を
引用してさらに詳細に性質を説明する。配列番号７および８、ＯＲＦ１ ： 配列番号４のヌクレオチド位置８２８〜１、２７５アミノ酸。誘導可能な遺伝子
産物はメチルトランスフェラーゼである。配列番号９および１０、ＯＲＦ２ ： 配列番号４のヌクレオチド位置１２８３〜２４５５、３９０アミノ酸。誘導可能
な遺伝子産物はグリコシルトランスフェラーゼである。配列番号１１および１２、ＯＲＦ３ ： 配列番号４のヌクレオチド位置２４９５〜３２４７、２５０アミノ酸。誘導可能
な遺伝子産物はメチルトランスフェラーゼである。配列番号１３および１４、ＯＲＦ４ ： 配列番号４のヌクレオチド位置４４４０〜３２５３、３９５アミノ酸。誘導可能
な遺伝子産物はメチルトランスフェラーゼである。配列番号１５および１６、ＯＲＦ５ ： 配列番号４のヌクレオチド位置４５７８〜６１９７、５３９アミノ酸。誘導可能
な遺伝子産物は、環化反応を行うＣ−Ｃ結合酵素である。配列番号１７および１８、ＯＲＦ６ ： 配列番号４のヌクレオチド位置６２１１〜７４０４、３９７アミノ酸。誘導可能
な遺伝子産物はメチルトランスフェラーゼである。配列番号１９および２０、ＯＲＦ７ ： 配列番号４のヌクレオチド位置７４０１〜８３００、２９９アミノ酸。誘導可能
な遺伝子産物はメチルトランスフェラーゼである。配列番号２１および２２、ＯＲＦ８ ： 配列番号４のヌクレオチド位置８３００〜９４６６、３８８アミノ酸。誘導可能
な遺伝子産物は、環化反応に関係する酵素である。配列番号２３および２４、ＯＲＦ９ ： 配列番号４のヌクレオチド位置１０５７２〜９５６２、３３６アミノ酸。誘導可
能な遺伝子産物は２，３−還元酵素である。配列番号２５および２６、ＯＲＦ１０ ： 配列番号４のヌクレオチド位置１２０２９〜１０５６９、４８６アミノ酸。誘導
可能な遺伝子産物は２，３−脱水酵素である。配列番号２７および２８、ＯＲＦ１１ ： 配列番号４のヌクレオチド位置１２５４９〜１２１０９、１４６アミノ酸。誘導
可能な遺伝子産物はチオエステラーゼと同族性を有する。配列番号２９および３０、ＯＲＦ１２ ： 配列番号４のヌクレオチド位置１３８６５〜１２５４６、４３９アミノ酸。誘導
可能な遺伝子産物はグリコシルトランスフェラーゼである。配列番号３１および３２、ＯＲＦ１３ ： 配列番号４のヌクレオチド位置１４２４５〜１５６３３、４６２アミノ酸。誘導
可能な遺伝子産物は３，４−脱水酵素である。配列番号３３および３４、ＯＲＦ１４ ： 配列番号４のヌクレオチド位置１５６７１〜１６８２８、３８５アミノ酸。誘導
可能な遺伝子産物は４−アミノトランスフェラーゼである。配列番号３５および３６、ＯＲＦ１５ ： 配列番号４のヌクレオチド位置１６８３１〜１７５８０、２４９アミノ酸。誘導
可能な遺伝子産物はＮ−ジメチルトランスフェラーゼである。配列番号３７および３８、ＯＲＦ１６ ： 配列番号４のヌクレオチド位置１８９３０〜１８２０５、２４１アミノ酸。誘導
可能な遺伝子産物は３，４−還元酵素である。配列番号３９および４０、ＯＲＦ１７ ： 配列番号４のヌクレオチド位置１９０２５〜１９８６１、２７８アミノ酸。誘導
可能な遺伝子産物は転写調節因子である。配列番号４１および４２、ＯＲＦ１８ ：配列番号５のヌクレオチド位置１１６−７９０３、アミノ酸位置１〜２５９５ ： ヌクレオチド位置１２８−１４０２、アミノ酸位置５−４２９、β−ケトアシル
：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置１６９１−２６５６、アミノ酸位置５２６−８４７、アシルト
ランスフェラーゼドメインをコードする。 ヌクレオチド位置２７９８−３０５２、アミノ酸位置８９５−９７９、β−ケト
アシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置３１０７−４３７２、アミノ酸位置９９８−１４１９、β−ケ
トアシル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置４６８８−５６６２、アミノ酸位置１５２５−１８４９、アシ
ルトランスフェラーゼドメインをコードする。 ヌクレオチド位置６５８７−７１３８、アミノ酸位置２１５８−２３４１、ケト
還元酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置７４０９−７６６６、アミノ酸位置２４３２−２５１７、β−
ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードする。配列番号４３および４４、ＯＲＦ１９ ：配列番号５のヌクレオチド位置７９２１−１４３７９、アミノ酸位置１〜２１５ ２ ： ヌクレオチド位置８０２９−９３１８、アミノ酸位置３７−４６６、β−ケトア
シル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置９６３４−１０６０８、アミノ酸位置５７２−８９６、アシル
トランスフェラーゼドメインをコードする。 ヌクレオチド位置１０７０５−１１２５９、アミノ酸位置９２９−１１１３、脱
水酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置１２０４３−１３０８０、アミノ酸位置１３７５−１７２０、
エノイル還元酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置１３０９３−１３６３５、アミノ酸位置１７２５−１９０５、
ケト還元酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置１３８８５−１４１４２、アミノ酸位置１９８９−２０７４、
β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードする。配列番号４５および４６、ＯＲＦ２０ ：配列番号５のヌクレオチド位置１４４２４−２３９３６、アミノ酸位置１〜３１ ７０ ： ヌクレオチド位置１４５２３−１５８２４、アミノ酸位置３４−４６７、β−ケ
トアシル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置１６１１０−１７０７５、アミノ酸位置５６３−８８４、アシ
ルトランスフェラーゼドメインをコードする。 ヌクレオチド位置１７９９７−１８５３６、アミノ酸位置１１９２−１３７１、
ケト還元酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置１８７９５−１９０５２、アミノ酸位置１４５８−１５４３、
β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置１９１０７−２０３８９、アミノ酸位置１５６２−１９８８、
β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置２０７１８−２１６９２、アミノ酸位置２０９９−２４２３、
アシルトランスフェラーゼドメインをコードする。 ヌクレオチド位置２２６２０−２３１７１、アミノ酸位置２７３３−２９１６、
ケト還元酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置２３４３６−２３６９３、アミノ酸位置３００５−３０９０、
β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードする。配列番号４７および４８、ＯＲＦ２１ ：配列番号５のヌクレオチド位置２３９８３−３８７５７、アミノ酸位置１〜４９ ２４ ： ヌクレオチド位置２４０８２−２５３９２、アミノ酸位置３４−４７０、β−ケ
トアシル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置２５６９６−２６６６１、アミノ酸位置５７２−８９３、アシ
ルトランスフェラーゼドメインをコードする。 ヌクレオチド位置２６７６１−２７３１５、アミノ酸位置９２７−１１１１、脱
水酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置２８２３１−２８７８２、アミノ酸位置１４１７−１６００、
ケト還元酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置２９０３５−２９２６５、アミノ酸位置１６８５−１７６１、
β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置２９３２９−３０６２４、アミノ酸位置１７８３−２２１４、
β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置３０９２８−３１９０２、アミノ酸位置２３１６−２６４０、
アシルトランスフェラーゼドメインをコードする。 ヌクレオチド位置３２８２７−３３３７８、アミノ酸位置２９４９−３１３２、
ケト還元酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置３３６５２−３３９００、アミノ酸位置３２２４−３３０６、
β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置３３９５２−３５２６２、アミノ酸位置３３２４−３７６０、
β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置３５５５４−３６５２２、アミノ酸位置３８５８−４１８０、
アシルトランスフェラーゼドメインをコードする。 ヌクレオチド位置３７４５３−３７９９８、アミノ酸位置４４９１−４６７２、
ケト還元酵素ドメインをコードする。 ヌクレオチド位置３８２５４−３８５１１、アミノ酸位置４５７８−４８４３、
β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードする。配列番号４９および５０、ＯＲＦ２２ ：配列番号５のヌクレオチド位置３８８０８−５００００および配列番号６のヌク レオチド位置１−５５７４、アミノ酸位置１〜５５８８ ： 配列番号５のヌクレオチド位置３８９０７−４０２２６、アミノ酸位置３４−４
７３、β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインをコード
する。 配列番号５のヌクレオチド位置４０４９４−４１４５３、アミノ酸位置５６３−
８８２、アシルトランスフェラーゼドメインをコードする。 配列番号５のヌクレオチド位置４１５５６−４２１１９、アミノ酸位置９１７−
１１０４、脱水酵素ドメインをコードする。 配列番号５のヌクレオチド位置４３０１７−４３５６８、アミノ酸位置１４０４
−１５８７、ケト還元酵素ドメインをコードする。 配列番号５のヌクレオチド位置４３８３３−４４０９０、アミノ酸位置１６７６
−１７６１、β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードす
る。 配列番号５のヌクレオチド位置４４１５１−４５４７３、アミノ酸位置１７８２
−２２２２、β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインを
コードする。 配列番号５のヌクレオチド位置４５７６５−４６７３０、アミノ酸位置２３２０
−２６４１、アシルトランスフェラーゼドメインをコードする。 配列番号５のヌクレオチド位置４６８２７−４７４５９、アミノ酸位置２６７４
−２８８４、脱水酵素ドメインをコードする。 配列番号５のヌクレオチド位置４８３７８−４８９３５、アミノ酸位置３１９１
−３３７６、ケト還元酵素ドメインをコードする。 配列番号５のヌクレオチド位置４９１８２−４９４１２、アミノ酸位置３４５９
−３５３５、β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードす
る。 配列番号５のヌクレオチド位置４９４８２−５００００および配列番号６のヌク
レオチド位置１−７５９、アミノ酸位置３５５９−３９８４、β−ケトアシル：
アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメインをコードする。 配列番号６のヌクレオチド位置１０８４−２０４９、アミノ酸位置４０９３−４
４１４、アシルトランスフェラーゼドメインをコードする。 配列番号６のヌクレオチド位置２１４６−２６９７、アミノ酸位置４４４７−４
６３０、脱水酵素ドメインをコードする。 配列番号６のヌクレオチド位置３６０４−４１５５、アミノ酸位置４９３３−５
１１６、ケト還元酵素ドメインをコードする。 配列番号６のヌクレオチド位置４４２０−４６７７、アミノ酸位置５２０５−５
２９０、β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメインをコードする。 配列番号６のヌクレオチド位置４８６４−５５３８、アミノ酸位置５３５３−５
５７７、チオエステラーゼドメインをコードする。配列番号５２および５３、ＯＲＦ２３ ： 配列番号５１のヌクレオチド位置３４４−１３３３、３２９アミノ酸。誘導可能
な遺伝子産物はｄＮＤＰ−グルコース−４，６−脱水酵素である。配列番号５４および５５、ＯＲＦ２４ ： 配列番号５１のヌクレオチド位置１３３０−２２４７、３０５アミノ酸。誘導可
能な遺伝子産物はｄＮＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコース−３，５−エピ
メラーゼである。
【００４０】 ５，６，５−三環体の環化に関係するＯＲＦ５（配列番号１６）およびＯＲＦ
８（配列番号２２）の産物は、異常な環化反応のために特に重要である。従って
、本発明は、特に相同核酸または相同遺伝子産物も含む。好ましくは、これらの
相同遺伝子産物は、少なくとも５０％、好ましくは６０％そして特に好ましくは
７０％の一致をアミノ酸レベルで示す。
【００４１】 さらに、本発明は、上記のポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。こ
のような抗体は、慣用の方法で産生される。これらの抗体は、例えば本発明の核
酸を内包する遺伝子ライブラリーの発現クローンを同定するために使用してもよ
い。
【００４２】 本発明は、本発明の核酸を作製するための方法にも関する。本発明の核酸は、
慣用の方法で作製してもよい。例えば、全核酸分子を化学的に合成することが可
能である。本発明の核酸の短い部分を化学的に合成しそしてこのオリゴヌクレオ
チドを放射能または蛍光染料を用いて標識することも可能である。標識したオリ
ゴヌクレオチドは、生物体の遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために使
用してもよい。標識したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするクローンは、
関連ＤＮＡを単離するために選択される。単離されたＤＮＡを特性決定した後、
本発明の核酸は、単純な方法で得られる。本発明の核酸は、化学的に合成された
オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法を用いて作製してもよい。
【００４３】 本発明は、さらに本発明のポリペプチドを作製するための方法に関する。本発
明の核酸によりコードされるポリペプチドは、少なくとも１種の本発明の核酸を
含む宿主細胞を適当な条件下で培養して作製してもよい。所望のポリペプチドは
、引き続いて慣用の方法で細胞または培地から単離してもよい。ポリペプチドは
生体外の系内で作製してもよい。
【００４４】 単離され特性決定された遺伝子クラスターおよび隣接または関連するＤＮＡ領
域は、直接または間接に生合成に関係する遺伝子または調節配列の遺伝子操作、
過剰または過少発現によりスピノシン生合成を増加するための標的である。これ
らの操作は、天然のスピノシン−産生生物体内および遺伝子的に操作されたスピ
ノシン産生生物体内の両方で行ってもよい。従って、例えば、慣用の強力なプロ
モーター、例えばプラスミドｐＩＪ７０２のｍｅｌプロモーター(John Innes Fo
undation, Norwich, UK, 1985)の制御下に選択されたＯＲＦを配置することが可
能である。
【００４５】 スピノシン生合成の遺伝子をクローニングおよび同定することにより、本発明
は、分子−遺伝子的方法を用いて新規のスピノシン前駆体およびスピノシン誘導
体を作製するための遺伝子的基礎を提供する。
【００４６】 本明細書中に使用される用語「スピノシン前駆体」は、検出または仮定できる
すべての生合成スピノシン前駆体に関する。
【００４７】 本明細書中に使用される用語「スピノシン誘導体」は、すべてのこれまでに既
知のスピノシンの構造誘導体に関する。
【００４８】 従って、本発明は、スピノシン前駆体およびスピノシン誘導体を作製するため
の方法にも関する。
【００４９】 例えば、コンビナトリアル(combinatorial) 生合成によりスピノシンアグリコ
ンの改変を有する新規のスピノシン誘導体を作製するために、本発明の核酸を使
用することができる。これは例えば、ＯＲＶ１９によりコードされそして酢酸単
位を組み込んだアシルトランスフェラーゼドメインを、プロピオン酸単位を組み
込んだアシルトランスフェラーゼと交換して達成してもよい。同様に、酢酸単位
を組み込んだＯＲＦ１８アシルトランスフェラーゼドメインは、プロピオン酸単
位を組み込んだアシルトランスフェラーゼドメインと交換することができる。さ
らに、上記の２個のＯＲＦによりコードされた両方またはそれぞれのケト還元酵
素について、不活性化されたドメインを、不活性ケト還元酵素ドメインにより置
換するかまたは欠失することが可能であり、そしてその結果、ヒドロキシル基を
巨大環内の適当な位置に生合成的に生成できる。すべてのアシルトランスフェラ
ーゼ、ケト還元酵素、脱水酵素、エノイル還元酵素、β−ケトアシル：アシルキ
ャリヤータンパク質およびチオエステラーゼドメインは、個別またはあらゆる組
み合わせで、適当なポリケチド合成酵素ドメインにより種々の基質特異性または
反応特異性をもって置換されてもよく、あらゆる組み合わせで互いに融合されて
も、個別またはあらゆる組み合わせで突然変異されても、欠失または重複されて
もよい。さらに、モジュールコード化配列を交換することも可能である。従って
、モジュール２−コード化ＤＮＡ配列（図６）をモジュール１−またはモジュー
ル３、４、５、６、７、８−または９−コード化ＤＮＡ配列（図６）と置換しそ
してこれらを機能的に発現すことも考えられる。モジュール２コード化ＤＮＡ配
列またはスピノシンポリケチド合成酵素遺伝子クラスターのあらゆるその他のモ
ジュールコード化ＤＮＡ配列を、種々の生合成伸長単位を組み込んだスピノシン
ポリケチド合成酵素遺伝子クラスターの種々のモジュール−コード化ＤＮＡ配列
と交換することも考えられる。さらに、スピノシンポリケチド合成酵素遺伝子ク
ラスターのあらゆるその他のモジュール−コード化ＤＮＡ配列は、Ｓ．スピノサ
またはＳ．スピノサ以外のあらゆる生物体、例えばサッカロポリスポラ・エリト
ラエ(Saccharopolyspora erythraea) からの種々のポリケチド合成酵素核酸配列
の種々のモジュールコード化ＤＮＡ配列と交換してもよい。これらの変性は、Ｅ
Ｔ組換え(WO99/29837 号、Muyrers et al., 1999) またはその他のクローニング
および組換え技術を使用して行ってもよい。
【００５０】 従って、本発明は、本来的または遺伝子的に操作されたスピノシンポリケチド
合成の成分であるすべてのモジュール−またはドメイン−コード化核酸にも関す
る。
【００５１】 本明細書中に使用される用語「モジュール」は、生合成伸長単位による成長ポ
リケチド鎖の伸長に導く３個の酵素−触媒活性ドメインの組を意味する。これら
のドメインは、β−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質合成酵素ドメイン
、アシルトランスフェラーゼドメインおよびβ−ケトアシル：アシルキャリヤー
タンパク質ドメインである。モジュールは、ケト還元酵素ドメイン、脱水酵素ド
メイン、エノイル還元酵素ドメインおよびチオエステラーゼドメインを有しても
よい。生合成の開始における「負荷」モジュールは、上記のドメインからアシル
トランスフェラーゼおよびβ−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質ドメイ
ン、さらに酵素的に不活性のβ−ケトアシル：アシルキャリヤータンパク質合成
酵素ドメインのみを有することができる。ポリケチド合成酵素ドメインは、これ
らの記載の酵素活性のいずれか一つを含んでなる。
【００５２】 さらに、本発明の核酸は、組換えポリケチド合成酵素核酸配列、組換えポリケ
チド合成酵素タンパク質または組換えにより作製したポリケチドのライブラリー
を作製するために、コンビナトリアル生合成の過程の間に、スピノシンポリケチ
ド合成酵素核酸配列の組換えおよび発現によりまたはＳ．スピノサまたはその他
の生物体、例えばサッカロポリスポラ・エリタエ(Saccharopolyspora erythaea)
からの種々のポリケチド合成酵素コード化核酸配列のポリケチド合成酵素核酸と
の組み合わせおよび発現により、使用されてもよい。これらのポリケチドは、本
発明の核酸を使用して、またはその誘導可能な産物が他の糖類の生合成およびア
グリコンにカプリングに関係する他の核酸を用いてグリコシル化されてもよい。
アグリコングリコシル化は、作用部位における生物学的活性に決定的な役を演じ
ることが知られている。上記の改変は、本来的および遺伝子的の両方で操作され
たスピノシン−産生生物体、特には細菌内で遂行してもよい。さらに、ＥＴ組換
え(WO99/29837 号、Muyrers et al., 1999) またはその他のクローニングおよび
組換え技術を利用して該改変を行うことも可能である。
【００５３】 本発明の核酸、ベクターおよび調節または遺伝子的な可動性領域も、ポリペプ
チドをコードする遺伝子の発見のために使用してもよく、これらは、機能的に類
似したポリケチド合成または糖類の生合成に関係する機能的に類似した産物をコ
ードする。
【００５４】 本発明の核酸は、Ｓ．スピノサゲノムの伸長部分を構成しているので、本発明
の核酸は、Ｓ．スピノサゲノムの配列決定のための標識として使用してもい。こ
れは、ゲノム配列決定プロジェクトの部分配列の整列を著しく容易にする。
【００５５】 従って、本発明の核酸は、増加するスピノシン産生のためのゲノム配列決定プ
ロジェクトおよびこれらに基づく代謝操作の枠組み内で使用できるデータを提供
する。実施例 細菌株およびプラスミド 大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’およびコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ
１(Stratagene, Europe)およびｐＯＪ４４６(Biermann et al., 1992) をＳ．ス
ピノサＡＴＣＣ４９４６０(American Type Culture Collection, U.S.A., 欧州
特許公開(EP-A)第0375316 号) の遺伝子ライブラリー確立に使用した。大腸菌Ｊ
Ｍ１１０(Stratagene, Europe)を、形質転換によりストレプトミセスへ転移され
たプラスミドを増殖するように使用した。ストレプトミセス アルブス(Strepto
myces albus)Ｊ１０７４(Chater and Wilde, 1980; John Innes Institute in N
orwich, UK) をスピノシン生合成遺伝子を用いる非相同発現および生体内変換の
ために使用した。
【００５６】 プラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１(Kim et al., 1992)およびｐＯＪ４４６(Bie
rmann et al., 1992) を大腸菌−ストレプトミセスＢＡＣシャトルベクターを作
製するために使用した。分子生物学的方法 分子生物学的方法、例えばＤＮＡ制限、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動、制
限断片の結合、大腸菌の培養および形質転換は、サンブルックら(Sambrook et a
l., 1992) の記載に従って行った。プラスミドをキアジェン・プラスミド・キッ
ト(Qiagen Plamid Kit, Qiagen, Hilden, Germany)を用いて単離した。使用した
酵素は、ロッシェ・ディアグノティクス有限会社(Roche Diagnostics GmbH, Man
nheim, Germany) からのものであった。
【００５７】 Ｓ．スピノサおよびストレプトミセスのための培養条件および分子−遺伝的方
法は、ホプウッドら(Hopwood et al., 1985)中に記載されたいる。液状培地内の
すべてのＳ．スピノサおよびストレプトミセス培養は、三角フラスコ中、２８℃
で有酸素的に行った。
【００５８】 ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、製造者の情報(Roche Diagnostics
GmbH, Mannheim, Germany) に従ってＤＩＧ−ハイ−プライム(DIG-High-Prime)
ＤＮＡ標識および検出キットを用いて行った。 培地： ＬＢ サンブルックら、１９８９ ＴＳ ディフコ注文番号０ ３７０−１７−３（Difco Detroit, MI, USA) Ｐ５Ａ イリングら(Illing et al., 1985)コスミドＳ．スピノサ遺伝子ライブラリーの作製 Ｓ．スピノサ遺伝子ライブラリーを得るために、染色体Ｓ．スピノサＡＴＣＣ
４９４６０ ＤＮＡをＭｂｏＩを用いて部分的に切断し、そしてグルコース密度
勾配中で遠心分離して分別した。コスミドＤＮＡ(SuperCos1, Stratagene, Euro
pe) を製造者の情報に従って作製し、３５〜４５ｋｂのＳ．スピノサＤＮＡ断片
と結合し、そしてジガパック・パッケージングシステム(Gigapack packaging sy
stem, Stratagene, Europe) を用いてファージ粒子内にパッケージした。トラン
スフェクションは、大腸菌ＸＬ−１ ｂｌｕｅ ＭＲＦ’内で行った。同様に、
この方法を大腸菌−ストレプトミセス シャトルコスミドｐＯＪ４４６を用いる
第二のＳ．スピノサ遺伝子ライブラリーの構築の目的に使用した。スピノシン生合成遺伝子クラスターおよびこのクラスターの外部ではあるがしか しその産物はスピノシンの生合成中に関係するＤＮＡ断片の配列決定 ＳｕｐｅｒＣｏｓ１コスミド１６−１−８、１６−５９−１および１６−５９
−８の挿入ＤＮＡを配列決定した。コスミド１６−５９−１と１６−１−８との
間の約４ｋｂギャップをプライマーウオーキング(primer walking)を用いてコス
ミド１６−５９−６の相当する部分領域を配列決定して閉じた。
【００５９】 ＳｕｐｅｒＣｏｓ１コスミド１６−２−２上の約２．３ｋｂ ＤＮＡ配列を配
列決定した。スピノシン生合成遺伝子配列を有するＳ．スピノサＢＡＣシャトルベクター遺伝 子ライブラリーからの染色体ＤＮＡ断片の同定および特性決定 大腸菌内のみでなく放線菌類、例えばストレプトミセス内へ転移および繁殖で
きるＢＡＣシャトルベクターを、ベクターｐＢｅｌｏＢＡＣ１１をＸｈｏＩを用
いて線状化しそしてクレノウ(Klenow)ポリメラーゼを適用して平滑化ＤＮＡ末端
を作製して作製した。プラスミドＳＣＰ２* の複製開始点を有するコスミドベク
ターｐＯＪ４４６の約６ｋｂ ＤｒａＩ−ＥｃｏＲＶ ＤＮＡ断片、アプラマイ
シン(apramycin) 耐性遺伝子および接合性転移のためのｏｒｉＴも線状化ＢＡＣ
ベクターを用いて結合した。得られたベクターをｐＥＢＺ３３３と名付けた。
【００６０】 株Ｓ．スピノサＡＴＣＣ４９４６０の部分的にＭｂｏＩ切断したゲノムＤＮＡ
およびＢａｍＨＩ−切断ベクターｐＥＢＺ３３３から出発して、ＢＡＣ遺伝子ラ
イブラリーを確立した。スピノシン生合成に直接または間接的に関係するＤＮＡ配列のオープンリーディ ングフレームの分析およびアノテーション 配列番号１〜３に記載の配列から出発して、スピノシンの生合成に直接または
間接的に関係するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定した。これら
のＯＲＦは、ＤＮＡ領域１およびＤＮＡ領域２（図２および５）と名付けられそ
して配列番号４または５および６に記載の配列を有する２個のＤＮＡ領域に分割
された。ＤＮＡ領域１は、その産物がスピノシンアグリコンの改変および三環形
成に関係するオープンリーディングフレームを有し、一方ＤＮＡ領域２（図２、
５および６）は、その産物がスピノシンポリケチド合成酵素をコードするオープ
ンリーディングフレームを含んでなる。これらのＤＮＡ領域のそれぞれの場合に
最初のヌクレオチド２個は、たがいに直接隣接して位置する（図２、３および５
）。
【００６１】 別のＤＮＡ領域３（配列番号５１）は、ＤＮＡ領域のこのクラスターの外部に
位置し、そして、その産物が同様にスピノシン糖トリメチルラムノースの生合成
に関係するオープンリーディングフレームを有する。トレーサー(R) (Tracer)からのスピノシンアグリコンおよび１７−シュードアグ リコンの作製 市場で入手できる製品のトレーサー(R) １８．７ｇから出発して、スピノシン
ＡおよびＤ８．９２ｇが、凍結乾燥およびシリカゲル上のカラムクロマトグラフ
ィーの後に比率８２：１８で得られた。
【００６２】 アミノ糖ホロサミンを還流しながらエタノール中で２．７Ｎ硫酸を用いて加水
分解した。この過程中で、スピノシンＡ／Ｄ １７−シュードアグリコンの大部
分が沈降した。それ以上の１７−シュードアグリコンの他に、少量から中程度の
量のスピノシンアグリコンが、反応時間によっては濾液中に見いだされた。
【００６３】 アグリコンへの完全な加水分解は、いくらかさらに過激な条件下で達成された
（還流しながらメタノール中、７．２Ｎ硫酸）。アグリコン画分はスピノシンＡ
アグリコンのみを含んでいた。これは、同様の反応条件下でのスピノシンＤシュ
ードアグリコンの完全な分解が記載されている文献(Creemer et al., 1998)と良
く一致する。著者らによると、その理由は、スピノシンＤ中の５，６二重結合が
さらに容易にプロトン化されて第三級炭素カチオンが形成され次いで転位するた
めであろう。
【００６４】 従って、市場で入手できるトレーサー(R) １８．７ｇから出発して、スピノシ
ンＡアグリコン３．０ｇを作製することが可能である。
【００６５】
【化１】
【００６６】 トレーサー(R) からスピノシンＡ／Ｄの製造 トレーサー(R) １８．７ｇの凍結乾燥は、灰色固体１０．０ｇを生成する。シ
リカゲル８００ｃｍ3 上のこの固体のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ジク
ロロメタン／メタノール９５：５）により、純粋のスピノシンＡ／Ｄ８．９２ｇ
（８２％Ａ、１８％Ｄ）が得られた。 −ＤＣ：Ｒf （ＳｉＯ2 、ジクロロメタン／メタノール９：１）＝０．４６。 − 1Ｈ−ＮＭＲ：ＣＤＣｌ3 、δ＝６．７７（ｓ，１３−Ｈ）；５．８８（ｄ，
スピノシンＡの５−Ｈ）；５．８０（ｍ，スピノシンＡの６−Ｈ）；５．４９（
ｍ，スピノシンＤの５−Ｈ）；４．８７（ｄ，１’−Ｈ）；４．６７（ｍ，２１
−Ｈ）；４．４３（ｄ，１”−Ｈ）；４．３１（ｍ，９−Ｈ）など。−ＬＣ／Ｍ
Ｓ：エレクトロスプレー法、陽イオン；室温、４４．０分のピーク：ｍ／ｚ＝７
３３（１００％）〔Ｍ＋Ｈ〕+ （スピノシンＡ）；室温、４４．７分のピーク：
ｍ／ｚ＝７４７（１００％）〔Ｍ＋Ｈ〕+ （スピノシンＤ）。スピノシンＡ／Ｄ １７−シュードアグリコンの作製 スピノシンＡ／Ｄ８．６５ｇ（１１．８１ミリモル）をエタノール６１ｍｌ中
に溶かしそして水１０４ｍｌおよび４Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 ２０８ｍｌと混合した。還
流しながら３時間加熱した後、沈降した固体（Ａ）を濾過して除きそして濾液（
Ｂ）とは別に処理した。固体（Ａ）を１Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 を用いて洗浄し、ジクロ
ロメタン１４０ｍｌ中に取り込み、飽和ＮａＨＣＯ3 溶液および飽和ＮａＣｌ溶
液を用いて順番に洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 上で乾燥しそして減圧下で濃縮した。エ
タノールからの再結晶によりスピノシンＡ／Ｄ １７シュードアグリコン３．０
３ｇおよび母液（Ｃ）が得られた。濾液（Ｂ）をジクロロメタンを用いて数回抽
出した。抽出液を飽和ＮａＨＣＯ3 溶液および飽和ＮａＣｌ溶液を用いて順番に
洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ4 上で乾燥しそして減圧下で濃縮した。残留物を母液（Ｃ）
と一緒にし、減圧下で濃縮しそして６５０ｃｍ3 シリカゲル上のカラムクロマト
グラフィー（溶離剤：シクロヘキサン／酢酸エチル１：１、次いで１００％酢酸
エチル）により分別した。追加のスピノシンＡ／Ｄ １７シュードアグリコン１
．７６ｇの他に、スピノシンＡアグリコン０．７８ｇ（１６％）が得られた。ス
ピノシンＡ／Ｄ １７シュードアグリコンの全収量は４．７９ｇ（６９％）であ
った。−ａ）スピノシンＡ／Ｄ １７シュードアグリコン（８２％Ａ、１８％Ｄ
）；ＤＣ：Ｒf （ＳｉＯ2 、酢酸エチル）＝０．４８。− 1Ｈ−ＮＭＲ：ＣＤＣ
ｌ3 、δ＝６．７８（ｓ，１３−Ｈ）；５．８８（ｄ，スピノシンＡの５−Ｈ）
；５．８０（ｍ，スピノシンＡの６−Ｈ）；５．４９（ｍ，スピノシンＤの５−
Ｈ）；４．８６（ｄ，１’−Ｈ）；４．７０（ｍ，２１−Ｈ）；４．３２（ｍ，
９−Ｈ）など。−ＬＣ／ＭＳ：エレクトロスプレー法、陽イオン；室温、４０．
７分のピーク：ｍ／ｚ＝６０９（１００％）〔Ｍ＋ＮＨ4 〕+ 、ｍ／ｚ＝６４１
（１０％）〔Ｍ＋ＮＨ4 ＋ＣＨ3 ＯＨ〕+ （スピノシンＡシュードアグリコン）
；室温、４１．４分のピーク：ｍ／ｚ＝６２３（１００％）〔Ｍ＋ＮＨ4 〕+ 、
ｍ／ｚ＝６５５（８％）〔Ｍ＋ＮＨ4 ＋ＣＨ3 ＯＨ〕+ （スピノシンＤシュード
アグリコン）。−ｂ）スピノシンＡアグリコン：ＤＣ：Ｒf （ＳｉＯ2 、酢酸エ
チル）＝０．２９。− 1Ｈ−ＮＭＲ：ＣＤＣｌ3 、δ＝６．８０（ｓ，１３−Ｈ
）；５．８９（ｄ，５−Ｈ）；５．８０（ｍ，６−Ｈ）；４．７０（ｍ，２１−
Ｈ）；４．４４（ｍ，９−Ｈ）など。−ＬＣ／ＭＳ：エレクトロスプレー法、陽
イオン；室温、３６．８分のピーク：ｍ／ｚ＝４２０（１００％）〔Ｍ＋ＮＨ4
〕+ 、ｍ／ｚ＝４５２（１０％）〔Ｍ＋ＮＨ4 ＋ＣＨ3 ＯＨ〕+ 。スピノシンＡ／Ｄアグリコンの作製 スピノシンＡ／Ｄシュードアグリコン４．３０ｇ（７．２９ミリモル）をメタ
ノール１９０ｍｌ中に溶かしそして７．２Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 ２８５ｍｌと混合した
。還流しながら３時間加熱した後、冷却した反応混合物を注意して飽和ＮａＨＣ
Ｏ3 溶液１７００ｍｌに加えた。混合物をジエチルエーテルを用いて抽出し、飽
和ＮａＨＣＯ3 溶液および飽和ＮａＣｌ溶液を用いて順番に洗浄し、Ｎａ2 ＳＯ 4 上で乾燥しそして減圧下で濃縮した。６５０ｃｍ3 シリカゲル上でこの固体を
カラムクロマトグラフィー処理（溶離剤：シクロヘキサン／酢酸エチル１：２、
次いで１００％酢酸エチル）して、スピノシンＡアグリコン１．８８ｇ（６４％
）が得られた。−ＤＣ：Ｒf （ＳｉＯ2 、酢酸エチル）＝０．２９。− 1Ｈ−Ｎ
ＭＲ：ＣＤＣｌ3 、δ＝６．８０（ｓ，１３−Ｈ）；５．８９（ｄ，５−Ｈ）；
５．８０（ｍ，６−Ｈ）；４．７０（ｍ，２１−Ｈ）；４．４４（ｍ，９−Ｈ）
など。−ＬＣ／ＭＳ：エレクトロスプレー法、陽イオン；室温、３６．６分のピ
ーク：ｍ／ｚ＝４２０（１００％）〔Ｍ＋ＮＨ4 〕+ 、ｍ／ｚ＝４５２（１４％
）〔Ｍ＋ＮＨ4 ＋ＣＨ3 ＯＨ〕+ （スピノシンＡアグリコン）。スピノシンアグリコンのホロサミニル化およびスピノシン糖生合成遺伝子を非相 同的に発現する組換えストレプトミセス株を用いる生体内変換によるスピノシン アグリコンへのトリメチルラムノース糖の付加 アプラマイシン５μｇ／ｍｌを含むＲ５Ａ培地(Illing et al., 1989) ２０ｍ
ｌに、組換え株Ｓ．アルブス（１６５−１）またはＳ．アルブス（１６５−８）
の菌糸体を用いて接種しそして好気的に２８℃で２４時間インキュベーションし
た。この培養物に、作製したスピノシンアグリコン（メタノール中の１％力価原
液１００μｌ；その作製は、「トレーサー(R) からスピノシンアグリコンおよび
１７−シュードアグリコンの製造」、「トレーサー(R) からスピノシンＡ／Ｄの
製造」および「スピノシンＡ／Ｄアグリコンの作製」の項参照）５０μｇ／ｍｌ
を加えそして混合物を好気的に２８℃で約１２０時間インキュベーションした。
対照としてＳ．アルブス（ｐＥＢＺ３４０；約１．８ｋｂを有するベクターｐＯ
Ｊ４４６、コスミド１６−１−８からのＤＮＡ領域を有するスピノシン−ＰＫＳ
）を同じ方法で培養しそしてスピノシンアグリコンと混合した。インキュベーシ
ョンの後、培養物を遠心分離して細胞菌糸体を除去し、そして上清（２０ｍｌ）
をメタノール２５ｍｌと混合した。
【００６７】 それぞれメタノールと混合した培養物上清３５ｍｌを凍結乾燥し、水１５ｍｌ
中に取り込み、そしてそれぞれ酢酸エチル１０ｍｌを用いて２回抽出した。一緒
にした有機相を乾燥するまで蒸発しそしてメタノール３５０μｌ中に取り込んだ
。この抽出液の試料を陽イオン化エレクトロスプレーを用いるＬＣ／ＭＳにより
分析した。
【００６８】 Ｓ．アルブス（１６５−１）培養物上清は、ホロサミニル化スピノシンＡアグ
リコンおよびスピノシンＡの分子量を有する化合物を含んでいた。 ピーク１：室温＝４１．０分：ｍ／ｚ＝５４４（１００％）〔Ｍ＋Ｈ〕+ 、ｍ／
ｚ＝５７６（１６％）〔Ｍ＋Ｈ＋ＣＨ3 ＯＨ〕+ （ホロサミニル化スピノシンＡ
アグリコン）；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４２（３８％）（ホロサミン断片
）。
【００６９】
【化２】
【００７０】 ピーク２：室温＝４４．２分：ｍ／ｚ＝７３３（１００％）〔Ｍ＋Ｈ〕+ （スピ
ノシンＡ）；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４２（２１％）（ホロサミン断片）
。
【００７１】 Ｓ．アルブス（１６５−８）培養物上清は、ホロサミニル化スピノシンＡアグ
リコンの分子量を有する化合物を含んでいた。 ピーク１：室温＝４０．９分：ｍ／ｚ＝５４４（１００％）〔Ｍ＋Ｈ〕+ 、ｍ／
ｚ＝５７６（１６％）〔Ｍ＋Ｈ＋ＣＨ3 ＯＨ〕+ （ホロサミニル化スピノシンＡ
アグリコン）；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４２（３９％）（ホロサミン断片
）。
【００７２】 Ｓ．アルブス（ｐＥＢＺ３４０）培養物上清は、ＭＷ５４３の化合物もスピノ
シンＡも含んでいなかった。スピノシン糖生合成遺伝子を非相同的に発現する組換えストレプトミセス株を用 いる生体内転換によるスピノシン１７−シュードアグリコンのホロサミニル化 アプラマイシン５μｇ／ｍｌを含むＲ５Ａ媒体(Illing et al., 1989) ２０ｍ
ｌを、組換え株Ｓ．アルブス（１６５−１）またはＳ．アルブス（１６５−８）
の菌糸体を用いて接種しそして好気的に２８℃で２４時間インキュベーションし
た。この培養物に、作製したスピノシン１７−シュードアグリコン（メタノール
中の１％力価原液１００μｌ；その作製は、「トレーサー(R) からスピノシンア
グリコンおよび１７−シュードアグリコンの製造」、「トレーサー(R) からスピ
ノシンＡ／Ｄの製造」および「スピノシン１７−シュードアグリコンの作製」の
項参照）５０μｇ／ｍｌを加えそして混合物を好気的に２８℃で約１２０時間イ
ンキュベーションした。インキュベーションの後、培養物を遠心分離して細胞菌
糸体を除去し、そして上清（２０ｍｌ）をメタノール２５ｍｌと混合した。
【００７３】 メタノールと混合した培養物上清それぞれ３５ｍｌを凍結乾燥し、水１５ｍｌ
中に取り込み、そしてそれぞれ酢酸エチル１０ｍｌを用いて２回抽出した。一緒
にした有機相を乾燥するまで蒸発しそしてメタノール３５０μｌ中に取り込んだ
。この抽出液の試料を陽イオン化エレクトロスプレーを用いるＬＣ／ＭＳにより
分析した。
【００７４】 Ｓ．アルブス（１６５−１）培養物上清は、痕跡量のスピノシンＡおよびＤを
含んでいた。 ピーク１：室温＝４４．２分：ｍ／ｚ＝７３３（１００％）〔Ｍ＋Ｈ〕+ （スピ
ノシンＡ）；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４２（８％）（ホロサミン断片） ピーク２：室温＝４４．７分：ｍ／ｚ＝７４７（１００％）〔Ｍ＋Ｈ〕+ （スピ
ノシンＤ）；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４２（３７％）（ホロサミン断片）
。
【００７５】 Ｓ．アルブス（１６５−８）培養物上清は、痕跡量のスピノシンＡおよびＤを
含んでいた。 ピーク１：室温＝４４．１分：ｍ／ｚ＝７３３（１００％）〔Ｍ＋Ｈ〕+ （スピ
ノシンＡ）。 ピーク２：室温＝４４．７分：ｍ／ｚ ｚ＝７４７（１００％）〔Ｍ＋Ｈ〕+ （
スピノシンＤ）。微生物の寄託 下記の微生物およびプラスミドは、ドイツ微生物および細胞培養物集積所有限
会社(Deutsche Sammlung von Mikrooroganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ),
Mascheroder Weg 1b, D-38124 Brunswick) に、ブダペスト条約(Budapest Trea
ty）の要求にしたがって寄託された。 微生物およびプラスミド 寄託日付および番号 大腸菌XL1-Blue MRF' コスミド16-1-8を含む DSM 12961 1999-08-02 大腸菌XL1-Blue MRF' コスミド16-2-2を含む DSM 12962 1999-08-02 大腸菌XL1-Blue MRF' コスミド16-59-1 を含む DSM 12963 1999-08-02 大腸菌XL1-Blue MRF' コスミド16-59-6 を含む DSM 12964 1999-08-02 大腸菌XL1-Blue MRF' コスミド16-59-8 を含む DSM 12965 1999-08-02 大腸菌XL1-Blue MRF' コスミド165-1 を含む DSM 13005 1999-08-18 大腸菌XL1-Blue MRF' コスミド165-8 を含む DSM 13007 1999-08-18 大腸菌DH10B BAC シャトルベクタークローン P8/G11を含む DSM 13012 1999-08-18 大腸菌DH10B BAC シャトルベクタークローン P10/B10 を含む DSM 13011 1999-08-18 大腸菌DH10B BAC シャトルベクタークローン P11/G6を含む DSM 13010 1999-08-18
【００７６】
【表１】
【００７７】
【表２】
【００７８】
【表３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 スピノシン糖Ｄ−ホロサミンおよび２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｌ−ラム
ノースの生合成のためのモデル。
【図２】 スピノシン生合成に直接または間接に関係するＤＮＡ領域１（配列番号４）お
よびＤＮＡ領域２（配列番号５および６）の位置。図の下部の黒色棒はたがいに
そしてＤＮＡ領域１および２に関係するコスミドＤＮＡ挿入物の位置を図示する
。図示したコスミド挿入物は、配列番号１〜３の配列決定に使用された。
【図３】 スピノシンアグリコンおよびスピノシンシュードアグリコンの生体内変換によ
るホロサミン残基またはトリメチルラムノース残基を付加させるために使用され
た該コスミドの挿入ＤＮＡ（図の下部の黒色棒）の位置の図示。
【図４】 コスミド１６−２−２上の配列番号５１に相当するＤＮＡ領域３のオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）の図示、
【図５】 ＤＮＡ領域１および２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の図示。Ｏ
ＲＦは配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２
７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９
に相当して１〜２２と番号付けしてある。
【図６】 ＤＮＡ領域２（配列番号５および６）のオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）および誘導可能なモジュールおよびドメインの図示。ＳＭ：開始モジュール
、Ｍ１〜Ｍ１０ モジュール１〜モジュール１０、ＫＳ：β−ケトアシル；アシ
ルキャリヤータンパク質合成酵素、ＡＴ：アシルトランスフェラーゼ、ＡＣＰ：
β−ケトアシル；アシルキャリヤータンパク質、ＫＲ：ケト還元酵素、ＤＨ：脱
水酵素、ＥＲ：エノイル還元酵素、ＴＥ：チオエステラーゼ。
【図７】 図の下部に黒色棒としてＢＡＣシャトルクローン内に挿入されたＤＮＡの位置
の図示。挿入されたＤＮＡの大きさは、少なくとも１００ｋｂである。連続棒：
ＤＮＡ配列がＤＮＡ領域１の一部分および全ＤＮＡ領域２と一致（Ｐ１１／Ｇ６
およびＰ１１／Ｂ１０）、または全ＤＮＡ領域１および全ＤＮＡ領域２の一部分
と一致する（Ｐ８／Ｇ１１）。断続棒：ＤＮＡ配列の配列決定した領域より外に
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 9/90 ４Ｈ０４５ 9/10 Ｃ１２Ｐ 19/62 9/90 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 19/62 Ｃ１２Ｒ 1:01 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 19/62 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フレデ，リタ ドイツ・デー−40789モンハイム・ヘーア ベーク58 (72)発明者 フエルテン，ロベルト ドイツ・デー−56061ケルン・ハーネンベ ーク２ (72)発明者 サラス，ホセ・エイ スペイン33006オビエド・２−バジヨイス ダ・ギレルモエストラダ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA08 BA10 BA67 DA05 EA03 EA04 FA15 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL05 4B063 QA01 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AF53 CA03 CA19 CC24 DA02 4B065 AA01X AA01Y AA50X AB01 AC14 BA02 CA34 CA44 CA47 4H045 AA11 CA11 DA75 FA74

Claims (72)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 スピノシンの生合成に関係する酵素活性をコードする少なく
    とも１個の領域を含んでなる核酸。
  2. 【請求項２】 一本鎖または二本鎖状ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴
    とする、請求項１記載の核酸。
  3. 【請求項３】 ＤＮＡ断片であることを特徴とする、請求項２記載の核酸。
  4. 【請求項４】 スピノシンの生合成に関係する酵素活性をコードするすべて
    の領域を含んでなることを特徴とする、請求項３記載の核酸。
  5. 【請求項５】 酵素活性がポリケチド合成酵素、メチルトランスフェラーゼ
    、グリコシルトランスフェラーゼ、エピメラーゼ、アミノトランスフェラーゼ、
    ジメチルトランスフェラーゼ、還元酵素、脱水酵素および／または環化酵素のも
    のであることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか記載の核酸。
  6. 【請求項６】 サッカロポリスポラ・スピノサ(Saccharopolyspora spinosa
    ) に由来することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか記載の核酸。
  7. 【請求項７】 （ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、９、１１、１
    ３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３
    ７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５２または５４に記載の配列
    、 （ｂ）（ａ）項において定義した配列の全長中で少なくとも１４塩基対の部分配
    列、 （ｃ）（ａ）項において定義した配列にハイブリダイズする配列、 （ｄ）（ａ）項において定義した配列に少なくとも７０％一致する配列、 （ｅ）（ａ）項において定義した配列に相補的である配列、および （ｇ）遺伝暗号の縮重のために、（ａ）〜（ｄ）項において定義した配列と同じ
    アミノ酸配列をコードする配列 から選択された少なくとも１個の配列を含んでなる、請求項１記載の核酸。
  8. 【請求項８】 配列番号１〜６に記載の配列を含んでなることを特徴とする
    、請求項７記載の核酸。
  9. 【請求項９】 配列番号４に記載の配列を含んでなることを特徴とする、請
    求項７記載の核酸。
  10. 【請求項１０】 配列番号５および６に記載の配列を含んでなることを特徴
    とする、請求項７記載の核酸。
  11. 【請求項１１】 配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、
    ２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７または３９に記載の少なくと
    も１個の配列を含んでなることを特徴とする、請求項７記載の核酸。
  12. 【請求項１２】 配列番号４１、４３、４５、４７または４９に記載の少な
    くとも１個の配列を含んでなることを特徴とする、請求項７記載の核酸。
  13. 【請求項１３】 サッカロポリスポラ・スピノサ中における請求項１から７
    までのいずれか記載の核酸の転写を制御する調節領域。
  14. 【請求項１４】 請求項１から１２までのいずれかに記載の核酸および少な
    くとも１個の非相同プロモーターを含んでなる、ＤＮＡ構築物。
  15. 【請求項１５】 請求項１から１２までのいずれか記載の少なくとも１個の
    核酸、請求項１３記載の調節領域または請求項１４記載のＤＮＡ構築物を含んで
    なるベクター。
  16. 【請求項１６】 核酸が、原核または真核細胞内の核酸のコード領域の発現
    を確実にする調節配列に機能的に連結していることを特徴とする、請求項１５記
    載のベクター。
  17. 【請求項１７】 ＢＡＣベクター、ＰＡＣベクターまたはＢＡＣまたはＰＡ
    Ｃベクターに機能的に等価のベクターであることを特徴とする、請求項１５また
    は１６のいずれか記載のベクター。
  18. 【請求項１８】 寄託番号ＤＳＭ１３０１０、ＤＳＭ１３０１１またはＤＳ
    Ｍ１３０１２を有するＢＡＣクローンに相当するベクターであることを特徴とす
    る、請求項１７記載のベクター。
  19. 【請求項１９】 原核生物および真核生物の両方へ転移できるシャトルベク
    ターであることを特徴とする、請求項１５から１８までのいずれか記載のベクタ
    ー。
  20. 【請求項２０】 グラム陰性およびグラム陽性細菌へおよびアーキア(Arche
    a)への両方に転移できるシャトルベクターであることを特徴とする、請求項１５
    から１９までのいずれか記載のベクター。
  21. 【請求項２１】 大腸菌(Escherichia coli)へおよび放線菌類(Actinomycet
    es) への両方に転移できるシャトルベクターであることを特徴とする、請求項１
    ５から１９までのいずれか記載のベクター。
  22. 【請求項２２】 大腸菌へおよびストレプトミセス(Streptomyces)への両方
    に転移できるシャトルベクターであることを特徴とする、請求項２１記載のベク
    ター。
  23. 【請求項２３】 原核生物内で自律的に複製できることを特徴とする、請求
    項１５から２２までのいずれか記載のベクター。
  24. 【請求項２４】 ファージΦＣ３１組込み機構、ｐＳＡＭ２組込み機構また
    はミニ−サークル(mini-circle) 組込み機構の関与の下で原核生物のゲノム内に
    組み込むことができることを特徴とする、請求項１５から２２までのいずれか記
    載のベクター。
  25. 【請求項２５】 ＲｅｃＡ−媒介組換えにより原核生物のゲノム内に組み込
    むことができることを特徴とする、請求項１５から２２までのいずれか記載のベ
    クター。
  26. 【請求項２６】 ＲｅｃＥ−およびＲｅｃＴ−媒介組換えにより原核生物の
    ゲノム内に組み込むことができることを特徴とする、請求項１５から２２までの
    いずれか記載のベクター。
  27. 【請求項２７】 請求項１から１２までのいずれか記載の核酸、請求項１３
    記載の調節領域、請求項１４記載のＤＮＡ構築物または請求項１５から２６まで
    のいずれか記載の少なくとも１個のベクターを含んでなる宿主細胞。
  28. 【請求項２８】 原核または真核細胞であることを特徴とする、請求項２７
    記載の宿主細胞。
  29. 【請求項２９】 原核細胞が、放線菌類の群、好ましくはストレプトミセス
    の群に属することを特徴とする、請求項２８記載の宿主細胞。
  30. 【請求項３０】 真核細胞が植物細胞であることを特徴とする、請求項２８
    記載の宿主細胞。
  31. 【請求項３１】 請求項１から７までのいずれか記載の核酸によりコードさ
    れるポリペプチド。
  32. 【請求項３２】 メチルトランスフェラーゼ活性を有することを特徴とする
    、請求項３１記載のポリペプチド。
  33. 【請求項３３】 配列番号８、１２、１４，１８もしくは２０記載のアミノ
    酸配列またはこの部分配列を有することを特徴とする、請求項３２記載のポリペ
    プチド。
  34. 【請求項３４】 グリコシルトランスフェラーゼ活性を有することを特徴と
    する、請求項３１記載のポリペプチド。
  35. 【請求項３５】 配列番号１０もしくは３０記載のアミノ酸配列またはこの
    部分配列を有することを特徴とする、請求項３４記載のポリペプチド。
  36. 【請求項３６】 環化反応を行うＣ−Ｃ結合酵素の活性を有することを特徴
    とする、請求項３１記載のポリペプチド。
  37. 【請求項３７】 配列番号１６記載のアミノ酸配列またはこの部分配列を有
    することを特徴とする、請求項３６記載のポリペプチド。
  38. 【請求項３８】 環化反応に関係する酵素の活性を有することを特徴とする
    、請求項３１記載のポリペプチド。
  39. 【請求項３９】 配列番号２２記載のアミノ酸配列またはこの部分配列を有
    することを特徴とする、請求項３８記載のポリペプチド。
  40. 【請求項４０】 ２，３−還元酵素活性を有することを特徴とする、請求項
    ３１記載のポリペプチド。
  41. 【請求項４１】 配列番号２４記載のアミノ酸配列またはこの部分配列を有
    することを特徴とする、請求項４０記載のポリペプチド。
  42. 【請求項４２】 ２，３−脱水酵素活性を有することを特徴とする、請求項
    ３１記載のポリペプチド。
  43. 【請求項４３】 配列番号２６記載のアミノ酸配列またはこの部分配列を有
    することを特徴とする、請求項４２記載のポリペプチド。
  44. 【請求項４４】 チオエステラーゼ活性を有することを特徴とする、請求項
    ３１記載のポリペプチド。
  45. 【請求項４５】 配列番号２８記載のアミノ酸配列またはこの部分配列を有
    することを特徴とする、請求項４４記載のポリペプチド。
  46. 【請求項４６】 ３，４−脱水酵素活性を有することを特徴とする、請求項
    ３１記載のポリペプチド。
  47. 【請求項４７】 配列番号３２記載のアミノ酸配列またはこの部分配列を有
    することを特徴とする、請求項４６記載のポリペプチド。
  48. 【請求項４８】 ４−アミノトランスフェラーゼ活性を有することを特徴と
    する、請求項３１記載のポリペプチド。
  49. 【請求項４９】 配列番号３４記載のアミノ酸配列またはこの部分配列を有
    することを特徴とする、請求項４８記載のポリペプチド。
  50. 【請求項５０】 Ｎ−ジメチルトランスフェラーゼ活性を有することを特徴
    とする、請求項３１記載のポリペプチド。
  51. 【請求項５１】 配列番号３６記載のアミノ酸配列またはこの部分配列を有
    することを特徴とする、請求項５０記載のポリペプチド。
  52. 【請求項５２】 ３，４−還元酵素活性を有することを特徴とする、請求項
    ３１記載のポリペプチド。
  53. 【請求項５３】 配列番号３８記載のアミノ酸配列またはこの部分配列を有
    することを特徴とする、請求項５２記載のポリペプチド。
  54. 【請求項５４】 転写調節因子活性を有することを特徴とする、請求項３１
    記載のポリペプチド。
  55. 【請求項５５】 配列番号４０記載のアミノ酸配列またはこの部分配列を有
    することを特徴とする、請求項５４記載のポリペプチド。
  56. 【請求項５６】 ポリケチド合成酵素活性を有することを特徴とする、請求
    項３１記載のポリペプチド。
  57. 【請求項５７】 配列番号４２、４４、４６、４８もしくは５０記載のアミ
    ノ酸配列またはこの部分配列を有することを特徴とする、請求項５６記載のポリ
    ペプチド。
  58. 【請求項５８】 グルコース脱水酵素活性を有することを特徴とする、請求
    項３１記載のポリペプチド。
  59. 【請求項５９】 配列番号５３記載のアミノ酸配列を有することを特徴とす
    る、請求項５８記載のポリペプチド。
  60. 【請求項６０】 ３，５−エピメラーゼ活性を有することを特徴とする、請
    求項３１記載のポリペプチド。
  61. 【請求項６１】 配列番号５５記載のアミノ酸配列を有することを特徴とす
    る、請求項６０記載のポリペプチド。
  62. 【請求項６２】 配列番号１５もしくは２２記載のアミノ酸配列または反応
    の少なくとも一部を行うことがまだ可能なその部分配列を含んでなりまたはアミ
    ノ酸レベルでこれに少なくとも５０％一致することを特徴とする、環化反応に関
    係する酵素。
  63. 【請求項６３】 請求項３１から６３までのいずれか記載のポリペプチドと
    特異的に反応する抗体。
  64. 【請求項６４】 下記の工程 （ａ）それ自体公知の方法での完全な化学合成または （ｂ）オリゴヌクレオチドの化学合成、オリゴヌクレオチドの標識付与、Ｓ．ス
    ピノサからのゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡから出発して作製されたゲノムもし
    くはｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイジン
    グ、陽性クローンの選択および陽性クローンからハイブリダイズしたＤＮＡの単
    離または （ｃ）オリゴヌクレオチドの化学合成およびＰＣＲを用いる標的ＤＮＡの増幅 を含んでなる、請求項１から７までのいずれか記載の核酸を作製するための方法
    。
  65. 【請求項６５】 下記の工程 （ａ）請求項１から７までのいずれか記載の核酸の発現を確実化する条件下で請
    求項２７から３０までのいずれか記載の宿主細胞を培養し、または （ａ１）インビトロ系内で請求項１から７までのいずれか記載の核酸を発現し、
    そして （ｂ）細胞、培地もしくは生体外系からポリペプチドを得る、 を含んでなる、請求項３１から６２までのいずれか記載のポリペプチド作製のた
    めの方法。
  66. 【請求項６６】 下記の工程 （ａ）請求項１から７までのいずれか記載の核酸の発現を確実化する条件下での
    請求項２７から３０までのいずれか記載の宿主細胞を培養し、そして （ｂ）細胞または培地からスピノシン、スピノシン前駆体またはスピノシン誘導
    体を得る、 を含んでなる、スピノシン、スピノシン前駆体またはスピノシン誘導体を作製す
    るための方法。
  67. 【請求項６７】 下記の工程 （ａ）請求項７記載の少なくとも１個のモジュール−コード化核酸配列を、請求
    項７記載の少なくとも１個の他のモジュール−コード化核酸配列と交換し、また
    は （ｂ）請求項７記載の少なくとも１個のモジュール−コード化核酸配列を、Ｓ．
    スピノサからの少なくとも１個の他のモジュール−コード化核酸配列と交換し、
    または （ｃ）請求項７記載の少なくとも１個のモジュール−コード化核酸配列を、Ｓ．
    スピノサ以外の生物体からの少なくとも１個の他のモジュール−コード化核酸配
    列と交換し、または （ｄ）請求項７記載の少なくとも１個のドメイン−コード化核酸配列を、請求項
    ７記載の少なくとも１個の他のドメイン−コード化核酸配列と交換し、または （ｅ）請求項７記載の少なくとも１個のドメイン−コード化核酸配列を、Ｓ．ス
    ピノサからの少なくとも１個の他のドメイン−コード化核酸配列と交換し、また
    は （ｆ）請求項７記載の少なくとも１個のドメイン−コード化核酸配列を、Ｓ．ス
    ピノサ以外の生物体からの少なくとも１個の他のドメイン−コード化核酸配列と
    交換し、または （ｇ）請求項７記載の第一のアシルトランスフェラーゼ−コード化核酸配列を、
    請求項７記載の第二のアシルトランスフェラーゼコード化核酸配列と交換し、こ
    こで第二のアシルトランスフェラーゼは第一のアシルトランスフェラーゼのもの
    とは異なる基質特異性を有し、または （ｈ）請求項７記載の第一のアシルトランスフェラーゼ−コード化核酸配列を、
    Ｓ．スピノサからの第二のアシルトランスフェラーゼコード化核酸配列と交換し
    、ここで第二のアシルトランスフェラーゼは第一のアシルトランスフェラーゼの
    ものとは異なる基質特異性を有し、または （ｉ）請求項７記載の第一のアシルトランスフェラーゼ−コード化核酸配列を、
    Ｓ．スピノサ以外の生物体からの第二のアシルトランスフェラーゼコード化核酸
    配列と交換し、ここで第二のアシルトランスフェラーゼは第一のアシルトランス
    フェラーゼのものとは異なる基質特異性を有し、または （ｊ）請求項７記載の少なくとも１個のドメイン−コード化核酸配列を欠失させ
    、または （ｋ）請求項７記載の少なくとも１個のドメイン−コード化核酸配列を、請求項
    ７記載のモジュールコード化核酸配列中に組込み、または （ｌ）請求項７記載の少なくとも１個のドメイン−コード化核酸配列を突然変異
    させ、 そしてスピノシン誘導体またはスピノシン前駆体の合成を可能とする条件下で宿
    主細胞内に組換え核酸配列を発現することを含んでなる、スピノシン前駆体を含
    むスピノシン誘導体を作製するための方法。
  68. 【請求項６８】 スピノシン生合成遺伝子を同定、不活性化および／または
    改変するための、請求項１から７までのいずれか記載の核酸の使用。
  69. 【請求項６９】 ポリケチド合成酵素のライブラリーを作製するための、請
    求項１から７までのいずれか記載の核酸の使用。
  70. 【請求項７０】 下記の工程 （ａ）配列番号２３、２５、２９、３１、３３、３５および３７記載の核酸を、
    スピノシンアグリコンもしくはスピノシン１７−シュードアグリコンもしくはポ
    リケチドアグリコンを産生できる宿主細胞内に転移し、または （ａ１）配列番号２３、２５、２９、３１、３３、３５および３７記載の核酸を
    、スピノシンアグリコンもしくはスピノシン１７−シュードアグリコンもしくは
    ポリケチドアグリコンを産生できない宿主細胞内に転移しそしてスピノシンアグ
    リコンもしくはスピノシン１７−シュードアグリコンもしくはポリケチドアグリ
    コンを培地内に加え、そして （ｂ）宿主細胞を活性細胞代謝に導く条件下で培養する、 を含んでなる、スピノシンアグリコンまたはスピノシン１７−シュードアグリコ
    ンまたはポリケチドアグリコンにホロサミン糖残基を付加するための方法。
  71. 【請求項７１】 下記の工程 （ａ）配列番号７、９、１１、１３、１７および／または１９記載の核酸を、ス
    ピノシンアグリコンもしくはスピノシン９−シュードアグリコンもしくはポリケ
    チドアグリコンを産生できる宿主細胞内に転移し、または （ａ１）配列番号７、９、１１、１３、１７および／または１９記載の核酸を、
    スピノシンアグリコンもしくはスピノシン９−シュードアグリコンもしくはポリ
    ケチドアグリコンを産生できない宿主細胞内に転移しそしてスピノシンアグリコ
    ンもしくはスピノシン９−シュードアグリコンもしくはポリケチドアグリコンを
    培地内に加え、そして （ｂ）宿主細胞を活性細胞代謝に導く条件下で培養する、 を含んでなる、スピノシンアグリコンまたはスピノシン９−シュードアグリコン
    またはポリケチドアグリコンにトリメチルラムノース糖残基を付加するための方
    法。
  72. 【請求項７２】 工程（ａ）において、配列番号９、１１、１３および１７
    記載の核酸が転移される、請求項７１記載の方法。
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