JP2000515390A

JP2000515390A - 新規ポリケチド誘導体およびそれを製造するための組換え方法

Info

Publication number: JP2000515390A
Application number: JP10549352A
Authority: JP
Inventors: カツツ，レオナルド; スタツシー，ダイアン・エル; サマーズ，リチヤード・ジイ，ジユニア; ルーアン，シヤオアン; ペレダ―ロペス，アナ; カカフアス，ステイーブン・ジエイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1997-05-16
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2000-11-21
Also published as: US6060234A; CA2261025A1; US20030013662A1; WO1998051695A3; WO1998051695A2; US6200813B1; AR012850A1; ZA984038B; EP0956288A2; AU7478198A

Abstract

(57)【要約】本発明は、マクロラクトン環上のメチル基が−Ｈ、−Ｅｔおよび／または−ＯＨで置換され、エチル側鎖がヒドロキシメチルまたはジヒドロキシシクロヘキシルメチル側鎖で置き換えられた新規エリスロマイシン誘導体を提供する。また、本発明は、単離されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび新規化合物を製法するための該ベクターで形質転換した宿主細胞も提供する。遺伝子工学技術を利用する化合物の製法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】新規ポリケチド誘導体およびそれを製造するための組換え方法本出願は１９９１年１月１７日に出願された同時係属米国特許出願第０７／６５２，７３４号の一部継続出願である１９９７年５月１６日に出願された同時係属米国特許出願第０８／８５８，００３号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、新規ポリヌクレオチド配列、それによりコードされているポリケチドの生合成に関与する蛋白質、それらのポリヌクレオチド配列を用いる新規ポリケチドの生合成に向けられている方法およびそれから生産される新規ポリケチド誘導体に関する。特に、本発明は、ポリケチドシンターゼをコードする遺伝子の操作による新規ポリケチド誘導体の生産に関する。発明の背景ポリケチドはエリスロマイシン、テトラサイクリン、アンフォテリシン、ダウノルビシン、アベルメクチンおよびラパマイシンのような多くの重要な抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、抗蠕虫剤および免疫抑制化合物を含む天然物の大きなクラスである。それらの合成は、後に成熟ポリケチドに変換される種々の長さおよび置換パターンの炭素鎖を生じるアシルエステルの順序立てた縮合によって進行する。この工程は似ているが重要な差異がある脂肪酸生合成として長い間認識されてきた。脂肪酸シンターゼとは異なり、典型的なポリケチドシンターゼは、炭素鎖組立ての間に多くの選択をなすようにプログラムされている。例えば、「開始剤」および「延長剤」ユニットの選択があり、これはポリケチドシンターゼによって規定配列におけるアセテート、プロピオネートまたはブチレート残基からしばしば選択される。それを完全に省略するいくつかの縮合工程後における還元−脱水−還元の全サイクルの使用、または２つの不完全なサイクルのうち１つ（還元のみまたは還元に続いて脱水）の使用の選択がそれ以外にプログラムされており、ケトもしくはビロキシル基のパターンおよび鎖中の異なる点における飽和の程度を決定する。最後に、炭素原子のうちの多くにおける置換基についての立体化学はポリケチドシンターゼによってプログラムされている。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよび密接に関連するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属は非常に多様なポリケチド代謝を有する生産菌である。これらの化合物の商業的重要性のため、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ遺伝学の研究において多大な努力が費やされてきた。その結果、これらの生物について多くが知られ、それらの形質転換のためのいくつかのクローニングベクターおよび技術が存在している。多くのポリケチドが同定されてきたが、増強された特性を持つ新規ポリケチド構造体を得る要望が依然として存在する。このような分子を得るための現在の方法は、天然単離体のスクリーニングおよび存在するポリケチドの化学的修飾を含み、その双方はコスト高であって時間を消費する。現在のスクリーニング方法は、分子の総特性、すなわち、抗菌活性、抗真菌活性等に基づいており、得られた分子の構造の先験的知識または増強された特性の予備決定は共に実質的に不可能である。予め存在する構造の化学的修飾は新規ポリケチドを得るためにうまく用いられているが、得られる化合物のタイプの現実的な制限に悩まされ、修飾を行うための多段工程による低収率および利用可能な化学に大いに関係している。達成するのが特に困難な修飾は、炭素側鎖の付加または欠失を含むものである。従って、このような変化が特定でき、コスト的に有利であって高収率で行うことができる分子を得るというかなりの要望が存在する。本発明は、化学修飾よりもむしろ、試薬（具体的には、ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび該ベクターを含む宿主細胞）およびｄｅｎｏｖｏ生合成によって新規ポリケチドを生成する方法を提供することによって、これら課題を解決する。発明の要約１つの観点において、本発明は、式：［式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆は、独立して、Ｑから選択され、ここに、Ｑは（ａ）−Ｈ、（ｂ）−Ｍｅ、（ｃ） −Ｅｔ、および（ｄ）−ＯＨよりなる群から選択され；Ｒ₇は−Ｅｔ、−ＨＯＭｅ、および１３−３，４−ジヒドロシクロヘキシルメチルよりなる群から選択され；Ｌ₁およびＬ₂は独立して−Ｈまたは−ＯＨであり；Ｌ₃はＤ−デスオサミンまたは−ＯＨであり；およびＬ₄はＬ−ミカロース、Ｌ−クラジノースまたは− ＯＨであり、但し、Ｒ₇が−ＥｔであってＲ₁−Ｒ₅が−Ｍｅである場合、Ｒ₆は− Ｈまたは−Ｍｅ以外である］で示される化合物を提供する。本発明の好ましい化合物は、Ｑが前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）または前記（ａ）、（ｂ）および（ｄ）または前記（ａ）、（ｃ）および（ｄ）または前記（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）または前記（ａ）および（ｂ）または前記（ａ）および（ｃ）または前記（ａ）および（ｄ）または前記（ｂ）および（ｃ）または前記（ｃ）および（ｄ）よりなる群から選択され、Ｒ₇が−Ｅｔであって、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄が前記定義のものであるものである。他の好ましい化合物はＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆が全て−Ｈまたは−Ｅｔまたは−ＯＨであり、Ｒ₇が−Ｅｔであって、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄ が前記定義のものを含む。さらに他の好ましい化合物は式Ｘの化合物のジデスメチル、トリデスメチル、テトラデスメチル、ペンタデスメチルおよびヘキサデスメチル誘導体、特にエリスロマイシンＡおよびＢのジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキサデスメチル誘導体を含む。式Ｘの他の特に好ましい化合物は、６，１０−ジデスメチル−６−エチルエリスロマイシンＡ、１０，１２−ジデスメチル−１２−デオキシ−１２−エチルエリスロマイシンＡ、１０，１２−ジデスメチル−１２−デオキシ−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡ、６，１０，１２−トリデスメチル −６，１２−ジエチルエリスロマイシンＡ、６，１０，１２−トリデスメチル− ６−デオキシ−６，１２−ジエチルエリスロマイシンＡ、１０−ジデスメチルエリスロノリドＢ、１０−デスメチル−６−ジオキシエリスリノリドＢ、１２−デスメチルエリスロノリドＢ、１２−デスメチル−６−デオキシエリスリノリドＢ、１２−デスメチル−１２−エチルエリスリノリドＢ、６−デスメチル−６−デオキシ−６−エチルエリスリノリドＢ、１０−デスメチルエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ、１２−デスメチルエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、１２ −デスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ、６−デスメチル−６ −エチルエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−１２−エチルエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−１２−デオキシ−１２−エチルエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡ−１２−デスメチル− １２−エピヒドロキシエリスロマイシンＡ−１０，１２−デスメチルエリスロマイシンＡ、１０，１２−ジデスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、１０，１２−ジデスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ、１０−デスメチルエリスリノリドＢ、１０−デスメチル−６−デオキシエリスリノリドＢ、１２−デスメチルエリスリノリドＢ、１２−デスメチル−６−デオキシエリスリノリドＢ、１０−デスメチルエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−１２− デオキシエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ、１２−デスメチルエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−１２ −デオキシエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ、１０，１２−ジデスメチルエリスロマイシンＡ、１０，１２− ジデスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡおよび１０，１２ −ジデスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡを含む。最も好ましい化合物は、１０−デスメチルエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−１２− デオキシエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、８−デスメチル−８−ヒドロキシエリスロマイシンＡ、６−デスメチル −６−エピエリスロマイシンＡ、４−デスメチル−４−ヒドロキシエリスロマイシンＡ、２−デスメチル−２−ヒドロキシエリスロマイシンＡ、１３−デスメチル−１３−ヒドロキシメトールエリスロマイシンＡ、２，１２−ジデスメチル− ２，１２−ジヒドロキシエリスロマイシン、４，１０−ジデスメチル−４，１０ −ジヒドロキシエリスロマイシン、１０，１２−ジデスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシン、６，１０−ジデスメチル−６−エチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡおよび１３−デスエチル−１３−（３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡを含む。もう１つの観点において、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓから選択されるＰＫＳからの酵素的に活性なアシルトランスフェラーゼドメインをコードする単離されたポリヌクレオチド配列またはその断片を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチド配列は配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２９または配列番号：３０である。もう１つの好ましい実施態様において、ポリヌクレオチド配列は配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４よりなる群から選択されるアシルトランスフェラーゼドメインをコードする。また、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの酵素的に活性なアシルトランスフェラーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を含むベクターを提供する。好ましくは、ポリヌクレオチド配列は前記したものから選択され、該ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓである。特に好ましいベクターはｐＣＳＳである。本発明の他のベクターはｐＵＣ１８／ＬｉｇＡＴ２、ｐＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２、ｐＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２、ｐＵＣ１８／ｖｅｎＡＴ、ｐＥｒｙＡＴ１／ｖｅｎＡＴ、ｐＵＣ１９／ｒａｐＡＴ１４、ｐＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４、ｐＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４、ｐＵＣ／５’−ｆｌａｎｋ／ｅｔｈＡＴ、ｐＵＣ／ｅｔｈＡＴ／Ｃ−６、ｐＥＡＴ４、ｐＵＣ１８／ＮｉｄＡＴ６、ｐＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６、ｐＥｙＡｔＳ／ＮｉｄＡＴ６およびｐＥｒｙＡＴｓ／ｒａｐｌｉｇａｓｅ３．０を含む。もう１つの観点において、本発明は前記したベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。宿主細胞は細菌細胞であって、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ種よりなる群から選択される。代わりに、該宿主細胞はポリケチド生産微生物である。好ましいポリケチド−生産宿主細胞はＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種、Ｎｏｃａｒｄｉａ種、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ種、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種およびＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ種よりなる群から選択される。なおより好ましいポリケチド−生産宿主細胞はＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｈｉｒｓｕｔａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｒｏｓａｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｅａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｐｌａｎｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅよりなる群から選択される。これらの宿主細胞のうち、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓが最も好ましい。また、本発明は、（ａ）第１および第２ゲノムＤＮＡセグメントを単離し、各々はポリケチドシンターゼを含み、ここに第１ゲノムＤＮＡセグメントは第１ポリケチド生産微生物からのものであって第２ゲノムＤＮＡセグメントは第１ポリケチド生産微生物または第２ポリケチド生産微生物からのものであり；（ｂ）第１ゲノムＤＮＡセグメントの１またはそれ以上の異なる断片を同定し、その各々はアシルトランスフェラーゼドメインをコードし；（ｃ）第２ゲノムＤＮＡセグメントの１またはそれ以上の異なる断片を同定し、その各々は第１ゲノムＤＮＡセグメントに関連しているドメインをコードし；（ｄ）第１ゲノムＤＮＡセグメントからの断片の１またはそれ以上を工程（ｃ）からの断片の１またはそれ以上で置換することに導く、相同組換え事象の発生に適した条件下で、工程（ｃ）からの断片の１またはそれ以上で第１ポリケチド生産微生物の細胞を形質転換する；工程を含む第１ポリケチド生産微生物においてポリケチドシンターゼの基質特異性を改変する方法を提供する。１つの実施態様において、第１ポリケチド生産微生物はＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈ、ｒａｅａであり、第２ポリケチド生産微生物はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである。好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅよりなる群から選択される。なおさらに好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅである。第２の実施態様において、第１ポリケチド生産微生物は前記したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓであって第２ポリケチド生産微生物はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｅｒｙｔｈｒａｅａである。また、好ましい実施態様において、関連ドメインは配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４よりなる群から選択される。図面の簡単な記載本発明は添付図面と関連してより容易に理解されるであろう。図１はＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるエリスロマイシンＡの生合成の提案された代謝経路である。図２はエリスロマイシンＰＫＳの模式図である。図３はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ；ＬｉｇＡＴ２およびｒａｐＡＴ１−１４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ；ｖｅｎＡＴ）およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａ（Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ、ｅｒｙＡＴ１−６）からのＡＴドメインの発達樹分析である。図４ａはＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるＥｒｙＡＴ１のＬｉｇＡＴ２またはｖｅｎＡＴでのおよびＥｒｙＡＴ２のＬｉｇＡＴ２での遺伝子置換の模式図である。図４ｂはＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるＥｒｙＡＴ４のエチルＡＴ（ＮｉｄＡＴ５）での遺伝子置換の模式図である。図５は相同組換えによる遺伝子置換の図である。図６はＳ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３からのリガーゼ −ＰＫＳクラスターの遺伝的組織の模式図である。図７はＬｉｇＡＴのヌクレオチド配列（配列番号：１、頂部鎖）および対応するアミノ酸配列（配列番号：３１、底部鎖）、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３のＬｉｇａｓｅ−ＰＫＳクラスターのモジュール２からのマロニルＡＴドメインを表す。図８はＬｉｇＡＴ２ドメインをクローン化するストラテジーの図である。図９はプラスミドｐＣＳ５におけるＥｒｙＡｔ１フランキング領域のクローニングの系統線図である。図１０はｐＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２の構築を示す系統線図である。図１１はプラスミドｐＣＳ５におけるＥｒｙＡＴ２フランキング領域のクローニングの系統線図である。図１２はｐＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２の構築を示す系統線図である。図１３はｖｅｎＡＴのヌクレオチド配列（配列番号：２、頂部鎖）および対応するアミノ酸配列（配列番号：３２、底部鎖）、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅＡＴＣＣ１５４３９からのＰＫＳクラスターからのマロネートＡＴドメイン（以後、ｐｖｅｎ４という）を表す。図１４はｖｅｎＡＴドメインをクローン化するストラテジーの図である。図１５はｐＥｒｙＡｔ１／ｖｅｎＡＴの構築を示す系統線図である。図１６はｒａｐＡＴ１４ドメインをクローン化するストラテジーの図である。図１７はｐＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４の構築を示す系統線図である。図１８はｐＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４の構築を示す系統線図である。図１９はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１からのＰＫＳクラスターの遺伝的組織の模式図である。図２０はニッダマイシンのマクロライド環の構造の図である。図２１はＮｉｄＡＴ５のヌクレオチド配列（配列番号：２９、頂部鎖）および対応するアミノ酸配列（配列番号：３３、底部鎖）、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１のモジュール５からのエチルＡＴドメインを表す。図２２はｐＵＣ／ｅｔｈＡＴ／Ｃ−６の構築を示す系統線図である。図２３はＮｉｄＡＴ５の５’末端にＡｖｒＩＩ部位を生じるように作成されたヌクレオチド変化を示す図である。図２４は置換プラスミドｐＥＡＴ４の図である。図２５はＮｉｄＡＴ６のヌクレオチド配列（配列番号：３０、頂部鎖）および対応するアミノ酸配列（配列番号：３４、底部鎖）、ニッダマイシンＰＫＳクラスターのモジュール６におけるＡＴドメインを表す。図２６はＮｉｄＡＴ６ドメインをクローン化するストラテジーの図表示である。図２７はｐＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６の構築を表す図である。図２８はプラスミドｐＣＳ５におけるＥｒｙＡＴｓフランキング領域のクローニングを示す系統線図である。図２９はｐＥｒｙＡＴｓ／ＮｉｄＡＴ６の構築を示す系統線図である。図３０はｐＥｙＭ１／ＮｉｄＡＴ６のクローニングを示す系統線図である。図３１はプラスミドｐＳＬ１１８０／ラプリガーゼ３．０の構築を示す系統線図である。図３２はプラスミドｐＥｒｙＡｔｓ／ラプリガーゼ３．０の構築を示す系統線図である。発明の詳細な説明Ｉ．定義ここに開示されクレームされている本発明のために、以下の用語を定義する：本明細書で用いる「ポリケチド」なる用語は、限定されるものではないが、抗生物質、抗癌剤、抗蠕虫剤、抗菌類剤、色素および免疫抑制剤化合物を含めた天然物の大きくて多様なクラスをいう。抗生物質は、限定されるものではないが、アントラサイクリン、テトラサイクリン、ポリエーテル、ポリエン、アンサミシン、およびアベルメクチン、エリスロマイシンおよびニッダマイシンのような種々のタイプのマクロライドを含む。ポリケチドなる用語は、また、化学合成における中間体として使用できるこのクラスの化合物をいうことを意図する。例えば、エリスロマイシンＡは単離され、抗生物質クラリスロマイシンの化学合成で使用されるポリケチドである。中間体として使用されるポリケチドはそれ自体必ずしもいずれかの生物学的もしくは治療活性を有しない。本明細書で用いる「ポリケチド生産微生物」なる用語は、ポリケチドを産生できる、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ目または他のＥｕｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目からの細菌を含むが、それらの限定されるものではない。ポリケチドを産生するａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓおよびｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａの例は、限定されるものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｈｉｒｓｕｔａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｒｏｓａｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｙｃａｒｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ vｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅおよびポリケチドを産生する種々の他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅＳ、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、ＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍおよびＡｍｙｃｏｌｏｔｏｐｓｉｓ株を含む。ポリケチドを産生する酵母および菌類も「ポリケチド−産生微生物」と考えられる。ポリケチドを産生する菌類の例は限定されるものではないがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属を含む。本明細書で用いる「ポリケチドシンターゼ」（ＰＫＳ）なる用語はポリケチドの生合成を担う酵素活性の複合体をいう。ＰＫＳに含有される酵素活性は、限定されるものではないが、β−ケトリダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）、エノイルリダクターゼ（ＥＲ）、β−ケトアシルＡＣＰシンターゼ（ＫＳ）、アシルキャリアー蛋白質（ＡＣＰ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）およびチオエステラーゼ（ＴＥ）を含む。各酵素活性を担うポリペプチド断片を「ドメイン」をいう。「モジュール」とはポリケチド形成の工程における１つの縮合工程を行うドメインの群または組をいい、成長するポリケチドにおけるβ−カルボニル基のプロセッシングを行うドメインを含んでも含まなくてもよい。本明細書で用いる「タイプＩＰＫＳ」とは、大きな多機能蛋白質である、ＰＫＳをいい、ＤＥＢＳ（後記参照）が例示される。用語「タイプＩＩＰＫＳ」とはいくつかの別々の殆んどが大きな単機能の酵素を有するＰＫＳをいい、アクチノルホジンおよびテトラセノマイシンの生合成を担うＰＫＳが例示される（Ｃ．Ｒ．ＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎおよびＩ．Ｆｕｊｉｉ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：２０１−２３８（１９９５年））。本明細書で用いる「同族ドメイン」なる用語は、天然に生じる単一モジュールを構成するドメインの特定の組のメンバーをいう。本明細書で用いる「関連ドメイン」または「異種ドメイン」なる用語は、第２ＰＫＳドメインに機能的に似ているＰＫＳドメインをいう。「機能的に似ている」とは、各ドメインがある特定のタイプの反応を触媒するが、異なる基質に対して作用することを意味する。例えば、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈａｅａのモジュール１のＡＴドメイン（ｅｒｙＡＴ１）およびＳ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのモジュール１４のＡＴドメイン（ｒａｐＡＴ１４）は共に対応するＡＣＰドメインへの伸長ユニットの移動を触媒する。しかしながら、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの場合、ｅｒｙＡＴ１は基質としてメチルマロニルＣｏＡを利用し、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓにおいてはｒａｐＡＴ１４はマロニルＣｏＡを利用する。したがって、ｅｒｙＡＴ１およびｒａｐＡＴ１４は「関連する」または「異種」ドメインであると考えられる。本明細書で用いる「縮合」なる用語は、新生ポリケチド鎖への伸長ユニットの付加をいい、ＰＫＳのＫＳ、ＡＴおよびＡＣＰドメインの作用を要する。本明細書で用いる「開始剤」なる用語は、ポリケチドの第１の構築ブロックとしてポリケチドシンターゼによって使用されるカルボン酸の補酵素Ａチオエステルをいう。本明細書で用いる「伸長」なる用語は第１位置以外の位置においてポリケチドシンターゼによってポリケチドに一体化されるジカルボン酸の補酵素Ａチオエステルをいう。本明細書で用いる「ＤＥＢＳ」なる用語は、ポリケチド−由来マクロラクトン６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ＤＥＢ）を構築するＰＫＳ、酵素６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼをいう。本明細書で用いる「ｅｒｙＡ」なる用語は、ＤＥＢＳをコードする遺伝子をいう。本明細書で用いる「相同組換え」なる用語は、同一配列を含むＤＮＡストランド間の交差をいう。本明細書で用いる「単離された」なる用語は、物質が、その本来の環境（例えば、物質が天然に生じる天然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きた動物に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されておらないが、天然系で共存する物質のいくらかまたは全てから分離された同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部となりえおよび／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部となりえ、依然として、ベクターまたは組成物が天然環境の一部ではない点で単離されている。本明細書で用いる「制限断片」なる用語は、１またはそれ以上の制限酵素の作用によって生じたいずれの線状ＤＮＡをも表す。本明細書で用いる「形質転換」なる用語は、微生物に挿入するのに使用される方法を問わず、ＤＮＡの受容体微生物への導入をいう。本明細書で用いる「レプリコン」なる用語は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律単位として挙動するプラスミド、染色体またはウイルスのようないずれの遺伝要素もいう。「ベクター」は、もう１つのポリヌクレオチド断片が付着されて、付着された断片の複製および／または発現を行うレプリコンである。本明細書で用いる「組換えポリヌクレオチド」または「組換えポリペプチド」なる用語は、その起源または操作によって、天然で会合しているおよび／またはそれが天然で連結しているもの以外のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに連結したポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全てまたは一部と会合していない少なくともポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。本明細書で用いる「宿主細胞」なる用語は、組換えポリヌクレオチドおよびここに提供されるベクターの受容体として使用される原核細胞または真核細胞を共にいう。本明細書で用いる「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」なる用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域をいい；この領域はコーディング配列またはの一部または全コーディング配列を表すことができる。ＩＩ．本発明最も広い意味において、本発明は、治療活性（例えば、抗菌剤、抗癌剤、抗真菌剤、免疫抑制剤および／または抗蠕虫剤活性）を持つ新規ポリケチドおよびポリケチドのような中間体化合物を含む。また、本発明は、天然にポリケチドを生産する生物の遺伝情報を選択的に改変することによってインビボで新規ポリケチドを産生する方法を提供する。さらに、本発明は、ポリケチド−産生微生物からのＰＫＳドメイン（すなわち、ポリペプチド）をコードする単離・精製されたポリヌクレオチド、その断片、それらのポリヌクレオチドを含有するベクター、およびそれらのベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。これらのポリヌクレオチド、その断片、およびポリヌクレオチドを含むベクターは前記方法における試薬として使用できる。ここに開示するポリヌクレオチド配列の一部は、ＤＮＡの増幅用のプライマーとして、または他のポリケチド−産生微生物からの関連ドメインを同定するためのプローブとしても有用である。ＩＩＩ．ポリヌクレオチド本発明は、ＰＫＳドメイン（すなわち、ポリペプチド）をコードする単離・精製されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に関与するその断片を提供する。本発明の範囲内に含まれるポリヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡおよび合成ＤＮＡの形態であってよい。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってよく、一本鎖はコーディング（センス）鎖または非コーディング（アンチセンス）鎖であってよい。ポリペプチドをコードするコーディング配列はここに提供されるコーディング配列と同一であってよく、あるいは遺伝暗号の重複性または縮重の結果として、ここに提供されるＤＮＡとして同一のポリペプチドをコードする異なるコーディング配列であってもよい。ポリヌクレオチドは、特定のポリペプチドについてのまたはここに提供されるポリペプチド配列と機能的に同等であるポリペプチドについてのコーディング配列のみを含むことができる。加えて、本発明は、ポリヌクレオチド欠失、置換または付加のような修飾を含む変異体ポリヌクレオチド、および該変異体ポリヌクレオチド配列に由来するポリペプチド修飾を含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、ここに提供されるコーディング配列の天然に生じる対立遺伝子変異体であるコーディング配列を有することもできる。ここに提供されるポリヌクレオチド配列に従って構築されたプローブおよびプライマーも本発明の範囲内にあると意図され、種々のタイプの分析を供する種々の方法で使用することができる。例えば、特定のドメインをコードするポリヌクレオチド配列に従ってプライマー配列を設計することができ、次いで、これを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）のようなよく知られた増幅技術を用い、同一または他の関連ドメインのポリヌクレオチド配列を増幅することができる（ＰＣＲは米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に開示され、ＬＣＲは１９８９年６月１６日に公開されたＫ．Ｂａｃｋｍａｎに対するＥＰ−Ａ−３２０３０８および１９９１年７月３１日に公開されたＫ．Ｂａｃｋｍａｎらに対するＥＰ−Ａ−４３９１８２に開示されており、その全てをここに出典明示して本明細書の一部とみなす）。他の増幅技術またはそれらの増幅技術の変法（例えば、入れ子ＰＣＲ）で使用されるプライマーの生成も本発明の範囲内にあると意図され、また、日常的な実行者の知識の範囲内にあると考えられる。プローブおよびプライマーは、注目するポリヌクレオチドの保存されたヌクレオチド領域から、または注目するポリヌクレオチドの非保存ヌクレオチド領域から設計することができる。一般に、核酸プローブは、最大特異性が望まれる場合は、非保存またはユニーク領域から開発され、多遺伝子ファミリーの関連メンバーのヌクレオチド領域につき、または関連種においてアッセイする場合には、保存領域から開発される。また、プローブは、放射性同位体または組換えライブラリーのスクリーニング用の他の検出標識で標識することもできる。プライマーおよびプローブを合成する種々の方法は、標識をプライマーまたはプローブに付着される方法のごとく、当該分野でよく知られている。例えば、慣用的ヌクレオチドホスホルアミダイト化学およびＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）、Ｄｕｐｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）またはＭｉｌ１ｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手可能な装置を用いて所望の核酸プライマーまたはプローブを合成するのは日常的事項である。本発明のプライマーまたはプローブのようなオリゴヌクレオチドを標識するための多くの方法が記載されている。商業的に入手可能なプローブ標識キットは、ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ（ＡｒｌｉｎｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＥｎｚｏＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）およびＣ１ｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）からのものを含む。ＩＶ．ベクターおよび宿主細胞本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよび本発明のベクターにて遺伝子的工学的に作成した宿主細胞を提供する。ａ．ベクターおよび発現系本発明は前記にて広く記載した１以上の配列を含む組換え構築体を含む。該構築体は、それに本発明の配列が順方向または逆方向に挿入されたプラスミドもしくはウイルスベクターのようなベクターを含む。このようなベクターは原核生物または真核生物源からの染色体、非染色体および合成配列を含む。非常に多数の適当なプラスミドおよびベクターが当業者に知られており、商業的に入手できる。中間宿主におけるクローニングおよび発現で特に有用なベクターは、限定されるものではないが、（ａ）細菌：ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）；ｐＧＥＭ（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＵＣ、ｐＳＰＯＲＴ１およびｐＰｒｏＥｘｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）；ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｏｌｌａ，ＣＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５およびｐＧＥＸ４Ｔよび（ｂ）真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む。原核生物および真核生物で使用される他の適当なクローニングおよび発現ベクターはＭａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏ１ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８２年）に記載されており、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす。しかしながら、一般に、宿主中で複製可能であって活性な限り、いずれのプラスミドまたはベクターを用いることもできる。もう１つの実施態様において、該構築体は、ｍＲＮＡ合成およびポリペプチド生産を指令する、注目する配列に作動可能に連結した調節配列も含む発現ベクターである。原核細胞および／または真核細胞で作動することが知られている調節配列は、ｍＲＮＡ転写を調節するための誘導性および非誘導性ブロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、翻訳終止のための停止コドンおよび転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化シグナルを含む。加えて、発現ベクターは発現を増幅するための適当な配列を含むことができる。プロモーター領域はいずれかの所望の遺伝子から選択することができる。特に指名された細菌プロモーターはＬａｃＺ、gｐｔ、ラムダＰ_R、ラムダＰ_L、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｅｒｍＥおよび（ｅｒｍＥ^＊としても知られている）ｅｒｍＥＰ１ＴＧＧのようなその誘導体（Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕ１ａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４（３）：５３３−５４５（１９９４年））、ｍｅｌＣＩおよびａｃｔＩＩ（Ｃ．Ｍ．Ｋａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：５０９−５１２（１９９４年））を含む。真核生物プロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期、単純泡疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、マウスメタロチオネイン−Ｉ、プリオン蛋白質およびニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）を含む。適当なプロモーターの選択は当業者の技量内のものである。加えて、組換え発現ベクターは、安定に形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能とする複製起点および（抗生物質（例えば、ネオマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリンまたはチオストレプトン）に対する耐性を付与する遺伝子またはレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）のような）等の選択マーカーを含むであろう。いずれかの発現ベクターにおいて、異種構造配列（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）は、翻訳開始および終止配列を用い適当な相で組み立てられる。所望により、異種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製を付与するＮ−末端同定ペプチドを含めた融合蛋白質をコードするであろう。真核生物発現ベクターは、また、一般的に、複製起点、注目する配列に作動可能に連結された適当なプロモーターならびに必要な翻訳増強配列、ポリアデニル化部位、転写終止配列、および５’フランキング非転写配列も含む。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源の初期プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化部位を用いて、必要な遺伝要素を供することができる。このようなベクターは、また、遺伝子の転写を増加させるエンハンサー配列も含むことができる。エンハンサーは、その転写速度を増大させるようにプロモーターに対して作用する、通常約１０ないし３００ｂｐのＤＮＡのシス −作用性要素である。その例は、複製起点の後期部位にあるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００ないし２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期部位にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。ｉ．ベクター構築適当なＤＮＡ配列は種々の手順によってベクターに挿入することができる。一般に、部位特異的ＤＮＡ切断は、これらの市販の酵素の製造業者によって一般的に規定される条件下でＤＮＡを適当な制限酵素で切断することによって行われる。通常、約１マイクログラム（μｇ）のプラスミドまたはＤＮＡ配列は、３７℃ での１ないし２時間のイキンキュベーションによって、約２０マクイロリットル（μＬ）緩衝溶液中の１ユニットの酵素によって切断される。制限酵素とのイキンキュベーションの後、フェノール／クロロホルム抽出によって蛋白質を除去し、エタノールでの沈殿によってＤＮＡを回収することができる。切断された断片は、日常的な実行者によって知られている方法に従い、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルを用いて分離することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）。連結は、標準的な緩衝液および温度条件を用い、（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）およびＡＴＰにて行われる。粘着末端連結は平滑末端連結よりも必要とするＡＴＰおよびリガーゼが少ない。ベクター断片を細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理して、５’−リン酸を除去し、したがって、ベクターの再連結を防ぐことができる。連結混合物を適当なＥ．ｃｏｌｉのようなクローニング宿主に形質転換し、成功した形質転換体を抗生物質耐性を含めた方法によって選択し、次いで、正しい構築体につきスクリーニングすることができる。ｉｉ．形質転換／トランスフェクション宿主が組換えポリペプチドを産生するような、本発明の構築体での適当な宿主の形質転換またはトランスフェクションは種々の方法で行うこともできる。例えば、塩化カルシウムまたはポリエチレングリコール形質転換、塩化リチウムまたはリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって構築体を宿主細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換／トランスフェクトするためのこれらおよび他の方法は日常的な実行者によく知られている（例えば、Ｌ．Ｄａｖｉｓら、「ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、第２版、ＡｐｐｌｅｔｏｎおよびＬａｎｇ、ＰａｒａｍｏｕｎｔＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ,ＥａｓｔＮｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４年）およびＤ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄら、ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，ＴｈｅＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，英国（１９８５年）参照）。ｂ．宿主細胞１つの実施態様において、本発明は後記する組換え構築体を含有する宿主細胞を提供する。１つの観点において、宿主細胞は、（例えば、組換えポリヌクレオチド配列をクローニングしおよび／または確認する目的で）大規模ベースで本発明のポリヌクレオチドを生産するのに用いられる、または経時的にこのようなポリヌクレオチド配列を維持する手段としての（すなわち、維持または貯蔵株としての）「中間」宿主であり得る。「産生」宿主は、新規ポリケチドを生産するのに使用される宿主細胞である。宿主細胞（中間または産生）は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、または酵母細胞のような下等真核細胞、または細菌細胞のような原核細胞であり得る。下等真核細胞は好ましい中間および産生宿主である。適当な宿主の代表的な例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅのような細菌細胞；および属Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ内の他の種を含むが、（真核生物起源の）他のものを用いることもできる。宿主細胞のさらなる代表的例は（前記定義の）ポリケチド−産生微生物である。適当な宿主の選択は、本明細書で供する教示からして当業者の範囲内にあると思われる。宿主細胞は、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝子工学的に作成される（導入し、形質転換し、トランスフェクトし、結合し、またはエレクトロポレーションに付される）。遺伝子工学作成宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択しするのに適するように修飾された、または生合成基質の源としての通常の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等のような培養条件は発現につき選択された宿主細胞で従前に使用されたものであり、当業者に明らかであろう。ｖ．新規ポリケチドおよび新規ポリケチドを作成する方法本発明は、新規ポリケチド、その中間体化合物、および新規ポリケチドの生産方法も提供する。該方法はＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａからのポリケチド生合成遺伝子（すなわち、ｅｒｙＡ遺伝子）ならびに他の公知ポリケチド−産生微生物および／または推定ポリケチド−産生微生物（すなわち、既知のＰＫＳ配列にハイブリダイズするが、そのポリケチド生産は知られていないヌクレオチド配列を有するもの）からのものを利用する。ｅｒｙＡおよびそれからのコードされたＤＥＢＳの組織化（図１および図２参照）は１９９１年１月１７日に出願された同時係属米国出願第０７／６５２．７３４号に記載されており、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす。図２が示すごとく、ＤＥＢＳはモジュール中に組織化され、各モジュールは、延長ユニット、メチルマロニルＣｏＡがまず開始剤ユニット、プロピオニルＣｏＡに添加され、次いで、順次成長するアシル鎖に添加されるそのモジュール内居住ＫＳ、ＡＴおよびＡＣＰドメインの作用によって１つの縮合工程を担っている。伸長工程の正確な順序は６つのモジュールの順序によって指令され：モジュール１は第１の縮合を決定し；モジュール２は第２の縮合を決定し；モジュール３は第３の縮合を決定し；第６の縮合工程が起こるまで後同様である。加えて、各縮合において成長するポリケチド鎖に取り込まれる伸長ユニットの選択は、全体的にまたは部分的には、各モジュール内のＡＴドメインによって決定される。ＤＥＢＳの場合、取り込まれた伸長ユニットは常にメチルマロネートである。したがって、６−デオキシエリスロノリドＢが順次の縮合を通じて成長する時は、２つの炭素が出来たばかりの鎖に付加され、環中のＣ−１２に対応する炭素で出発する、各他の炭素は側鎖としてメチル基を担う。図２からも分かるように、各縮合後の成長する炭素鎖のプロセッシングは、各モジュール内の情報によって決定される。したがって、縮合事象によって生じた β−ケト基のβ−ケト還元は、モジュール３を除く各モジュールにおける活性ＫＲドメインの存在によって決定して、第３のものを除く各縮合工程後に起こり、他方、脱水およびエノール還元は、モジュール４におけるＤＨおよびＥＲドメインの存在によって決定した、第４の縮合工程の後に起こる。一旦ポリケチド鎖が十分に合成されると、それは、モジュール６の端部に存在するＴＥドメインの作用によりＰＫＳから放出され、環化して多環ラクトン６−デオキシエリスロノリドＢを形成し、引き続いてこれに、その遺伝子がＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体のエリスロマイシンクラスターに存在する一連の他の酵素が作用する（図１参照）。図１に示すごとく、エリスロマイシンは、ポリケチド部位の合成の各工程における伸長ユニットとしてメチルマロネートの取り込みにより、２、４、６、８、１０および１２位にメチル側鎖を担う。本発明においては、所望の構造の新規ポリケチド分子は、ポリケチド−産生微生物のゲノム中のＰＫＳ−コーディング配列へ特異的遺伝的改変を導入することによって生成される。１以上の遺伝子またはその断片の改変は、（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓに見られるように）専ら種内にある遺伝子の操作により生じることができ（種内改変）、単一ＰＫＳクラスター内のみならず単一株内にある異なるＰＫＳクラスター間の遺伝子の操作を含む。専ら単一ＰＫＳ内の遺伝子（すなわち、ｅｒｙＡ）の操作を示す種内改変のいくつかの例は前記引用の米国特許第０７／６２４，７３４号に記載されている。あるいは、遺伝子またはその断片は、異なるポリケチド−産生微生物のＰＫＳからの１以上の関連ドメインをコードする異種遺伝子または遺伝子断片と交換することもできる（種間改変）。異種遺伝子の交換から生じた新規ポリケチドのいくつかの例をここに提供する。遺伝子操作が種内または種間で行われようがいずれであっても、ＰＫＳ配列に対する３つのタイプの改変を行うことができる：（ｉ）モジュールに影響するが、鎖成長の阻止を引き起こさないもの（タイプＩ改変）；（ｉｉ）モジュール中の単一機能に影響し、それにより鎖成長の阻止を引き起こすもの（タイプＩＩの改変）：および（ｉｉｉ）全モジユールに影響するもの（タイプＩＩＩの改変）。１つの実施態様において、タイプＩの改変は、天然ポリケチドにおける特定位置で見出される官能基および／または酸化の程度を特定するドメインの不活化によって生じる。このようなドメインは、典型的には、β−ケトレダクターゼ、デヒドラターゼおよびエノールレダクターゼを含む。例えば、モジュール５のβ− ケトレダクターゼに対応する対立遺伝子は、β−ケトレダクターゼをコードするＤＮＡの実質的部分を欠失し（それにより不活性ドメインを生じさせる）ことによって変異させることができ、これを用いて天然株における野生型対立遺伝子を置き換えることができる。このような移行の結果、新規ポリケチドの５−オキソ−５，６ −ジデオキシ−３−α−ムカロシルエリスロノリドＢが生産される。別の実施態様において、タイプＩの改変は、特定のＰＫＳ中の少なくとも１つのドメインを、同一または第２のＰＫＳからの少なくとも１つのドメインで置き換えることによって生じる。このような関連ドメインは、（例えば、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓおよびＳ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓのＡＴドメインのような）異なるポリケチド− 産生微生物間に、または（例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓにおけるＬｉｇＡＴ２およびｒａｐＡＴ１のような）単一種内に存在し得る。ポリケチドシンターゼ、それらのドメインおよびドメインの機能的類似性を同定する方法は当業者によく知られている。例えば、ポリケチドまたは推定ポリケチド−産生微生物の染色体のＰＫＳ領域は、低または高ストリンジェンシーの条件下で核酸プローブにハイブリダイズさせることによって同定することができる。高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、一般に、約６５℃のインキュベーション温度にて０．１５ｍＭ塩化ナトリウムおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム（０．１×ＳＳＣ）よりなる緩衝液中で行われる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、前掲、参照）。より距離が離れた関連ＰＫＳ遺伝子を検出するには、ハイブリダイゼーションは、低温インキュベーションおよび／または増大した量の塩化ナトリウムおよびクエン酸三ナトリウムの存在を含む低ストリンジェンシー条件下で行われる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前掲、参照）。一旦同定されると、染色体領域を単離し、適当なベクターにクローン化し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＣｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）のような通常の方法または市販の配列決定キットを用い、配列決定することができる。染色体ＤＮＡを単離しクローン化する方法もまた当該分野でよく知られている（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）。次いで、ＤＮＡ配列およびポリケチド生合成に関与する１以上のポリペプチドのそれに対する未知のアミノ酸配列の比較から推定することができる。少なくとも約２０％、より好ましくは約２５％同一性を示し、かつ保存された活性部位残基またはモチーフを有する２つのアミノ酸配列は、機能的に類似のまたは同等のＰＫＳドメインを特定すると考えられる。このようなドメインを同定した後、モジュールの数および組成ならびに特定のＯＲＦ内のモジュールの配置を決定することができる。新しく定義されたＰＫＳが既知構造のポリペプチドを生成する場合、β−カルボニルプロセッシングおよび側鎖部位のタイプならびにポリペプチド骨格上でのそれらの位置決定をモジュール内の特定ドメインに関連付けることができる。モジュールはＯＲＦ内で線形的に確立されているので、この関連付けは、ＰＫＳにおけるモジュール活性の順序（すなわち、どのモジュールが縮合工程を触媒するか）を決定することを可能とする。例えば、β−カルボニルプロセッシングおよびポリペプチドにおける側鎖部位のタイプは、ＯＲＦ内のドメインのパターンに関連付けることができる化学基のパターンを生じる。所与の側鎖部位の特異的タイプに基づき、次いで、モジュールのＡＴドメインによって利用される特定の基質を予測することができる。ポリペプチド構造が未知である場合、理論的には、比較配列分析を単独で用いて、ＡＴドメインの基質特異性を予測することができる。これを行うには、少なくとも２つ、好ましくは３以上の、既知または特定基質を特定することが予測される配列を比較して、ＡＴのそのファミリーにユニークな１以上の保存されたまたはコンセンサスモチーフを決定することができる。このようなモチーフを有する未知ＡＴを、次いで、特定ファミリーに帰属させることができる。代わりに、一次アミノ酸配列類似性または系統発生的関係に基づいてＡＴドメインをグループ分けするコンピュータープログラムを用い、比較分析を行うことができる。例えば、ラパマシインについてのＰＫＳ中の対応するＡＴドメインとのＤＥＢＳ中のＡＴドメインのアミノ酸配列の比較分析を行って、特定ＡＴドメインによって使用された伸長ユニット（マロネートまたはメチルマロネート）がこれらのドメイン間の配列同一性の程度と相関するか否かを決定する。ラパマシインは１４の縮合事象を介して組み立てられた大きなポリペプチドであり；ラパマシインＰＫＳは、その配列が既知ヌクレオチド配列から推定された１４のＡＴドメインを保有する（Ａｐａｒｉｃｉｏら、Ｇｅｎｅ１６９：９−１６（１９９６年））。ラパマシインＰＫＳの１４のＡＴドメインの、相互との、およびＤＥＢＳからの６つのＡＴドメインとのアミノ酸配列比較は、ＡＴドメインが、モジュール１、３、４、６、７、１０および１３が６つのエリスロマイシンＡＴドメインとでクラスターを形成し、モジュール２、５、８、９、１１、１２および１４におけるラパマシインＡＴドメインが別のクラスターを形成した２つの区別される群に入ることを示した（Ｈａｙｄｏｃｋら、ＦＥＢｓＬｅｔｔＳ．３７４：２４６−２４８（１９９５年））。ラパマシインのポリペプチド構造の調査は、メチル側鎖が縮合工程１、３、４、６、７、１０および１３に対応するラクトン環上の位置にあることを示し、これは、メチルマロネートがアシル鎖のこれらのセクションの合成の間に伸長ユニットとして使用されたことを示唆する；縮合工程２、５、８、９、１１、１２および１４に対応するラクトン環の位置におけるプロトンは、マロネートがこれらのセクションの合成間に伸長ユニットして利用されたことを示唆した。また、ここに記載する２つのさらなるＡＴドメイン、１ｉｇＡＴ２およびｖｅｎＡＴは、ラパマシインＰＫＳからの推定マロネートＡＴドメインとクラスターを形成することが判明した（図３）。ｒａｐモジュール２、５、８、９、１１、１２または１４からのＡＴドメイン、ならびにｌｉｇＡＴ２およびｖｅｎＡＴが伸長ユニットとしてマロネートを特定することを予測した後、このようなドメインをコードするＤＮＡを単離し、クローン化し、これを用いて、ＤＥＢＳのようなＰＫＳ中の１以上のＡＴドメインをコードするＤＮＡを置き換えて、新規ポリペプチドを生じさせることができる。アミノ酸配列の「類似性」を決定するための技術は当該分野でよく知られている。一般に、２以上のポリペプチドを相互に整列させたとき、配列類似性とは、同一であるか、あるいは電荷または疎水性のような類似の化学的および／または物理的特性を保有する各ポリペプチド配列内の対応する位置におけるアミノ酸をいう。次いで、比較したポリペプチド配列間で、いわゆる「パーセント類似性」を決定することができる。一般に、「同一性」なる用語は、各々、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の所与の位置における正確なヌクレオチド− 対−ヌクレオチドおよびアミノ酸−対−アミノ酸対応をいう。２つのアミノ酸配列（またその事項では、２以上のポリヌクレオチド配列）は、これらの「パーセント同一性」を決定することによって比較することができる。（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能な）ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８で利用できるプログラム、例えばＧＡＰプログラムは、２つのポリヌクレオチドの間の同一性および２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性を共に計算することができる。配列間の類似性を計算し表示するための他のプログラムは当該分野で知られている。例えば、Ｇｒｏｔｒｅｅプログラム（ＧＣＧ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）は、最も深く関連する配列がクラスターを形成し、最短の線によって結ばれた系統発生樹を生じる。この樹は、一群の整列された配列内の対の関係を計算するプログラムＤｉｓｔａｎｃｅｓ（ＧＣＧ、Ｍａｄｉｓｏｎ．ＷＩ）によって生成されたマトリックスに由来する。好ましい実施態様において、所望の構造の新規ポリペプチド分子は、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体のＤＮＡの少なくとも１つのＡＴドメインコーディング断片を、もう１つのＰＫＳクラスターからのＤＮＡの少なくとも１つの異種ＡＴドメインコーディング断片で置き換えて、６−デオキシエリスロノリドＢ、エリスロノリドＢ、３−α−Ｌ−ミカロシルエリスロノリドＢ、またはエリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤの誘導体である新規ポリケチド化合物を得ることによって生じる。このような誘導体は、多環ラクトン環の１以上の位置におけるメチル（−Ｍｅ）側鎖が、独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）エチル基（−Ｅｔ）；（ｃ）ヒドロキシル基（ −ＯＨ）および（ｄ）アリル基（−Ａｌ）よりなる群から選択される置換基によって置き換えられた化合物である。特に好ましい実施態様において、新規化合物１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、１０−デスメチルエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、または６−デスメチル−６−エチルエリスロマイシンＡを生じることを可能とするエリスロマイシン−産生微生物の遺伝的修飾方法が提供される。化合物１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、１０−デスメチルエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−１２デオキシエリスロマイシンＡ、および６−デスメチル−６−エチルエリスロマイシンＡは構造式：によって表される。このようなポリケチドを生産する一般的反応図式は図４ａおよび図４ｂに概説されている。好ましい実施態様において、関連ＡＴドメインをコードする異種ＤＮＡ断片を、遺伝子置換という２−工程によって、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体に導入する。遺伝子置換の第１の工程において、置換されるべき居住ポリヌクレオチド配列と（各側で）すぐに境界を接するものと同一である配列を有するＤＮＡの２つのセグメント間に異種遺伝子またはその断片を入れる多工程クローニングアプローチにより組込ベクターを構築する。このようなベクターの構築は、当業者に公知のいずれかの手段によって達成することができる。例えば、置き換えるべき遺伝子を挟んでそれに近接するヌクレオチド配列は、鋳型として染色体ＤＮＡ、および注目するフランキング配列のすぐに上流および下流の染色体配列にハイブリダイズするプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって生じさせることができる。フランキング配列の長さは本発明の実施に臨界的ではないが、好ましくは、約２０−５０００塩基対（ｂｐ）、より好ましくは約１００−５０００ｂｐ、なおさらに好ましくは約５００−５０００ｂｐである。フランキング配列の最も好ましい長さは約７５０−１５００ｂｐである。そのような増幅で使用されるプライマーは、適当な分取用ベクターへの増幅配列のクローニングを容易とし、注目する異種配列のフランキング配列間への挿入を容易としおよび／または配列の全群の（５’−フランキング領域／注目する異種ポリヌクレオチド配列／フランキング領域−３’）の組込用の適当なベクターへのサブクローニングを容易とする便利な制限部位を含ませることもできる。所望の異種ポリヌクレオチド配列は同様にして生成させることができる。組込ベクターは、中問宿主では機能するが、産生宿主では機能しないかほとんど機能しない少なくとも１つの複製起点を含有するＤＮＡの断片を含むようにも構築される。該ベクターは、さらに、そのうち少なくとも１つが中間宿主で機能し、少なくとも１つが産生宿主で機能する、抗生物質に対する耐性を付与する１以上のＤＮＡ断片を含む。好ましい組込ベクターは、プラスミドｐＣＳ５で見出されるごとく、ＣｏｌＥ１およびｐＩＪ１０１複製起点を含む（Ｊ．Ｖａｒａら、Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．１７１：５８７２ −５８８１（１９８９年））。特に好ましいベクターは、チオストレプトンおよびアンピシリンに耐性を付与するＤＮＡ断片を担う。しかしながら、当業者ならば、特定の抗生物質耐性および前記で確認した複製起点は、それらが所望の組換えプラスミドおよび宿主細胞の生成および選択を可能とする限りにおいて必要なことを理解するであろう。他のマーカーおよび複製起点を本発明の実施で用いることもできる。ＰＫＳの居住ドメインが大きな多機能ポリペプチドの機能的構成要素である場合、異種ＡＴドメインをコードする異種ＤＮＡ断片が正しい向きで、およびコーディング配列の開始からの翻訳に際して酵素的に機能する蛋白質が産生されるようにリーディグフレームがそのフランキングＤＮＡに対して位置するように組込みプラスミドの構築において注意を払わなければならない。正しい位置は宿主ＰＫＳ遺伝子および遺伝子置換で用いる異種遺伝子のヌクレオチド配列の知識から直ちに明らかとなる。第２の工程において、関連遺伝子またはその断片を担う各組込ベクターは、独立して、宿主株に導入し、組込プラスミドにおける各ゲノム断片および宿主株染色体におけるその対応する異種断片の間の組換えが起こることが可能となる。この手順の結果、その異種カウンターパートについての染色体における居住ＡＴ− コーディングＤＮＡの交換が生じる。異種組換えによる遺伝子置換のための一般的図式は図５で概説されている。ＤＮＡをポリケチド−産生微生物へ導入し、相同組換えを容易とする手順は本明細書に記載する。しかしながら、当業者にならば、エレクトロポレーション、形質導入、または接合のような、ＤＮＡをポリケチド−産生微生物に導入する別の手順はよく知られ、それを用いて本発明を実施できることを理解するであろう。ポリケチド−産生微生物を培養する手順、ならびに修飾された株から産生された新規ポリケチドを回収し、このような化合物を精製し、（質量分析またはＮＭＲによるような）それらの化合物の同一性を確認する方法は当業者によく知られている。本発明を好ましい実施態様を後の実施例で記載するが、それらは本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。以下の記載はエリスロマイシンの新規誘導体の生成に関与する原理および方法を説明するために供する。以下の実施例はＳａｃ．ｓｒｙｔｈｒａｅａＡＴ１、ＡＴ２およびＡＴ４−コーディングＤＮＡ断片を、マロネートの取込を特定するＡＴドメイン（マロネート−ＡＴ）またはエチルマロネートの取込を特定するＡＴドメイン（エチルマロネート−ＡＴ）いずれかをコードする異種ＤＮＡ断片で置き換えることを記載するが、当業者ならば、マロネート、エチルマロネート、アリルマロネートおよび／またはヒドロキシマロネート（タルトロネート）−ＡＴドメインをコードする異種ＤＮＡの１以上の断片を用いて、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるエリスロマイシンＰＫＳの他のＡＴ−コーディングＤＮＡ断片に置き換え、その結果、他の新規エリスロマイシン誘導体を得ることを理解するであろう。例えば、エリスロマイシンＰＫＳ（ｅｒｙＰＫＳ）における居住ＡＴ−コーディングＤＮＡ断片が独立して伸長ユニットとしてのマロネートおよび／またはエチルマロネートを特定する異種ＤＮＡ断片で置き換えられた場合の新規エリスロマイシンを表１に示す。特に、当業者ならば、ｅｒｙＰＫＳにおける単一の居住ＡＴ−コーディングＤＮＡ断片の置換、２つの居住ＡＴ−コーディングＤＮＡ断片の２工程での異種ＤＮＡ断片（マロネート、エチルマロネート、アリルマロネート、および／またはヒドロキシマロネート−ＡＴドメインを特定するもの）での置換も可能であって、その結果、新規ジ置換エリスロマイシンが形成されることを理解するであろう。同様に、トリ置換エリスロマイシン、テトラ置換エリスロマイシン、ペンタ置換エリスロマイシンおよびヘキサ置換エリスロマイシンも、各々、ｅｒｙＰＫＳにおける３、４、５および６つの居住ＡＴ−コーディングＤＮＡ断片を、本明細書に記載された異種ＡＴ−コーディングＤＮＡ断片で置き換えることによってなすことができる。したがって、ｅｒｙＰＫＳにおけるＡＴ−コーディングＤＮＡ断片の異種ＡＴ−コーディングＤＮＡ断片での全ての置換（プロトン、エチル、アリル、およびヒドロキシ置換エリスロマイシン誘導体の全ての変種を生じるもの）は本発明の範囲内のものである。このような置換によって生じた化合物の例は以下の表Ｉに示されるものを含むが、それに限定されるものではない。 Table 1 側鎖位置における変化からの構造以下の実施例において、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅＡＴＣＣ１５４３９、およびＳ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１からのＡＴ−コーディングＤＮＡ断片を用いて、ｅｒｙＰＫＳにおける居住ＡＴ−コーディングＤＮＡ断片を置き換えて、デスメチル、デスメチルエチルおよびデスメチルヒドロキシエリスロマイシンを得た。多くのマロネート、エチルマロネートおよびヒドロキシマロネートＡＴ−コーディングＤＮＡ断片を、ここに記載した異種マロネート、エチルマロネートおよびコーディングマロネート−ＡＴＤＮＡ断片の代わりに、またはそれに加えて用いて、同一デスメチル、デスメチルエチル、およびデスメチルヒドロキシエリスロマイシン化合物を得ることができることが理解される。以下の実施例で特に記載したものの代わりに、またはそれに加えて使用できるマロネート−ＡＴドメインをコードするＤＮＡ断片の例は限定されるものではないが、Ｓ．ｈｙｇｒｐｓｃｏｐｉｃｕｓからのラパマイシンＰＫＳのモジュール２、５、８、９、１１または１２からのＡＴドメイン、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅによるメチルマイシンまたはピクロマイシンの合成を担うＰＫＳのモジュール２からのＡＴドメイン、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅによるチロシンの合成を担うＰＫＳのモジュール３および７からのＡＴドメイン、またはＳ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓによるスピラマイシンの合成を担うＰＫＳのモジュール１、２、３および７からのＡＴドメインをコードするＤＮＡ断片を含む。以下の実施例に特に記載されたものに代えて、またはそれに加えて使用できるエチルマロネート−ＡＴドメインをコードするＤＮＡ断片の例は限定されるものではないが、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓからのスピラマイシンＰＫＳ遺伝子のモジュール５からのＡＴドメイン、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅからのチロシンＰＫＳ遺伝子のモジュール５からのＡＴドメイン、およびＳ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのマリドマイシンＰＫＳのモジュール５からのＡＴドメインをコードするＤＮＡ断片を含む。以下の実施例に特に記載したものに代えてまたはそれに加えて使用することができるヒドロキシマロネート−ＡＴドメインをコードするＤＮＡ断片の例は、限定されるものではないか、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓからのスピラマイシンＰＫＳ遺伝子のモジュール６からのＡＴドメイン、Ｓ．ｈｙｇｒｐｓｃｏｐｉｃｕｓからのマリドマイシンＰＫＳ遺伝子のモジュール６からのＡＴドメイン、およびＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓからのロイコマイシンＰＫＳ遺伝子のモジュール６からのＡＴドメインをコードするＤＮＡ断片を含む。ｅｒｙＰＫＳ遺伝子におけるメチルマロネート−ＡＴをコードする居住ＤＮＡ断片のいずれかを置き換えて、その結果、エリスロマイシンの新規誘導体を得るための、マロネート、エチルマロネート、およびヒドロキシマロネート−ＡＴをコードするＤＮＡ断片のいずれかのおよび全ての使用は、したがって、本発明の範囲内であると考えられる。さらに、ｅｒｙＰＫＳ中の開始剤、モジュール１またはモジュール２のＡＴドメインを置き換えて、各々、エリスロマイシンのポリケチド骨格の１４、１２および１０位にヒドロキシル基を導入するのに、本明細書ではＮｉｄＡＴ６ドメインを例示したが、ＮｉｄＡＴ６ドメインを用いて、ｅｒｙＰＫＳのモジュール３、４、５または６のＡＴドメインを置き換え、その結果、各々、エリスロマイシン誘導体の８、６、４または２位にヒドロキシル基を含むエリスロマイシン誘導体を生じさせて、対応する位置に通常見られるメチル基を置き換えることもできることが理解される。従って、化合物８−デスメチル−８−ヒドロキシエリスロマイシンＡ、６−デスメチル−６−エピエリスロマイシンＡ、４−デスメチル− ４−ヒドロキシエリスロマイシンＡおよび２−デスメチル−２−ヒドロキシエリスロマイシンＡまたはそれらの６−デオキシ誘導体を含めた、ＮｉｄＡＴ６でのｅｒｙＡＴドメインの置換から生じた全ての化合物およびそれらを生成する対応する株は本発明の範囲下に含まれる。さらに、ｅｒｙＰＫＳにおける単一のＡＴドメインを置き換えて、単一のさらなるヒドロキシ基を含有する誘導体化エリスロマイシンＡモジュールを得るのに本明細書ではＮｉｄＡＴ６ドメインを例示したが、当業者ならば、ＮｉｄＡＴ６ドメインでｅｒｙＰＫＳの２以上のＡＴドメインを独立して置き換えて、２以上のさらなるヒドロキシ基を持つ誘導体化エリスロマイシンを得ることができるのを理解するであろう。２以上のさらなるヒドロキシ基を含有するエリスロマイシン分子の例は、限定されるものではないが、２，１２−ジデスメチル−２，１２ −ジヒドロキシエリスロマイシン、４，１０−ジデスメチル−４，１０−ジヒドロキシエリスロマイシン等を含む。従って、ｅｒｙＰＫＳの２以上のＡＴドメインをＮｉｄＡＴ６で置き換えて生じる全ての化合物およびそれらを製造する対応する株は本発明の範囲下に含まれる。また、当業者ならば、ｅｒｙＰＫＳにおける１を超える位置でのＮｉｄＡＴ６ドメインの置換の結果、ＮｉｄＡＴ６−コーディング配列の間で起こり得る相同組換えのためハイブリッドＰＫＳＤＮＡの遺伝子不安定性が生じ得ることを理解するであろう。この組換え事象を回避するために、当業者ならば、ＮｉｄＡＴ６ＤＮＡ配列の変化を導入して、ＤＮＡ配列が相互に、かつ天然ＮｉｄＡＴ６ＤＮＡとは異なるが、エリスロマイシン中のヒドロキシル基でメチル基を置き換えるのに使用できる機能的ドメインを依然としてコードする一連の修飾されたＮｉｄＡＴ６ＤＮＡドメインを作成する必要性を認識するであろう。ＮｉｄＡＴ６とのまたは相互との組合せを使用して２以上のＡＴ置換を生じさせる場合、ＮｉｄＡＴ６のこのような誘導体は、ハイブリッドＰＫＳを、相同組換えを介する突然変異に対して安定とするであろう。このような修飾を生じさせる方法は当業者によく知られている。したがって、ヒドロキシル基をエリスロマイシンに導入するのに使用できる機能的ドメインをコードするＮｉｄＡＴ６の誘導体の全ては本発明の範囲に含まれる。また、化学的多様性をエリスロマイシン骨格に導入するのに、ＮｉｄＡＴ６ドメインを他の異種マロニルＡＴまたはエチルＡＴドメインと組み合わせて使用できることも理解される。例えば、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓからのマロニルＡＴドメインによって置き換えられたｅｒｙＡｔ１ドメインをそれ自体が有するＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ１におけるｅｒｙＡＴ２ドメインを置き換えて、その結果、化合物１０，１２−ジデスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンを得るのにＮｉｄＡＴ６ドメインを用いることができる。同様に、ＮｉｄＰＫＳからのエチルＡＴドメインによって置き換えられたｅｒｙＡＴ４ドメインをそれ自体が有するＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａｎＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ４／ＮｉｄＡＴ５におけるｅｒｙＡＴ２ドメインに置き換えて、その結果、化合物６，１０−ジデスメチル−６−エチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡを得るのにＮｉｄＡＴ６ドメインを使用できる。従って、ｅｒｙＰＫＳからの２以上のＡＴドメインを、マロニル、エチルまたはヒドロキシルマロニル開始剤ドメインをコードするＡＴドメインのいずれかの組合せで置き換えて生じた全ての化合物およびそれらを生成するそれらの対応する株は本発明の範囲下に含まれる。さらに、当業者ならば、ｓｒｍＧ、ｔｙｌＧ、ｒｉｆＰＫＳＤＮＡ、ｒａｐＰＫＳＤＮＡ、または他のモジュールＰＫＳ遺伝子における遺伝子置換でＮｉｄＡＴ６ドメインを使用して、スピラマイシン、チロシン、リファマイシン、ラパマイシンまたは他の還元されたポリケチドにヒドロキシル基を導入できるのを理解するであろう。従って、ＮｉｄＡＴ６、または例えばカルボマイシンＰＫＳ、ミデカマイシンＰＫＳまたはマリドマイシンＰＫＳの第６モジュールからのＡＴドメインのような、ヒドロキシマロニル開始剤ドメインを特定するいずれかの他のＡＴドメインを使用して、エリスロマイシン、スピラマイシン、リファマイシン、ラパマイシンまたはその組立てにモジュールＰＫＳを使用するいずれかの他のポリケチドのポリケチド骨格の１以上の位置にヒドロキシル基を導入するのは本発明の範囲下に含まれる。加えて、ＬｉｇＡＴ２、またはマロニル開始剤ドメインを特定するいずれかの他のセグメントと組み合わせて、またはＮｉｄＡＴ５、またはエチルマロニル開始剤ドメインを特定するいずれかの他のＡＴセグメントと組み合わせて、ＮｉｄＡＴ６、またはヒドロキシルマロニル開始剤ドメインを特定するいずれかの他のＡＴセグメントを使用して、ｅｒｙＡ、ｓｒｍＧ、ｔｙｌＧまたはいずれかの他のモジュールＰＫＳにおいて２以上の置換を作成し、エリスロマイシン、スピラマイシン、チロシン、またはそれらの合成にモジュールＰＫＳを使用する他のポリケチドに化学的多様性を導入するのは本発明の範囲下に含まれる。ｅｒｙＰＫＳのＡＴドメインを置き換えて、化合物１３−デスメチル−１３− （３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡの生産をコードするハイブリッドＰＫＳを得るのに、本明細書ではラプリカーゼおよび隣接ＥＲＳドメインをコードするＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３からのｒａｐＡ遺伝子の３．０ｋｂセグメントを例示したが、ｒａｐＡ遺伝子のより長いセグメントを用いるいくつかの他の遺伝子置換を、類似の遺伝子置換実験における３．０ｋｂセグメントの代わりに使用して、同一生成物を生じる株を創製することができるのが理解される。より長いセグメントの例は、限定されるものではないが、ラプリカーゼ−ＥＲＳセグメントおよびｅｒｙＰＫＳのＡＴ−ＡＣＰセグメントを置き換えるのに使用できるｒａｐＡの隣接ＡＣＰドメインを含有するもの、およびラプリカーゼ−ＥＲＳセグメントおよびｅｒｙＰＫＳのＡＴ−ＡＣＰ−ＫＳ１セグメントを置き換えるためのｒａｐＡの隣接ＡＣＰ−ＫＳ１−コーディングセグメントを含有するものを含む。したがって、ｅｒｙＡＩ遺伝子での遺伝子置換で使用して、その結果、１３ −デスエチル−１３−（３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡが合成できるｒａｐＡの全てのセグメントは、１３−デスエチル−１３−（３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡを生じる株と共に、本発明の範囲下に含まれる。加えて、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥｒｙＴ／ラプリカーゼ３．０における１３−３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルエリスロマイシンＡの生産は、化合物３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸の培地への供給に依存していたが、当業者ならば、３，４−ジヒドロキシシタロヘキシルカルボン酸の代わりに３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸の種々の塩およびエステルを使用して１３−デスエチル−１３−（３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡを得ることができるのを理解するであろう。さらに、３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸の誘導体またはその対応する塩もしくはエステルを、３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸またはその塩もしくはエステルの代わりにＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥｒｙＴ／ラプリカーゼ３．０に供給し、その結果、１３−デスエチル−１３−（３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡ誘導体が生成される。ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥｒｙＴ／ラプリカーゼ３．０に供給することができる３，４−ジヒドロキシシタロヘキシルカルボン酸の誘導体またはその塩もしくはエステルの例は、限定されるものではないが、各々、１３−デスエチル−１３−（３’−ヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡ、１３−デスエチル−１３−（４’−ヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡ、１３−デスエチル−１３−（３’，４’，５’−トリヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡ、１３−デスエチル−（３’−メトキシ−４’−ヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡ等を得るための３−ヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸、４−ヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸、シキミ酸、３−メトキシ−４−ヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸等を含む。従って、３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸の誘導体をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥｒｙＴ／ラプリカーゼ３．０に供給することによって生成できる１３−デスエチル−１３−（３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡの全ての誘導体は本発明の範囲内に含まれる。さらに、当業者ならば、ｅｒｙＰＫＳにおける居住ＡＴ−コーディングＤＮＡ断片の置換につき本明細書に記載した方法に従い、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、またはＳ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓにおけるマロネート−ＡＴをコードするＤＮＡ断片、およびＳ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓにおけるエチルマロネートまたはヒドロキシマロネート−ＡＴを、基質としてメチルマロニルＣｏＡを利用するｅｒｙＰＫＳからのそれらのＡＴ−コーディングＤＮＡ断片で置き換えることができるのを理解するであろう。このｅｒｙＰＫＳに関しては、例えば、１３−メチルラパマイシン、１５−メチルラパマイシン、３３−メチルラパマイシン、１３，１５−ジメチルラパマイシン、１３，１５，３３−トリメチルラパマイシンおよび１０−メチルピクロマイシンの生産に導く全ての組合せが考えられる。本発明の方法は全てのエリスロマイシン−産生微生物に広く適用でき、その非限定的リストは、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｏｐｌａｎｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ種、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ種、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓを含む。これらのうち、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａが最も好ましい。通常はエリスロマイシンを産生しないが、クローニングによってエリスロマイシン生合成遺伝子を導入できる他の宿主も使用することができる。このような株は、限定されるものではないが、例えば、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓを含む。他のエリスロマイシン−産生株の各々において、エリスロマイシンＰＫＳにおける居住ＡＴドメインの置換は、以下の実施例で説明するごとく異種ＡＴでの居住ＡＴのスイッチングを行うための置換すべきＡＴドメインの両側のクローン化ｅｒｙＰＫＳ配列を用いる二重相同組換えによって行われる。以下の実施例で説明される方法の多くの他の変法は当業者に起こるであろう。例えば、ＬｉｇＡＴ２、ｖｅｎＡＴ、ｒａｐＡＴ１４、ＮｉｄＡＴ５またはＮｉｄＡＴ６−コーディングＤＮＡ断片のクローニングおよび組込ベクターの構築に、本発明では、プラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＧＥＭ３ＺｆおよびｐＣＳ５を使用したが、限定されるものではないが、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９、ｐＧＥＭ７Ｚｆ等を含めた他のプラスミド、ファージまたはファゲミドをそれらの代わりに使用して同一の構築をなすのを可能とすることができる。ｅｒｙＰＫＳの対応する領域で相同組換えが起こるのを可能とする組込ベクターへの異種ＡＴ−コーディングＤＮＡ断片のクローニングのために、多くの別法ストラテジーによることができる。別法ストラテジーの例は、ＡＴドメインまたは隣接フランキング配列のクロ−ニングに異なる制限部位を用い、あるいはメチルマロニルＣｏＡよりもむしろ基質としてマロニルＣｏＡを認識するドメインをそれが発現するように居住ＡＴ−コーディングＤＮＡ断片の配列を変化させて、ＡＴドメインまたはフランキング配列いずれかに対応するＤＮＡのより長いまたは短い断片を使用することを含む。全てのこのような変形は本発明の範囲内のものである。同様に、接合、導入またはエレクトロポレーションのように、遺伝子交換を行って、その結果、新規エリスロマイシンを得る目的で、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａまたは他のエリスロマイシン− 産生宿主にＤＮＡを導入する別法ストラテジーを使用することは本発明の範囲内に含まれる。また、当業者ならば、エリスロマイシンＢ、ＣおよびＤはエリスロマイシンの天然に生じる形態であり、従って、本明細書に開示する修飾によってＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおいて新規誘導体として生産されるであろうことも理解するであろう。これらの形態の生産は、さらに、ｅｒｙＫを不活化して（Ｓｔａｓｓｉ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７５：１８２−１８９（１９９３年））エリスロマイシンＢ誘導体、ｅｒｙＧ（Ｓ．Ｆ．Ｈａｙｄｏｃｋら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１２０−１２８（１９９１年））を得て、エリスロマイシンＣ誘導体およびｅｒｙＫおよびｅｒｙＧを得て、エリスロマイシン誘導体Ｄを得ることによって増強させることができる。さらに、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおいて、新規エリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤの６−デオキシ形態は、Ｃ−６位をヒドロキシル化を担うヒドロキシラーゼをコードする（前記で特定したものに加えて）ｅｒｙＦ（Ｊ．Ｍ．Ｗｅｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１１４−１１７（１９９１年））の不活化によって生成させることができる。加えて、新規エリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤの６−デオキシ形態からそれらの対応するエリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤ誘導体への変換は、さらなるコピーをクローニングすることによって、あるいは産生宿主においてｅｒｙＦ遺伝子を過剰産生させる他の手段を使用することによって達成することができる。同様に、エリスロマイシンＢ、ＣおよびＤの新規形態からエリスロマイシンＡの新規形態への変換は、産生宿主においてｅｒｙＫおよび／またはｅｒｙＧを発現または過剰発現させることによって達成することができる。エリスロマイシンＢ、ＣおよびＤおよび６−デオキシエリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤを生成させる方法は当業者によく知られている。当業者ならば、エリスロノリドＢおよび３−α−ミカロシルエリスロノリドＢはエリスロマイシンの生合成における天然に生じる中間体であって、従って、本明細書に開示した修飾によってＳａ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおいて新規中間体として産生されるであろうことも理解するであろう。これらの形態の産生は、さらに、ｅｒｙＢ遺伝子のいずれかを不活化して、エリスロノリドＢまたはｅｒｙＣ遺伝子を得て、３−α−Ｌ−ミカロシルエリスロノリドＢを得ることによってさらに増強することができる（Ｗｅｂｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：２３７２−２３８３（１９９０年）およびＨａｙｄｏｃｋら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１２０−１２８（１９９１年））。さらに、これらの新規中間体の６−デオキシ形態は、前記したごとくｅｒｙＦを不活化することによって生じさせることができる。エリスロノリドＢおよび３−α− ミカロシルエリスロノリドＢ、ならびにそれらの６−デオキシ誘導体を生じさせる方法は当業者によく知られている。細菌株、プラスミドベクターおよび増殖培地本発明の以下の実施例を実施するのに使用したエリスロマイシン−産生微生物はＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０であった（Ｊ．Ｐ．ＤｅＷｉｔｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．１６４：９６９（１９８５年））。Ｅ．ｃｏｌｉ由来プラスミドの増殖用の宿主株はＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤからのＤＨ５αであった。Ｌｉｇ−ＰＫＳクラスターを担持するＳ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ株はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから受託番号ＡＴＣＣ２９２５３下で入手可能である。本明細書で記載するｖｅｎＡＴドメインを担持するＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ株はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから受託番号ＡＴＣＣ１５４３９下で入手できる。ｐＵＣ１８／ｖｅｎＡＴを担持するＥ．ｃｏｌｉは、ブダペスト条約の規定下、１９９６年１２月２３日現在、米国イリノイ州、Ｐｅｏｒｉａ、１８１５Ｎ．ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｔｒｅｅｔのＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）に寄託されており、寄託日から３０年の期間、または最後の分譲の要求後５年間、または米国特許の有効期間のいずれか長い間維持されるであろう。ここに記載する寄託およびいずれかの他の寄託物は便宜のためだけに供し、本明細書で提供する教示の観点から本発明を実施するのには必要ではない。全ての寄託物のＤＮＡ配列はここに出典明示により本明細書の一部とみなす。ｐＵＣ１８／ｖｅｎＡＴを担持するＥ．ｃｏｌｉ細菌はＮＲＲＬ受託番号Ｂ−２１６５２が付与された。プラスミドｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９はＧＩＢＣＯＢＲＬから得ることができる。プラスミドｐＣＳ５、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの組込形質転換用の多機能ベクターはＶａｒａら、Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７１：５８７２−５８８１（１９８９年）に記載されており、そこではｐＷＨＭ３と言われる。コスミドｐＮＪ１はＴｕａｎら、Ｇｅｎｅ，９０：２１−２９（１９９０年）に記載されている。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのプロトプラスト形成用におよび日常的増殖用に、適切な場合にはプラスミド選択のために１０μｇを補足したＳＧＧＰ培地（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ．３９：１３０４（１９８６年））の５０ｍｌ中で培養した。試薬および一般的方法酪酸、アンピシリン、チオストレプトン、制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ、および子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼを含めた、商業的に入手可能な試薬を用いて、本発明の化合物、プラスミドおよび遺伝変異体を作成した。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａからのｅｒｙＡ遺伝子のヌクレオチド配列は受託番号Ｍ６３６７６およびＭ６３６７７下でＧｅｎＢａｎｋデータ・ベースに寄託されており、公に入手可能である。標準的な分子生物学手順（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）を、置換プラスミドの構築および特徴付けで使用した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶解法（Ｈ．Ｃ．ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＪ．Ｄｏｌｙ，１９７９年ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：１５１３）によって、あるいは製造業者の指示に従ってＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて日常的に単離した。制限酵素はＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて０．８−１％アガロースゲルから回収した。プラスミド構築の各工程用の連結産物を用いて、中間宿主Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を形質転換し、これをアンピシリンの存在下で培養して、組換えプラスミドを運ぶ宿主細胞につき選択した。Ｘ−ｇａｌでのインサートＤＮＡについての選択を適当な場合には使用した。典型的には、ＬＢプレートは３０ｍＬのＬＢＮ寒天を含有する（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）。プラスミドＤＮＡは、液体培地中で培養してあって、既知の制限部位に関して特徴付けられている個々の形質転換体から単離した。ＤＮＡ配列決定は、製造業者の指示に従ってサイクル配列決定（ｆｍｏｌＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍ，ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によった。ＳＣＭ培地は、蒸留水１リットル当たり、２０ｇのＳｏｙｔｏｎｅ、１５ｇの可溶性澱粉、１０．５ｇのＭＯＰＳ、１．５ｇの酵母エキスおよび０．１ｇのＣａＣｌ₂よりなる。ＳＧＧＰ培地は水性溶液１リットル当たり４ｇのペプトン、４ｇの酵母エキス、４ｇのカザミノ酸、２ｇのグリシン、０．５ｇのＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂Ｏ、１０ｇのグルコース、２０ｍＬの５００ｍＭＫＨ₂ＳＯ₄よりなる（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８６年、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ．３９：１３０４）。Ｐ_M緩衝液（リットル当たり）は８９０ｍＬの水中に２００ｇスクロース、０．２５ｇＫ₂ＳＯ₄であり、滅菌後に、１００ｍＬの０．２５ＭＴＥＳ、ｐＨ７．２、２ｍＬの微量元素溶液（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９８５年，ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｉａｌ，ＴｈｅＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、０．０８ｍＬの２．５ＭＣａＣｌ₂ 、１０ｍ１の０．５％ＫＨ₂ＰＯ₄、２ｍＬの２．５ＭＭｇＣｌ₂を添加する。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａプロトプラストの組込形質転換、および日常的増殖および胞子形成は、Ｄｏｎａｄｉｏら，１９９１年，Ｓｃｉｅｎｃｅ１１５：９７；ＷｅｂｅｒおよびＬｏｓｉｃｋ、１９８８年、Ｇｅｎｅ６８：１７３；およびＹａｍａｍｏｔｏら，１９８６年、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ．３９：１３０４に記載されている手順に従って行った。ＰＣＲ増幅で使用し、以下の実施例に記載したオリゴプライマーは以下の通りである。質量分析は大気圧化学イオン化源（ＡＰＣＩ）を備えたＦｉｎｎｉｇａｎ−ＭＡＴ７０００マススペクトロメーターで日常的に行った。エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）はＦｉｎｎｉｇａｎ大気圧イオン化（ＡＰＩ）源を備えたＦｉｎｎｉｇａｎ−ＭＡＴ７５２−７０００マススペクトロメーターで行った。ＨＰＬＣ分離は、ＰｒｏｄｉｇｙＯＤＳ（２）カラム（５μｍ、５０×２ｍｍ）および５ｍＭ酢酸アンモニウムおよびメタノールのグラジエント溶出を用い、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ１０５０液体クロマトグラフィーで行った。流量は０．３ｍＬ／分であった。エリスロマイシン誘導体の大規模調製では、発酵醸造物を、典型的には、ＮＨ₄ ＯＨでｐＨ９に調整し、対で、等容量のＣＨ₂Ｃｌ₂で２回抽出する。次いで、プールした抽出物を濃縮して油（発酵醸造物リットル当たりほぼ１ｇ）とする。濃縮した抽出物をメタノール中に希釈し、同一溶媒にてＳｅｐｈａｄＵｐｐｓａｌａ，スェーデン）のカラム上のクロマトグラフィーに付す。画分をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓに対する生物活性につきテストし、活性画分を合わせ、濃縮する。さらなるカラムクロマトグラフィーが試料重量を減少させるのに所望される場合、濃縮した試料をｎ−ヘプタン、クロロホルム、エタノール（１０：１０：１、ｖ／ｖ／ｖ）よりなる −２０のカラム上のクロマトグラフィーに付す。次いで、δ＝５．０（Ｈ−１３）、δ＝４．９（Ｈ−１”）、およびδ＝４．４（Ｈ−１’）（ＥｖｅｒｅｔｔおよびＴｙｌｅｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ．Ｉ，２５８８頁（１９８５））の周辺の特徴的エリスロマイシン共鳴に焦点を当てる¹ ＨＮＭＲによって分析し、純度に従ってプールする。代わりに、カラムクロマトグラフィーを抽出系列で置き換えることもできる。この場合、最初にプールしたＣＨ₂Ｃｌ₂抽出物をほぼ４００ｍＬまで濃縮する。これをｐＨ４．５−６の間に選択したｐＨを持つ等容量の０．０５Ｍリン酸カリウム水溶液で２回抽出する。次いて、水性相をプールし、ｐＨ８−９に調整し、等容量の酢酸エチルで２回抽出する。最後に、酢酸エチル抽出物をプールし、濃縮する。試料重量のさらなる減少が所望される場合、１０−５０倍小さい規模で抽出系列を置き換え、典型的には、約５００ｍｇの部分的に精製された物質を得る。エリスロマイシン誘導体の高分解能分離は、１以上のラウンドの向流クロマトグラフィー（ＨｏｓｔｅｔｔｍａｎｎおよびＭａｒｓｔｏｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．２３６：６３−７６（１９９０年））によって得られる。カラムクロマトグラフィーまたは抽出系列からの部分的純粋試料の重量が５ｇであるが０．５ｇより大きい場合、それを、６．５−８．０の間の選択されたｐＨを持つ、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、０．０２Ｍリン酸カリウム水溶液よりなる溶媒系（３：７：５，ｖ／ｖ／ｖ）の上相７ｍＬ中で消化し、移動相として上相を用いる同一溶媒系にて、慣用的液滴向流クロマトグラフィー（ＤＣＣＣ）装置［１００の垂直カラム、０．４ｃｍ直径×２４ｃｍ長；ＨｏｓｔｅｔｔｍａｎｎおよびＭａｒｓｔｏｎ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．２３６：６３−７６（１９９０））］上のクロマトグラフィーに付す。ほぼ１２０−２００ｍＬ／時間の流量を使用する。前記したごとく、ＮＭＲおよび生物活性によって画分を分析し、純度に従ってプールする。部分的に純粋な試料の重量がほぼ０．５ｇ以下である場合、前記使用の６．５−８．０間の選択ｐＨを持つ、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、０．０２Ｍリン酸カリウム水溶液（３：７：５、ｖ／ｖ／ｖ）よりなる系、またはＥｔＯＡｃに対するヘキサンの比および／またはｐＨを変更した同様の系を用い、向流クロマトグラフィーをＩｔｏ多層水平ＣｏｉｌＰｌａｎｅｔＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｐ．Ｃ．Ｉｎｃ．，Ｐｏｔｏｍａｃ，ＭＤ）で行う。クロマトグラフィーはイソクラティック溶媒で展開するか、あるいは例えば６．５−８．０間のｐＨを持つｎ−ヘキサン、酢酸エチル、０．０２Ｍリン酸カリウム水溶液（７：３：５：、ｖ／ｖ／ｖ）よりなる溶媒系の上相で開始し、同一ｐＨのｎ−ヘキサン、酢酸エチル、０．０２Ｍリン酸カリウム水溶液（１：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）よりなる溶媒系の上相で終わるグラジエントにて展開する。全ての場合、ほぼ１２０ｍＬ／時間の流量を使用する。前記したごとく、画分をＮＭＲおよび生物活性によって分析し、純度に従ってプールする。一旦十分な純度が達成されると、¹Ｈおよび¹³ＣＮＭＲスペクトルをＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃＧＮ５００分光計で測定し、スペクトルの帰属を、補正分光（ＣＯＳＹ）、異核多重量子補正（ＨＭＱＣ）、異核多重結合補正（ＨＭＢＣ）および偏光移行（ＤＥＰＴ）実験による無乱れ増強の助けにより行う。前記したものは以下の実施例を参照して良好に理解され、これは本発明の実施のために非限定的なものとして供される。実施例１：ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３からのＬｉｇＡＴ２ドメインのクローニング組換えＤＮＡ技術の標準的な方法を用い、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２６３ＤＮＡのケノムライブラリーを二機能性コスミドｐＮＪ１（Ｔｕａｎら、Ｇｅｎｅ９０：２１−２９（１９９０年））中で構築した。略言すると、ｐＮＪ１をＥｃｏＲＩのほぼ５μｇで消化し、子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化し、次いで、ＢｇｌＩＩで消化して１つのアームを生成させ、またＰＮＪ１の５μｇをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＣＩＡＰで脱リン酸化し、次いでＢｇｌＩＩで消化して他方を生成させることによってコスミドベクターを調製した。インサートＤＮＡは、ほぼ２５μｇの高分子量Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ染色体ＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓ、前掲に概説されている手順に従ってＳａｕＩＩＩＡで部分的に消化することによって調製した。ほぼ３５ｋｂのＳａｕＩＩＩＡ断片は、適当なゲルスライスを６５℃まで融解し、３容量のＴＥ緩衝液を添加し、フェノールで２回、およびクロロホルムで１回温和に抽出し、水性相をエタノール沈殿させることによって、０．５％低融点アガロースゲルから回収した。連結にて、ほぼ３μｇのこの染色体ＤＮＡをほぼ０．５μｇの各コスミドアームと混合し、ＥｔＯＨ沈殿させた。沈殿を、２μＬの５×連結緩衝液および１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加した７μＬの水に再懸濁した。混合物を１６℃で一晩インキュベートした。製造業者の指示に従って、２μＬの連結混合物を充填するのにＧｉｇａｐ細菌はＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からのＥ．ｃｏｌｉＥＲ１７７２であった。制限分析によって２６のコロニーを調べ、インサートＤＮＡを含有することが判明した。個々のコロニーを３４の９６− ウェルプレートに拾って、該ライブラリーが全てのＳ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ配列を表した９９．９９％の確率を得た。さらなる制限分析は平均インサートサイズが約３０ｋｂであることを示した。エリスロマイシンＰＫＳ遺伝子ｅｒｙＡＩＩＩ（ＤｏｎａｄｉｏおよびＫａｔｚ，１９９２，Ｇｅｎｅ，１１１：５１−６０）のモジュール５からケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインを含む１．４５ｋｂのＳｓｔＩ−ＭＳｃＩＤＮＡ断片で該ライブラリーをスクリーニングした。ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡ標識システム（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用い、該ＤＮＡ断片を³²Ｐで標識した。コロニー（３６００）を９６−ウェルプレートからＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に移し、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前掲）に概説されている手順に従ってプールした。ハイブリダイゼーションは６５℃で行い、ストリンジェンシー洗浄は６５℃の０．１×ＳＳＣで行った。このＰＫＳプローブで最強のシグナルを与えた約６０のコスミドクローン選択した。また、本発明者らは、この株における潜在的に遺伝的に連結したペプチドシンテターゼを同定するために、第２のプローブでこれらのクローンのサザン消化物をスクリーニングしようと決定した。該プローブは非リボソームペプチドシンテターゼの保存されたモチーフから設計し（Ｂｏｒｃｈｅｒｔら、１９９２、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，９２：１７５−１８０）、２つの縮重３５量体、配列番号：３および配列番号：４の混合物よりなるものであった。ＤＮＡ５’ＥｎｄＬａｂｅｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用い、混合したプローブを標識した。ハイブリダイゼーションを５５℃で一晩行って、ストリンジェンシー洗浄を５５℃で０．５×ＳＳＣで行う以外は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前掲）に従って該６０のコスミドクローンを消化した。２つのコスミド５４および５８はこの第２のプローブを用いて同定した。コスミド５８のインサートの左側からの１ｋｂ断片でコスミドライブラリーを再度プローブすることによって１３のさらなるコスミドを引き続いて単離した。これらの１３のコスミドのうち２つ（Ａ１５およびＡ１６と命名）を、次いで、制限分析およびＤＮＡ配列決定によってさらに分析した。Ａ１６からのＤＮＡの３２．８ｋｂの連続的セグメントの制限および配列分析により、４つのＰＫＳ分子を持つタイプＩＰＫＳクラスターが明らかとされた。該クラスターの遺伝子地図は図６に示す。異常なＣｏＡリガーゼ−ようドメインがＯＲＦ１で見つかったので（ＰＫＳ１）、該クラスターを「Ｌｉｇ−ＰＫＳ」と命名した。Ｌｉｇ−ＰＫＳからのＬｉｇＡＴ２ドメインのヌクレオチド配列（頂部鎖）およびその対応するアミノ酸配列（底部鎖）を図７に示す（各々、配列番号：１および配列番号：３１）。配列番号：３１をラパマイシンＰＫＳにおける１４のＡＴドメインと比較すると（ＧｒｏｗｔｒｅｅＰｒｏｇｒａｍ，ＧＣＧ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、それはマロネート−特定ラパマイシンドメインとクラスターを形成していることが判明した（図３のグローツリー分析参照）。したがって、ＬｉｇＡＴ２は、Ｌｉｇ−ＰＫＳによってコードされるポリケチドの合成の間にその同族伸長ユニットとしてのマロネートを特定することが判明した。実施例２：プラスミドｐＵＣ１８／ＬｉｇＡＴ２の構築Ｌｉｇ−ＰＫＳクラスターからのＬｉｇＡＴ２ドメインをコードする９８５ｂｐＤＮＡセグメントをサブクローンし、カセットクローニングのための２つのユニーク制限部位ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩを導入するために２つのＰＣＲオリゴヌクレオチド（配列番号：５および配列番号：６）を設計した。ＡＴ−コーディングＤＮＡのカセットクローニングに必要な該ユニーク制限部位ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩは、ＬｉｇＡＴ２、ｖｅｎＡＴ、ｒａｐＡＴ２、ｒａｐＡＴ５、ｒａｐＡＴ８、ｒａｐＡＴ９、ｒａｐＡＴ１１、ｒａｐＡＴ１２、ｒａｐＡＴ１４、ｅｒｙＡＴ１、ｅｒｙＡＴ２、ｅｒｙＡＴ３、ｅｒｙＡＴ４、ｅｒｙＡＴ５、ｅｒｙＡＴ６、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓからの単機能ＡＴ（Ｒ．Ｇ．Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：９３８９−９４０２（１９９５年））を比較するプログラムＰＩＬＥＵＰおよびＰＲＥＴＴＹ（ＧＣＧ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用い、複数配列整列に基づいて選択した。制限部位の選択および位置決定は、以下の考慮：（ｉ）種々のＡＴ間のアミノ酸配列保存の程度、当該部位は最大保存の領域外であるがその近くに位置する、（ｉｉ）異種ＡＴ−コーディングＤＮＡおよびｅｒｙＡＴフランキングＤＮＡからの部位の不存在、および（ｉｉｉ）異種ＡＴアミノ酸配列上のこれらの部位の翻訳に起因するアミノ酸配列変化のインパクトに基づくものであった。これは、ＬｉｇＡＴ２−コーディングＤＮＡ配列の末端の始まりおよびそれの近くの図８で太線で示したヌクレオチド変化を必要とした（図８では、下線を施したヌクレオチドは野生型配列である）。加えて、ＰＣＲ−生成産物の便宜なサブクローニングのために、２つの他の制限部位ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩも、各々、Ｎ−末端およびＣ−末端オリゴヌクレオチドの５’末端に導入した。ほぼ１ｋｂのＬｉｇＡＴ２ドメインを以下のごとくにコスミド５８から増幅した：１００μＬのＰＣＲ反応混合物は１０μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２μＬの１０ｍＭｄＴＮＰ混合物、２−４μＬの５０ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｐＭの各オリゴ、１０−５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを含有し、水で１００μＬとしたものであった。サイクリング条件は以下の通りであった：９６℃／６分、８０℃／１分（５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼをこの１分の間に添加）および７２℃／２分の１サイクル：９５℃／１分、６５℃／１分および７２℃／２分の３０サイクルで、最後のサイクルでは７２℃で５分間延長。次いで、１％アガロースゲル上で全反応物を泳動させ、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で所望の断片を単離した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位にサブクローン化した。連結混合物を製造業者の指示に従ってＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に形質転換し、形質転換体を、１５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび青色／白色選択用のＸ−ｇａｌの２％溶液５０μＬを含有するＬＢプレート上で選択した。クローンは制限分析で確認し、インサートの忠実度はＤＮＡ配列決定によって確認した。最終のプラスミド構築体はｐＵＣ１８／ＬｉｇＡＴ２と命名した。実施例３：プラスミドｐＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２の構築ｐＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２は図９および１０の図式概略に従って組換えＤＮＡ技術の標準的な方法を用いて構築した。ｅｒｙＡＴ１ドメインにつき特異的な遺伝子−置換ベクターを構築するために、ｅｒｙＡＴ１−コーディングＤＮＡにすぐ隣接する２つのＤＮＡ領域をクローン化し、実施例２に記載したごとくにＬｉｇＡＴ２−コーディングＤＮＡに隣接して位置させた。ｅｒｙＡＴ１の５’ および３’境界は３８２５および４８６６と命名し、これは寄託されたｅｒｙＡＩ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６３６７６）に対応する。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体からのｅｒｙＡＴ１ドメインコーディング領域の上流のＤＮＡ断片をサブクローンするために、２つのＰＣＲオリゴヌクレオチド（配列番号：７および配列番号：８）を、ＥｃｏＲＩ部位が該領域の５’末端に付加され、かつＡｖｒＩＩ −ＢａｍＨＩ制限部位が３’末端に導入されるように設計した。鋳型としてプラスミドｐＡＩＥＮ２２ＤＮＡを用い、実施例２に記載されごとくに、５’−フランキング領域（約１ｋｂ）をＰＣＲで生成させた（このプラスミドは、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ切断したｐＵＣ１９にクローン化したｅｒｙＡＩＩにおけるｅｒｙＡＩないしＮｈｅＩ部位の上流にあるＥｃｏＲＩ部位からのＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＤＮＡの２２ｋｂを含有するｐＵＣ１９誘導体である）。ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位にサブクローン化し、連結したＤＮＡを製造業者の指示に従ってＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に形質転換した。１５０μｇ／ｍＬアンピリシンおよび５０μＬの青色／白色選択用のＸ−ｇａｌの２％溶液を含有するＬＢプレート上でクローンを選択した。クローンは制限分析によって確認し、インサートの忠実度はＤＮＡ配列決定によって確認した。得られた構築体はｐＵＣ１９／ＡＴ１／５’−ｆｌａｎｋと命名した。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体からのｅｒｙＡＴ１の３’−フランキング領域をサブクローンするために、２つのＰＣＲオリゴヌクレオチド（配列番号：９および配列番号：１０）を、ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ制限部位が該領域の５’末端に導入され、かつＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が３’末端に付加されるように設計した。また、前記したごとくに鋳型としてｐＡＩＥＮ２２を用いるＰＣＲによって３’−フランキング領域（約１ｋｂ）を生じさせた。ＰＣＲ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローン化し、連結したＤＮＡを前記したごとくにＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換した。１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μ Ｌの青色／白色選択用のＸ−ｇａｌの２％溶液を含有するＬＢプレート上でクローンを選択した。クローンは制限分析によって確認し、インサートの忠実度はＤＮＡ配列決定によって確認した。この中間構築体をｐＵＣ１９／ＡＴ１／３’− ｆｌａｎｋと命名した。２つのフランキング領域を、まず、ｐＵＣ１９／ＡＴ１／３’−ｆｌａｎｋを単離し、次いで、この断片を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ１９／ＡＴ１／５’−ｆｌａｎｋに連結することによって、結合させた。連結したＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し、前記したごとくに単離した。得られたプラスミドをｐＵＣ１９／ＡＴ１−ｆｌａｎｋと命名した。次いで、ｐＵＣ１９／ＡＴ１−ｆｌａｎｋからの２．１ｋｂのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離し、同一酵素で切断したｐＣＳ５に連結してｐＣＳ５／ＡＴ１−ｆｌａｎｋを得た。ｐＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２の構築における最終工程は、ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩ末端を有する１ｋｂのＬｉｇＡＴ２断片を同一酵素で切断したｐＣＳ５／ＡＴ１−ｆｌａｎｋに連結させて、遺伝子置換／組込プラスミドｐＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２を得ることであった。全ての連結混合物を中間宿主Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し、前記したごとくにクローンを選択した。実施例４：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２の構築Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０のエリスロマイシンＰＫＳ（ＥｒｙＡＴ１）のモジュール１におけるメチルマロニルアシルトランスフェラーゼドメインをコードするＤＮＡ断片を、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３からのマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ＬｉｇＡＴ２）をコードする新しく発見されたＤＮＡ断片で置き換えることによって、１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ産生微生物の例を調製した。これは、実施例３に記載したごとくに調製した組換えプラスミドｐＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２で達成された。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０の形質転換および組込事象の分離（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）は以下の方法に従って行った。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０細胞を３２℃にて３日間、５０ｍＬのＳＧＧＰ培地中で増殖させ、次いで、１０ｍＬの１０．３％スクロース中で洗浄した。細胞を１ｍｇ／ｍＬリゾチウムを含有する１０ｍＬのＰ_M緩衝液に再懸濁し、菌糸体セグメントのほとんどが球状プロトプラストに変換されるまで３０℃で１５−３０分間インキュベートした。プロトプラストをＰ_Mで１回洗浄し、次いで、−８０℃で２００μＬアリコート中にて貯蔵するための１０％ＤＭＳＯを含有する同一緩衝液３ｍＬに再懸濁した。形質転換は、プロトプラストのアリコートを素早く解凍し、遠心管中にて１５秒間遠心し、上清をデカントし、プロトプラストを管に残存するＰ_Mに再懸濁させることによって達成された。１０μＬのＤＮＡ溶液を添加し（７μＬのＰ_M緩衝液中約１μｇ／μＬの実施例３からのｐＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＴＡ２ＤＮＡの３μＬ）、管を穏やかに叩くことによってプロトプラストと混合した。２／１０ｍＬのＴ緩衝液中２５％ＰＥＧ８０００（Ｈｏｐｗｏｏｄら、１９８５，ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＴｈｅｊｏｈｎＩｎｎｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、次いで、添加し、溶液を３回ピペッティングすることによって混合し、懸濁液を直ちに乾燥Ｒ３Ｍプレート上に伸ばした。プレートを３０℃で２０時間インキュベートし、１００ μＬ／ｍＬチオストレプトンを含有する２ｍＬの水を重ね、簡単に乾燥し、３０ ℃でさらに４日間インキュベートした。安定な形質転換（組込体）を選択するために、形質転換プレートから生起したコロニーを、チオストレプトン（２０μｇ／ｍＬ）を含有するＲ３Ｍプレートに再度画線培養した。２つのコロニーはチオストレプトン耐性であることが判明し、これらのうちの１つをチオストレプトン（１０μｇ／ｍＬ）を含有するＳＧＧＰに接種して、サザン分析用の染色体ＤＮＡを単離した。さらに、サザンハイブリダイゼーションによって、プラスミドＤＮＡのＥＲ７２０染色体への組込を確認した（データは示さず）。ハイブリダイゼーションは６５℃で行い、ストリンジェンシー洗浄は６５℃で０．１×ＳＳＣで行った。確認した組込体を、抗生物質を含まないＳＧＧＰ中で増殖させ、次いで、胞子形成のために非選択Ｒ３Ｍプレート上で平板培養した。胞子をＲ３Ｍプレート上で平板培養して個々のコロニーが得られ、次いで、これをチオストレプトンに対する感受性につきスクリーニングし、染色体からのプラスミド配列の喪失が示された。５つのチオストレプトン感受性コロニーを選択し、それらの染色体ＤＮＡをＳｐｈＩで消化し、サザンハイブリダイゼーションによって分析した。ハイブリダイゼーションは６５℃で行い、ストリンジェンシー洗浄は６５℃にて０．１ ×ＳＳＣで行った。５つのチオストレプトン感受性コロニーのうち３つにおいて、ｐＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＴＡ２からのほぼ３ｋｂＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片よりなるプローブは、ほぼ３．５および１．６ｋｂの断片とハイブリダイズし、これはＬｉｇＡＴ２がこれらの分離体（ｒｅｓｏｌｖａｎｔ）の染色体においてＥｒｙＡＴ１を置き換えたことを示す。該株をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２と命名した。実施例５：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２によって産生された化合物の分析その構築を実施例４に記載した組換えＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ＥＲ７２０は、ＴＬＣ、バイオオートグラフィー、質量分析およびＮＭＲ分析によって特徴付けた。ＴＬＣ分析では、細胞をＳＧＧＰまたはＳＣＭ培地いずれか中で３０℃にて４ −５日間増殖させた。培養物のアリコート（１．５ｍＬ）を遠心管中で１分間遠心して細胞を除去した。１ｍＬの得られた上清をもう１つの遠心管に取り出し、６μＬのＮＨ₄ＯＨの添加によってｐＨを調整した。次いで、酢酸エチル０．５ｍＬを添加し、管を１０秒間撹拌し、次いで、ほぼ５分間遠心して相分離を達成した。有機相をもう１つの管に取り出し、水性相を０．５ｍＬの酢酸エチルで再抽出した。第２の有機相を第１の有機相と合わせ、ＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥した。残渣を１０μＬの酢酸エチル中に取り、５μＬをＭｅｒｃｋ６０Ｆ−２５４シリカゲルＴＬＣプレート上にスポットした。次いで、該プレートをイソプロピルエーテル：メタノール：ＮＨ₄ＯＨ（７５：３５：２）にて展開した。該プレートにアニスアルデヒド：硫酸：エタノール（１：１：９）をスプレーすることによって、エリスロマイシン誘導体を可視化した。この試薬を用い、新規化合物は１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡであると予測され、エリスロマイシンＡよりもわずかに早く移動する青色スポットとして出現した。生物学的活性を検出するために、ＴＬＣ−バイオオートグラフィーアッセイを行った。このアッセイにおいて、１マイクロリットルの前記からの抽出試料をＴＬＣプレート上にスポットし、これを前記したごとくに展開した。次いで、該プレートを風乾し、滅菌バイオアッセイ皿（２４５×２４５×２５ｍｍ）に入れた。次いで、該プレートを、インジケーター株としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓを含有する１００ｍＬの抗生物質培地１１（ＤＩＦＣＯ−ＢＡＣＴＯ）で被覆し、３７℃で一晩インキュベートした。陽性対照のように、阻害の明瞭なゾーンが試料スポットの周りに発生し、新規化合物は生物活性を有することが示された。ＴＬＣ上に観察された新規スポットが予測された１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡに対応する分子量を有するか否かを判断するために、酢酸エチル抽出物をさらに質量分析によって分析した。質量分析試料は、プレートをアニスアルデヒド試薬でスプレーする以外は基本的には前記したごとくにＴＬＣによって単離した。新規スポットの領域は、その代わりに、ＴＬＣプレートから掻き取り、シリカ樹脂を酢酸エチル−メタノール（１：１）で再抽出し、次いで、酢酸エチルで２回再抽出した。合わせた溶媒相を次いでＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥した。質量分析により、新規化合物は、１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する７０４の質量を有することが明らかとされた。ＮＭＲ分析実行用高度に精製された物質のミリグラム量を獲得するために、培養物を４２リットルのＬＨＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＳｅｒｉｅｓ２０００発酵槽中で増殖させた。ＳＣＭ培地を接種物の増殖および発酵のために使用した。発酵用の種は２工程で増殖させた。第１の工程では、凍結生長接種物を用いて、５００ｍＬのエルレンマイアーフラスコ中の１００ｍＬのＳＣＭ培地に接種した。第２の工程では、６００ｍＬのＳＣＭ培地を含有する２リットルのエルレンマイアーフラスコに第１継代増殖の５％を接種した。各工程は２２５ｒｐｍで作動するロータリー振盪機で３２℃にて３日間インキュベートした。３０リットルのＳＣＭ培地を４２リットルの発酵槽中に調製し、１２１℃および１５ｐｓｉにて１時間滅菌した。消泡剤（ＸＦＯ−３７１、ＩｖａｎｈｏｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）をまず０．０１％にて添加し、次いで、要求に応じて使用した。発酵槽を１．５リットルの第２継代種増殖を用いて接種した。温度は３２℃に維持した。回転速度は２６０ｒｐｍであり、空気速度は１．３容量／容量／分であった。ヘッド圧は６ｐｓｉに維持した。発酵の間、ｐＨは５Ｍプロピオン酸で７．３に制御した。発酵は１１１時間に停止し、発酵醸造物をｐＨに調製した。これに続いて、等容量のＣＨ₂Ｃｌ₂で２回抽出した。プールしたＣＨ₂Ｃｌ₂抽出物を、次いで、ほぼ４００ｍＬまで濃縮し、等容量の０．０５Ｍリン酸カリウム水溶液（ｐＨ５．５）で２回抽出した。水性相をプールし、ｐＨ８．０に調整し、次いで、等容量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル抽出物をプールし、濃縮して５ｍｌの油を得た。次いで、前記抽出系列を反復して濃縮後に６００ｍｇの油を得た。次に、試料を分割し、各半分を、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、０．０２Ｍリン酸カリウム水溶液（ｐＨ８．０）（１：１：１、ｖ／ｖ／ｖ）よりなる溶媒系の上または下相各２．５ｍｌ中にて消化した。次いで、これらを、移動相として上相を用いるＣｏｉｌＰｌａｎｅｔＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ上のクロマトグラフィーに付した。画分をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓに対するバイオアッセイおよび¹ＨＮＭＲによって分析した。２つのマクロライド含有生物活性ピークが両試料で観察され、生物活性のほとんどを含有した各試料から遅く溶出するピークをプールし、濃縮した。濃縮した物質を、次いで、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、０．０２Ｍリン酸カリウム水溶液（ｐＨ６．５）（６：４：５、ｖ／ｖ／ｖ）よりなる溶媒系の上または下相各２．５ｍｌ中で消化し、移動相として上相を用いるＣｏｉｌＰｌａｎｅｔＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ上のクロマトグラフィーに付した。画分をバイオアッセイおよび¹ＨＮＭＲによって分析した。２つのマクロライド含有生物活性ピークが観察され、遅く溶出する種は、その¹Ｈおよび¹³ＣＮＭＲスペクトルによって１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡと容易に特徴付けられた。¹ＨＮＭＲスペクトルからのパラメーターを表２にリストする。帰属決定は、補正スペクトロスコピー（ＣＯＳＹ）、異核多重量子補正（ＨＭＱＣ）、異核多重結合補正（ＨＭＢＣ）、および偏光移行（ＤＥＰＴ）実験による乱れ増強の助けによりなした。この試料のマススペクトルデータは構造帰属とも一致した。この試料のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）により、Ｍ／Ｚ７０４においいてＭ＋Ｈ⁺イオンが明らかとされ、これはメチル基およびヒドロキシル基を共に欠くエリスロマイシンＡと十分に合致した。 Table2 ＣＤＣｌ₃中での１２-デスメチル−１２-デオキシエリスロマイシンＡについての¹ＨＮＭＲ化学シフト（）帰属実施例６：プラスミドｐＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２の構築組換えＤＮＡ技術の標準的方法を用い、ｐＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２を構築した。ｅｒｙＡＴ２ドメインにつき特異的な遺伝子−置換ベクターを作成するために、ｅｒｙＡＴ２を挟み近接する２つのＤＮＡ領域をクローン化し、挿入すべきドメインをコードするＤＮＡに隣接して位置させて、相同組換えを行った。ＡＴ２ドメインの境界は実施例２に記載したごとくに選択した。ｅｒｙＡＴ２の５’および３’境界は、各々、８２５５および９２８２と命名し、これは寄託されたｅｒｙＡＩ配列と対応する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６３６７６）。ｅｒｙＡＴ２ＤＮＡの上流のＤＮＡ断片をサブクローンするために、２つのＰＣＲオリゴヌクレオチド（配列番号：１１および配列番号：１２）を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位が該領域の５’末端に付加され、かつＡｖｒＩＩ−ＰｓｔＩ制限部位が３’末端に導入されるように設計した。ｅｒｙＴＡ２の３’−フランキング領域をサブクローンするために、２つのオリゴヌクレオチド（配列番号：１３および配列番号：１４）を、ＰＳｔＩ−ＮｓｉＩ制限部位が該領域の５’末端に導入され、ＥｃｏＲＩ部位が３’末端に導入させるように設計した。５’−フランキングおよび３’−フランキング領域（各々約１ｋｂ）を共に実施例３に記載したごとくにＰＣＲ生成させた。５ ’−フランキング領域の場合、ＰＣＲ産物を引き続いてｐＵＣ１８のＨＩｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩ部位にサブクローンし、他方、３’−フランキング領域のＰＣＲ産物はｐＵＣ１８のＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした。選択したクローンの連結、形質転換および確認は実施例３に記載したごとくに行った。ＡＴ２５’−フランキング領域を含有する得られた構築体はｐＵＣ１８／ＡＴ２／５’−ｆｌａｎｋと命名し、ＡＴ２３’−フランキング領域を含有する構築体はｐＵＣ１８／ＡＴ２／３’−ｆｌａｎｋと命名した。２つのフランキング領域を、次いで、ますｐＵＣ１８／ＡＴ２／３’−ｆｌａｎｋからＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ断片（３’−ｆｌａｎｋ）を単離し、次いでこの断片を、ＰＳｔＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８／ＡＴ２／５’−ｆｌａｎｋに連結することによって結合させた。連結体をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し、クローンを前記したごとくに単離した。得られたプラスミドをｐＵＣ１８／ＡＴ２−ｆｌａｎｋと命名した（図１１）。次いで、ｐＵＣ１８／ＡＴ２ −ｆｌａｎｋからの２．２ｋｂのＥｃｏＲＩおよびＨＩｎｄＩＩＩ断片を単離し、同一酵素で切断したｐＣＳ５に連結してｐＣＳ５／ＡＴ２−ｆｌａｎｋを得た。ｐＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２の構築における最終工程は、ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩ末端を有するｐＵＣ１８／ＬｉｇＡＴ２からのＬｉｇＡＴ２コーディングＤＮＡ断片（実施例２記載）を、同一酵素で切断したｐＣＳ５／ＡＴ２−ｆｌａｎｋに連結して遺伝子置換組込プラスミドｐＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２を得ることであった（図１２）。全ての連結体を中間宿主Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し、前記したごとくにクローンを選択した。実施例７：Ｓａｃ．ｓｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２の構築１０−デスメチルエリスロマイシンＡおよび１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ産生微生物の例は、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０のエリスロマイシンＰＫＳ（ＥｒｙＡＴ２）のモジュール２のメチルマロニルアシルトランスフェラーゼドメインを、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３の新しく発見されたマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ＬｉｇＡＴ２）で置き換えることによって調製した。これは、実施例６に記載したごとくに調製した組換えプラスミドｐＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２で達成された。ＥＲ７２０の形質転換および安定な分離体の選択および確認は実質的に実施例４に記載されたごとくに行った。２つのチオストレプトン感受性コロニーを選択し、それらの染色体ＤＮＡをＳｐｈＩで切断し、サザンハイブリダイゼーションによって分析した。２つのチオストレプトン感受性コロニーのうち１つにおいて、ほぼ１ｋｂＬｉｇＡＴ２配列よりなるプローブはほぼ９００ｂｐの染色体ＤＮＡ断片とハイブリダイズし、これはＬｉｇＡＴ２がこの分離体の染色体においてＥｒｙＡＴ２を置き換えたことを示す。該株をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２と命名した。実施例８：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２によって産生された化合物の分析その構築が実施例７に記載された組換えＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２によって産生された化合物をＴＬＣ、バイオオートグラフィーおよび質量分析によって特徴付けた。小規模分析では、細胞を３０℃にて４−５日間、ＳＧＧＰまたはＳＣＭ培地いずれか中で増殖させた。実施例５に実質的に記載したごとくに培養物をＴＬＣ分析用に加工した。２つの新規化合物は１０−デスメチルエリスロマイシンＡおよび１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡであると予測され、エリスロマイシンＡよりもわずかに遅く泳動する下方スポットおよびエリスロマイシンＡよりもわずかに速く泳動する上方スポットとして出現した。生物学的活性を検出するために、実施例５に実質的に記載されているごとくにＴＬＣ−バイオオートグラフィーアッセイを行った。このアッセイでは、前記からの抽出試料の０．２ないし１マイクロリットルをＴＬＣプレート上にスポットし、これを前記したごとくに泳動させた。次いで、プレートを風乾し、滅菌バイオアッセイ皿（２４５×２４５×２５ｍｍ）に入れた。次いで、プレートを、インジケーター株としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓを含有する１００ｍＬの抗生物質培地１１（ＤＩＦＣＯ−ＢＡＣＴＯ）で被覆した。３７℃でのプレートの一晩インキュベーションによって阻止ゾーンが発生した。陽性対照のように、２つの新規スポット（化合物）の周りに阻止ゾーンが発生し、これは各々がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓに対して生物活性を有することを示している。ＴＬＣ上で観察されたスポットが予測された１０−デスメチルエリスロマイシンＡおよび１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡに対応する分子量を有するか否かを判断するために、酢酸抽出物を、さらに、質量分析によって分析した。プレートをアニスアルデヒド試薬でスプレーしない以外は前記した方法と同様にＴＬＣによって単離した。その代わりに、新規スポットを含有する２つの領域をＴＬＣフレートから掻き取り、シリカ樹脂を酢酸エチル−メタノール（１：１）で再抽出し、酢酸エチルで２回再抽出した。次いで、合わせた溶媒相をＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥した。前記した試料に加えて、粗製酢酸エチル抽出物をＬＣ−ＭＳによっても分析し、そこでは、試料化合物をまず液体クロマトグラフィーによって分離し、次いで、質量分析によって分析した。質量分析により、２つの新規化合物は７２０および７０４の質量を有することが明らかとなり、これは、各々、１０− デスメチルエリスロマイシンＡおよび１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する。実施例９：ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅからのｖｅｎＡＴドメインのクローニング組換えＤＮＡ技術の標準的方法を用い、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅＡＴＣＣ１５４３９ＤＮＡのゲノムライブラリーを二機能性コスミドｐＮＪ１（Ｔｕａｎら、Ｇｅｎｅ８０：２１−２９（１９９０年））中で構築した。このライブラリーからのコスミドｐＶｅｎ１７をサザン分析によって特徴付け、ほぼ３．５、３．８および４．０ｋｂのＳｓｔＩ断片は、エリスロマイシンＰＫＳ遺伝子ｅｒｙＡＩのモジュール２からのケトシンターゼ（ＫＳ）を含む１．３７ｋｂＳｍａＩ断片（Ｄｏｎａｄｉｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：６７５−６７９（１９９１年））にハイブリダイズすることが判明した。次いで、４．０ｋｂＳｓｔＩ断片をｐＵＣ１９にサブクローンしてｐＶｅｎ４．０を得た。ｐＶｅｎ４．０インサートＤＮＡのヌタレオチド配列は、７−ジアザ−ｄＧＴＰ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）および５’−［α−³²Ｐ］または５’−［α−³³Ｐ］−ｄＣＴＰ（ＮＥＮＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いるＳｅｑｕｅｎａｓｅｖｅｒｓｉｏｎ２を用い、Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ，３３：１０３（１９８５年））サブクローンから調製した一本鎖ＤＮＡ鋳型から決定した。ｐＶｅｎ４．０は全ＡＴドメインを含有しなかったので、鋳型としてｐＶｅｎ１７ＤＮＡを用いてヌクレオチド配列を伸長させた。ｖｅｎＡＴドメインのヌクレオチド配列（配列番号］２）およびその対応するアミノ酸配列（配列番号：３２）を図１３に示す（各々、頂部および底部鎖）。実施例１０：プラスミドｐＥｒｙＡＴ１／ｖｅｎＡＴの構築図１４および１５の図式概説に従って、組換えＤＮＡ技術の標準的方法を用い、ｐＥｒｙＡＴ１／ｖｅｎＡＴを構築した。Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅＰＫＳクラスターからのｖｅｎＡＴドメインをコードする１．０３ｋｂＤＮＡ断片（図１４）をサブクローンし、カセットクローニングのための２つのユニーク制限部位ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩを導入するように（実施例２記載）、２つのＰＣＲオリゴヌクレオチド（配列番号：１５および配列番号：１６）を設計した。これは、ｖｅｎ配列の最初および末端近くにおいてヌクレオチド変化（図１４で太線で示す）を必要とした（下線を施したヌクレオチドは野生型配列である）。加えて、２つの他の制限部位ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩも、ＰＣＲ生成産物のサブクローニングの便宜のために、各々、Ｎ−末端およびＣ−末端オリゴヌクレオチドの５’末端に導入した。ＶｅｎｔＲＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用い、コスミドｐＶｅｎ１７鋳型ＤＮＡ（実施例２）からほぼ１ｋｂのｖｅｎＡＴ−コーディングＤＮＡをＰＣＲ増幅した。典型的なＰＣＲ反応は１０μＬＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液、１０μＬのホルムアミド、１０μＬの２０％グリセロール、５５μＬの水、１００ピコモルの各プライマー、およびほぼ０．２μｇのＤＮＡを含有するものであった。試料を９９℃まで２分間で加熱し、次いで、２分間で８０℃まで冷却させ、その時点で、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの１．２５ｍＭ混合物１６μＬおよび２ユニットのＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを添加した。９６．５℃の３５秒、７２℃の２分１５秒の温度サイクルを次いで３０回反復し、続いて７２℃で３分間インキュベートした。次いで、標準的な手順によって所望のＰＣＲ断片を低融点アガロースから単離した。ＰＣＲ産物をＨｉｎｃＩＩ消化のｐＵＣ１８に連結し、製造業者の指示に従ってＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α （ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に形質転換した。１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μＬの青色／白色選択用のＸ−ｇａｌの２％溶液を含有するＬＢプレート上でクローンを選択した。クローンは制限分析によって確認し、インサートの忠実度はＤＮＡ配列決定によって確認した。最終構築体はｐＵＣ１８／ｖｅｎＡＴと命名した。ｐＥｒｙＡＴ１／ｖｅｎＡＴの構築における最終工程は、ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩ末端を有する１ｋｂのｖｅｎＡＴ断片を、同一酵素で切断したｐＣＳ５／ＡＴ１−ｆｌａｎｋ（実施例３）に連結して、遺伝子置換／組込プラスミドｐＥｒｙＡｔ１／ｖｅｎＡＴ（図１５）を得ることであった。全ての連結体を中間宿主Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し、前記したごとくにクローンを選択した。実施例１１：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＴ７２０ＥｒｙＡＴ１／ｖｅｎＡＴの構築Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＴ７２０のエリスロマイシンＰＫＳのモジュール１のメチルマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ＥｒｙＡＴ１）を、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅＡＴＣＣ１５４３９からの新しく発見されたマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ｖｅｎＡＴ）で置き換えることによって、１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ産生微生物を調製した。これは、実施例１０に記載したごとくに調製した組換えプラスミドｐＥｒｙＡＴ１／ｖｅｎＡＴで達成された。ＥＲ７２０の形質転換および安定な分離体の選択および確認は実質的に実施例４に記載されたごとくに行った。４つのチオストレプトン感受性コロニーが選択され、それらの染色体ＤＮＡをＰｖｕＩＩで切断し、サザンハイブリダイゼーションによって分析した。４つのチオストレプトン感受性コロニーのうち２つにおいて、ｖｅｎＡＴ配列のプローブは、ほぼ４．２および２．４ｋｂの染色体ＤＮＡ断片とハイブリダイズし、これはｖｅｎＡＴがこれらの分離体においてＥｒｙＡＴ１を置き換えたことを示す。該株をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡｔ１／ｖｅｎＡＴと命名した。実施例１２：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡｔ１／ｖｅｎＡＴによって産生された化合物の分析その構築が実施例１１に記載された組換えＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ、ＥＲ７２０ＥｒｙＡｔ１／ｖｅｎＡＴによって産生された化合物をＴＬＣ、バイオオートグラフィーおよび質量分析によって特徴付けた。ＴＬＣ分析では、細胞を３０℃で４−５日間、ＳＧＧＰまたはＳＣＭのいずれかの中で増殖させた。培養物は、実質的に実施例５に記載したごとくにＴＬＣ用に加工した。新規化合物は１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡであると予測され、エリスロマイシンＡよりもわずかに速く泳動するスポットとして出現した。生物学的活性を検出するには、実質的に実施例５に記載されたごとくにＴＬＣ −バイオオートグラフィーアッセイを行った。陽性対照のように、阻止の明瞭なゾーンが試料スポットの周りに発生し、これは新規化合物が生物活性であることを示す。ＴＬＣ上で観察される新規スポットが予測される１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡに対応する分量を有するか否かを判断するために、酢酸エチル抽出物をさらに質量分析によって分析した。質量分析試料は、プレートをアニスアルデヒドでスプレーしない以外は実質的に前記したごとくに基本的にはＴＬＣによって単離した。新規スポットの領域は、その代わり、ＴＬＣプレートから掻き取り、シリカ樹脂を酢酸エチル−メタノール（２：１）で再抽出し、次いで、酢酸エチルで２回再抽出した。合わせた溶媒相を次いでＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥した。質量分析により、新規化合物が、１２−デスメチル−１２− デオキシエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する７０４の質量を有することが明らかとなった。実施例１３：プラスミドｐＵＣ１９／ｒａｐＡＴ１４の構築ラパマイシン生合成遺伝子クラスターからの１０２３ｂｐｒａｐＡＴ１４−コーディングＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号＃：Ｘ８６７８０）をサブクローンし、カセットクローニング用の２つの制限部位ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩを導入するように（実施例２記載）、２つのＰＣＲオリゴヌクレオチド（配列番号：１７および配列番号：１８）を設計した。これは、ｒａｐＡＴ１４配列の最初および末端近くのヌクレオチド変化（図１６に示す）を必要とした（図１６において、下線を施したヌクレオチドは野生型配列である）。加えて、２つの他の制限部位ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩも、ＰＣＲ−生成産物の便宜なサブクローニングのために、各々、Ｎ−末端およびＣ−末端オリゴヌクレオチドの５’末端に導入した。鋳型としてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｐｃｓｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２６３からの染色体ＤＮＡを用い、ほぼ１ｋｂのｒａｐＡＴ１４−コーディングＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：１００μＬ反応混合物は１０μＬの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、２％グリセロール、１０％ホルムアミド、１００ピコモルの各オリゴ、１００−２００ｎｇの鋳型ＤＮＡを含有し、水で８４μＬとした。次いで、２分間で試料を９９℃まで加熱し、続いて２分間で８０℃まで冷却させ、その時点で１６μＬのｄＮＴＰ溶液（１．２５ｍＭｄＡＴＰおよびｄＴＴＰ、１．５ｍＭｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）およｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を添加した。サイクリングは以下の通りであった：９６．５℃／３５秒、６５℃／１分および７２℃／１．５分の３０サイクル、続いて７２℃の３分間の１サイクルであった。次いで、全反応を１．２％低融点アガロースゲル上で泳動させ、所望の断片を、６５℃で適当なゲルを融解させ、３容量のＴＥ緩衝液を添加し、フェノールで２回、クロロホルムで１回抽出し、水性相をエタノール沈殿させることによって、単離した。単離したＤＮＡをＨｉｎｃＩＩ消化のｐＵＣ１９に直接連結した。連結混合物を製造業者の指示に従ってＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に形質転換し、形質転換体を、１５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μＬの青色／白色選択用のＸ−ｇａｌの２％溶液を含有するＬＢプレート上で選択した。制限分析によってクローンを確認し、インサートの忠実度はＤＮＡ配列決定によって確認した。最終プラスミド構築体はｐＵＣ１９／ｒａｐＡＴ１４と命名した。実施例１４：プラスミドｐＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４の構築実施例１６および１７の図式概説に従って、組換えＤＮＡ技術の標準的方法を用い、ｐＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４を構築した。ｅｒｙＡＴ１ドメインにつき特異的な遺伝子−置換ベクターを作成するために、ｅｒｙＡＴ１にすぐに隣接する２つのＤＮＡ領域をクローン化し、ｒａｐＡＴ１４ドメインをコードするＤＮＡに隣接して位置させて、相同組換えを起こさせた。フランキング領域を含有する中間プラスミドを構築するためのストラテジーおよびプロトコルは実施例３および図９に記載されている。ｒａｐＡＴ１４断片をフランキング領域間に挿入するために、（実施例１３からの）ｐＵＣ１９／ｒａｐＡＴ１４をＮｓｉＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、得られた１ｋｂ断片をＰｒｅｐ −Ａ−Ｇｅｎｅにて０．８％アガロースゲルから単離した。ｐＣＳ５／ＡＴ１− ｆｌａｎｋもこれらの酵素で消化し、線状化プラスミドを０．８％アガロースゲルから単離した。２つの断片を連結し、中間宿主Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し、アンピシリン耐性クローンを前記したごとくに選択した。ｅｒｙフランキング領域間へのｒａｐＡＴ１４断片の挿入は制限分析によって確認し、得られたプラスミドをｐＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４と命名した。実施例１５：Ｓａｃ．ｅｒｖｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４の構築１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ産生微生物の例は、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０のエリスロマイシンＰＫＳのモジュール１のメチルマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ＥｒｙＡＴ１）を、Ｓ．ｈｙｇｒｐｃｓｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３からのラパマイシンＰＫＳのモジュール１４からのアシルトランスフェラーゼドメインで置き換えることによって調製した。これは、実施例１４に記載されたごとくに調製した組換えプラスミドｐＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４で達成された。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０の形質転換および安定分離体の選択および確認は実質的に実施例４に記載されているごとくに行った。６つのチオストレプトン感受性コロニーを選択し、それらの染色体ＤＮＡをＳｔｙＩで切断し、サザンハイブリダイゼーションによって分析した。６つのチオストレプトン感受性コロニーのうち１つにおいて、ｐＣＳ５ＡＴ１−ｆｌａｎｋからのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片よりなるプローブはほぼ１．６ｋｂの染色体ＤＮＡ断片とハイブリダイズし、これは、ｒａｐＡＴ１４がこの分離体の染色体におけるＥｒｙＡＴ１を置き換えたことを示す。該株をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４と命名した。実施例１６：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４によって産生された化合物の分析その構築を実施例１５に記載した組換えＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株、ＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４によって産生された化合物をＴＬＣおよび質量分析によって特徴付けた。ＴＬＣ分析では、株４−Ａ−１をＳＣＭ培地中で３０℃で４日間増殖させた。培養物をＴＬＣのために実質的に実施例５に記載されているごとくに加工した。新規化合物は１２−デスメチル−１２−デスオキシエリスロマイシンＡであると予測され、エリスロマイシンＡよりもわずかに速く泳動する青色スポットとして出現した。ＴＬＣで観察された新規スポットが予測される１２−デスメチル−１２−デスオキシエリスロマイシンＡに対応する分子量を有するか否かを判断するために、酢酸エチル抽出物をさらに質量分析によって分析した。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４をＳＣＭ培地中出４日間増殖させた。１０ｍＬの培養物を遠心して菌糸を除去し、上清のｐＨをＮＨ₄ＯＨで９に調整した。次いで、上清を酢酸エチルで２回抽出し、有機相をプールし、乾燥した。この粗製酢酸エチル抽出物の質量分析は、新規スポットの質量が７０４であることを示し、これは１２−デスメチル−１２−デスオキシエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する。実施例１７：プラスミドｐＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４の構築図１６および１８の図式概説に従って、組換えＤＮＡ技術の標準的技術を用い、ｐＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４を構築した。ｅｒｙＡＴ２ドメインにつき特異的な遺伝子置換ベクターを作成するために、ｅｒｙＡＴ２にすぐに隣接する２つのＤＮＡ領域をクローン化し、ｒａｐＡＴ１４ドメインをコードするＤＮＡに隣接して位置させて、相同組換えが起こるのを可能とした。フランキング領域、ｐＣＳ５／ＡＴ２−ｆｌａｎｋを含有する中間プラスミドを構築するためのストラテジーおよびプロトコルは実施例６および図１２に記載されている。ｐＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４の構築における最終工程は、ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩ末端を有する１ｋｂｒａｐＡＴ１４−コーディングＤＮＡ断片を、同一酵素で切断したｐＣＳ５／ＡＴ２−ｆｌａｎｋ（実施例６）に連結させて遺伝子置換／組込プラスミドｐＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４を得ることであった（図１８）。全ての連結体を中間宿主Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し、前記したごとくにクローンを選択した。実施例１８：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｖＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４の構築Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０のエリスロマイシンＰＫＳのモジュール２のメチルマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ＥｒｙＡＴ２）をコードするＤＮＡ断片を、Ｓ．ｈｙｇｒｐｃｓｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３からのマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ｒａｐＡＴ１４）で置き換えることによって、１０−デスメチルエリスロマイシンＡおよび１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ産生微生物を調製した。これは、実施例１７に記載したごとくに調製した組換えプラスミド、ｐＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４で達成された。ＥＲ７２０の形質転換および安定分離体の選択および確認は、実質的に実施例４に記載したごとくに行った。４つのチオストレプトン感受性コロニーを選択し、それらの染色体ＤＮＡをＢｓｐＥＩで切断し、サザンハイブリダイゼーションによって分析した。４つのチオストレプトン感受性コロニーにうち３つにおいて、ｅｒｙＡＴ２の５’−フランキング領域の断片よりなるプローブは、ほぼ４．３ｋｂの染色体ＤＮＡ断片とハイブリダイズし、これは、ｒａｐＡＴ１４がこれらの分離体の染色休においてＥｒｙＡＴ２を置き換えたことを示す。該株をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４と命名した。実施例１９：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４によって産生された化合物の分析その構築を実施例１８に記載した組換えＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ、ＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４によって産生された化合物をＴＬＣ、バイオアッセイおよび質量分析によって特徴付けた。ＴＬＣ分析では、細胞ょＳＧＧＰまたはＳＣＭ培地いずれか中で３０℃で４− ５日間増殖させた。培養物をＴＬＣのために実質的に実施例５に記載されたごとくに加工した。２つの新規化合物は１０−デスメチルエリスロマイシンＡおよび１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡであると予測され、青色スポットとして出現し、下方スポットはエリスロマイシンＡよりもわずかに遅く泳動し、上方スポットはエリスロマイシンＡよりもわずかに速く泳動した。生物学的活性を検出するために、実質的に実施例５に記載されているごとくにバイオアッセイを行った。陽性対照のように、新規化合物の周りに阻止ゾーンが発生し、これはそれらが生物活性を有することを示す。ＴＬＣで観察された新規スポットが予測される１０−デスメチルエリスロマイシンＡおよび１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡに対応する分子量を有するか否かを判断するために、もうつ１つの培養物からの酢酸エチル抽出物を、さらに、質量分析によって分析した。試料は４日間増殖させた２０ｍＬの培養の粗製抽出物であった。質量分析は、２つの新規化合物が７２０および７０４の質量を有することを明らかとし、これは、各々、１０−デスメチルエリスロマイシンＡおよび１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する。実施例２０：ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓからのエチルＡＴドメインのクローニングＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１（１９６５年１１月１６日に発行された米国特許第３，２１８，２３９号）のゲノムライブラリーを、二機能性コスミドｐＮＪ１（Ｔｕａｎら、Ｇｅｎｅ，９０：２１０２９（１９９０））において構築した。コスミドベクターは、５μｇのｐＮＪ１をＥｃｏＲＩで消化し、ＣＩＡＰで脱リン酸化し、次いで、ＢｇｌＩＩで消化して１つのアームを生成させ、また、５μｇのｐＮＪ１をＨＩｎｄＩＩＩで消化し、ＣＩＡＰで脱リン酸化し、次いで、ＢｇｌＩＩで消化して他方のアームを生成させることによって調製した。インサートＤＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓ（前掲）に概説された手順に従い、ほぼ５μｇの染色体Ｓ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１ＤＮＡをＳａｕＩＩＩＡで部分的に消化することによって調製した。ほぼ４０ｋｂの断片サイズを生成する消化条件を選択した。連結は、ほぼ１μｇの消化染色体ＤＮＡを０．５μｇの各コスミドアームと混合することによって行った。連結体を１６℃で一晩インキュベートした。製造業者の指示に従い、２μＬの連結混合物をパッケージングするためにＧｉｇａｐａｃｋＩＩＸＬ（Ｓて行った。個々のコロニーを３０の９６−ウェルプレートに拾って、ライブラリーが全てのＳ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１ゲノム配列を表す９９．９９％の確率を得た。Ｓ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１ＰＫＳ領域につき特異的なプローブを用い、該ライブラリーをスクリーニングした。該プローブは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるコンセンサスケトシンターゼ（ＫＳ）およびアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）配列から設計した縮重プライマーを用い、Ｓ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって生成させた。ＫＳ特異的オリゴ（配列番号：１９）およびＡＴ特異的オリゴ（配列番号：２０）は９００ｂｐＰＣＲ断片を生成した。ＰＣＲ反応は、１０μＬのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液、２μＬのホルムアミド、２５μＬの２０％グリセロール、３μＬの５０ｍＭＭｇＣｌ₂、４５μＬの水、５０ピコモルの各プライマーおよびほぼ０．２μｇのＤＮＡを含有するものであった。試料を５分間で９９℃まで加熱し、次いで氷上に置き、その時点で、２μＬのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの１０ｍＭ混合物、２ユニットのＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼおよび７μＬの水よりなる１０μＬのカクテルを添加した。次いで、試料をＧｅｎｅＡｍｐ９６００サーモサイクラー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）に移し、９５℃の１分、５０℃の４分、および７２℃の４分の温度サイクルを３０回反復し、続いて、７２℃で１５分間インキュベートした。次いで、所望のＰＣＲ断片を標準的手順によって１．０％低融点アガロースから単離した。ＫＳ／ＡＴプローブは、ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＡｍｅｒｉｃａｎＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用い、ほぼ５０ｎｇのＰＣＲ断片を³²Ｐで標識することによって作成した。ライブラリークローン（２，８８０）を９６−ウェルプレートからＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前掲）中の手順に従い、ＫＳ／ＡＴプローブでスクリーニングした。ハイブリダイセーションを６５℃で行い、最終洗浄は６５℃での０．１×ＳＳＣにおけるものであった。クローンのうち１９は該プローブと強くハイブリダイズした。次いで、これらのクローンをＳｓｔＩで消化し、１．０％アガロースゲル上で泳動させ、ＫＳ／ＡＴプローブを用いるサザン分析のためにＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロンフィルターに移した。ｐＣＥＬ１８ｈ５と命名したコスミドをさらなる分析のために選択した。というのは、それは非常に多数のハイブリダイズする制限断片を含有したからである。コスミドｐＣＥＬ１８ｈ５からのＳｓｔＩ断片をｐＧＥＭ−３ｚｆ（ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローン化し、ｆｍｏｌｅＤＮＡＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて配列決定した。反応物をＳｅｑｕｉ−ＧｅｎＩＩ配列決定装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で泳動させた。該断片の５’および３’末端にハイブリダイズするプライマーを用い、コスミドｐＣＥＬ１８ｈ５を配列決定することによって、個々の断片を相互に対して向かせて、上流および下流配列を生成させた。次いで、これらの配列を個々の断片からの配列とマッチさせて、それらを適当な順序に置いた。非常に大きなＳｓｔＩ断片（＞１０ｋｂ）をさらにＳｍａＩで消化して、クローニングおよび配列決定用のより小さい断片を生成させた。得られた配列に関してＧｅｎＢａｎｋデータベースをサーチすることによって、ニッダマイシンＰＫＳクラスターに関連する種々の酵素的モチーフを同定し、タイプＩＰＫＳ組織化の従前の知識に基づいてこれらのモチーフをモジュールにグループ分けした（図１９）。ニッダマイシンマタロラタトン環のＣ−６位はエチル側鎖に由来するアルデヒドを有する（図２０）。したがって、ニッダマイシンクラスターのモジュール５のＡＴはこのエチル基を成長しつつある鎖に取り込むことを担うと予測された。加えて、分子のＣ−７における炭素は完全に飽和され、これは、ＥＲおよびＤＨモチーフもモジュール５に存在するという予測に導いた。事実、これらのモチーフは配列の予測領域で見出された。さらに、先行４モジュールについてのモチーフは、予測されるごとく、モジュール４における不活性ケトリダクターゼモチーフを持ち、これは環のＣ −９位でケト基を脱離する。ＫＲの配列決定は、ヌクレオチド結合部位ＧＸＧＸＸＧ（配列番号：２７）がＤＸＴＸＸＰ（配列番号：２９）に突然変異したことを示した。モジュール５のエチルＡＴのヌクレオチド配列（配列番号：２９）および対応するアミノ酸配列（配列番号：３３）は図２１に示す（各々、頂部および底部鎖）。また、ノックアウト実験をこのクラスターについて行い、ＤＮＡのこの配列がニッダマイシン生合成の経路をコードすることが示された。実施例２１：プラスミドｐＥＡＴ４の構築多工程ストラテジーを用いてプラスミドｐＵＣ／ｅｔｈＡＴ／Ｃ６（図２２）を構築した。これは全てｐＵＣ１９に含有された、ｅｒｙＡＴ４コーディング配列の上流およひ下流のほぼ２．０ｋｂ配列によって両側が近接されたＮｉｄＡＴ５ドメインをコードするＤＮＡよりなる。ＥｒｙＡＴ４フランキングＤＮＡはｐＡＩＢＸ８５からサブクローンした。このプラスミドは、エリスロマイシンＰＫＳクラスターのｅｒｙＡＩＩ遺伝子におけるＸｈｏＩ部位ないしＢａｍＨＩ部位の８．４ｋｂのＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＤＮＡを含有するｐＣＳ５誘導体である。これらの部位は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６３６７６の、各々、塩基２３２１１および３１５８１に対応する。ＥｒｙＡＴ４５’− フランキングＤＮＡは、ｐＡＩＢＸ８５を（各々、ヌクレオチド２３，２１１および３１，５８１に対応する）ＭｓｃＩおよびＢＳｔＥＩＩで消化することによって単離した。得られた１８００ｂｐＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で処理し、ｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ αに形質転換した。１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μＬの青色／白色選択用のＸ−ｇａｌの２％溶液を含有するＬＢプレート上でクローンを選択した。該クローンを制限分析によって確認し、その結果、中間ベクターｐＵＣ／５ ’−ｆｌａｎｋを得た。ＮｉｄＡＴ５−コーディング配列の便利なクローニングのために、ＡｖｒＩＩ部位を５’フランキングＤＮＡの３’末端に作成した。これは、２つのオリゴヌタレオチド（配列番号：２１および配列番号：２２）を用いる５’フランキングＤＮＡのＰｍｌＩ部位ないしＢＳｔＥＩＩ部位のＰＣＲ増幅によって達成された。配列番号：２２は３’および５’フランキングＤＮＡにＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩ部位を取り込む。ＰＣＲ条件は、以下の変形を施し、鋳型としてＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＤＮＡを用いる実施例２０に記載されている通りであった：Ｔａｑポリメラーゼの代わりに伴う１０×緩衝液と共に使用し、サイクリング条件は２５サイクルにつき９６℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／３０秒であった。次いで、得られた３００ｂｐＰＣＲ断片をＰｍｌＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｐｒｅｐ −Ａ−Ｇｅｎｅにて１．０アガロースゲルから精製し、ＰｍｌＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ／５’−ｆｌａｎｋに逆連結してｐＵＣ／５’−ｆｌａｎｋ −ＡｖｒＩＩを得た。連結体をＤＨ５αに形質転換し、１５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレートに平板培養した。クローンは制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認した。５’フランキングＤＮＡの下流のＮｉｄＡＴ５−コーディングＤＮＡ断片をクローン化するために、ＮｉｄＡＴ５−コーディングＤＮＡの５’末端にＡｖｒＩＩ部位も作成した。図２３に示すごとく、アミノ酸配列を変化させることなくＡｖｒＩＩ部位をＮｉｄＡＴ５ＤＮＡに作成することもできる。２つのＰＣＲオリゴヌクレオチド（配列番号：２３および配列番号：２４）は、ＮｉｄＡＴ５−コーディングＤＮＡの、各々、５’ 末端にＡｖｒＩＩ部位を、３’末端にＢａｍＨＩ部位を生じるように設計した。便利なＦｓｅＩ部位が天然でＮｉｄＡＴ５−コーディング配列の３’末端に生じ、従って、得られたＰＣＲ断片はＰＣＲ作成ＢａｍＨＩ部位の丁度上流にＦｓｅＩ部位を含有する。配列番号：２３および配列番号：２４を、鋳型ｐ１６−２．２でのＰＣＲ反応で使用した。このプラスミドは、ニッダマイシンＰＫＳクラスターのモジュール５からの２．２ｋｂｋＳｍａＩ断片を含有するｐＵＣ１９であり（図１９）、これはＮｉｄＡＴ５をコードする配列を含む。得られた１．０ｋｂＰＣＲ断片をＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅを用いる１．０％アガロースゲルから精製し、ｐＵＣ／５’−ｆｌａｎｋ−ＡｖｒＩＩのＡｖｒＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。クローンは制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認し、中間プラスミドｐＵＣ／５’−ｆｌａｎｋ／ｅｔｈＡＴを得た。ＥｒｙＡＴ４３’−フランキングＤＮＡは、ｅｒｙＡＩＴ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６３６７６）からの、各々、ヌクレオチド２９，２３１および３１，２０９に対応する、ＰｍｌＩおよびＭｓｃＩでｐＡＩＢＸ８５を消化することによってサブクローンした。該ＤＮＡをＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅを用いる１．０％アガロースゲル上でゲル精製し、ｐＵＣ１９のｓｍａＩ部位に連結した。連結体をＤＨ５αに形質転換し、前記したごとくに平板培養した。クローンは制限分析によって確認し、その結果、プラスミドｐＵＣ／３’−ｆｌａｎｋが得られた。ＥｒｙＡＴ４３’−フランキングＤＮＡをＮｉｄＡＴ５−コーディング配列に付着させるのは、プラスミドｐＵＣ／３’−ｆｌａｎｋをＦｓｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅを用いる１．０％アガロースゲル上で断片をゲル精製し、それを、予めＦｓｅＩおよびＢａｍＨＩで消化されているｐＵＣ／５’−ｆｌａｎｋ／ｅｔｈＡＴに連結することによって達成された。前記したごとくに連結体をＤＨ５αに形質転換し、クローンを制限分析によって分析し、その結果、中間プラスミドｐＵＣ／ｅｔｈＡＴ／Ｃ−６が得られた。最終工程は、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ／ｅｔｈＡＴ／Ｃ−６からＮｉｄＡＴ５／フランキングＤＮＡインサートを取り出し、それをｐＣＳ５のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結し、遺伝子置換／組込プラスミドｐＥＡＴ４を得ることであった（図２４）。実施例２２：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥＡＴ４−４６の構築６−デスメチル−６−エチルエリスロマイシンＡ産生微生物の例は、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０のエリスロマイシンＰＫＳのモジュール４におけるメチルマロニルアシルトランスフェラーゼドメインをコードするＤＮＡ断片（ＥｒｙＡＴ４）をＳ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１からのエチルマロニルアシルトランスフェラーゼドメインをコードする新しく発見されたＤＮＡ断片（ＮｉｄＡＴ５）で置き換えることによって調製した。これは、実施例２１に記載されたごとく調製した組換えプラスミドｐＥＡＴ４を用いて達成された。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０の形質転換および安定分離体の選択および確認は実質的に実施例４に記載されたごとくに行った。９つのチオストレプトン感受性コロニーを選択し、それらの染色体ＤＮＡをＭｌｕＩで切断し、サザンハイブリダイゼーションによって分析した。９つのチオストレプトン感受性コロニーのうち３つにおいて、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓにおけるＫＳ／ＡＴドメインにわたるほぼ９００ｂｐ断片よりなるプローブはほぼ１．８ｋｂの染色体断片とハイブリダイズし、これは、ＮｉｄＡＴ５がこれらの分離体の染色体においてＥｒｙＡＴ４を置き換えたことを示している。該株をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥＡＴ４−４６と命名した（単に、ＥＡＴ４−４６という）。実施例２３：ＥＡＴ４−４６によって産生された化合物の分析その構築が実施例２２に記載された株ＥＡＴ４−４６によって産生された化合物をＴＬＣ、バイオオートグラフィーおよび質量分析によって特徴付けた。細胞を３０ｍＬのＳＣＭ中にて３０℃で４−５日間増殖させた。培養物を実質的に実施例５に記載されたごとくにＴＬＣ用に加工した。結果は、ＥＡＴ４−４６が、かなり低い収率であることを除き、野生型ＳＡｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０によって産生されたエリスロマイシンＡと同一ｒｆで移動する化合物を産生したことを示した。該化合物の分子量を測定するために、適量の試薬を用い、前記したＥＡＴ４− ４６の５０ｍＬのＳＣＭ培養から酢酸エチル抽出物を調製した。得られた残渣を５０μＬの酢酸エチル中に採り、プレートをアニトアルデヒドでスプレーしない以外は前記したごとくにＴＬＣプレート上で泳動させた。注目する化合物は、実施例８に記載ごとくスポットに隣接するシリカ樹脂を掻き採り、該樹脂を抽出することによって単離した。質量分析により、ＥＡＴ４−４６によって産生された化合物は７３４の質量を有することが明らかとされ、これはエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する。ＮｉｄＡＴ５エチルマロニルＡＴ構築用の基質プールを増大させる試みにおいて、５０ｍＭ酪酸（ｐＨ７．０）を含有する１００ｍＬのＳＣＭ培地中でＥＡＴ４−４６株を増殖させた。培養を３０℃で４日問増殖させ、次いで、ＳｏｒｖａｌＧＬＣ−４Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で１０分間遠心して細胞をペレット化した。得られた上清を６００μＬのＮＨ₄ＯＨの添加によってｐＨ９．０に調整し、前記したごとくに１／２容量の酢酸エチルで２回抽出した。Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃロータリー濃縮機中で乾燥した後、抽出された物質を１００μＬの酢酸エチルに採り、１０μＬを前記したごとくにＴＬＣ分析で用いた。ＳＣＭ培地単独では１つのスポットのみが観察されたのに対し、酪酸供給培養ではｅｒｙＡ近くで泳動する２つのスポットが観察された。２つのスポットの分子量を測定するために、抽出物の残りの大部分を再度ＴＬＣに付し、プレートのｅｒｙＡ領域中の化合物を前記したごとくに単離した。質量分析は、２つのスポットが７３４および７４８の分子量を有することを明らかとした。７３４の分子量はエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する一方で、分子量７４８の種はエチルエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に合致する。実施例２４：ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１からのＮｉｄＡＴ６ドメインのクローニング実施例２０に記載したごとくにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１ＤＮＡのゲノミックライブラリーを生成させ、ＰＫＳ遺伝子につき特異的なプローブでスクリーニングした。陽性クローンのＳｓｔＩ消化物のサザン分析から、いくつかのクローンをさらなる分析用に選択した。これらのクローンをＳｍａＩと消化し、ＰＫＳ特異的プローブにてサザンハイブリダイゼーションのために１％アガロース上で泳動させた。該分析は、第２のコスミドｐＣＥＬ１３ｆ５がｐＣＥＬ１８ｈ５とハイブリダイズする多くのバンドを有するが、１．９ｋｂおよび６．０ｋｂの２つのユニークなバンドも含有することを明らかとした。このコスミドをさらなる分析用に選択して、ニッダマイシン経路における残りのＰＫＳ遺伝子の配列を決定した。コスミドｐＣＥＬ１３ｆ５をＳｓｔＩで消化し、断片をｐＵＣ１９に連結した。大きなＳｓｔｌ断片（＞１０ｋｂ）をさらにＳｍａＩで消化し、ｐＵＣ１９に連結した。連結体をＤＨ５α細胞に形質転換し、１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μｌの青色／白色選択用のＸ−ｇａｌの２％溶液を含有するＬＢプレート上でクローンを選択した。適当なインサートを含有するクローンからのＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮＩｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて単離した。ＡＢＩＰＲＩＳＭＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてサブクローンを配列決定し、反応物を４．７５％アクリルアミド、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍにおける８．３Ｍ尿素上で泳動させた。インサートの順序付けおよびモチーフ同定は実施例２０に記載したごとくに行った。コスミドｐＣＥＬ１３ｆ５におけるインサートは長さがほぼ２５ｋｂであることが判明し、該インサートの５’末端はｐＣＥＬ１８ｈ５におけるインサートの３’末端と同一の約１０ｋｂ配列を有した。一緒にすると、２つのコスミドは、ニッダマイシン経路のＰＫＳ遺伝子の全てを含有する（図１９）。ニッダマイシンの構造に基づくと（図２０）、モジュール６に含有されたＡＴ（ＮｉｄＡＴ６）は、ニッダマイシンのマクロラクトン環のＣ−３、Ｃ−４およびＯ−４位の生合成においてヒドロキシマロネート（タルトロネート）を利用し得る。（Ｓ．Ｏｍｕｒａら（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ３６：６１１−６１３（１９８３））は、密接に関連した１６−員マクロライドであるロイコマイシンのＣ−３、Ｃ −４およびＯ−４位の生合成においてグリコーレートが取り込まれ得ることを示唆した）。ＮｉｄＡＴ６のヌクレオチド配列（頂部鎖、配列番号：３０）およびその対応するアミノ酸配列（下方鎖、配列番号：３４）を図２５に示す。ＮｉｄＡＴ６のアミノ酸配列とＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースにおける他のＡＴとの比較は、ＮｉｄＡＴ６がメチルマロニルＡＴに似ていることを示す。実施例２５：プラスミドｐＵＣ１８／ＮｉｄＡＴ６の構築ニッダマイシンＰＫＳクラスターからのＮｉｄＡＴ６ドメインをコードする１０２４ｂｐＤＮＡ断片をサブクローンし、カセットクローニング用の２つのユニーク制限部位ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩを導入するために、２つのＰＣＲオリゴヌクレオチド（配列番号：２５および配列番号：２６）を設計した。これは、ＮｉｄＡＴ６−コーディングＤＮＡ配列の末端の開始および近くの、図２６で太線で示した、ヌクレオチド変化を必要とした。示した該変化は、ＮｉｄＡＴ６ドメインのＮ−末端近くのプロリンコドンのバリンコドンでの置換も引き起こして、ラパマイシンＰＫＳのＡＴドメインのいくつかにつき天然で見出されるものに対してドメイン結合配列の類似性を増大させる。（図２６において、下線を施したヌクレオチドは野生型配列である）。加えて、ＰＣＲ生成の産物の便利なサブクローニングのために、各々、Ｎ−末端およびＣ −末端オリゴヌクレオチドの５’末端に２つの他の制限部位ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩも導入する。コスミドｐＣＥＬ１３ｆ５からの試薬および一般的方法で記載された方法を用い、ほぼ１ｋｂのＮｉｄＡＴ６ドメインをコードするＤＮＡを増幅する。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位にサブクローンする。連結混合物を製造業者の指示に従ってＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α （ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に形質転換し、１５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μＬの青色／白色選択用のＸ−ｇｓｌの２％溶液を含有するＬＢプレート上で形質転換体を選択する。クローンを制限分析によって確認し、インサートの忠実度をＤＮＡ配列決定によって確認する。最終プラスミド構築体をｐＵＣ１８／ＮｉｄＡＴ６と命名する。実施例２６：プラスミドｐＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６の構築図２６および２７の図式概説に従い、組換えＤＮＡ技術の標準的方法を用いてｐＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６を構築する。ｅｒｙＡＴ２ドメインにつき特異的な遺伝子置換ベクターを作成するために、ｅｒｙＡＴ２にすぐ隣接する２つのＤＮＡ領域をクローン化し、ＮｉｄＡＴ６ドメインをコードするＤＮＡに隣接して位置させて、相同組換えが起こることを可能とする。フランキング領域、ｐＣＡ５／ＡＴ２−ｆｌａｎｋを含有する中間プラスミドを構築するためのストラテジーおよびプロトコルは実施例６および図１１に記載する。ｐＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６の構築における最終工程は、ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩ末端を有する１ｋｂのＮｉｄＡＴ６−コーディングＤＮＡ断片を、同一酵素で切断したｐＣＳ５／ＡＴ２−ｆｌａｎｋ（実施例６）に連結して、遺伝子置換／組込プラスミドｐＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６を得ることである（図２７）。全ての連結混合物を中間宿主Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し、クローンを選択し、前記したごとくに特徴付ける。実施例２７：Ｓａｃ．ｅｒｖｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ＨｉｄＡＴ６の構築Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０のエリスロマイシンＰＫＳのモジュール２のメチルマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ＥｒｙＡＴ２）をコードするＤＮＡ断片を、Ｓ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１からのヒドロキシマロニルアシルトランスフェラーゼドメシン（ＮｉｄＡＴ６）をコードするＤＮＡ断片で置き換えることによって、１０−デスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡおよび１２−デオキシ−１０−デスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡ産生微生物を調製する。これは、実施例２６に記載された組換えプラスミドｐＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６で達成される。ＥＲ７２０の形質転換および安定溶解体の選択および確認は実質的に実施例４に記載されたごとくに行う。次いで、チオストレプトン感受性コロニーを選択し、これらは、前記した条件を用いるサザンハイブリダイゼーションによって、ＮｉｄＡＴ６によって置き換えられたＥｒｙＡＴ２を有することが確認される。該株はＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６と命名される。実施例２８：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６によって産生された化合物の分析その構築が実施例２７に記載された組換えＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株、ＥＲ７２０ＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６によって産生された化合物をＴＬＣ、バイオアッセイ、および質量分析によって特徴付ける。ＴＬＣ分析では、細胞をＳＧＧＰまたはＳＣＭいずれか中で３０℃にて４−５日間増殖させる。培養物を実質的に実施例５に記載ごとくにＴＬＣ用に加工する。１０−デスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡおよび１２−デオキシ−１０−デスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡであると予測される２つの新規化合物はエリスロマイシンＡよりもわずかに遅く泳動する青色スポットとして出現すると予測される。ＴＬＣで観察される新規スポットが予測された１０−デスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡおよび１２−デオキシ−１０−デスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡに対応する分子量を有するか否かを判断するために、残りの抽出物をさらに質量分析によって分析する。２つの新規化合物は７３６および７２０の質量を有すると予測され、これは、各々、１０−デスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡおよび１２−デオキシ−１０−デスメチル− １０−ヒドロキシエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する。実施例２９：プラスミドｐＥｒｙＡＴ／ＮｉｄＡＴ６の構築ｐＥｒｙＡＴ／ＮｉｄＡＴ６は、図２８および２９の図式概説に従って組換えＤＮＡ技術の標準的方法を用いて構築した。ｅｒｙＡＴドメインにつき特異的な遺伝子−置換ベクターを構築するために、ｅｒｙＡＴ−コーディングＤＮＡにすぐに隣接する２つのＤＮＡ領域をクローン化し、ＮｉｄＡＴ６をコードするＤＮＡに隣接して位置させた（実施例２５）。ｅｒｙＡＴの５’および３’境界をヌクレオチド９０２および１９０８と命名し、これは寄託されたｅｒｙＡＩ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６３６７６）に対応する。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体からのｅｒｙＡＴドメインコーディング領域の上流のＤＮＡ断片をサブクローンするために、ＥｃｏＲＩ部位が該領域の５’末端に付加され、かつＡｖｒＩＩ−ＢａｍＨＩ制限部位が３’ 末端に導入されるように２つのＰＣＲオリゴヌクレオチド（配列番号：３５および配列番号：３６）を設計した。実施例２に記載した条件下、プラスミドｐＡＩＥＮ２２ＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲによって５’−フランキング領域（約１．２ｋｂ）を生成させた。ＰＣＲ産物をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位にサブクローンし、製造業者の指示に従って連結したＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に形質転換した。１５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μＬの青色／白色選択用のＸ−ｇａｌの２％溶液を含有するＬＢプレート上でクローンを選択した。クローンは制限分析によって確認し、インサートの忠実度はＤＮＡ配列決定によって確認した。得られた構築体をｐＵＣ１８／ＡＴ／５’−ｆｌａｎｋと命名した。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ染色体からのｅｒｙＡＴの３’ −フランキング領域をサブクローンするために、ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩ制限部位を該領域の５’末端に導入し、ＨｉｎｄｌｌＩ制限部位を３’末端に付加するように、２つのＰＣＲオリゴヌクレオチド（配列番号：３７および配列番号：３８）を設計した。また、前記したごとく鋳型としてｐＡＩＥＮ２２を用いるＰＣＲによって、３’−フランキング領域（約１．２ｋｂ）も生成させた。ＰＣＲ断片をｐＵＣ１８のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローンし、連結したＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに前記したごとくに形質転換した。１５０μ ｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０μＬの青色／白色選択用のＸ−ｇａｌの２％溶液を含有するＬＢプレート上でクローンを選択した。クローンは制限分析によって確認し、インサートの忠実度はＤＮＡ配列決定によって確認した。この中間構築体をｐＵＣ１８／ＡＴ／３’−ｆｌａｎｋと命名した（図２８）。ｐＵＣ１８／ＡＴ／３’−ｆｌａｎｋから１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ５’−フランキング断片を単離し、同一酵素で切断したプラスミドｐＣＳ５にサブクローンし、ｐＣＳ５／ＡＴ／５’−ｆｌａｎｋを得た。ｐＵＣ１８／ＡＴ／３’−ｆｌａｎｋから１．２ｋｂのＢａｍＨＴおよびＨｉｎｄＩＩＩ３’−フランキング断片を単離し、次いで、同一酵素で切断したｐＣＳ５／ＡＴ／５’−ｆｌａｎｋベクターにクローン化し、ｐＣＳ５／Ａ−ｆｌａｎｋを得た。ｐＥｒｙＡＴ／ＮｉｄＡＴ６の構築における最終工程は、ｐＵＣ１８／ＮｉｄＡＴ６（実施例２５）から単離したＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩ末端を有する１ｋｂのＮｉｄＡＴ６断片を、同一酵素で切断したｐＣＳ５／ＡＴ−ｆｌａｎｋに連結して、遺伝子置換／組込プラスミドｐＥｒｙＡＴ／ＮｉｄＡＴ６を得ることであった（図２９）。全ての連結混合物を中間宿主Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し、クローンを前記したごとくに選択した。実施例３０：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＨＡＴＳの構築開始ユニットプロピオニルＣｏＡのロードを指令するＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０のエリスロマイシンＰＫＳのアミノ末端の第１ＡＴにおけるアシルトランスフェラーゼドメイン（ＥｒｙＡＴ）をコードするＤＮＡ断片を、Ｓ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１のニッダマイシンＰＫＳの第６モジュールからのヒドロキシマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ＮｉｄＡＴ６）をコードするＤＮＡで置き換えることによって、１４−ヒドロキシエリスロマイシンＡ産生微生物を調製した。これは、実施例２９に記載されたごとくに調製した組換えプラスミドｐＥｒｙＡＴ／ＮｉｄＡＴ６で達成した。ＥＲ７２０の形質転換および安定分離体の選択および確認は実質的に実施例４に記載されたごとくに行った。チオストレプトン−感受性コロニーから単離したＤＮＡを、前記したストリンジェンシー条件を用いるサザンハイブリダイゼーションで使用して、ＮｉｄＡＴ６によって置き換えられたＥｒｙＡＴドメインを有するクローンを同定した。このような置換を担持する株をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＨＡＴＳと命名した。実施例３１：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＨＡＴＳによって産生された化合物の分析０．５％グリシンを補足した３０ｍＬのＤＯＭ培地（蒸留水１リットル中に１５．０ｇ可溶性澱粉、２２．０ｇ大豆粉、２．０ｇＣａＣＯ₃、１．５ｇ醸造酵母、１．０ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、５０ｍＬ大豆油）中でＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＨＡＴＳを３０℃で７日間増殖させ、次いで、診療遠心機中で１０分間遠心して細胞を除去した。上清をもう１つの管に取り出し、ＮＨ₄ＯＨの添加によってｐＨを９．０に調整した。上清を１５．０ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、下方有機相をプールし、乾燥した。残渣をヘプタン：メタノール：０．０５ＭＫＨ₂ＰＯ₄の１０：１０：１混合液中に分配し、下方のメタノール／０．０５ＭＫＨ₂ＰＯ₄層を収集した。新鮮な１０：１メタノール／０．０５ＭＫＨ₂ＰＯ₄混合物をヘプタン相に添加し、再度分配した。メタノール／０．０５ＭＫＨ₂ＰＯ₄相をプールし、乾燥して、メタノールを除去し、残存する水性相を０．０５ＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８でｐＨ８に調整した。次いで、これを１／２容量のジクロロメタンで２回抽出し、下方の有機相をプールし、次いで、乾燥した。残渣を３０μＬの酢酸エチルに採り、実質的に実施例５に記載されているごとくにＴＬＣを行った。エリスロマイシンＡであると予測される化合物は、やはり青色で出現するがエリスロマイシンＡスポットのわずかに下方で泳動する１４−ヒドロキシエリスロマイシンＡであると予測される化合物と共に、青色スポットとして検出された。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＨＡＴＳによって産生された化合物の質量を測定するために、抽出物の前記試料１６μＬを質量分析によって分析した。分析は、エリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する質量７３４を持つ化合物、ならびに１４−ヒドロキシエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に合致する質量７３６を持つ化合物を同定した。実施例３２：プラスミドｐＥｒｙＭ１／ＮｉｄＡＴ６の構築図９および３０の図式概説に従って組換えＤＮＡ技術の標準的方法を用いてｐＥｒｙＭ１／ＮｉｄＡＴ６を構築した。ｅｒｙＡＴ１ドメインにつき特異的な遺伝子置換ベクターを構築するために、ｅｒｙＡＴ１コーディングＤＮＡにすぐに隣接する２つのＤＮＡ領域をクローン化し、ＮｉｄＡＴ６ドメインをコードするＤＮＡに隣接して位置させて、相同組換えが起こることを可能とした。ｅｒｙＡＴ１フランキング領域、ｐＣＳ５／ＡＴ１−ｆｌａｎｋを含有する中間プラスミドの構築のためのストラテジーおよびプロトコルは実施例２および図９に記載されている。ｐＥｒｙＭ１／ｎｉｄＡＴ６の構築における最終工程は、まず、ｐＵＣ１８／ＮｉｄＡＴ６（実施例２５）をＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩで消化し、次いで、生成した１ｋｂのＮｉｄＡＴ６断片を同一酵素で切断したｐＣＳ５／ＡＴ１−ｆｌａｎｋに連結して遺伝子置換／組込プラスミドｐＥｒｙＭ１／ＮｉｄＡＴ６を得ることであった（図３０）。全ての連結混合物を中間宿主Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換し、クローンを選択し、前記したごとくに特徴付けした。実施例３３：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＨＡＴ１の構築Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０のエリスロマイシンＰＫＳのモジュール１のメチルマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ＥｒｙＡＴ１）をコードするＤＮＡ断片を、Ｓ．ｃａｅｌｅｓｔｉｓＮＲＲＬ−２８２１からのヒドロキシマロニルアシルトランスフェラーゼドメイン（ＮｉｄＡＴ６）をコードするＤＮＡ断片で置き換えることによって、６−デオキシ−１２−デスメチル −１２−エピエリスロマイシンＡ−および１２−デスメチル−１２−エピエリスロマイシンＡ−産生微生物を調製した。これは、実施例３２に記載されているごとてにくに調製した組換えプラスミドｐＥｒｙＭ１／ＮｉｄＡＴ６で達成された。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０の形質転換および安定分離体の選択および確認は実質的に実施例４に記載されているごとくに行った。チオストレプトン感受性コロニーから単離したＤＮＡを、前記したストリンジェンシー条件下を用いるサザンハイブリダイゼーションで使用して、ＮｉｄＡＴ６によって置き換えられたＥｒｙＡＴドメインを有するクローンを同定した。このような置換を担持する該株をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＨＡＴ１と命名した。実施例３４：Ｓａｃ．ｅｒｖｔｈｒａｅａＨＡＴ１によって産生された化合物の分析増殖用培地に応じて、異なる化合物をＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＨＡＴ１（実施例３３）によって産生させた。１つの例において、１０ｍＭグリセロールを補足した５０ｍＬのＳＣＭ培地（蒸留水１リットル当たり２０ｇのＳｏｙｔｏｎｅ、１５ｇの可溶性澱粉、１０．５ｇのＭＯＰＳ、１．５ｇの酵母エキスおよび０．１ｇのＣａＣｌ₂）中で、培養を３０℃にて５日間増殖させた。次いで、培養物を実質的に実施例５に記載されているごとくにＴＬＣ分析用に加工した。エリスロマイシンＡの領域中で泳動する青色スポットとして出現する化合物を検出した。１６μＬの抽出物の試料の質量分析は、エリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する質量７３４を持つ化合物、ならびに６−デオキシ−１２−デスメチル−１２−エピエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に合致する質量７０４を持つ化合物を同定した。第２の実験において、５０ｍＬの以下の培地：蒸留水１リットル当たり１５ｇのコーンスターチ、２０ｇの大豆粉、１．５ｇの乾燥醸造酵母、１０ｇの大豆油、１ｇのＣａＣＯ₃、０．５ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１５ｇのＦｅＳＯ₄および１ｇのピルビン酸ナトリウム中、Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＨＡＴＳ１を３０℃で４日間増殖させた。増殖後、培養物を前記したごとくにＴＬＣ用に加工した。エリスロマイシンＡの領域中で泳動する青色スポットとして出現する化合物を検出した。少量の抽出物試料の質量分析は、１２− デスメチル−１２−エピエリスロマイシンＡの分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺ ）に合致する質量７２０を持つ化合物を同定した。実施例３５：ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３からの断片を含有するｒａｐリガーゼ−ＰＫＳのクローニング実施例１に記載されたＰＣＲ条件およびプライマー配列番号：３９および配列番号：４０を用い、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３から調製したゲノムＤＮＡからのＰＣＲによって、ｒａｐＰ遺伝子（Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２，７８３９−７８４３［１９９５］）のセクメントをコードする０．８ｋｂ断片を増幅した。得られた０．８ｋｂＤＮＡ断片を、ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡ標識システム（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用い³²Ｐで標識し、以下のようにしてｒａｐＰおよび隣接ＤＮＡを含有するコスミドを単離するためのプローブとして用いた：ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３ゲノムＤＮＡのライブラリー（実施例１）をＬＢ寒天プレートに形質転換してほぼ３，０００コロニー／プレートを得た。一晩の増殖の後、コロニーをプレートからＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ，ＴＬ）に移し、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前掲）に概説されている手順に従って標識ｒａｐＰＤＭＡセグメントでプローブした。ハイブリダイゼーションは６５℃で行い、ストリンジェンシー洗浄は６５℃にて０．１×ＳＳＣで行った。１１の陽性コスミドクローンを制限およびＰＣＲ分析用に拾った。５つのコスミドが、ｒａｐＰ遺伝子ならびにラパマイシンＯＫＳの一部をコードするｒａｐＡ遺伝子のセグメントを含有する隣接ＤＮＡを共に含有すると同定された。ｒａｐＡ遺伝子の５’末端は、ラパマイシン生合成の開始に必要な以後「ラプリガーゼ」と呼ぶ機能をコードしている。コスミドのうち１つが、ラプリガーゼおよび遺伝子置換用のＤＮＡ源ＰＫＳドメインを含有するＤＮＡを構築するためのＰＣＲおよびサブクローニング用ＤＮＡ源として選択された。実施例３６：プラスミドＯＳＬ１１８０／ラプリガーゼ３．０の構築ラパマイシンの生合成は、開始剤としてジヒドロシクロヘキシルー部位を使用するラプリガーゼによって開始される。ラプリガーゼドメインに隣接して、エノイルレダタターセ活性を含有することが提案されているＥＲＳと命名されるドメインがある。図３１に概説されているごとく、組換えＤＮＡ技術の標準的方法を用い、ラプリガーゼおよびＥＲＳをコードするｒａｐＡの３．０ｋｂセグメントをプラスミドｐＳＬ１１８０（Ｂｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，ＤＮＡ８，７５９，１９８９）に挿入して、プラスミドｐＳＬ１１８０／ラプリガーゼ３．０を得た。ラプリガーゼ−ＥＲＳ−含有セグメントはエリスロマイシンＰＫＳの開始セグメントを置き換えるのに使用されるべきであり、それにより、引き続いてのカセットクローニングを容易とするための、各々、３．０ｋｂ断片の５−’および３’−における２つのユニーク制限部位ＡｖｒＩＩおよびＮｓｉＩの置換が必要であったので、図３１に示した一連のクローニング工程を介してラプリカーゼおよびｒａｐＥＲＳを含有する３．Ｏｋｂ断片を組み立てる必要があった。（ａ）ｐＳＬ１１８０／０．１１の構築ＰＣＲプライマー配列番号：４１および配列番号：４２を用いて、ＤＮＡ鋳型としてコスミド＃２（実施例３５）を用い、ラプリガーゼドメインの０．１１ｋｂのＮ−末端断片を増幅した。プライマー配列番号：４２を設計して、ラプリガーゼドメインをコードする配列の上流のＡｖｒＩＩ部位を含有させた（図３１）。ＰＣＲ反応、サイクリング条件および所望の断片の単離は実施例１に記載されたものであった。次いで、ＰＣＲ産物をｐＳＬ１１８０のＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ部位にクローン化してｐＳＬ１１８０／０．１１（図３１）が得られ、配列忠実度はヌクレオチド配列決定によって確認した。（ｂ）ｐＬＳ１１８０／０．７７の構築ＰＣＲプライマー配列番号：４３および配列番号：４４を用いて、直前に記載した条件を使用し、ＤＮＡ鋳型としてコスミド＃２（実施例３５）を用い、ｒａｐＥＲＳドメインの０．７７ｋｂのＣ−末端を増幅した。ＥＲＳドメインからすぐに上流にＮｓｉＩ部位を有するようにプライマー配列番号：４４を設計した。次いで、ＰＣＲ産物をｐＳＬ１１８０のＸｈｏＩ／ＨｎｉｄＩＩＩ部位にクローン化してｐＳＬ１１８０／０．７７（図３１）が得られた。配列忠実度はヌクレオチド配列決定によって確認した。（ｃ）ｐＳＬ１１８０／０．１１／２．１の構築コスミド＃２（実施例３５）から２．１ｋｂのＳｐｈＩ／ＸｈｏＩ制限断片を単離し、ｐＳＬ１１８０／０．１１のＳｐｈＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローンしてｐＳＬ１１８０／０．１１／２．１を得た（図３１）。（ｄ）ｐＳＬ１１８０／ラプリガーゼ３．０の構築ｐＳＬ１１８０／０．７７から０．７７ｋｂのＸｈｏＩ／ＨｎｉｄＩＩＩ断片を単離し、ｐＳＬ１１８０／０．１１／２．１のＸｈｏＩ／ＨｎｉｄＩＩＩ部位にサブクローンしてプラスミドｐＳＬ１１８０／ラプリガーゼ３．０（図３１）を得た。実施例３７：プラスミドｐＥｒｙＡＴ／ラプリガーゼ３．０の構築図３２の図式概説に従って組換えＤＮＡ技術の標準的な方法を用いてプラスミドｐＥｒｙＡ／ラプリガーゼ３．０を構築した。ｅｒｙＡＴフランキング領域、ｐＣＳ５／ＡＴ−ｆｌａｎｋを含有するプラスミドカセットを実施例２９に記載したごとくに構築した。図３２に概説したごとくに、プラスミドｐＳＬ１１８０／ラプリガーゼ３．０（実施例３５）から単離された３．０ｋｂのＡｖｒＩＩ／ＮｓｉＩ断片をｐＣＳ５／ＡＴ−ｆｌａｎｋの同部位にサブクローンして、遺伝子置換／組込プラスミドｐＥｒｙＡＴ／ラプリガーゼ３．０（図３２）を得た。実施例３８：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥｒｙＡＴ／ラプリガーゼ３．０の構築Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０のエリスロマイシンＰＫＳのアミノ末端におけるアシルトランスフェラーゼドメイン（ＥｒｙＡＴ）をコードするＤＮＡ断片を、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡＴＣＣ２９２５３からのラプリガーセ−ｒａｐＥＲＳドメインをコードするＤＮＡ断片（実施例３５）で置き換えることによって、１３−デスメチル−１３（３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡ産生微生物の例を調製した。これは、実施例３７に記載ごとくに調製した組換えプラスミド、ｐＥｒｙＡＴ／ラプリガーゼ３．０で達成された。Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥＲ７２０の形質転換および安定溶解体の選択および確認は実施例４に記載されたごとく行った。４つのチオストレプトン感受性コロニーを選択し、それらのう１つがサザンハイブリダイゼーションによってラプリガーゼ−ｒａｐＥＲＳによって置き換えられたＥｒｙＡＴを有することが確認された。該株はＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥｒｙＡＴ／ラプリガーゼ３．０と命名された。実施例３９：Ｓａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥｒｙＡＴ／ラプリガーゼによって産生された化合物の分析その構築を実施例３８に記載したＳａｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａＥｒｙＡＴ／ラプリガーゼ５０ｍＬの３．０をＳＣＭ培地（実施例３４）中、３０℃で２日間増殖させ、次いで、１ｍＬの３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルカルボン酸をさらに３日間毎日補足した。次いで、培養物を実質的に実施例５に記載されたごとくＴＬＣ用に加工した。１３−デスエチル−１３（３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡであると予測される新規化合物はエリスロマイシンＡよりもわずかに遅く泳動する青色スポットとして出現した。生物学的活性を検出するために、２０μＬの抽出された試料を用いる以外は実質的に実施例５に記載されたごとくにＴＬＣ−バイオオートグラフィーアッセイを行った。陽性対照のように、阻止の小さなゾーンが試料スポットの周りに発生し、これは新規化合物が生物活性を有することを示す。ＴＬＣで観察された新規スポットが予測１３−デスエチル−１３（３’，４’ −ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡに対応する分子量を有するか否かを判断するために、少量の酢酸エチル抽出物試料をさらに質量分析によって分析した。質量分析は、新規化合物が８２０の質量を有することを明らかとし、これは１３−デスエチル−１３（３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡの予測分子イオン＋プロトン（Ｍ＋Ｈ⁺）に対応する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/08 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/08 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者スタツシー，ダイアン・エルアメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハイランド・パーク、エルムウツド・ドライブ・1883 (72)発明者サマーズ，リチヤード・ジイ，ジユニアアメリカ合衆国、ウイスコンシン・54911、アツプルトン、イースト・ハリス・117 (72)発明者ルーアン，シヤオアンアメリカ合衆国、イリノイ・60044、レイク・ブラフ、ノース・エンビロン・サークル・29734 (72)発明者ペレダ―ロペス，アナアメリカ合衆国、イリノイ・60060、マンデレイン、コンコルド・サークル・1033 (72)発明者カカフアス，ステイーブン・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60089、バツフアロー・グローブ、ジヨンソン・ドライブ・1441、アパートメント・ナンバー・ 1122

Claims

【特許請求の範囲】１．式：［式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ６は独立してＱから選択され、ここに、Ｑは（ａ）−Ｈ、（ｂ）−Ｍｅ、（ｃ）−Ｅｔおよび（ｄ）−ＯＨよりなる群から選択され；Ｒ₇は−Ｅｔ、−ＨＯＭｅ（ヒドロキシメチル）および３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルメチルよりなる群から選択され；Ｌ₁およびＬ₂は独立して−Ｈまたは−ＯＨ；Ｌ₃はＤ−デスオサミンまたは−ＯＨ；およびＬ₄はＬ−ミカロース、Ｌ−クラジノースまたは−ＯＨである；但し、Ｒ₇が−ＥｔであってＲ₁−Ｒ₅が−Ｍｅである場合、Ｒ₆は−Ｈまたは− Ｍｅ以外である］で示される化合物。２．Ｑが（ａ）、（ｂ）および（ｃ）よりなる群から選択され、Ｒ₇が−Ｅｔであって、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄が前記定義のものである請求項１記載の化合物。３．Ｑが（ａ）、（ｂ）および（ｄ）よりなる群から選択され、Ｒ₇が−Ｅｔであって、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄が前記定義のものである請求項１記載の化合物。４．Ｑが（ａ）、（ｃ）および（ｄ）よりなる群から選択され、Ｒ₇が−Ｅｔであって、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄が前記定義のものである請求項１記載の化合物。５．Ｑが（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）よりなる群から選択され、Ｒ₇が−Ｅｔであって、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄が前記定義のものである請求項１記載の化合物。６．（ａ）Ｒ₆およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｂ）Ｒ₅およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｃ）Ｒ₄およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｄ）Ｒ₆およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｅ）Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｆ）Ｒ₆およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｇ）Ｒ₅およびＲ₂がＨであって、Ｒ₁、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｈ）Ｒ₄およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₃、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｉ）Ｒ₃およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｊ）Ｒ₆およびＲ₃が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｋ）Ｒ₅およびＲ₃が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｌ）Ｒ₄およびＲ₃が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｍ）Ｒ₆およびＲ₄が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｎ）Ｒ₅およびＲ₄が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₆が−Ｍｅであり、または（ｏ）Ｒ₆およびＲ₅が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄が−Ｍｅであり；Ｒ₇が−Ｅｔであり；およびＬ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄が前記定義のものである請求項１記載の化合物。７．（ａ）−（ｏ）およびＲ₇が前記定義のものであり、Ｌ₁およびＬ₂が−ＯＨであり、Ｌ₃がＤ−デスオサミンであってＬ₄がＬ−クラジノースである請求項６記載の化合物。８．（ａ）Ｒ₆、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｂ）Ｒ₅、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｃ）Ｒ₄、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₃、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｄ）Ｒ₃、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｅ）Ｒ₆、Ｒ₃およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂、Ｒ₄およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｆ）Ｒ₅、Ｒ₃およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂、Ｒ₄およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｇ）Ｒ₄、Ｒ₃およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｈ）Ｒ₆、Ｒ₄およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｉ）Ｒ₅、Ｒ₄およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｊ）Ｒ₆、Ｒ₅およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄が−Ｍｅであり、（ｋ）Ｒ₆、Ｒ₃およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₄およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｌ）Ｒ₅、Ｒ₃およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₄およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｍ）Ｒ₄、Ｒ₃およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｎ）Ｒ₆、Ｒ₄およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｏ）Ｒ₅、Ｒ₄およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｐ）Ｒ₆、Ｒ₅およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₄が−Ｍｅであり、（ｑ）Ｒ₆、Ｒ₄およびＲ₃が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｒ）Ｒ₅、Ｒ₄およびＲ₃が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｓ）Ｒ₆、Ｒ₅およびＲ₃が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₄が−Ｍｅであり、または（ｔ）Ｒ₆、Ｒ₅およびＲ₄が−Ｈであって、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃が−Ｍｅであり；Ｒ₇が−Ｅｔであって、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄が前記定義のものである請求項１記載の化合物。９．（ａ）−（ｔ）およびＲ₇が前記定義のものであり、Ｌ₁およびＬ₂が−ＯＨであり、Ｌ₃がＤ−デスオサミンであってＬ₄がＬ−クラジノースである請求項８記載の化合物。１０．（ａ）Ｒ₆、Ｒ₃、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₅およびＲ₄が−Ｍｅであり、（ｂ）Ｒ₅、Ｒ₃、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₆およびＲ₄が−Ｍｅであり、（ｃ）Ｒ₄、Ｒ₃、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｄ）Ｒ₆、Ｒ₄、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₃およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｅ）Ｒ₅、Ｒ₄、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₃およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｆ）Ｒ₆、Ｒ₅、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₃およびＲ₄が−Ｍｅであり、（ｇ）Ｒ₆、Ｒ₄、Ｒ₃およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｈ）Ｒ₅、Ｒ₄、Ｒ₃およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｉ）Ｒ₆、Ｒ₅、Ｒ₄およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂およびＲ₃が−Ｍｅであり、（ｊ）Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₃およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｋ）Ｒ₆、Ｒ₄、Ｒ₃およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁およびＲ₅が−Ｍｅであり、（ｌ）Ｒ₅、Ｒ₄、Ｒ₃およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁およびＲ₆が−Ｍｅであり、（ｍ）Ｒ₆、Ｒ₅、Ｒ₃およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁およびＲ₄が−Ｍｅであり、または（ｎ）Ｒ₆、Ｒ₅、Ｒ₄およびＲ₃が−Ｈであって、Ｒ₁およびＲ₂が−Ｍｅであり；Ｒ₇が−Ｅｔであって、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄が前記定義のものである請求項１記載の化合物。１１．（ａ）−（ｎ）およびＲ₇が前記定義のものであって、Ｌ₁およびＬ₂が− ＯＨであり、Ｌ₃がＤ−デスオサミンであって、Ｌ₄がＬ−クラジノースである請求項１０記載の化合物。１２．（ａ）Ｒ₅、、Ｒ₄、Ｒ₃、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₆が−Ｍｅであり、（ｂ）Ｒ₆、Ｒ₄、Ｒ₃、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₅が−Ｍｅであり、（ｃ）Ｒ₆、Ｒ₅、Ｒ₃、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₄が−Ｍｅであり、（ｄ）Ｒ₆、Ｒ₅、Ｒ₄、Ｒ₂およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₃が−Ｍｅであり、（ｅ）Ｒ₆、Ｒ₅、Ｒ₄、Ｒ₃およびＲ₁が−Ｈであって、Ｒ₂が−Ｍｅであり、（ｆ）Ｒ₆、Ｒ₅、Ｒ₄、Ｒ₃およびＲ₂が−Ｈであって、Ｒ₁が−Ｍｅであり；Ｒ₇が−Ｅｔであって、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃およびＬ₄が前記定義のものである請求項１記載の化合物。１３．（ａ）−（ｆ）およびＲ７が前記定義のものであり、Ｌ₁およびＬ₂が−ＯＨであり、Ｌ₃がＤ−デスオサミンであって、Ｌ₄がＬ−クラジノースである請求項１２記載の化合物。１４．Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅およびＲ₆が−Ｈであって、Ｒ₇、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃ およびＬ₄が前記定義のものである請求項１記載の化合物。１５．Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆およびＲ₇が前記定義のものであり、Ｌ₁およびＬ₂が−ＯＨであり、Ｌ₃がＤ−デスオサミンであって、Ｌ₄がＬ−クラジノースである請求項１４記載の化合物。１６．６，１０−ジデスメチル−６−エチルエリスロマイシンＡ；１０，１２− ジデスメチル−１２−デオキシ−１２−エチルエリスロマイシンＡ；１０，１２ −ジデスメチル−１２−デオキシ−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡ；６，１０，１２−トリデスメチル−６，１２−ジエチルエリスロマイシンＡNおよび６，１０，１２−トリデスメチル−６−デオキシ−６，１２−ジエチルエリスロマイシンＡよりなる群から選択される請求項１記載の化合物。１７．１０−デスメチルエリスロノリドＢ、１０−デスメチル−６−デオキシエリスロノリドＢ、１２−デスメチルエリスロノリドＢ、１２−デスメチル−６− デオキシエリスロノリドＢ、１２−デスメチル−１２−エチルエリスロノリドＢ、６−デスメチル−６−デオキシ−６−エチルエリスロノリドＢ、１０−デスメチルエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ、１２−デスメチルエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ、６−デスメチル−６−エチルエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−１２−エチルエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−１２−デオキシ−１２−エチルエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−１２−エピヒドロキシエリスロマイシンＡ、１０，１２−ジデスメチルエリスロマイシンＡ、１０，１２−ジデスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡおよび１０，１２−ジデスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡよりなる群から選択される請求項１記載の化合物。１８．１０−デスメチルエリスロノリドＢ、１０−デスメチル−６−デオキシエリスロノリドＢ、１２−デスメチルエリスロノリドＢ、１２−デスメチル−６− デオキシエリスロノリドＢ、１０−デスメチルエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、１０−デスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡ、１２−デスメチルエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡ、１２−デスメチル−６，１２− ジデオキシエリスロマイシンＡ、１０，１２−ジデスメチルエリスロマイシンＡ、１０，１２−ジデスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡおよび１０，１２−ジデスメチル−６，１２−ジデオキシエリスロマイシンＡよりなる群から選択される請求項１記載の化合物。１９．１０−デスメチルエリスロマイシンＡ、１０−デスメトル−１２−デオキシエリスロマイシンＡおよび１２−デスメチル−１２−デオキシエリスロマイシンＡよりなる群から選択される化合物。２０．８−デスメチル−８−ヒドロキシエリスロマイシンＡ、６−デスメチル− ６−エピエリスロマイシンＡ、４−デスメチル−４−ヒドロキシエリスロマイシンＡ、２−デスメチル−２−ヒドロキシエリスロマイシンＡおよび１３−デスエチル−１３−ヒドロキシメトールエリスロマイシンＡよりなる群から選択される請求項１記載の化合物。２１．２，１２−ジデスメチル−２，１２−ジヒドロキシエリスロマイシン、４，１０−ジデスメチル−４，１０−ジヒドロキシエリスロマイシン、１０，１２ −ジデスメチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシン、および６，１０−ジデスメチル−６−エチル−１０−ヒドロキシエリスロマイシンＡよりなる群から選択される請求項１記載の化合物。２２．１３−デスエチル−１３−（３’，４’−ジヒドロキシシクロヘキシル）メチルエリスロマイシンＡである請求項１記載の化合物。２３．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅ１ａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓよりなる群から選択されるポリケチド−産生微生物からの酵素的に活性なアシルトランスフェラーゼドメインをコードする単離されたポリヌクレオチド配列またはその断片。２４．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択される請求項２３記載のポリヌクレオチド。２５．該アシルトランスフェラーゼドメインが配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４よりなる群から選択される請求項２３記載のポリヌクレオチド。２６．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの酵素的に活性なアシルトランスフェラーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を含むベクター。２７．該ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｅｌｅｓｔｉｓよりなる群から選択される請求項２６記載のベクター。２８．該ポリヌクレオチドが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：２９および配列番号：３０よりなる群から選択される請求項２６記載のベクター。２９．該アシルトランスフェラーゼドメインが配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４よりなる群から選択される請求項２６記載のベクター。３０．ｐＵＣ１８／ＬｉｇＡＴ２、ｐＥｒｙＡＴ１／ＬｉｇＡＴ２、ｐＥｒｙＡＴ２／ＬｉｇＡＴ２、ｐＵＣ１８／ｖｅｎＡＴ、ｐＥｒｙＡＴ１／ｖｅｎＡＴ、ｐＵＣ１９／ｒａｐＡＴ１４、ｐＥｒｙＡＴ１／ｒａｐＡＴ１４、ｐＥｒｙＡＴ２／ｒａｐＡＴ１４、ｐＵＣ／５’−ｆｌａｎｋ／ｅｔｈＡＴ、ｐＵＣ／ｅｔｈＡＴ／Ｃ−６、ｐＥＡＴ４、ｐＵＣ１８／ＮｉｄＡＴ６、ｐＥｒｙＡＴ２／ＮｉｄＡＴ６、ｐＥｒｙＡＴｓ／ＮｉｄＡＴ６、ｐＥｒｙＡＴｓ／ｒａｐｌｉｇａｓｅ３．０よりなる群から選択されるベクター。３１．請求項３２記載のベクターで形質転換した宿主細胞。３２．該細胞が細菌細胞またはポリケチド−産生微生物である請求項３１記載の宿主細胞。３３．該ポリケチド−産生微生物がＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種よりなる群から選択される請求項３２記載の宿主細胞。３４．該ポリケチド−産生微生物がＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａである請求項３３記載の宿主細胞。３５．（ａ）第１および第２ゲノムＤＮＡセグメントを単離し、各々はポリケチドシンターゼを含み、ここに、該第１ゲノムＤＮＡセグメントは該第１ポリケチド−産生微生物からのものであって、該第２ゲノムＤＮＡセグメントは該第１ポリケチド−産生微生物または第２ポリケチド−産生微生物からのものであり；（ｂ）該第１ゲノムＤＮＡセグメントの１またはそれ以上の異なる断片を同定し、その各々はアシルトランスフェラーゼドメインをコードし；（ｃ）該第２ゲノムＤＮＡセグメントの１またはそれ以上の異なる断片を同定し、その各々は該第１ゲノムＤＮＡセグメントの該アシルトランスフェラーゼドメインに対する関連ドメインをコードし；次いで、（ｄ）該第１ゲノムＤＮＡセグメントからの断片の１またはそれ以上を、工程（ｃ）からの該断片の１またはそれ以上で置き換えることに導く、相同組換え事象の発生に適した条件下で、該第１ポリケチド−産生微生物の細胞を工程（ｃ）からの該断片の１またはそれ以上で形質転換する；工程を含むことを特徴とする第１ポリケチド−産生微生物においてポリケチドシンターゼの基質特異性を改変する方法。３６．該第１ポリケチド−産生微生物がＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａである請求項３５記載の方法。３７．該第２ポリケチド−産生微生物がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである請求項３５記載の方法。３８．該第２ポリケチド−産生微生物がＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａである請求項３５記載の方法。３９．該関連ドメインが配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４よりなる群から選択される請求項３５記載の方法。