JP2003528592A - ナイスタチンポリケチドシンターゼをコードする新規の遺伝子、およびそれらの取扱ならびに用途 - Google Patents

ナイスタチンポリケチドシンターゼをコードする新規の遺伝子、およびそれらの取扱ならびに用途

Info

Publication number
JP2003528592A
JP2003528592A JP2001558462A JP2001558462A JP2003528592A JP 2003528592 A JP2003528592 A JP 2003528592A JP 2001558462 A JP2001558462 A JP 2001558462A JP 2001558462 A JP2001558462 A JP 2001558462A JP 2003528592 A JP2003528592 A JP 2003528592A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
pks
nystatin
nucleic acid
acid molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2001558462A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4902925B2 (ja
JP2003528592A5 (ja
Inventor
ボリソビッチ ゾチェフ，セルゲイ
ニコライブナ セクロヴァ，オルガ
フヤルヴィク，エスペン
ブラウタセット，トライヴェ
ストレム，アーネ，ライダー
ヴァラ，スヴァイン
エリングセン，トロンド，アーリング
スレッタ，ホヴァルド
グリクセン，オレ−マーティン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sinvent AS
Original Assignee
Sinvent AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0002840A external-priority patent/GB0002840D0/en
Priority claimed from GB0008786A external-priority patent/GB0008786D0/en
Priority claimed from GB0009387A external-priority patent/GB0009387D0/en
Application filed by Sinvent AS filed Critical Sinvent AS
Publication of JP2003528592A publication Critical patent/JP2003528592A/ja
Publication of JP2003528592A5 publication Critical patent/JP2003528592A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4902925B2 publication Critical patent/JP4902925B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/08—Hetero rings containing eight or more ring members, e.g. erythromycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、（ａ）SEQ ID No. 35に示されるヌクレオチド配列；または（ｂ）SEQ ID No. 35の相補物であるヌクレオチド配列；または（ｃ）SEQ ID No. 35の縮重物であるヌクレオチド配列；または（ｄ）SEQ ID No. 35に対して高緊縮の条件下でハイブリダイズして、SEQ ID No. 35の相補物、またはSEQ ID No. 35由来のハイブリダイゼーションプローブあるいはその相補物になるヌクレオチド配列；または（ｅ）SEQ ID No. 35と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｆ）SEQ ID No. 35と少なくとも６５％の配列同一性を有し、当該配列が好ましくはナイスタチンＰＫＳ酵素またはその部分をコードするか、またはそれらをコードする配列と相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。さらに、このような分子の部分およびこのような核酸分子によりコードされるポリペプチド（その部分）、およびこのような分子およびポリペプチドのナイスタチン生体合成およびナイスタチン誘導体の合成における用途、およびマクロライド構造としての新規のポリケチドをも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マクロライド抗生物質ナイスタチン（nystatin）の生合成に関連す
る、モジュールポリケチドシンターゼ酵素をコードする遺伝子クラスターのクロ
ーニングおよびシーケンシングに関する。従って、本発明は、ナイスタチン生合
成に関連する機能的活性を示すタンパク質／ポリペプチドをコードする新規な遺
伝子および核酸分子、このような機能的タンパク質／ポリペプチドそのもの、お
よびナイスタチン生合成の促進およびナイスタチン誘導体の合成の双方における
その使用、および新規なポリケチドまたはマクロライド構造物に関する。
【０００２】
【発明の技術的背景】
ポリケチド(polyketide)は微生物により合成される天然産物であり、その多く
は医薬として、または農業用または獣医学用の生成物として使用される可能性が
ある。医学的処置に使用されるポリケチドの例としては、抗生物質エリスロマイ
シン（抗細菌剤）、ナイスタチン（抗真菌剤）、アベルメクチン(avermectin)（
抗寄生虫剤）ラパマイシン(rapamycin)（免疫抑制剤）およびダウノルビシン（
抗腫瘍剤）が挙げられる。グラム陽性菌ストレストマイセス属はポリケチドの主
要な生産者であり、これらの微生物におけるポリケチド生合成の遺伝学および生
化学は、かなりよく特性決定されている (Hopwood ら, Chem. Rev. v. 97: 2465
-2497 (1997))。マクロライドポリケチド化合物は、簡単なカルボン酸をモジュ
ール（Ｉ型）のポリケチドシンターゼ（PKS）と繰り返し縮合させることにより
、脂肪酸の生合成と同様の方法で形成される。Donadio ら, Science, v. 252: 6
75-679 (1991) により提案されたモジュール仮説は、Ｉ型 PKS が反復単位（モ
ジュール）において組織され、その各々はポリケチド鎖合成の１縮合サイクルの
ためであることを示唆した。これは、マクロライドの化学構造の推測可能な変更
をもたらしたＩ型 PKS 遺伝子の操作によって正しいことが証明された。成長ポ
リケチド鎖上への次のカルボン酸の縮合（β-ケトアシルシンターゼ（KS）ドメ
インの触媒活性により確認される）ほかに、Ｉ型 PKS のモジュールはβ-ケトレ
ダクターゼ（KR）、デヒドラターゼ（DH）およびエノイルレダクターゼ（ER）活
性を有するドメインを含有することができ、これは、挿入された延長物単位の還
元状態を決定する。各モジュールに存在するアシルトランスフェラーゼ（AT）お
よびアシルキャリアタンパク質（ACP）ドメインは、それぞれ、 PKS 上の成長ポ
リケチド鎖の延長物単位の選択および保持のためである。合成が完了すると、ポ
リケチド鎖はチオエステラーゼ（TE）の作用により PKS から放出され、これは
最終産物の環化にも関連する。従って、Ｉ型 PKS はポリペプチド生合成の組立
ラインであり、これはモジュールの数、カルボン酸に対するその特異性を変える
ことにより、またドメインを不活性化するかまたはドメインに還元的活性を挿入
することにより、操作することができる (Katz, Chem. Rev., v. 97, 2557-2575
, 1997)。マクロライドのポリケチド部分が合成され、環化されてマクロラクト
ン環が形成された後に、これは、通常ヒドロキシル化、グリコシル化、メチル化
および／またはアシル化により修飾される。これらの修飾はマクロライドの生物
学的活性にとって決定的に重要であると信じられる。
【０００３】 ストレプトマイセス属におけるマクロライド抗生物質生合成のための遺伝子は
クラスターに組織され、このような多数のクラスターが既に同定されている。組
み換え DNA 技術の開発は、 PKS をコードする DNA プローブで遺伝子ライブラ
リーをスクリーニングすることにより、完全な抗生物質生合成遺伝子クラスター
の単離を可能にした (Schwecke ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 92: 7839
-7843, 1995)。分子クローニングおよび完全 DNA シーケンシングは、ストレス
トマイセス属の幾つかのマクロライド抗生物質遺伝子クラスター（アベルメクチ
ン、ピクロマイシンおよびラパマイシンのためのものを含む）について記載され
ている (Ikeda ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 96: 9509-9514 1999; Xue
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 95: 1211-12116, 1998; Schwecke ら, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 92: 7839-7843, 1995)。ポリエンマクロライド
抗生物質ピマリシン (pimaricin) のための遺伝子クラスターの部分的なクロー
ニングおよび DNA シーケンシングが、最近報告された (Aparicio ら, J. Biol.
Chem., v. 274: 10133-10139, 1999)。しかしながら、抗真菌剤活性を有するポ
リエンマクロライド抗生物質の生合成のための遺伝子の完全な DNA 配列は、ま
だ開示されていない。利用可能な抗真菌剤抗生物質のレパートリーを増大するこ
と、および／または現存する薬剤の特性（例えば効力、毒性など）を改善するこ
との必要性および要求が存在する。それ故に、新規な抗真菌剤処置法、特に新規
なまたは改善された特性を示す処置法を提供することは、当技術分野における著
しい進歩を表すであろう。
【０００４】 本発明はこの目的に向けられ、ナイスタチン生合成遺伝子クラスターのクロー
ニングおよび DNA 配列決定にもと付いている。これは、このような抗真菌剤抗
生物質生合成遺伝子の同定の最初の例、ならびにナイスタチンの特性および／ま
たは産生微生物を変更するため、または有用な可能性のある新規化合物を得るた
めの遺伝子操作のツールを提供する。
【０００５】 ポリエン抗真菌剤抗生物質ナイスタチン A1（その完全な立体構造（図１参照
）は Lancelin & Beau, Tetrahedron Lett, v. 30: 4521-4524, (1989) により
決定されている）は、ストレプトマイセス・ヌールセイ (Streptomyces noursei
) ATCC11455 によって産生される。マクロライド化合物のクラスに属するナイス
タチン分子の構造から、本発明者らは、そのポリケチド主鎖がＩ型 PKS 酵素に
より合成されると予想した。この仮定に基づいて、また下記の実施例に記載する
ように、特別に設計されたプローブ（これは、既知モジュール PKS 酵素の既知
β-ケトアシルシンターゼ（KS）およびアシルキャリアタンパク質（ACP）ドメイ
ン内の保存アミノ酸配列に基づくプライマーを用いた PCR で得られる）を使用
して、ストレプトマイセス・ヌールセイ ATCC11455 のゲノムライブラリーをス
クリーニングした。これは多数のクローンおよび断片の同定に導いた。本発明者
らはこれらを配列決定し、これらがナイスタチン PKS 遺伝子クラスターの部分
または一部を含有することを示した。本発明者らはさらに、コードされた産物を
不活性化する断片配列の変化がナイスタチン生合成の廃止に導くことを示し（下
記の実施例１参照）、これによってナイスタチン生合成のための同定された PKS
の必要条件を確認した。クローン／断片に関する後続の研究は、PKS 遺伝子ク
ラスターのシーケンシング、およびその中の異なるモジュールおよび酵素ドメイ
ン、調節領域などの同定に導いた。
【０００６】 さらに、より詳細には以下に記載するように、本発明者らが同定した新規なナ
イスタチン PKS 遺伝子クラスター内の機能的 DNA 配列の操作は、新規な分子構
造物、例えば改善された機能を有するナイスタチン誘導体の合成に導いたことを
本発明者らは示した。これは、有益な新規ナイスタチン誘導体を得るためだけで
なく、生合成産生過程を改善して促進するため（例えば収率または産生条件を改
善するか、または利用可能なホスト細胞の範囲を拡大するため）、または新規な
活性および／または特性を有する新規な化合物を提供するためにも、ナイスタチ
ン A1 PKS 遺伝子クラスターを操作する刺激的な可能性を開く。
【０００７】 より詳細には、ナイスタチン PKS 遺伝子クラスターの２つの主要領域（また
は "部分" または "一部"）を最初に同定して配列決定した。これらは併せて、
ナイスタチン PKS 遺伝子クラスターの約８０％を表した。また、これらの領域
内の機能的配列（例えば PKS 遺伝子、調節領域など、ならびに機能的遺伝子産
物、酵素ドメイン）を同定して特性決定した。
【０００８】 第一領域（"領域１"）（これを "Nys 1" と名付け、その完全 DNA 配列を配列
番号１に示す）は、多数の PKS または関連遺伝子または調節領域を含むことが
示され、１３の別個の "特徴" またはオープンリーディングフレーム（ORF）が
同定された。その翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３〜１５に示す。 第二領域（"領域２"）（これを "Nys 2" と名付け、その完全 DNA 配列を配列
番号２に示す）もまた、多数の "機能的" 領域を含んでおり、５つの別個の "特
徴" または ORF が同定された（その翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ配列番
号１６〜２０に示す）。
【０００９】 Nys 1 および Nys 2（すなわち配列番号１および２、およびこれらがコードす
る配列）は、2000 年２月８日出願の英国特許出願第 0002840.7 号の対象である
。 後続の配列決定の努力は、配列番号１および２の間隙にまたがる DNA の配列
の決定、およびこの領域中の新規な遺伝子の同定に導いた。加えて、配列番号１
および２に含まれており、遺伝子産物 NysI（配列番号２０）および NysDII（配
列番号３）をコードする部分的遺伝子配列（さらには下記参照）を完成した（そ
れぞれ新しい配列番号３６および３７参照 − さらには下記参照）。従って、こ
れらの配列決定の努力は、全ナイスタチン PKS 遺伝子クラスターを含む DNA 領
域の同定および配列決定、およびこの領域内の機能的配列の同定および特性決定
に導いた。
【００１０】 ナイスタチン生合成遺伝子クラスターのための完全コード配列（すなわち、こ
のクラスターをコードする完全ヌクレオチド配列）を、配列番号３５に示す。こ
れは、多数の PKS または関連遺伝子または調節領域を含むことを示し、２３の
別個の "特徴" または ORF が同定された（その翻訳産物のアミノ酸配列をそれ
ぞれ配列番号２〜１９および３６〜４２に示す）。
【００１１】 配列番号３５に示したナイスタチン生合成遺伝子クラスターのための完全コー
ド配列（すなわち、このクラスターをコードする完全ヌクレオチド配列）は、20
00 年４月１０日出願の英国特許出願第 0009387.2 号の対象である。 従って、一つの態様において、本発明は、 (a) 配列番号３５に示すヌクレオチド配列；または (b) 配列番号３５の相補物であるヌクレオチド配列；または (c) 配列番号３５による変性物であるヌクレオチド配列；または (d) 配列番号３５に、配列番号３５の相補物に、または配列番号３５から誘
導したハイブリダイゼーションプローブまたはその相補物に、高ストリンジェン
シー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；または (e) 配列番号３５と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配
列；または (f) 配列番号３５と少なくとも６５％の配列同一性を有するヌクレオチド配
列（この配列は、ナイスタチン PKS 酵素またはその部分をコードする配列をコ
ードするか、またはその配列と相補性であることが好ましい） を含む核酸分子を提供する。
【００１２】 "ナイスタチン PKS 酵素" は以下でさらに定義するが、上記 (f) の部の文脈
で簡単にいうと、マクロライド抗生物質またはポリケチド部分、好ましくはナイ
スタチンまたはナイスタチン誘導体またはナイスタチン関連分子の合成、輸送ま
たは転移において機能的である酵素またはタンパク質またはポリペプチドを意味
する。
【００１３】 もう一つの態様において、本発明はまた、 (a) 配列番号１および／または配列番号２に示すヌクレオチド配列；または (b) 配列番号１および／または配列番号２の相補物であるヌクレオチド配列
；または (c) 配列番号１および／または配列番号２による変性物であるヌクレオチド
配列；または (d) 配列番号１および／または配列番号２に、配列番号１および／または配
列番号２の相補物に、または配列番号１および／または配列番号２から誘導した
ハイブリダイゼーションプローブまたはその相補物に、高ストリンジェンシー条
件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；または (e) 配列番号１および／または配列番号２と少なくとも６５％の配列同一性
を有するヌクレオチド配列（この配列は、ナイスタチン PKS 酵素またはその部
分をコードする配列をコードするか、またはその配列と相補性であることが好ま
しい） を含む核酸分子を提供する。
【００１４】 本発明の核酸分子は、単離された核酸分子（換言すれば、天然に通常一緒に存
在する成分から単離または分離されたもの）であってもよく、または組み換えま
たは合成核酸分子であってもよい。 本発明の核酸分子は、ナイスタチン A1 PKS 酵素を、またはその一部、例えば
単一ドメインをコードする配列をコードするか（またはこの配列をコードするヌ
クレオチド配列を含むか）、または機能的または非機能的遺伝要素であるナイス
タチン A1 PKS 遺伝子クラスター中のヌクレオチド配列を含む。より正確には、
本発明の核酸分子は、１個またはそれ以上のポリペプチドをコードするか、また
はマクロライド抗生物質またはポリケチド部分、好ましくはナイスタチンまたは
ナイスタチン誘導体またはナイスタチン関連分子の合成において機能的活性を有
する１個またはそれ以上の遺伝要素を含む。このような機能的活性は、酵素活性
、例えばポリケチド部分またはマクロライド分子の合成または輸送または転移に
関連する活性であってもよく（これは、マクロライド鎖または環の合成、または
それに寄与する任意の段階、またはマクロライド環またはポリケチド鎖修飾物な
どでありうる）、そして／または調節活性、例えば合成に関連する遺伝子または
タンパク質の発現の調節、または合成過程の調節であってよもよく、そして／ま
たは "トランスポーター活性" であってもよい。従って、一般的には、ポリケチ
ドまたはマクロライド部分の転移または輸送に、例えば細胞内に細胞からの合成
された分子の輸送または流出に関連する輸送タンパク質が含まれる。同様に、こ
れに関しては、グリコシル化タンパク質が含まれ、これらのタンパク質にはサッ
カライド（例えばマイコサミン(mycosamine)）の生合成および／またはマクロラ
イドまたはポリケチドへのその付着に関連する分子が含まれる。
【００１５】 本発明によれば、所望の産物をコードするヌクレオチド配列が好ましいが、プ
ロモーター、プロモーター-オペレーター領域、エンハンサー、他の調節配列な
どのような機能的遺伝要素を含むヌクレオチド配列も包含される。従って、本発
明の核酸分子は、全 PKS 遺伝子クラスターを含む必要はないが、タンパク質ま
たはその部分、例えば特定の機能または調節配列を有するポリペプチドをコード
する部分を含んでいてもよい。これは、１個またはそれ以上の遺伝子、および／
または１個またはそれ以上の調節配列、および／または１個またはそれ以上のモ
ジュールまたは酵素ドメイン、または非コードまたはコード機能的遺伝要素（例
えば遺伝子発現、転写、翻訳などを制御する要素）を含んでいてもよい。
【００１６】 一つの態様において、本発明は、配列番号３５の上記ヌクレオチド配列（また
は上記 (b)〜(f) で定義したような、その変異体）が ORF 1 を含む分子の一部
を含有しない、上記で定義した核酸分子を提供する（以下の表１参照）。換言す
れば、この実施形態において、配列番号３５のヌクレオチド配列は、ヌクレオチ
ド 124026〜125222 を含まない。
【００１７】 別のこのような態様において、本発明は、配列番号３５の上記ヌクレオチド配
列（または上記 (b)〜(f) で定義したような、その変異体）が ORF 2 を含む分
子の一部を含有しない、上記で定義した核酸分子を提供する（以下の表１参照）
。換言すれば、この実施形態において、配列番号３５のヌクレオチド配列は、ヌ
クレオチド 122812〜123876 を含まない。
【００１８】 もう一つのこのような態様において、本発明は、配列番号３５の上記ヌクレオ
チド配列（または上記 (b)〜(f) で定義したような、その変異体）が NysF を含
む分子の一部を含有しない、上記で定義した核酸分子を提供する（以下の表１参
照）。換言すれば、この実施形態において、配列番号３５のヌクレオチド配列は
、ヌクレオチド 454〜1191 を含まない。
【００１９】 その代わりに、本発明は、ORF 1、ORF 2 および／または NysF 遺伝子産物が
単離されるように、ORF 1、ORF 2 および／または NysF の部分、または ORF 1
、ORF 2 および／または NysF の修飾配列を含有する核酸分子を提供する。 配列番号１または２または３５またはその相補物に、またはその部分（すなわ
ち、以下により詳細に論じる、配列番号１または２または３５から誘導したハイ
ブリダイゼーションプローブ）に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイ
ズし、そして好ましくは、ナイスタチン PKS 酵素またはその部分をコードする
配列をコードするかまたはその配列と相補的であるヌクレオチド配列が、本発明
の範囲に含まれる。高ストリンジェンシーの条件は、例えば Sambrook ら, 1989
, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版に記載されたような当分野
でよく知られた技術により、容易に決定することができる。本発明の範囲に含ま
れるハイブリダイズ配列は、非ストリンジェントな条件（室温で 6 x SSC/50%
ホルムアミド）において結合し、高ストリンジェンシーの条件（例えば 0.1 x S
SC、68℃）において洗浄されるものである。ここで、SSC ＝ 0.15 M NaCl、0.01
5 M クエン酸ナトリウム、pH 7.2 である。
【００２０】 ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号１または配列番号２または配列
番号３５の配列（または相補的配列）の部分であってもよく、この部分は、高ス
トリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションが起きるかどうかを決定する
ためのサンプルまたは試験核酸配列にハイブリダイズするように機能するのに充
分な塩基長および組成のものである。従って、このプローブは、少なくとも１５
塩基の長さ、好ましくは少なくとも３０、４０、５０、７５、１００または２０
０塩基の長さである。従って、代表的なプローブ長としては、３０〜５００塩基
、例えば３０〜３００、５０〜２００、５０〜１５０、７５〜１００が挙げられ
る。
【００２１】 ハイブリダイゼーションプローブは、配列（すなわち、配列番号１または２ま
たは３５、またはその相補物）のコードまたは非コードの機能的または非機能的
部分から誘導することができ、例えば遺伝子またはモジュールに、または酵素ド
メインに、またはその部分（例えば活性部位をコードする部分）に、または酵素
ドメインまたはモジュールを連結する配列に対応している。従って、ハイブリダ
イゼーションプローブは、上記で定義したようにポリケチド／マクロライド合成
において機能的活性を有することができる。
【００２２】 ヌクレオチド配列同一性は、ウィスコンシン大学からの Genetics Computer G
roups (GCG) Version 10 Software パッケージの BestFit プログラムを用いて
決定することができる。このプログラムには、デホールト値：ギャップ生成ペナ
ルティー ＝ ５０、ギャップ延長ペナルティー ＝ ３、平均マッチ ＝ 10,000、
平均ミスマッチ ＝ -9.000 を用いる Smith および Waterman の局部相同性演算
法が使用される。
【００２３】 本発明に係るヌクレオチド配列は、配列番号１または２または３５と少なくと
も６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性
を示すことができ、好ましくは、ナイスタチン PKS 酵素またはその部分をコー
ドする配列をコードするか、またはその配列と相補的である。本明細書で定義し
た％配列同一性基準を満たすヌクレオチド配列は、"実質的に同一な" 配列と考
えることができる。
【００２４】 従って、配列番号１および／または２を参照して本発明の核酸分子を定義する
場合、本発明の核酸分子は、配列番号１または "配列番号１-変異体" 配列（す
なわち、配列番号１と相補的または変性した配列、または上記で定義したハイブ
リダイズ配列または実質的に同一の配列のような機能的に等価な変異体）、また
は配列番号２または "配列番号２-変異体" 配列（すなわち、配列番号２と相補
的または変性した配列、または上記で定義したハイブリダイズ配列または実質的
に同一の配列のような機能的に等価な変異体）、またはその両方を含むことがで
きる。配列番号１／配列番号１-変異体の配列および配列番号２／配列番号２-変
異体の配列の両方を含む核酸分子が好ましい。
【００２５】 本明細書で言及するように、"機能的に等価な変異体" または "機能的等価物"
は、これらが関連する本体（entity）（またはこれらが誘導される本体）の少
なくとも１つの機能を保持しており、例えば実質的に同一の特性を有するタンパ
ク質をコードするか、または実質的に同一の調節または他の機能的特性または活
性を示す。
【００２６】 上記のように、配列番号３５または配列番号１および／または２（またはそれ
らの相補的な、変性した、または機能的に等価な変異体）のヌクレオチド配列の
部分または一部（例えば断片）を含む核酸分子もまた、本発明の範囲に包含され
る。 PKS 遺伝子クラスターのこのような部分または一部は、有利には、完全な配列
の機能的等価物と考えることもできる。例えば、配列の一部または断片は、上記
で定義した機能的活性、例えばポリケチドまたはマクロライド生合成における酵
素的、調節的またはトランスポーター活性を保持することができる。
【００２７】 好都合には、PKS 遺伝子クラスター（例えば配列番号３５、または１および／
または２）の部分または一部は、少なくとも１５塩基の長さ、好ましくは少なく
とも２０、２５、３０、３５、４０、５０、７０、１００、２００、３００、４
００、５００、１０００、２０００、５０００、１０,０００、１５,０００、２
０,０００、３０,０００または５０,０００塩基である。この部分または一部は
、隣接または非隣接ヌクレオチドまたはアミノ酸を含むかまたはコードすること
ができる。
【００２８】 PKS 遺伝子配列の機能的部分の部分または一部は、以下でより詳細に論じられ
る。 PKS 遺伝子クラスターの部分または一部は、DNA 分子（またはヌクレオチド配
列）の非コードまたは非機能的部分、例えばプロモーターまたはオペレーター配
列、または個々の遺伝子、モジュールまたは酵素ドメインを連結するリンカー配
列を含むこともできる。
【００２９】 上記のように、配列番号３５、１および２内の多数の遺伝子および ORF を同
定した。このような遺伝子（または上記で定義した、それらの相補的な、変性し
た、または機能的に等価な変異体）は、配列番号３５、１および２の好ましい "
部分" または断片である。これらを下記の表１に作表して示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【表２】
【００３２】 上記の表中の "C" は相補性ストランドを指す。 配列番号１の nysD2、D1、A、B、C、E、R1〜R5、ORF1、ORF2、および配列番号
２の nysF、G、H および D3、および部分的 nysI 配列は、遺伝子クラスターの
ための全体の完全コード配列を表す配列番号３５において名付けた、それらの対
向物に対応しており、配列番号１および２のヌクレオチド配列を含む。しかしな
がら、配列番号２および３５中の対応特徴間でのように、ヌクレオチドの番号付
けには相違があり；配列番号１および２の場合は、停止コドン中の最初のヌクレ
オチドが遺伝子の終点と考えられる一方で、配列番号３５の場合は、停止コドン
の３番目のヌクレオチドが遺伝子の終点と考えられる。NysD1、D2 および D3 は
、NysDI、DII および DIII としても知られており、nysR1〜R5 は nysRI〜RV と
しても知られている。
【００３３】 配列番号１（nys1）および遺伝子配列 nysRI に関して、表１は、これがヌク
レオチド 51405〜54303 を含むことを示している。しかしながら、さらなる配列
分析は、実際には２つの始点コドン、すなわち GTG をコードするヌクレオチド
51405-51407 および ATG をコードするヌクレオチド 51408-51410 があることが
明らかになった。従って、配列番号１のヌクレオチド 51408 は、nysRI のため
の代わりの始点ヌクレオチドである。ATG は GTG よりも始点コドンとして好ま
しく、その結果として、51408 は nysRI に対する将来のリファランス中の始点
ヌクレオチドと考えられる。配列番号３５中の nysRI の始点は、上記の表１に
おいて ATG コドンとして示されており、下記の配列番号９に示す nysRI の翻訳
産物は配列番号１のヌクレオチド 51408-54303 から演繹される。［配列番号１
のヌクレオチド 51405 が始点ヌクレオチドである NysRI 翻訳産物の代わりの表
示において、配列番号９は追加の "最初の" アミノ酸、Ｖを挿入することによっ
て修飾される。］ 配列３５および１、および遺伝子配列 nysRIV に関して、表１は、これが配列
３５中のヌクレオチド 120676〜123108（nysRIV 短）を含むことを示している。
しかしながら、さらなる配列分析は、実際には２つのコドン、すなわち GTG を
コードするヌクレオチド 120676-120678 および GTG をコードするヌクレオチド
120628-120630 があることが明らかになった。これらの始点コドンは、nysR4
のための配列番号１中のヌクレオチド 60367-60369（表１で述べたとおり）およ
び 60415-60417 における始点コドンに対応している。上流 GTG（配列番号３５
中の 120628-120630、これは配列番号１中の 60367-60369 に対応している）は
、始点コドンとして好ましく（実施例６参照）、その結果として、120628 は ny
sRIV に対する将来のリファランス中の始点ヌクレオチドと考えられる。配列番
号３５中の nysRIV の始点は、下流始点コドンとして上記の表１に示されており
（nysRIV 短）、本明細書で "NysRIV 短" と名付けた nysRIV 短 の演繹翻訳産
物は、配列番号１１に示されている。また表１には、配列番号３５中の nysRIV
（nysRIV 長）の代わりの始点コドンが上流始点コドン 120628-120630 として示
されている。従って、本明細書で "NysRIV (長)" と名付けた NysRIV 翻訳産物
の代わりの好ましい表示は、配列番号４３に示されている。
【００３４】 配列番号３５、または１および／または２の配列の代わりとなる代表的な部分
は、それぞれの "始点" および "終点" ヌクレオチド位置の間にあるヌクレオチ
ドを個別的または集合的に含有する。 それぞれの "遺伝子" の翻訳産物が演繹され、アミノ酸配列は以下に示す下記
の配列番号において述べられる。
【００３５】
【表３】
【００３６】 配列番号４、１０、１２、１３、１４、１６、１８、４１および４３は、最初
のアミノ酸としてバリン（Ｖ）を示す。この分野の慣習および細菌 DNA の概念
上の翻訳によれば、タンパク質（翻訳産物）の最初のアミノ酸は、始点コドンと
は無関係に、常にメチオニン（Ｍ）である。従って、本発明の翻訳産物およびア
ミノ酸配列は、提示したように配列番号４、１０、１２、１３、１４、１６、１
８、４１および４３だけでなく、最初のＶがＭと交換した上記配列の修飾物をも
含んでいる。以下で、配列番号４、１０、１２、１３、１４、１６、１８、４１
および４３の言及は、提示した配列だけでなく、最初のＶがＭと交換した上記配
列をも含むと理解されるであろう。
【００３７】 代わりの態様からみると、本発明はまた、配列番号３〜２０または３６〜４３
から選択される１個またはそれ以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列、またはそれと相補的な、またはそれにより変性したヌクレオチド配列を含む
核酸分子を提供する。 また、配列番号３〜２０または３６〜４３の何れか１つと少なくとも６０％の
配列同一性を示す１個またはそれ以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
配列を含む核酸分子が提供される。
【００３８】 本発明のもう一つの形態は、上記で定義した本発明の核酸分子によりコードさ
れるポリペプチドが提供される。 より詳細には、本発明のこの態様は、 (a) 配列番号３〜２０または３６〜４３の何れか１個またはそれ以上に示す
アミノ酸配列の全部または部分；または (b) 配列番号３〜２０または３６〜４３の何れか１個またはそれ以上と少な
くとも６０％のア配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または部分 を含むポリペプチドを提供する。
【００３９】 特に、アミノ酸配列は、配列番号３〜２０または３６〜４３の何れか１個また
はそれ以上のポリペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列の
全部または部分を示すことができる。その代わりに、アミノ酸配列は、配列番号
３〜２０または３６〜４３の何れか１個またはそれ以上のポリペプチドと少なく
とも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の類似性を
示すことができる。本明細書における％配列同一性または類似性の基準を満たす
アミノ酸（ポリペプチド）配列は、"実質的に同一" と考えられる。本発明のポ
リペプチドは、単離、精製または合成されたポリペプチドであってよい。"ポリ
ペプチド" という用語は、本明細書において、２つまたはそれ以上のアミノ酸の
アミノ酸配列を包含するために用いられ、すなわち、短いペプチドおよびより長
いもの（すなわち、ポリペプチド）の両方が含まれる。
【００４０】 アミノ酸配列の同一性または類似性は、ウィスコンシン大学からの Genetics
Computer Groups (GCG) Version 10 Software パッケージの BestFit プログラ
ムを用いて決定することができる。このプログラムには、デホールト値：ギャッ
プ生成ペナルティー ＝ ８、ギャップ延長ペナルティー ＝ ２、平均マッチ ＝
2.912、平均ミスマッチ ＝ -2.003 を用いる Smith および Waterman の局部相
同性演算法が使用される。
【００４１】 配列番号３〜２０または３６〜４３（または上記で定義した "実質的に同一の
" 配列）の何れか１個またはそれ以上のアミノ酸配列の "部分" は、少なくとも
２０の隣接アミノ酸、好ましくは３０、４０、５０、７０、１００、１５０、２
００、３００、４００、５００、１,０００、２,０００、５,０００または１０,
０００の隣接アミノ酸を含むことができる。
【００４２】 ポリペプチド、および同様に好ましくはその部分は、上記の定義により機能的
に活性であり、例えば酵素的に活性であるか、または調節または輸送の機能的活
性を有する。この部分は、自らは機能的に活性でないことがあるが、場合によっ
ては全体の機能的特性を有する領域を与えることができ、例えば、酵素活性に必
要な活性部位または補因子の結合部位である。
【００４３】 以下の実施例に記載する研究では、本発明のヌクレオチドおよびポリペプチド
配列が特性決定され、その中にある種々の機能的領域が同定された。このような
機能的領域は、本発明の別の態様を形成する。種々の翻訳産物（例えば配列番号
３〜２０および３６〜４３の遺伝子産物）について、これらの機能的領域を下記
の表２にまとめて示す。
【００４４】
【表４】
【００４５】
【表５】
【００４６】
【表６】
【００４７】
【表７】
【００４８】
【表８】
【００４９】
【表９】
【００５０】
【表１０】
【００５１】 上述したように、「不活性」とは、他のPKS類におけるDHで見られる活性部位
モチーフ、H(X3)G(X4)Pを表す保存アミノ酸配列を欠いているDHドメインを表示
している。しかしながら、これらのドメインはある活性を有してもよいが、もっ
ともそれはおそらく他のPKS類におけるDHドメインの活性とは、異なっているか
も知れないと理解されるだろう。
【００５２】 配列番号５（NysA）、６（NysB）、７（NysC）、20および37（NysI）、38（Ny
sJ）および39（NysK）は、実際の”PKS”酵素、すなわちポリケチド合成に関わ
る酵素を構成することはわかるであろう。これらの遺伝子産物は、同定可能な酵
素的なドメインおよびモジュールを含んでおり、これらは、上記の表２ならびに
図４，８および９（下記の実施例1および表４、ならびにナイスタチン生合成遺
伝子クラスターのDNA配列分析を詳細に記載している実施例４もまた参照のこと
。）にも示されている。そうした個々のドメインおよび分子は、本明細書におい
て同定されるように本発明の別の面を形成している。
【００５３】 配列番号3および26（NysDII）、4（NysDI）、8（NysE）、16（NysF）、19（Ny
sDIII）、40（NysL）、41（NysM）および42（NysN）は、ポリケチドまたはマク
ロライド合成、すなわち、PKSからのポリケチド放出、翻訳後のPKS修飾およびポ
リケチド修飾に機能する他の酵素類を表す。配列番号10〜15および43（NysRIか
らNysRVおよびORF2）はそれぞれ転写レギュレーターを表し、配列番号17および1
8（NysGおよびNysH）は、細胞からのポリケチド輸送に関与していると推測され
ている「トランスポート」タンパク質を表している。このことは、以下の実施例
においてもさらに詳細に記載されている。そのような機能的タンパク質は本発明
の別個の面を形成するものである。さらにそうしたタンパク質の機能性部分また
はフラグメント、すなわち、それらが由来する「親分子」（すなわちタンパク質
全体またはポリペプチド全体の）の生物的活性を（すなわち測定可能なレベルに
示す）保持する活性な部分またはフラグメントもまた含まれる。
【００５４】 本発明のヌクレオチド配列は、ナイスタチン生合成を操るための多くの方法に
おいて利用できる重要なツールと情報を提供し、新しいナイスタチン誘導体また
は新規なポリケチドもしくはマクロライド構造を合成できたり、新規なもしくは
改変PKSシステムを提供することができる（ここでは「PKSシステム」によってポ
リケチド合成システム、すなわち遺伝子クラスターまたはタンパク質複合体、集
合体または構築物を意味し、ポリケチド合成において機能するが必ずしもPKS酵
素類または酵素上のドメインに限定されるものでなく、他の機能的な活性、たと
えば他の酵素的（例えば修飾的な）、トランスポータータンパク質もしくは調節
機能的なタンパク質をもまた含むものである）。
【００５５】 したがって、たとえば、本明細書に提示されるナイスタチンPKS遺伝子クラス
ター全体またはPKS合成システム、またはその部分は修飾を受けてもよく、それ
により１以上の遺伝子、１以上のモジュール、酵素的ドメインまたはその内部の
機能的配列を修飾することとなる。かくして修飾された、または誘導化されたPK
Sシステムは、あとでさらに詳細に記述されるように、新規な、または改変され
たポリケチドの部分を合成するのに用いることができる。この場面では、本明細
書に記載するナイスタチンPKSシステム、またはそのフラグメント、部分は修飾
のための「原型」または「鋳型」または「起源」のシステムまたは配列として機
能するに違いない。
【００５６】 さらに具体的には、あるそうした態様において、また後で述べるように、該シ
ステムの機能的でない部分（たとえば、生物的に活性ではない部分）は、「足場
（scaffold）」として利用することができ、機能的部分（たとえば、酵素的部分
をコードする配列）は、修飾されて派生的、修飾されたPKSシステムを生み出す
ことができる。ある態様では、１個だけが選択された、または少数しか選択され
ない機能的（たとえば、酵素的な）領域は修飾され、残りの配列または構造は大
部分がそのままに残されるであろう。
【００５７】 代わりに、そのような機能的部分は、他の「足場」構造の修飾のためのツール
または材料として利用することができる。たとえば個々のナイスタチン遺伝子、
モジュール、またはドメインは、他のPKS足場構造への導入（たとえば挿入か置
換）のために使用されてもよい。たとえば他のマクロライド抗生物質（たとえば
エリスロマイシンまたはラパマイシンなど）用の、PKSシステムに由来するPKS足
場システムである。
【００５８】 合成のもしくは遺伝子組み換えのポリケチドシンターゼ酵素は本発明の範囲に
含まれ、これはナイスタチン遺伝子クラスターによりコードされる「足場」から
派生したものであり、該酵素は、他のモジュラー酵素から誘導される１以上の機
能性単位を含むように修飾される。そのような機能性単位は、触媒性もしくは輸
送のタンパク質ドメインをコードすることができるかも知れない。たとえば、PK
S酵素からのケトレダクターゼドメイン、モジュラーハイブリッドポリケチド／
ペプチド合成酵素からのACPドメインである。そうしたドメインは、DNA配列酵素
ドメイン、たとえばポリケチド合成酵素、ペプチド合成酵素、ペプチド・ポリケ
チドハイブリッド合成酵素、脂肪酸合成酵素、あるいは当業界で知られた他の酵
素ドメインから誘導され得る。類推的に本発明に含まれるものとして、異なるポ
リケチドシンターゼ遺伝子クラスターによりコードされる足場から誘導される合
成のもしくは遺伝子組み換えのポリケチドシンターゼ酵素、あるいはナイスタチ
ン遺伝子クラスターに由来する１以上の機能性単位を含むように修飾されるモジ
ュラー酵素をコードする遺伝子クラスターである。
【００５９】 したがって、ナイスタチン生合成遺伝子クラスターについて本明細書に提示さ
れる配列および活性の情報は、現存の公知遺伝子クラスター、結果としてそれら
の生産産物を変更するために使用することができる。特に、本明細書に記載され
る特定のドメインを選別し、現存するPKS遺伝子クラスターへ取り込むこと（あ
るいは現存配列を修飾すること）は、ナイスタチン遺伝子クラスターに帰着され
るべき特定の性質を取り込むこととなるであろう。
【００６０】 かくして、極めて一般的な意味において、本発明は、修飾されたPKSシステム
の調製あるいは修飾を受けたポリケチド分子の調製において、本明細書に記載さ
れた本発明の核酸分子の利用を提供する。 そうした新規なまたは修飾されたポリケチドまたはマクロライド分子は、本発
明の別個の面を形成するものである。
【００６１】 かようにして本発明によれば、ヌクレオチド配列は、ランダムに、または指示
されて、または志向的なやり方で利用することができる。たとえば、特定の所定
もしくは所与の構造を獲得してテストしたり、あるいはスクリーニング用の（こ
れもあとでさらに詳細に記載する）ポリケチド構造のライブラリーといったラン
ダム分子を創生する目的のためである。
【００６２】 ナイスタチン−PKS足場内の修飾のためであろうと、あるいは代替性の足場構
造への導入のためであろうと、修飾を受け得る遺伝子または遺伝子要素は、実際
のPKS遺伝子（NysA、NysB、NysC、NysI、NysJおよびNysK）、それらの個々の分
子もしくはそのドメインだけでなく、ナイスタチン生合成および輸送に関係して
いる他の酵素もしくは機能的タンパク質をコードする遺伝子をも含むものである
（本明細書では一括して「PKS遺伝子（類）」または「ナイスタチン遺伝子（類
）」という）。
【００６３】 実際のPKS遺伝子類については、あとでさらに詳細に記載するように、これら
は修飾されて、それによりスターター単位（starter unit）の性格、モジュール
の数、エクステンダー（extender）の性格を決定する負荷ドメイン分子の性質の
みならず、ポリケチド鎖の構造を決定する様々なデヒドラターゼ、レダクターゼ
およびシンターゼの活性を変更することとなる。
【００６４】 修飾を受け得る他の遺伝子として、チオエステラーゼ遺伝子（配列番号８のNy
sEをコードする）が挙げられ、これはPKSシステムの効率が上昇するように修飾
され得るものである（PKSから不適切な基質を取り除く「編集機能」の活性を有
するチオエステラーゼの場合）。チオエステラーゼが単にPKSの最終産物を切り
離すだけならば、該酵素はナイスタチンPKSの頭部を切断し、遺伝子工学によっ
て、該エステラーゼをその頭部切断されたタンパク質末端に融合することによっ
て、より小さいマクロラクトン環を有するナイスタチン誘導体を作成するために
使用できる。
【００６５】 ポリケチドまたは抗生物質の生産を亢進させるため、調節遺伝子のアクチベー
ターは、強発現され得るし、リプレッサーは不活性化され得る。このことは、組
換え株において新しいナイスタチン誘導体を生産するためには特に重要である（
それは極めて僅かな量しか生産されないかも知れない）。 推定の４'−ホスホパンテテイン（PPT）トランスフェラーゼ遺伝子（配列番号
16のNysFをコードする）は、PKSの効率的な翻訳後修飾および完全な機能性を達
成するために、強発現され得る。特異的なPPT活性を欠いている異種の宿主にお
けるナイスタチン（または他の）PKSの発現に使用することも可能である。その
ような宿主として、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシイなどが挙げられる。
【００６６】 合成された分子、たとえば新規なナイスタチン誘導体のグリコシル化を亢進さ
せるように、デオキシ糖遺伝子：グリコシルトランスフェラーゼ（配列番号４の
NysDIをコードする）は、強発現され得る。それは、新しい基質に対する特異性
を増加するためにインビトロの突然変異によっても修飾を受け得る。このグリコ
シルトランスフェラーゼの不活性化は、非グリコシル化ナイスタチン（おそらく
何らかの修飾も欠いている）を生産する組換え体株をもたらすであろう。それは
、たとえば化学修飾または新しい修飾活性をスクリーニングするための酵素的ア
ッセイに使用することができる。
【００６７】 アミノトランスフェラーゼ（配列番号３および36のNysDII）は、不活性化され
てナイスタチン誘導体を与え得る。この酵素は、デオキシ糖マイコサミンにアミ
ノ基を付着させると推定されている。この遺伝子もまた、通常はアミノ基を欠い
ている別のデオキシ糖との同じ反応を遂行するように、他のストレプトマイセス
属においても発現され得る。
【００６８】 ABCトランスポーター（具体的には、配列番号17および18のNysHおよびNysG）
は、ナイスタチンの流出とその誘導体の流出をもっと効率的にするように強発現
され得る。これらは、異なる化合物に対するその特異性をシフトするように突然
変異を受け得る。もし、何らかの理由により細胞内にナイスタチンまたはその誘
導体を蓄積することを所望するならば、これらは不活性化させることができる。
【００６９】 モノオキシゲナーゼ、NysLおよびNysN（配列番号40および42）をコードする遺
伝子は、ヒドロキシル化および酸化をともにされていないナイスタチン誘導体が
得られるように、S. nourseiにおいて不活性化され得る。代わりにこれらの遺
伝子は、ナイスタチン前駆体に対するそれらの特異性を変更することをねらって
、変異を起こさせ得る。もし上記のヒドロキシル化および／または酸化の段階が
ナイスタチン生合成経路において律速であるならば、nysLおよびnysNの強発現は
、おそらくナイスタチンまたはその誘導体の収率の上昇をもたらすに違いない。
ナイスタチン前駆体の修飾のためのインビトロP450ヒドロキシラーゼシステムを
確立しようと望むならば、フェレドキシン（配列番号41）をコードするnysMを用
いる遺伝子操作は、有用であるかもしれない。
【００７０】 かくして、「ナイスタチン」遺伝子を使用することにより、ナイスタチンPKS
システムの修飾または他のPKSシステムの修飾に加えて、本発明の核酸分子は、
たとえば宿主の範囲を拡張したり、あるいは収率もしくは生産効率の上昇によっ
て、生合成過程を操るかまたは促進するためにも用いることができる。 上記の原理に従って、本発明の実施を可能とするために、本発明はさらに発現
ベクター、本明細書で定義した核酸分子を含む宿主細胞を提供する。
【００７１】 ポリケチドまたはマクロライド分子（具体的にはナイスタチンまたはナイスタ
チン誘導体）の生産のための方法もまた提供される。その方法は、上記のような
核酸分子を宿主細胞内で発現することを含むものである。核酸分子の発現結果と
して（すなわち、導入された「PKS合成装置機構」の発現）、宿主細胞内で、ポ
リケチドまたはマクロライド分子が生産され、宿主細胞により分泌されるか、ま
たは輸送され、その後回収される。
【００７２】 したがって、本発明の方法は、核酸分子が発現されるような条件のもとで宿主
細胞を成長させるか培養すること、および核酸分子の発現産物（類）がポリケチ
ド／マクロライド分子を合成するようにさせること、換言すれば、ポリケチドま
たはマクロライド分子が生産される条件下で、宿主細胞を成長させるか、または
培養することを含むものである。
【００７３】 本発明によれば、組換え核酸分子を調製する方法もまた提供され、その方法は
、本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子を別の核酸分子、たとえばベクター
核酸、具体的にはベクターDNA内に挿入することを含むものである。 本発明の発現ベクターは、適当な調節配列を含めることができる。たとえば翻
訳調節エレメント（たとえば開始コドンおよび停止コドン、リボソーム結合部位
）ならびにリーディングフレームを本発明の核酸分子とマッチさせることに関係
する転写調節エレメント（たとえばプロモーターオペレーター領域、終結停止配
列）である。
【００７４】 本発明のベクターは、当業界で周知であり、文献に記録された諸技術によるプ
ラスミドおよびウィルス（バクテリオファージおよび真核生物のウィルスの両方
を含む）を含んでもよく、さらに、当業界で周知であり、文献に記録された様々
な異なる発現システムで発現させることもできる。 発現目的で、原核生物細胞または真核生物細胞内にそうしたベクターを導入す
るための、あるいは形質転換動物を作成するために細菌株または体細胞内に導入
するための様々な技術が知られており、そして用いることができる。適切な形質
転換またはトランスフェクション技術が文献に充分に記載されている。
【００７５】 上記の本発明による核酸分子を含むトランスジェニック生物体用に、本発明は
、形質転換された、あるいはトランスフェクションされた原核生物の宿主細胞ま
たは真核生物の宿主細胞をも含むものである。そのような宿主細胞には、たとえ
ば、大腸菌、ストレプトマイセスおよび他の細菌といった原核生物細胞、酵母ま
たはバキュロウィルス−昆虫細胞システムといった真核生物細胞、形質転換され
た動物細胞およびトランスジェニック動植物細胞が挙げられる。
【００７６】 上記の発現ベクター、宿主細胞および生物体等の内に含まれる核酸分子は、あ
とでさらに詳細に記載するように、上記で定義された核酸分子に由来する派生的
な核酸分子であってもよく、そうした分子またはその部分を修飾することによる
か、あるいは他の核酸分子に導入したり、または結合するかによって得られる。 よって、ある面で本発明は、ポリケチド類のコンビナトリアル・ライブラリー
の製造のため、組換え体の材料を提供する。該ライブラリーのポリケチド構成員
は、天然に存在するナイスタチンA1システム（本明細書において提示される）か
ら、このシステムを足場として用いることにより誘導される修飾PKSシステムに
よって合成される。一般的には、該ライブラリーの多くの構成員自体が新規な化
合物であり、本発明はこれらのライブラリーの新規なポリケチド構成員を含むも
のである。それゆえ、本発明の方法は個々のポリケチドの調製に適用されてもよ
い。ポリケチドが新規であろうとなかろうと、該調製方法はそれを調製するため
のより便利な方法であってもよい。生成するポリケチドは、さらに修飾を受けて
から抗生物質に変換されてもよい。典型的にはグリコシル化を通じてである。本
発明のライブラリーをスクリーニングすることによって、所望の結合活性を有す
る新規なポリケチドを回収するための方法も本発明に含まれる。
【００７７】 したがって、ある面で本発明は、改変ポリケチドシンターゼ酵素または酵素シ
ステムをコードするヌクレオチド配列から構成されるか、または含む核酸分子を
調製する方法にも適用される。本明細書において提示されるような配列をコード
するナイスタチンPKSを、足場として用いること、ならびに酵素的または他の機
能的活性をコードするヌクレオチド配列の部分を、たとえば突然変異、不活性化
（具体的には欠失もしくは挿入）または置換により修飾することを含むものであ
る。このようにして修飾されたヌクレオチド配列（改変PKSをコードする）は、
適当な宿主細胞を改変するために用いることができ、さらにこのようにして改変
された細胞は、原生のナイスタチンPKSにより産生されるポリケチドとは異なる
ポリケチドを産生するために用いることができる。原生ナイスタチンPKSの「足
場組み」は，酵素的活性の修飾を支援するために用いられてきた。
【００７８】 代わりに酵素的または他の機能的活性をコードするヌクレオチド配列の１つ以
上の部分は、代替的な（すなわち、異なる「二番目」の）PKS足場（すなわち、
「二番目」のPKSシステムに由来する足場であり、ナイスタチンPKSシステムとは
相違している）に導入されてもよい。 本発明は、このようにして産生されたポリケチドおよびそれらが次に変換され
得る抗生物質に対しても適用される。
【００７９】 本発明は、別の面で、細胞コロニーのライブラリーを含む多数の細胞コロニー
にも適用される。そのライブラリーでは、各々のコロニーは、異なるモジュラー
PKSを産生するための発現ベクターを含んでいるが、上記のように本発明のナイ
スタチンPKSに由来している。異なるモジュラーPKSのライブラリーは、ある酵素
的活性をコードしている天然産「ナイスタチン」遺伝子または遺伝子クラスター
の1つ以上の領域を修飾することにより得ることができ、その結果、その活性を
変更するが、該天然産遺伝子の足場部分をもとのままにしておく。
【００８０】 他の側面では、本発明は、コロニーのライブラリーを含む細胞コロニーの多様
性に関し、ここでライブラリーの各コロニーは、本発明のナイスタチンＰＫＳか
ら誘導された異なるモジュラーＰＫＳを含む。また本発明は、ＰＫＳ錯体のライ
ブラリー製造方法およびこれらコロニーの培養によるポリケチドのライブラリー
の製法、ならびにこのようにして製造されたライブラリーに関する。さらに、本
発明は、得られるポリケチドライブラリーのスクリーニング法およびそこに含ま
れる新規ポリケチドに関する。
【００８１】 上述したように、ナイスタチンＰＫＳ遺伝子のクラスター／システムの構造的
および機能的配列解析は、下記実施例に与えられ、またＤＮＡ配列はSEQ ID NO
1, 2および35に示され、また上記表1,2、SEQ ID 3〜20および36〜42また図２，
３，７，８および９でさらに解析した。「ＰＫＳ」の構造をコードするモジュラ
ーおよび「ドメイン」が見いだされるだろう。モジュールは典型的には、ケトシ
ンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）およびアシルキャリアタ
ンパク（ＡＣＰ）を含有するだろう。これらの三つの機能は、拡張単位を活性化
するのに十分であり、生長分子の残余にそれを結合する。モジュールに包含され
るであろう付加的な活性は、クライゼン縮合以外の反応に関係し、デヒドラター
ゼ活性（ＤＨ）、エノイルリダクターゼ（ＥＲ）およびケトリダクターゼ活性（
ＫＲ）を含む。仕込まれたモジュールは初期縮合に触媒作用を及ぼし、すなわち
、それはＡＴおよびＡＣＰで示される「仕込ドメイン」で始まり、これは開始単
位の性質を決める。分子の「終了」は、チオエステラーゼ活性（ＴＥ）により調
整されると信じられ、これはＮｙｓＫに埋め込まれたＴＥ活性により達成される
と信じられる。このチオエステラーゼは、マクロライド環の環化に触媒作用を及
ぼすと思われ、ポリケチド生成物の収率を向上させる。ＮｙｓＥ ＴＥ活性は、
「編集」活性であると信じられ、ナイスタチンＰＫＳ錯体からのある種の基質の
開裂に関連する。
【００８２】 上述ならびに後述の配列、図面、および表から、酵素活性をコードする遺伝子
および分子の領域は、リンカーあるいは「足場」コード領域により分離されるこ
とがわかる。これらの足場領域は、適当な距離および正しい順序で、酵素的／機
能性活性を分けるアミノ酸配列をコードする。したがって、これらのリンカー領
域は、集団的に種々の活性が、特定の順序および空間的配置で位置付けられるよ
うに「足場」をコードすると考えることができる。しかしながら、いくつかの場
合、足場領域は、得られるＰＫＳの活性に意義ある影響を与えることなく、削除
あるいは改変されることもあるであろうことを注意するべきだ。実際、機能的な
活性をもっていくつかのドメインをコードする配列が、意義ある効果なしに、完
全に、あるいは部分的に削除されることもある。したがって、ここで用いられて
いるように、「足場」とは、該ＰＫＳの機能的、たとえば酵素的活性に直接的に
寄与せずに、その全体的な活性を維持すること、たとえば正しい空間的配向ある
いは構造、を保証するＰＫＳクラスターの部分を意味する。該足場は、ＰＫＳの
全てのリンカーおよび非機能性領域あるいは、その機能的活性部分（すなわち構
造保全の維持）を含むだろう。この有機体は、他の自然発生的モジュラーＰＫＳ
遺伝子クラスターにおいて類似している。
【００８３】 本発明は、ナイスタチンＰＫＳ遺伝子クラスター中に変体を発生させ、該クラ
スターにより生成するタンパク錯体が１以上の点で変更された活性を有するよう
にすることで、ライブラリーあるいは個々の改変体、究極的にはポリケチドの改
変体を与え、またこうしてＰＫＳの天然体（すなわちナイスタチンＡ１）以外の
ポリケチドを製造する。この方法を用いることで、新規ポリケチドが調製され、
あるいはポリケチドが概して容易に製造される。自然発生的ナイスタチンＰＫＳ
遺伝子クラスターから誘導される多種の遺伝子または遺伝子クラスターであって
、それぞれが天然クラスターからは異なった方法で改変されたものを与えること
で、これら活性における多様な変動の結果として、ポリケチドの効果的な結合ラ
イブラリーが製造される。あるいは、ナイスタチンＰＫＳ「機能領域」（たとえ
ば遺伝子、分子あるいはドメイン）は、他の自然発生的ＰＫＳ系から得られた「
足場」に導入するために用いても良い。したがって、本発明で用いられる改変Ｐ
ＫＳをコードする配列およびシステムは、自然発生型ナイスタチンＰＫＳ「から
誘導される」モジュラーポリケチドシンターゼを示す。
【００８４】 ナイスタチンＰＫＳ「から誘導される」モジュラーＰＫＳとは、自然発生型遺
伝子の有用部分の全ての足場を維持するモジュラーポリケチドシンターゼ（ある
いはその対応物がコードする遺伝子）を意味する。（構成中に全てのモジュラー
あるいは遺伝子が含まれる必要はない）。定常の足場では、少なくとも１つの酵
素性あるいは機能性活性が、突然変異、削除あるいは置換され、活性が変化する
。これらの活性が削除されたり、活性の異なる型に置換されたり、あるいは単純
に、これら集合的活性からの天然生成の結果物以外のポリケチドのように突然変
異される場合に、変化が起る。これが起るのは、生成ポリケチド中の対応する位
置で発生する開始単位および／または拡張単位、および／または立体化学、およ
び／または鎖長あるいは環化および／または還元性あるいは脱水素周期の結果と
して変化があるためである。削除された活性が置換される場合、置換活性の起源
は、異なる自然発生型ポリケチドシンターゼにおける対応活性あるいは同じＰＫ
Ｓの異なる領域に由来する。あるいはまた、このような「誘導された」モジュラ
ーＰＫＳは、ここで記述したナイスタチンＰＫＳから得られるか、またはこれに
由来する１以上の酵素性あるいは他の機能性活性（あるいはこれらがコードする
ヌクレオチド配列）を、第２の異なるモジュラーＰＫＳ（またはその遺伝子）の
足場において、合併する。
【００８５】 モジュラーＰＫＳの改変または操作は、たとえば遺伝子またはドメインまたは
モジュールの削除またはドメイン／遺伝子／モジュール交換、付加、不活性化な
どの、挿入、削除を含む切断を包含している。あるいはまた、ランダムまたは直
接的改変（すなわち突然変異）が選択された部分のヌクレオチド配列（たとえば
遺伝子／ドメイン／モジュール等の中）で行われてもよい。
【００８６】 誘導体は、好ましくは少なくともナイスタチンＰＫＳ遺伝子クラスターからの
チオエステラーゼ活性を有する。 有利には、ナイスタチンＰＫＳ「から誘導される」ポリケチドシンターゼは、
ナイスタチンシンターゼ遺伝子に採用されている全てまた一部によってコードさ
れる足場を含んでいてもよく、機能性の２以上のモジュール、好ましくは４以上
のモジュールを含み、またこれら機能性モジュールの活性の１以上の突然変異、
削除あるいは置換を含み、かくして得られるポリケチドの性質は変化する。この
定義は、タン白質および遺伝子レベルの双方に適用される。特に好ましい態様に
は、ＫＳ，ＡＴ，ＫＲ，ＤＨあるいはＥＲが不活性化または削除あるいは異なる
ＰＫＳあるいは同じＰＫＳ中の他の部分からの活性型により置換されたものが含
まれる。また好ましいものとしては、少なくとも１つの非縮合周期酵素性活性（
ＫＲ，ＤＨまたはＥＲ）が削除されているか、またはこれらの活性の何れかかが
突然変異され、最終的に得られるポリケチドが変化するようにしたものが挙げら
れる。
【００８７】 したがって、製造されるポリケチドに関し、ポリケチドシンターゼの構成には
５つの自由度がある。第１には、ポリケチド鎖長は、ＰＫＳシステム中のモジュ
ールの数により決定されるであろう。第２には、ＰＫＳの炭素骨格の性質は、マ
ロニル、メチルマロニルあるいはエチルマロニルのような各位置における拡張単
位の性質を決定するアシルトランスフェラーゼの特性により決定されるであろう
。第３には、仕込ドメインの特性はまた、得られるポリケチドの炭素骨格に影響
を及ぼすであろう。したがって、仕込ドメインは、アセチル、プロピオニルなど
のような異なる開始単位を使用してもよい。第４には、ポリケチドの多様な位置
における酸化状態は、モジュールのデヒドラターゼおよびリダクターゼ部により
決定されるであろう。これは、ポリケチド中のケトン、アルコール、二重結合、
単結合の存在および位置を決定するだろう。
【００８８】 最後に、得られるポリケチドの立体化学は、シンターゼの３つの側面の機能で
ある。第１の側面は、拡張単位としての置換マロニルに関係したＡＴ／ＫＳ特異
性に関し、これは、還元周期が失われているか、あるいはケトリダクターゼのみ
を含む場合に、デヒドラターゼがキラリティを廃止するため、立体化学に影響を
及ぼす。第２に、ケトリダクターゼの特異性は、いかなるβ−ＯＨのキラリティ
も決定するだろう。最後に、拡張単位としての置換マロニルのためのエノイルリ
ダクターゼ特異性は、完全なＫＲ／ＤＨ／ＥＲが得られる場合に、結果に影響を
及ぼすだろう。
【００８９】 このように、モジュラーナイスタチンＰＫＳシステムは、広範はポリケチドの
合成を許容する。芳香族ＰＫＳシステムと比較して、脂肪族単量体（アセチル、
プロピオニル、ブチリル、イソバレリル等）、芳香族類（アミノヒドロキシベン
ジル）、脂環族類（シクロヘキサノイル）およびヘテロ環類（チアゾイル）を含
む広範な開始単位が、マクロ環ポリケチド中に見出される。近年の研究によれば
、モジュラーＰＫＳが、これら開始単位のための緩和特異性を有することが示さ
れている。モジュラーＰＫＳはまた、各縮合環中の拡張単位の選択に関して、か
なりの多様性を示す。縮合反応に続くβ−ケト還元の度合は、遺伝子操作により
変化されることが示されている（Donadio, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1993) 90:7119-7123）。同様に、ポリケチド生成物の大きさは、適当な数
のモジュールとともに突然変異を設計することで変化できる（Kao, C. M. et al
. J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 11612-11613）。最後に、これらの酵素は、
高度に制御された方法で、それら生成物中の非対称中心の影響範囲を発生させる
ことでよく知られている。本発明の方法により製造されるポリケチドおよび抗生
物質は、典型的には、単一の立体異性的な形をとる。本発明の化合物は、立体異
性体の混合物として発生するが、このシステムを使用して、個々の立体異性体を
発生させることがより実用的である。ナイスタチン、ＰＫＳ足場のような自然発
生モジュラーに基づくモジュラーＰＫＳ経路中での結合ポテンシャルは、実質的
に制限されない。
【００９０】 一般的に、ＰＫＳのポリケチド生成物は、抗生活性を示すようにするために、
典型的には、グリコシル化によりさらに改変される必要がある。ポリケチドのグ
リコシル化の方法はよく知られており、グリコシル化は、適当なグリコシル化酵
素を与えることで細胞内で行ってもよく、また化学合成の手段でin vitroで行っ
てもよい。
【００９１】 マクロライド系抗生物質、モジュラーＰＫＳにより合成されるポリケチド部位
は、多くの他のデオキシ糖のいずれかを含んでいてもよい。ナイスタチン分子は
、マイコサミンデオキシ糖部位を含んでいる。デオキシ糖生合成は、典型的には
、グルコース−１−フォスフェートで開始し、ｄＴＤＰ−グルコースシンターゼ
およびｄＴＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼの作用で進行する。後者
の生成物、典型的にはｄＴＤＰ−４，６−ケト−６−デオキシグルコースには、
さらに次の反応−エピマー化、異性化、還元、脱水素、アミノ交換反応あるいは
メチル化−の少なくとも２つが施され、ｄＴＤＰ−Ｄ−デオキシ糖を与える。次
いで後者は、グルコシル化トランスフェラーゼの作用でマクロラクトン環に結合
し、マクロライド化合物のグルコシル化を与える。
【００９２】 グルコシル化は、出発物質として、非グルコシル化マクロライドを用い、スト
レプトマイセートの突然変異体あるいはグルコシル化活性を与える他の有機体（
すなわち、ミクソコッカス、シュードモナス、マイコバクテリウム等）を用いて
行われる。あるいはまた、上記した有機体からのグリコシルトランスフェラーゼ
がコードする遺伝子は、S. nourseiまたは天然あるいは改変ナイスタチンＰＫＳ
遺伝子またはそのタン白質を含む有機体に導入されることができ、所望のグリコ
シル化を与える。ナイスタチン遺伝子クラスターからのデオキシ糖生合成遺伝子
は、別のＰＫＳ発生における対応活性の補償のために用いることができ、同様に
、他のデオキシ糖の生合成経路を形成するためにも用いられる。
【００９３】 ナイスタチンＰＫＳ誘導体は、関連した遺伝子の操作によって、あるいは他の
ＰＫＳ中にナイスタチン遺伝子またはその部分を導入することによって調製でき
る。多数のモジュラーＰＫＳ遺伝子クラスターがマップ化および／または配列化
されており、エリスロマイシン、soraphen A、リファマイシン、avermectinおよ
びrapamycinは完全にマップ化および配列化されており、FK506およびオレアンド
マイシンは部分的に配列化されており、またカンジシジン、pimaricinおよびnem
adectinはマップ化され、部分的に配列化されている。付加的モジュラーＰＫＳ
遺伝子クラスターは、時間の経過とともに入手できるようになるであろうと期待
される。これらの遺伝子は、標準的技術を用いて操作され、活性がコードする領
域の削除あるいは不活性化、同一または別のＰＫＳシステムからの遺伝子がコー
ドする対応活性の領域の導入、あるいは他にも、標準的手法による突然変異で、
遺伝子改造体が得られる。もちろん、所望の誘導体をコードする配列の一部また
は全部を、Jaye et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6331に記載されているよ
うな標準的な固相合成法で合成することもでき、またたとえばApplied Biosyste
ms, Incから市販されている。
【００９４】 天然発生ＰＫＳの多様な誘導体をコードするヌクレオチド配列を得て、ライブ
ラリー構成のためのポリケチドの多様性を得るために、所望の数の構成体は、酵
素性活性−コード部を「混合および適合」することで得られ、また突然変異は、
天然ホスト（すなわちナイスタチン）ＰＫＳ遺伝子クラスターまたはその部分に
導入されることができる。
【００９５】 突然変異は、定法を用いて天然配列に行うことができる。突然変異の基質は、
遺伝子の全てのクラスターでもよく、またその１または２のみでもよく、突然変
異の基質はこれら遺伝子の１以上の部分でもよい。突然変異の技術は良く知られ
ており、たとえばWO98/49315に記載されており、その文献をここに引用する。こ
のような技術は、突然変異を含む合成オリゴヌクレオチドの調製と、制限エンド
ヌクレオチド消化を用いたＰＫＳサブユニットをコードする遺伝子への突然変異
配列を挿入することを含む。（たとえばKunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al. BioTechniques (1987) 5:786.参照
）あるいはまた、天然ヌクレオチド配列にハイブリッド形成する不適合プライマ
ー（一般的に鎖長は１０〜２０ヌクレオチド）を、不適合複写物の融点以下の温
度で用いることで突然変異を起こさせることもできる。プライマーの長さおよび
基本組成を比較的狭い範囲に保ち、突然変異基部を中央に位置するように保つこ
とで、プライマーを特異性にできる（Zoller and Smith, Methods Enzymol. (19
83) 100:468）。プライマー拡張は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われ、生成
物はクローン化され、プライマー拡張ストランドの分離により誘導された、突然
変異ＤＮＡを含有するクローンは選択される。突然変異プライマーをハイブリッ
ド化プローブとして用いることで選択は達成される。この技術は、多重点突然変
異の一般化にも適用できる。たとえば、Dalbie-McFarland et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1982) 79:6409参照。ＰＣＲ突然変異生成は、所望の突然変異
を起こさせるための使用も見出すだろう。
【００９６】 ヌクレオチド配列がコードする酵素性活性の選択部分のランダムな突然変異生
成は、いくつかの異なる公知方法によって達成され、たとえばプラスミド中にオ
リゴヌクレオチドリンカーをランダムに挿入すること、Ｘ−線または紫外線を照
射すること、in vitroのＤＮＡ合成中に正しくないヌクレオチドを導入すること
、異常伏位ＰＣＲ突然変異生成、合成突然変異体を調製することで、あるいはin
vitroで化学物質によってプラスミドに損傷を加えることで達成される。突然変
異誘導性化学物質としては、たとえば重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ニトロソグ
アニジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンあるいは蟻酸のように、塩基を損傷
または除去して通常の塩基対合を阻害する試薬、5-ブロモウラシル、2-アミノプ
リンのようなヌクレオチド前駆体の類似体、あるいはプロフラビン、アクリフラ
ビン、キナクリンのようなアクリジン挿入化剤等が挙げられる。一般的に、プラ
スミドＤＮＡあるいはＤＮＡフラグメントは、化学物質により処理され、E. col
iに返還され、突然変異プラスミドのプールあるいはライブラリーとして繁殖さ
れる。
【００９７】 酵素的あるいは他の機能性活性をコードする領域の突然変異形態を与えること
に加えて、所望の機能性あるいは活性をコードする領域が、同一のナイスタチン
ＰＫＳの異なる部位から、たとえば適当なプライマーを用いたＰＣＲ技術によっ
て、回収されうる。「対応する」活性をコードする領域とは、活性の同一な一般
的タイプをコードする領域を意味し、--たとえば、遺伝子クラスターのある場所
におけるケトリダクターゼ活性は、遺伝子クラスターの他の場所におけるケトリ
ダクターゼのコードする活性に「対応」する。
【００９８】 （「ナイスタチン」配列が挿入されているホストナイスタチンPKSまたは異な
るPKSとするために）ホストポリケチドシンターゼの特定のターゲット領域の置
換を行う場合には、この置換は、好適な制限酵素を用いてin vitroで行うか、ド
ナープラスミド中の置換遺伝子を形成する相同配列、および宿主プラスミド、ゲ
ノムまたは染色体中のレセプター領域を含めた組換え技術を用いてin vivoで行
うことが可能である。このような系は、好ましくは、たとえばPCT出願WO 96/409
68に記載されており、異なる温度感受性を有するプラスミドを含む。
【００９９】 WO 00/77181には、配列中のいくつかのDNAユニットを集合させて、本発明の範
囲内の組換えポリケチドシンターゼに適用できる巨大なDNA構築物とする方法が
記載されている。 ホストPKS遺伝子において酵素活性を置き換える種々の操作を行うために、も
しくは、ホストPKS遺伝子のそのような領域の変異をサポートするために使用さ
れたベクターは、得られるコード配列と連結することが可能な制御配列を含むよ
うに選択してもよく、いわばコード配列の発現は好適なホスト内でなされてもよ
い。しかしながら、単純なクローニングベクターも同様に使用できる。
【０１００】 発現のための誘導PKS欠如制御配列をコードしているPKS遺伝子を得るためにク
ローニングベクターが用いられ、コード化ヌクレオチド配列と連結可能な場合に
は、このヌクレオチド配列は好適な発現ベクターに挿入される。これは個別に実
施される必要はなく、単離されたコード化ヌクレオチド配列のプールを、ホスト
ベクター、ホスト細胞に形質転換または移入させて得られたベクター、および各
コロニーで培養して得られた細胞に挿入することができる。
【０１０１】 好適な制御配列としては、真核および原核ホスト細胞のそのような機能が挙げ
られる。好ましいホストとしては、原核ホスト、たとえば酵母のような菌類が挙
げられるが、単細胞培養したもの、たとえば、哺乳類の細胞も使用できる。しか
しながら、そのような系を使用する場合に有利な点は特にない。Streptomyces s
ppと共用できる制御配列を使用する酵母および原核ホストが特に好ましい。種々
のタイプの微生物の単細胞培養のための好適な制御配列は、よく知られた技術で
ある。酵母内での発現のための系統としては、分泌をもたらす制御配列が挙げら
れ、広く入手することができ、ルーチンに使用される。制御因子としては、プロ
モーター、所望によりオペレーター配列を含んでいてもよく、ホストの性質に依
存した他の因子、たとえば、リボソーム結合部位などが挙げられる。特に原核ホ
ストに有用なプロモーターとしては、２次的な代謝産物としてポリケチドを生成
するPKS遺伝子クラスターからのもの、たとえば、芳香族（タイプII型）PKS遺伝
子クラスターからのものが挙げられる。例として、actプロモーター、tcmプロモ
ーター、スピラマイシンプロモーターなどが挙げられる。しかしながら、他の細
菌のプロモーター、たとえば、ガラクトース、ラクトース（tac）およびマルト
ースなどの糖代謝酵素から誘導されるものも有用である。追加的な例としては、
生合成酵素、たとえば、トリプトファンシンターゼ(trp)、β−ラクタマーゼ（b
la）、バクテリオファージラムダ FL、T5およびT7をコードしている遺伝子から
誘導されたプロモーターが挙げられる。さらに、合成されたプロモーター、たと
えば、tacプロモーター（米国特許明細書4,551,433号）を用いることもできる。
【０１０２】 また、他の調節配列も、ホスト細胞の成長に比例してPKS置換配列の発現調節
を可能にするものが望ましい。調節配列は、公知の技術であり、例としては、化
学的または物理的な刺激、たとえば、調節化合物の存在に応じて、遺伝子の発現
を生じさせたりさせなかったりするものが挙げられる。他のタイプの調節因子も
またベクター内に存在してもよく、たとえば、エンハンサー配列が挙げられる。
【０１０３】 選択可能なマーカーを組換え発現ベクター内に取り込ませることもできる。マ
ーカーの種類は知られており、形質転換細胞系統を選択する際に有用であり、一
般に遺伝子を含み、この遺伝子の発現は、形質転換細胞が好適な選択培地で成長
するときに、形質転換細胞に選択可能な表現型を与える。このようなマーカーと
しては、たとえば、抗生物質耐性または感受性をプラスミドに与える遺伝子が挙
げられる。または、いくつかのポリケチドは自然に着色しており、この特性が本
構築物によって、首尾よく形質転換した細胞をスクリーニングするための固有の
マーカーを与える。
【０１０４】 種々のPKSヌクレオチド配列、またはそのような配列の混合物は、個別のカセ
ットとして離れた制御因子を有するか、または、たとえばシングルプロモーター
の制御下にある、1以上の組換えベクターへクローン化できる。前記PKSサブユニ
ットまたは成分の混合物は、隣接する制限部位（flanking restriction site）
を含み、それにより、容易に欠失および他のPKSサブユニットまたは成分混合物
を挿入させる。その結果、ハイブリッドPKSsが生成できる。このような独特の制
限部位は、公知の技術であり、上述した技術を用いて達成することができる。た
とえば、位置指定突然変異導入法およびPCRである。
【０１０５】 上述したように、具体的に有用な制御配列はそれら自身であるか、または好適
な制御系を使用することであり、該制御配列は栄養菌糸の増殖から定常期までの
遷移の間、発現を活性化する。プラスミドRM5に含まれる系、すなわち、actI/ac
tIIIプロモーターペアおよびactII−ORF4、活性化遺伝子が、特に好ましい（McD
anielら、Science,v.262、P1546-1550,1993）。
【０１０６】 特に好ましいホストは、ポリケチドを生成する独自の手段を欠いており、それ
により明確な結果が得られる。このタイプのホスト細胞の実例としては、PCT出
願WO 96/40968に記載された、修飾されたS.coeticotor CH999培養物およびS.liv
idans の同様の菌株が挙げられる。 修飾されたPKS系、または異なるポリケチドを生成するための種々のPKS系をコ
ードしているヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、その後、好適なホスト細
胞、たとえば、ライブラリーを構築するホスト細胞へ形質転換してもよい。ある
率直なアプローチにおいては、前記ベクターの混合物を選択されたホスト細胞に
形質転換し、得られた細胞を各コロニーに培養し、首尾よく形質転換体を選択す
る。各コロニーは、それぞれ特定のPKSシンターゼおよび最終的に特定のポリケ
チドを生成する能力を有するコロニーを代表する。典型的には、いくつかのコロ
ニーは複製され、形質転換されたコロニーのサブセットは、各コロニーごとに異
なるPKSを含有しており、ライブラリーとみなすことができる。または、発現ベ
クターは、それぞれ形質転換ホストとして使用することができ、その後、形質転
換されたホストは、ライブラリーを構築する。戦略の種類は、コロニーの多様性
を獲得するために工夫されるべきであり、各コロニーは、ナイスタチンホスト遺
伝子クラスターから誘導されるPKS遺伝子クラスターを含有する。その結果、ラ
イブラリーの各コロニーは、異なるPKS、および最終的には異なるポリケチドを
生成する。前記ライブラリーによって生成された異なるポリケチドの数は、典型
的には少なくとも３（たとえば、PKS遺伝子中２つの変異が別々にまたは組み合
わせて現れる）、より典型的には少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、
より好ましくは少なくとも５０であり、異なる変化をしたPKS遺伝子クラスター
およびPKS遺伝子産物の数をほぼ反映する。ライブラリーのメンバー数は任意に
選択できるが、開始ユニット、伸長ユニット、立体化学、酸化状態および鎖長に
関して上述した自由度は、著しく大きい。
【０１０７】 本発明の組換えベクターを好適なホストへ挿入する方法は、公知の技術であり
、典型的には、CaCl2または他の試薬の使用、たとえば、２価のカチオン、リポ
フェクション、接合、プロトプラスト形質転換およびエレクトロポレーションが
挙げられる。 たとえ、いくつかのホストが本来的には、シンターゼのアシルキャリアータン
パク質を活性化するための好適な翻訳後のメカニズムを含んでいないとしても、
幅広い種類のホストを使用できる。これらのホストには、そのような修飾をなさ
しめるのに好適な組換え酵素、たとえば、NysFを補足することができる。
【０１０８】 ポリケチドを生成するコロニーは、公知の技術を用いて同定し単離することが
でき、生成されたポリケチドはさらに特徴付けられる。これらのコロニーによっ
て生成されたポリケチドは、ライブラリーを表すためにパネル内で集合的に使用
でき、または、個々の活性を評価してもよい。 したがって、ライブラリーには４つのレベルが考えられる；（１）すべてナイ
スタチンPKSクラスターから誘導された、異なるPKSクラスターを含有し、異なる
PKSコード化配列をそれぞれ有する多様性コロニー、（２）コード配列により生
成されたPKSの一員であるタンパク質を含有するコロニー、（３）生成されたポ
リケチド、（４）ポリケチドから誘導された抗生物質。
【０１０９】 ライブラリーにおけるコロニーは、関連するシンターゼを生成するように誘導
することができ、したがって、ポリケチド候補のライブラリーを得るために関連
するポリケチドを生成するように誘導することができる。生成されたポリケチド
は、抗菌剤、抗癌剤、抗寄生虫剤、免疫抑制活性に関してスクリーニングできる
と同様に、望ましいターゲット、たとえば、レセプター、シグナルタンパク質な
どに関してスクリーニングできる。上清または培養ペレット自体をスクリーニン
グに用いることができ、またはポリケチドの部分的もしくは全体的な精製を最初
に行うことができる。典型的には、このようなスクリーニング方法は、ライブラ
リーの各メンバーとレセプターまたは他のターゲットリガンドとの結合の検出を
含む。結合は、直接的にまたは競合アッセイを通じて検出することができる。そ
のようなライブラリーの結合に関するスクリーニングの手段は、当業者によく知
られている。
【０１１０】 または、ライブラリーの各ポリケチドメンバーを、望ましいターゲットに対し
て試験することができる。この場合には、ターゲットの生物化学的応答を測定す
ることを特徴とするスクリーニングがより容易に挙げられる。 多数の新規なポリケチドを本発明の方法によって、後述する実施例で代表して
説明されるようにして調製することができる。これらの新規なポリケチドは、グ
リコシル化または上述した反応を通じて、抗菌活性を有する化合物の形成におけ
る有用な中間体となる。上記に示したように、個々のポリケチドは、好適な糖誘
導体と反応して、抗菌活性を有する化合物を得ることができる。抗菌活性は、典
型的なスクリーニングアッセイ、例えばLehrer,R.らJ.Immunol.Meth.(1991)137:
167-173に提案されているようなものを用いて確認することができる。
【０１１１】 したがって、本発明はさらなる面として、修飾されたナイスタチンPKSをコー
ドしているヌクレオチド配列を含む核酸分子を調製する方法を与える。前記修飾
されたナイスタチンPKSは、本明細書で定義されたナイスタチンPKS（すなわち、
天然に生じるナイスタチンPKS）から誘導され、酵素または他の機能的な活性を
コードする最初の領域、および足場材料であるアミノ酸配列をコードする第２の
領域を含有する本明細書で定義されたヌクレオチド配列によってコードされてお
り、前記方法は、 （ａ）最初の領域の少なくとも１つを修飾するか、または （ｂ）最初の領域の少なくとも１つを、異なるPKSをコードしているヌクレオチ
ド配列の足場材料をコードしている第２の領域に組み込む ことを含有してなることを特徴としている。
【０１１２】 上述したように本発明の核酸分子に関しては、最初の領域は本発明のヌクレオ
チド配列（すなわち、SEQ ID NO.１または２または35）のいずれかの部分（たと
えば、コードしているドメイン、モジュールまたはそれらの部分）でもよい。 また、（ｉ）上記で定義した修飾されたナイスタチンPKSを調製する方法も与
える。前記方法は、上記で定義したように調製した核酸分子をホスト細胞（すな
わち、そのような核酸分子を含み、培養または増殖させたホスト細胞）内で、修
飾されたナイスタチンPKSが発現するような条件下で、発現させることを含んで
なる。また、(ii)そのようにして生成されたか、そのようにして得られうる、修
飾されたナイスタチンPKSをも与える。
【０１１３】 そのような修飾されたPKSによって生成された新しいポリケチドもまた、本発
明の範囲内である。一般に、これらのポリケチドのグリコシル化された形態であ
る新しい抗生物質、または、異なる翻訳後修飾、たとえばヒドロキシル化または
酸化によりグリコシル化されていなくても活性を有する、いくつかの新しい抗生
物質としても同様である。
【０１１４】 これより、下記の限定的でない実施例において図を参照しつつ、本発明をより
詳細に述べることにする。
【０１１５】
【実施例】
【０１１６】
【実施例１】ナイスタチン（Nystatin）生合成遺伝子群のクローニング 細菌株、プラスミドおよび増殖条件 この研究で用いられた細菌株およびプラスミドを表3に示す。この研究の中で
発育させた新規の株およびプラスミドをここで説明し、図3に示す。S.noursei
培地（Oxoid）中で増殖させた。E.coli ET12567（pUZ8002）からStreprtomyces
株への属間接合を、「ヒートショック」時間を5分短縮した以外は、FlettらがFE
MS Microbial Lett.、155巻、223〜229頁（1997年）に記載したように実施した
。50mg/mlの濃度のアプラマイシン（Apramycin）（Fluka）を用い、固体培地上
のS.noursei被接合体を選択した。全DNA単離の前に、S.noursei ATCC11455被接
合体の接種のために、20μｇ／mlのアプラマイシンを添加したTSB液体培地を用
いた。E.coli株を、SmbrookらがCold Spring Harbor Laboratory（1989年）に記
載したように増殖させ、変換した。E.coli ET12567（pUZ8002）を、20μｇ／ml
のクロラムフェニコールおよび50μｇ／mlのカナマイシン（kanamycin）を含有
する培地上に保持した。
【０１１７】
【表１１】
【０１１８】 Ａｍ−アプラマイシン、Ａｐ−アムピシリ、Ｎｅｏ−ネオマイシン、Ｔｈｉｏ−
チオストレプトン、Ｋｍ−カナマイシン、Ｔｃ−テトラサイクリン二次代謝産物の分析 培養は、グルコース水溶液を90gl-1、NH4NO3を2.5gl-1、コーンフラワーを3.0
gl-1、MgSO4を0.4 gl-1、KH2PO4を0.2 gl-1、CaCO3を7 gl-1、微量元素溶液を3
ml含む1.3 1 SAO-23培地が最初に入っているApplicon 3-1培養器中で実施した。
微量元素溶液（gl-1）：FeSO4・7H2O、5.0；CuSO4・5H2O、0.39；ZnSO4・7H2O、0.4
4；MnSO4・H2O、0.15；NaMoO4・2H2O、0.01；CoCl2・6H2O、0.02；HCl、50。培養は
、HCl（2M）およびNaOH（2M）でpHを6.5〜7.0に調節しながら、28℃で実施した
。溶存酸素は、攪拌（300〜900rpm）および通気により飽和濃度の40％より高く
なるように調節した。SAO-23培地を含む培養用の接種物（3vol%）をTSB培地（TS
B、Oxoid CM129、37gl-1）中で、振盪フラスコ（を100mlの培地を含む500mlの邪
魔板付き三角フラスコ、200rpm）中28℃で増殖させた。各フラスコに0.2mlの胞
子懸濁液を接種し、18〜20時間培養した。培養後、培養物のジメチルホルムアミ
ド抽出物のHPLCによりナイスタチン（Nystatin）産物を分析した（Raatikainen,
J.、 Chromatogr.、588巻、356〜360頁（1991年））。DNA操作 プラスミド、ファージおよび全DNAの調製、エンドヌクレアーゼ消化、核酸連
結ならびに分画を、前述（Sambrookら、1989年、上述；Hopwoodら、1985年、上
述）したように実施した。QIAGENキット（QIAGEN GmbH）を用いてDNA断片をアガ
ロースゲルから単離し、ベーリンガーマンハイムのdigoxygeninキットを用いて
標識化し、メーカーの手順に準拠してサザンブロット分析に用いた。DNA配列の
決定は、QIAGEN GmbH（ドイツ）で実施し、データをGCGソフトウェア（Devereux
ら、Nucleic Acid Res.、12巻、387〜395頁、1984年）で分析した。S.noursei ATCC 11455ゲノム由来のPSKをコードしたDNA断片のPCR-援助増幅およ びクローニング ナイスタチン生合成遺伝子をコードするDNAを得るために、S.noursei ATCC 11
455遺伝子ライブラリーを標識化されたPSKをコードしたDNAを用いて探索した。D
NAプローブを得るために、公知のモジュラーPKSのβ−ケトアシル合成酵素（KS
）およびアシル担体タンパク質（ACP）領域内の変換されたアミノ酸部位に相当
する、改変オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。増幅に用いられる改変プ
ライマーは、公知のPKSのACPおよびKS領域中の変換されたアミノ酸モチーフに相
当し、Streptomyces用コドン使用表（Wright & Bibb、Gene、113巻、55〜65頁、
1992年）に従って設計された。ACPヌクレオチドプライマー（センス）は、GLU (
Asp) Leu Gly Phe (Leu, Val) Asp Ser Leuモチーフ（配列識別番号：21）に相
当し、5'-GAG/C CTG/C GGC/GT/CTG/C GAC CTG/C-3配列（配列識別番号：22）を
有した。KSヌクレオチドプライマー（アンチセンス）は、Val Asp Thr Ala Cys
Ser Serモチーフ（配列識別番号：23）に相当し、5'-G/CGA G/CGA G/ACA/ G/CGC
C/GGT GTC G/CAC-3'配列（配列識別番号：22）を有した。S.noursei ATCC11455
から単離された全DNAを、KSおよびACPオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、
この生物のゲノム由来のDNA断片のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）−支援増幅用鋳
型として用いた。モジュラーPKS上のモチーフの相対位置から、得られたPCR生産
物が約0.7kbの大きさであろうと仮定された。50μlのPCR混合液は、0.1μg のS.
noursei ATCC11455の全DNA、それぞれ25pmのACPおよびKSオリゴヌクレオチドプ
ライマーdNTP（最終濃度350μm）、拡張高忠実PCR系（ベーリンガーマンハイム
）の1xPCR緩衝液、および同じ反応系の1.5UのDNAポリメラーゼ混合物を含有した
。PCRは、以下のプログラムによりPerkin Elmer GeneAmp PCR System 2400で実
施した。96℃（4分）で1サイクルの改変、94℃（45秒）および70℃（5分）で35
サイクルの改変／アニーリング／合成、および72℃（7分）で1サイクルの最終ア
ニーリング／伸展。この手法で得られた0.7kb DNA断片は、E.coli DH5αのpUC1
8ベクター中でSure Clone Ligationキット（Pharmacia）を用いてクローン化さ
れた。得られた組換え型プラスミドの1つ3.5kbのpPKS72をDNA配列分析した。
【０１１９】 Escherichia coliベクターのpUC18中の次のクローニングおよび得られた0.7kb
のPCR生産物のDNA配列決定は、概念的翻訳およびデータベース探索により継続し
、それはPKSタイプIの部分をコードすることが確認された。このDNA断片を、フ
ァージベクターDASHIII（下記参照）中に構成されたS.noursei ATCC11455遺伝子
ライブラリーのスクリーニング用プローブとして用い、１つの組換え型ファージ
である、設計されたλDASHII-N1をプローブに交雑し、単離した。以下、さらに
説明するように、DASHII-N1をさらにプローブを形成するために用いた。S.noursei ATCC11455遺伝子ライブラリーの構築およびスクリーニング S.noursei ATCC11455遺伝子ライブラリーを、メーカーの指示に従ってファー
ジλベクターDASHII（Stratagene）に構築させた。S.noursei ATCC11455の全DNA
を、上述のHopwoodら（1985年）に記載されているように、単離し、特に、上述
のSambrookら（1989年）に記載されているように、Sau3 AI制限酵素を用いて消
化し、スクロース勾配で分画した。13〜17kbの大きさの断片を含むS.noursei AT
CC11455 DNAの画分を、BamHI制限酵素によって消化されたDASHIIベクターのアー
ムとともに核酸連結に用いた。E.coli XL1-Blue MRA (P2)（Stratagene）を遺伝
子ライブラリーの構築および伝播ための宿主として用いた。
【０１２０】 メーカーの指示に従って、遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのプ
ローブとして用いられるDNA断片を、QIAGENキット（QIAGEN GmbH、ドイツ）を用
いて、アガロースゲルから精製し、ベーリンガーマンハイム（ドイツ）のdigoxy
genin（DIG）キットを用いて標識化した。プローブを、ライブラリーのスクリー
ニングに用い、関連する組換え型ファージを発見した。
【０１２１】
【表１２】
【０１２２】プローブの説明 1. PKS72プローブ。制限酵素EcoRIおよびHindIIIを用いてpPKS72プラスミド（
上記参照）から単離された0.7kbのDNA断片をPKS72プローブとして用いた。 2. E12.1プローブ。その左側の隣接領域を示す、組換え型ファージN1の挿入断
片由来の2.6kbのBamHI断片を、pGEM3Zf(-)にサブクローン化し、プラスミドpGEM
(B2.6)-1を得た。このプラスミドをEcoRI/AvaIにより消化し、N1のDNA挿入断片
の左末端に相当する0.55kbの断片を精製し、E12.1プローブとして用いた。 3. E4.7.2プローブ。その右側の隣接領域を示す、組換え型ファージN1由来の4.
7kbのEcoRI断片を、pGEM3Zf(-)にサブクローン化し、プラスミドpGEM(E4.7)-1を
得た。このプラスミドをEcoRI/HindIIIにより消化し、N1のDNA挿入断片の右末端
に相当する1.5kbのDNA断片を精製し、E4.7.2の名づけた。 4. L42E9.1プローブ。組換え型ファージN42のDNA挿入断片の左側の隣接領域を
示す9.0kbのEcoRI断片を、pGEM3Zf(-)にサブクローン化し、プラスミドpH42E9.1
を得た。このプラスミドをEcoRI/BamHIにより消化し、N42のDNA挿入断片の左側
隣接に相当する0.6kbの断片を精製し、L42E9.1プローブとして用いた。 5. L58B1.0プローブ。組換え型ファージN58のDNA挿入断片の右側の隣接領域を
示す3.0kbのEcoRI断片を、pGEM3Zf(-)にサブクローン化し、プラスミドｐGEM(E3
.0)-58を得た。後者のプラスミドから、N58のDNA挿入断片の右末端に位置する1.
0kbのBamHI断片を精製し、L58B1.0プローブとして用いた。ナイスタチン生合成遺伝子群を用いた遺伝子分裂実験 DASHII-N1組換え型ファージから単離された4.2kbのBamHIのDNA断片を、まずE.
coliのpGEM3Zf(-)ベクターにクローン化し、プラスミドpGEM4.2-1を得た。クロ
ーニングされた断片の両末端のDNA配列を決定し、データベース探索後、PKSタイ
プIをコードすることを見出した。pGEM4.2-1にクローン化されたS.nourseiのDNA
断片を、制限酵素EcoRIおよびHindIIIを用いてこのプラスミドから切除し、ベク
ターpSOK201（表3および図3を参照）由来の3.0kbのEcoRI/HindIII断片と結合し
、E.coliに変換した。DNAが設計したプラスミドpKO(4.2)-1を、形質変換体から
回収した後、「細菌株、プラスミドおよび増殖条件」の実施例1に記載したよう
な接合によってS.noursei ATCC 11455に変換した。
【０１２３】 pKO(4.2)-1は、S.noursei ATCC 11455中で複製できないので、それは、相同組
換えを介してS.nourseiのゲノムに統合される自滅ベクターとして機能するであ
ろうと仮定した。そのような組換えの結果として、S.noursei ATCC 11455ゲノム
中のPKS遺伝子に対して、pKO(4.2)-1にクローン化された4.2kbBamHI断片が内部
的であると仮定し、そのPKS遺伝子は、そのコード領域の分裂によって不活性化
されているであろう。3つのS.noursei被接合体のゲノムへのpKO(4.2)-1の統合を
、pGEM4.2-1由来の標識化された4.2kbのBamHI断片をプローブとして用いてサザ
ンブロット分析により確認した。そのゲノムに統合されたpKO(4.2)-1を運搬する
S.nourseiの分裂変異体の1つを、親株のATCC11455（「二次代謝産物の分析」の
方法に関する上記を参照）と平行してナイスタチン生産物について試験した。後
者は期待したレベルでナイスタチンを生産することを示したが、pKO(4.2)-1の分
裂変異体中ではナイスタチン生産物は検出されず、ナイスタチン生合成に対する
同定されたPKSの要求が確認された。ナイスタチン生合成遺伝子群のクローニング ナイスタチン生合成用全遺伝子群をクローン化するために、組換え型ファージ
DASHII-N1（N1）のS.noursei DNAの挿入断片の末端から誘導され、次いで、組換
え型ファージと部分的に一致することを見出したDNA断片を、遺伝子ライブラリ
ーをスクリーニングするためのプローブとして用いた（プルーブに関する上記を
参照）。このふるいわけが、図4に示すように、S.noursei ATCC11455ゲノム（総
計約98kb）の2つの領域（それぞれ配列識別番号1および2）から構成される組換
え型ファージN14、N41、N42、N44、N45、N48、N58、N64、N69およびN76の単離と
なった。組換え型ファージN64から誘導された4.3kbのEcoRI/BamHIのDNA断片を用
いた（上述と同様に実質的に実施された）遺伝子分裂実験で、第二領域（配列識
別番号2）もナイスタチン生合成遺伝子をコードすることを確認した。ナイスタチン生合成遺伝子群のDNA配列分析 上述した組換え型ファージ由来の完全なDNA断片を、XbaIまたはEcoRIのいずれ
かの断片として、E.coli宿主のpGEM3Zf(-)ベクターにサブクローン化し、ヌクレ
オチド配列をこれら断片の両方のDNA鎖について決定した。ナイスタチン生合成
遺伝子群の2つの領域（それぞれ配列識別番号1および2）から構成されるDNA配列
のコンピュータ援助分析が、図４に示し、表4に列挙した遺伝子の同定となった
。
【０１２４】
【表１３】
【０１２５】 ＰＫＳsタイプＩをコードする３つの完全遺伝子（nysA、nysBおよびnysC）（S
EQ ID NO:1中）および１つの不完全遺伝子（nysI）(SEQ ID NO:2中)が識別され
た。当該４つの遺伝子でコードされる生成物のアミノ酸(aa)配列は、公知のＰKS
sタイプＩのaa配列と比較して分析される（上記表２の分子形態参照）。全て４
つのタンパク質は、リファマイシンおよびラパマイシンPKSsへの高い相同性度合
いを表すので（AparicioらGene, v. 169: 9-16, 1996、TangらGene, v.216: 255
-265, 1998）、ナイスタチンPKSsの推定的機能解析は、前者に対する比較に基づ
く。1366aaのNysAタンパク質は、KSS、AT、DH、KRおよびACPドメインを構成する
PKSの１つのモジュールにコードされる。KSSドメイン中の転化システイン残留物
の欠乏は、このモジュールが縮合反応を行うことができず、このため、ナイスタ
チンポリケチドバックボーン生合成のアセテートスタータを提供する負荷モジュ
ールを表すことを示唆している(Bisangら、Nature,v. 401:502-505, 1999)。Nys
Bの3192aa配列の解析は、KS、AT、KR、ACPおよび明らかに不活性なDHドメインと
ともに、２つのモジュールを含むことを示した。ATドメインは、双方のメチルマ
ロニルCoA-特定のATドメインとして特徴付けられるNysBモジュール表示特性で識
別された(HaydockらFEBS Lett., v. 374: 246-248, 1995)。NysBのこの特長は、
ナイスタチン分子中に組み込まれた２つの最も近いメチルマロニルのみが最初の
２つの拡張単位であるように、ナイスタチンポリケチドバックボーン生合成経路
に包含される１番目および２番目モジュールからなることを示唆している。1109
6aaのNysCタンパク質は、我々の知見によればこれまでに発見された最も大きい
細菌性ポリペプチドであり、ナイスタチンポリケチド鎖生合成（C21-C32の結合
）における縮合段階３〜８を、明らかな原因とする６つのモジュールから構成さ
れる。NysCタンパク質のモジュール５はERドメインを含み、これは、C29とC28と
の間の二重結合の還元を説明できる（図１参照）。モジュール５の他に、NysC中
の他の全てのモジュールは、これがすべてKS、AT、DH、KRおよびACPドメインを
含む場合において同様である。こうしてモジュール4および5中のKRドメインは、
aa配列レベルで100%同一であり、これらのドメインでコードされるDNA配列レベ
ルで99.9%同一であることがわかった。こうして、モジュール４および５におけ
るKRドメインは、おそらく、進化プロセスにおける相対的に近い複写の例を表す
。C末端でaa配列情報はまだ喪失していない、7066aaのNysI C末端切り形タンパ
ク質は、少なくとも４つの完全モジュールから構成される。全てのこれらモジュ
ールは、KS、AT、DH、KRおよびACPドメインを含んでいるが、３つのモジュール
中のDHドメインは明らかに不活性であり、NysI PKSの公知部分は12を経由して伸
長ステップ９を引き起こすこと（C13-C20の組み込み）を示唆している。この推
定は、さらにモジュール11（配列類似性に基づく）中のATドメインが、メチルマ
ロニルCoA増量剤として特異のものであり、一方、NysA、NysCおよびNysI中の全
て他のATドメインはマロニルCoA特異性であるという事実にサポートされる。こ
うして、モジュール１１中のATドメインは、おそらく、後に酸化されてC16連結
カルボキシルを与えるナイスタチンポリケチドバックボーン上のC16でメチル基
の出現の原因となる（図１参照）。
【０１２６】 おそらくナイスタチンPKSsから成熟したポリケチド鎖解放の原因であるnysC遺
伝子の下流、チオエステラーゼに関しコードした配列nysEが発見された。nysR1
、nysR2およびnysR3遺伝子がnysEの下流に見つけられた。これら遺伝子生成物は
、仮想転写レギュレーターに対して、均一である。NysR1(966a)、NysR2(953aa)
およびNysR3(927aa)タンパク質は全て、Ｃ末端でLuxRタイプのモチーフと結合し
ている推定ヘリクス-ターン-ヘリクス(HTH)DNAを含むことが見つけられた。その
他、NysR1は識別可能なATP/GTP結合モチーフを含み、NysR3はN末端に「ロイシン
ジッパー」（推定DNA結合）モチーフを含む。NysR1コード化遺伝子は、遺伝子の
先頭に近接した希TTAコドン（ロイ11）を含むことが発見され、NysR1発現は、bl
dA様遺伝子によって、翻訳レベルでS. nourseiに調整されてもよいことを示唆し
ている（White&Bibb, J. Bacteriol, v. 179: 627-633, 1997）。
【０１２７】 ナイスタチン生合成におけるnysR1遺伝子の関与を確認するため、遺伝子破壊
実験を、nysR1コード化配列に対して内部の1379bpApaIDNAフラグメントを使用し
て行った。nysR1コード化配列に対して内部でかつnt51531-52910のSEQ ID NO 1
で表す1379bp ApaIDNAフラグメントは、pGEM11Zf(-)ベクターのApaIサイトにク
ローン化され、組み換えプラスミドpNRD1を与える。pNRD1から分離された1430 b
p EcoRI/HindIII DNAフラグメントは、結果としてpNRD2ベクターとなるpSOK201
の3.0kb EcoRI/HindIII フラグメントと連結した。後者は、続いてE. coli ET12
567(pUZ8002)から接合を介して、S. noursei ATCC11455におけるnysR1遺伝子破
壊に使用された。
【０１２８】 ｎysR1破壊変異体によるナイスタチン生成の解析は、ナイスタチンを生成する
能力が無いことを示す。しかしながら、nysR1破壊変異体から観察された表現形
は、nysR1と共転写しうるnysR2およびnysR3遺伝子上の破壊の極性効果に影響し
うることがわかる。 ｎysR3の下流、遺伝子nysR4、nysR5、ORF1およびORF2がみつかった。210aaの
ｎysR4遺伝子生成（これは、続いて、SEQ ID No. 35におけるヌクレオチド12062
8で上流開始コドンから266aa発現を検出する）は、応答調節タイプの転写活性化
物質への類似性を示し、中心に位置したATP/GTP結合およびC-末端に位置したLux
R型HTH 結合モチーフを含む。253aaのNysR5タンパク質は転写抑圧物質に類似性
を表示し、かつＮ末端で推定DeoR型HTH DNA結合モチーフを含む。ｎysR4およびn
ysR5遺伝子生成は、ナイスタチン生合成遺伝子への近位の局在に基づくナイスタ
チン生合成の規則性を包含しているようである。ｎysR5の下流に位置し、かつ反
対方向へ転写されるORF2は、転写活性化物質と類似性を示しかつ中心に位置した
推定AsnC型HTH DNA結合モチーフを有する354aaペプチドとコードされる。ナイス
タチン生合成の規則性を包含するこの遺伝子は、ORF1のように、直ちにORF2の上
流に位置するかどうか明白ではないが、推定ペプチターゼにコードされる。ORF2
はむしろORF1の規則性を包含しているが、しかし確認すると、ORF2不活性におけ
る実験が要求されるようである。ペプチターゼにコードした遺伝子はナイスタチ
ン生合成における役割は何ら与えられていないが、配列領域の右隣接上に見いだ
されたという事実は、ナイスタチン生合成遺伝子クラスターの右境界を定義され
ることを示唆する。
【０１２９】 上記したように遺伝子を包囲した配列領域の左側上で、nysAの上流に位置し、
かつ、nysAと反対方向に転写される２つの遺伝子が定義される（図４）。506aa
のnysD1遺伝子生成は、ほ乳類からのUDP- グルクロノシルトランスフェラーゼへ
のかなりの相同を示す。この酵素は、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ系統群
に属し、かつ脱クリコシル反応の途中で、潜在的毒性生体異物の除去プロセスに
参加する。ｎysD1は、ナイスタチンポリケチドバックボーンへのデオキシ糖部分
（ミコサミン）の付着の原因となるグリコシルトランスフェラーゼを示すようで
ある。ｎysD2生成は、ペロサミン合成酵素とその生合成プロセスにおけるデオキ
シ糖へのアミノ基の付着の原因となるトランスアミナーゼとの高い度合いの相同
性を示す。こうしてnysD2は、おそらくミコサミン生合成に包含されるアミノト
ランスフェラーゼを示す。
【０１３０】 PKSタイプIにコードされるｎysIの他、４つの他の遺伝子が、S. noursei ATCC
11455のナイスタチン生合成遺伝子クラスターの２番目の配列領域に（SEQ ID NO
.2）定義された（図４）。ｎysD3遺伝子によってコードされた344aaタンパク質
は、デオキシ糖形成に要求されるGDP-マンノース-4,6-デヒドラターゼへの高い
相同性がある。NysD3タンパク質は、S. noursei ATCC11455におけるナイスタチ
ンミコサミン部分の生合成を包含されやすい。584aaおよび605aaのｎysＨおよび
nysG遺伝子生成は、それぞれ、ABS系統群の輸送体に高い度合いの類似性を示す
。NysＨおよびNysGポリペプチドは両方とも、Ｃ末端、中心に局在したATP/GTP結
合モチーフ、およびN末端に局在した膜貫通領域で、異なるABC輸送体サインを含
む。これらの２つのタンパク質は、おそらく生産生物からナイスタチンのATP依
存活性流出の原因となり、こうして、疎水性ナイスタチン分子によって膜が塞が
れる危険を排除する。245aaポリペプチド、nysF遺伝子の生成は、4'-フォスフォ
パンテセイントランフェラーゼへの相同性を示す。後者の酵素は、PKSsのACPド
メイン翻訳後修飾の原因となり、かつその充分な機能性が要求される（CoxらFEB
S Lett., v. 405:267-272, 1997; KealeyらProc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 95
:505-509, 1998）。このため、NysFタンパク質は、ナイスタチンPKSsの翻訳後修
飾において機能し、かつナイスタチン生合成に要求される。
【０１３１】
【実施例２】新規ポリエン抗生物質の生成に導くナイスタチンPKS遺伝子の遺伝子的処置 ナイスタチンは、３〜８の共役２重結合をマクロラクトン環内に有することを
特徴とするポリエンマロクライド化合物の群に属する。ナイスタチン自体は、テ
トラエンであり、C20とC27の間に、４つの共役二重結合を有する。またナイスタ
チン分子上には、C28-C29近傍の４つの共役結合のセットから離れ、C30とC33と
の間に２つの二重結合のセットがある（図１参照）。NysC PKSのコンピューター
アシスト解析から、このタンパク質中のモジュール５におけるERドメインは、C2
8とC29との間の二重結合の還元の原因となることが明らかになる。このようにし
て、この特定ドメインは不活性となることで、C28とC29の間に二重結合を有する
化合物を得ることは理論的には可能となり、ナイスタチン分子中で共役二重結合
の２つのセットが結合し、かつヘプタエンマクロライド化合物が創造さする。
【０１３２】 NysＣのモジュール５におけるERドメインを不活性にするため、nysＣ遺伝子の
なかで“インフレーム”欠損方法が選択された。S.nourseiのNsyCコード化ゲノ
ム領域における遺伝子置換へのベクターpERD4.2の構成は、以下のように示され
た：NysCのモジュール５におけるERドメインの不活性 NysCのモジュール５におけるERドメインのＣ末端部分へのコード化配列および
(nt32174-32559)モジュール５におけるKRドメインのN末端へのコード化配列を示
す394bp DNAフラグメントのPCRアシスト増幅が実行された。オリゴヌクレオチド
プラマーERD1(5'-GTTGGTACCCCACTCCCGGTCCGCAC-3、センス)(SEQ ID NO.25)はKpn
I制限酵素切断サイトを創造するため、5'エンド上の追加ヌクレオチドとともに
、nt 32174-32190を構成するnysC遺伝子のヌクレオチド配列から選択された。オ
リゴヌクレオチドプライマーERD2 (5'-CCAGCCGCATGCACCACC-3'、アンチセンス(
SEQ ID NO.26))は、nysＣコードDNA配列から選択され、かつSphI制限酵素切断サ
イトを含むnt32559-32542(SEQ ID NO.1)の間のDNAセグメントから構成された。
結果として得られるPCRフラグメントは、KpnIおよびAphIで消化され、1828 bp B
amHI/KpnI DNA フラグメント(SEQ ID NO.1のnt 29224-31052)と1273 bp SphI/Ec
oRI DNA フラグメント(SEQ ID NO.1のnt 32548-33821)はともに、pGEM3Zf(-)ベ
クターに消化されるEcoRI/BamHIに連結された。連結混合物はE.coli. DH5αに転
換され、pERD4.1と命名される6.7kbの組み換えプラスミドが転換体の１つから回
収された。後者は、nysCコード化領域のnt 31052とnt 32174との間の内部欠損を
ともなうnt 29224-33821のSEQ ID NO. 1を表すハイブリッドDNAフラグメントを
含んでいた。この欠損は、DH-ER内部ドメインリンカー部分および推定NADP(H)結
合サイトを含むERドメインのＣ末端部分に、コード化領域（nysＣのaa 4837から
5208）を除去した。
【０１３３】 ベクターをS.nourseiにおけるNysC ERドメイン不活性に構成するため、組み換
えDNAフラグメントは、pERD4.1からEcoRIおよびHindIII制限酵素で励起され、か
つpSOK201から3.0kb EcoRI/HindIII DNAフラグメントで連結され、連結混合物は
E.coli. DH5αに転換された。6.5kbのプラスミドpERD4.2は、転換体の１つから
分離され、S.nourseiATCC11455における遺伝子置換手順を実行するために使用さ
れた（以下参照）。この手順の後に選択された組み換えS.noursei株はERD44およ
びERD48を命名される。
【０１３４】 後者のプラスミドは、S.nourseiATCC11455に、属間接合によって導入され、１
つのトランス接合個体、S.noursei(pERD4.2)は、さらなる処置が選択された。S.
noursei(pERD4.2)のゲノムにpERD4.2の正しいモードの組み込みがサザンブロッ
ト解析によって確認された後、二次交差イベントがSekurovaらFEMS Microbil Le
tt, v.177:297-304, 1999(および前記参照)に記載されたように行われた。遺伝子置換手順 この方法は、前記Sekurovaら1999に記載されたようにして行われる。
【０１３５】 上記のように遺伝子置換に構成されたプラスミドは、S.nourseiにE.coli ET12
567(pUZ8002)からの接合によって導入された。相同的組み換えを通して、染色体
にプラスミドが組み込まれたクローンの１つは、抗生物質フリーのISP2寒天培地
の上に、３回胞子形成を行い、３回終わった後の子孫は、抗生物質抵抗マーカー
の損失をテストした。適当なプローブで、いくつかの抗生物質感応株から分離さ
れた全DNAのサザンブロット解析は、所望の変異を確認するために使用された。
【０１３６】 選択マーカーが喪失し、二次交差イベントが行われた８つのコロニーの内、４
つはサザンブロット解析により、野生型遺伝形質に戻ることを示した。２つの株
「は、２つの他の変異体が所望の1116bp欠損あるいは期待した(ERD48)より多少
大きい欠損を含む一方で、ナイスタチン遺伝子クラスターの実質的部分を明らか
に排除した大きな欠損を含むことを示した。株ERD44およびERD48によるポリエン
抗生物質生成の解析は、それらがナイスタチンによって製造されないことを示し
た。その代わりに、ERD44は、期待していたように、ヘプタエンに特徴付けられ
るUVスペクトルピークを有するポリエン化合物を生じることが示された。驚くべ
きことに、ERD48変異体は、NysCタンパク質から完全なモジュール５のインフレ
ーム欠損をともなう構成要素である（分光学的解析により）ヘキサエンポリエン
を生じることが示された。ERD48変異体中で起こるイベントをさらに詳細に調べ
るため、DNAフラグメントは、かかる欠損の推定生成を包含するS.noursei ERD48
変異体のゲノムからPCR増幅した（以下参照）。ＰＣＲアシスト増幅およびS.nourseiERD48ゲノムからPKSコード化DNAフラグメン トのクローン化 S.nourseiERD48における変異体nysC遺伝子の部分の増幅を目的としたPCR反応
は、それぞれSEQ ID NO.1のDNA配列のnt 24744-24760およびnt 33818-33833に相
当する、オリゴノヌクレオチドプライマーKR48.1（センス、5'-CCG CGT CGG ATC
CGC CGA C-3'）(SEQ ID NO: 27)およびKR48.2(アンチセンス、5'-AGC CTT CGA
ATT CGG CGC C-3')(SEQ ID NO: 28)を用いて行われた。50μlのPCR混合物は0.1
μgのS.nourseiERD48全DNA、25pmの各KR48.1およびKR48.2オリゴヌクレオチドプ
ライマー、dNTPs（最終濃度350μm）、エキスパンドハイフィデリティPCRシステ
ム（Boehringer Mannheim）からの1xPCRバッファー、および同システムからの1.
5UのDNAポリメラーゼ混合物を含む。PCRは、下記プログラムをともなうパーキン
エルマーゲネアンプPCRシステム2400で行った：96℃（４分）で１サイクル改変
、94℃（４５秒）および70℃(10分)で35サイクルの改変/アニーリング/合成およ
び、および72℃(10分)で１フルサイクルの最終アニーリング/伸長。この手順で
得られた2.7kb DNAフラグメントは、EcoRIおよびBamHI制限酵素とともに消化さ
れ、同じ酵素とともに消化されるpGEM3Zf(-)ベクターDNAとともに連結された。
連結混合物は、変換によってE.coli DH5αに導入され、5.9kbのプラスミドpKR48
は変換体の１つから分離され、DNA配列解析が行われた。
【０１３７】 PKR48中の挿入DNA配列は、SEQ ID NO. 29（ここではERD48配列として定義され
る）中に存在している。翻訳生成物は、SEQ ID NO. 30に示され、かつ899aaタン
パク質であり、SEQ ID NO. 29および30の分子形態は以下に示される：
【０１３８】
【表１４】
【０１３９】 この２７００ｂｐ断片のクローニングおよびＤＮＡ配列決定により、該断片が
ハイブリッドＰＫＳモジュールの一部をコードすることが確認され、そのコード
された部分は、ＮｙｓＣのモジュール４および５の相同性の高いＫＲドメインを
コードするＤＮＡ配列間の組み換えと一致する。この組み換えにより、モジュー
ル４のＫＲおよびＡＣＰドメインのＣ末端部、ＫＳ、ＡＴ、ＤＨおよびＥＲドメ
イン、およびモジュール５のＫＲドメインのＮ末端部が明らかに削除され、結果
としてＮｙｓＣ ＰＫＳからモジュールが一つ完全に失われる。
【０１４０】 Ｓ.ｎｏｕｒｓｅｉ ＥＲＤ４４およびＥＲＤ４８から生成された化合物を予
備的に分析した。ＥＲＤ４４突然変異体から生成されたヘプタエン系化合物は、
抗真菌活性試験で使用された菌であるカンジダアルビカンスに対して高い抗真菌
活性を有することが分かった。この時点では、上記化合物（仮にＳ４４とする）
は、まだ十分精製されておらず、その正確な濃度も推定することが困難であるた
め、該化合物の抗真菌活性を正確にアッセイすることは不可能である。しかし、
ナイスタチン、Ｓ４４、およびアムホテリシン（ヘプタン系マクロライド）に特
有な波長における紫外線吸光度に基づいて概算すると、Ｓ４４はナイスタチンと
比較して４〜５倍高い抗真菌活性を有しているようである。ＥＲＤ４８突然変異
体から製造された化合物を高速液体クロマトグラフィーで分析すると、この菌株
（混合体Ｓ４８とする）から、滞留時間の異なるヘキサン系マクロライドが少な
くとも５つ生成されることが分かる。これは恐らく、Ｃ１９でのグリコシリル化
、Ｃ１０での水酸化、あるいはＣ１６でのメチル基の酸化による、マクロラクト
ン環の改変状態の違いを示していると思われる。この予想の根拠は、マクロラク
トン環のサイズ縮小が、変異酵素の新培養基に対する親和性につながることは大
いにあり得るためである。
【０１４１】 混合体Ｓ４８の抗真菌活性を試験した結果、該抗真菌活性はナイスタチンの抗
真菌活性の約１０％であることが分かった。検出された抗真菌活性は、環を変成
する酵素によって完全に装飾されたＥＲＤ４８から生成される混合体Ｓ４８中の
化合物の一つのみから由来するようである。よって、精製前にこの化合物の相対
的な抗真菌活性を評価することは不可能である。いくつかのヘキサン抗生物質は
抗真菌活性と共に抗菌活性を有することが知られている（Ｃｉｆｔｃｉ、ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ、ｖ．３７：８７６−８８４、１９８４）。よっ
て、ＥＲＤ４８突然変異体から生成されるヘキサン系化合物を、抗菌剤の製造に
使用することが可能である。ＥＲＤ４４突然変異体およびＥＲＤ４８突然変異体
中の新ポリエン化合物の製造につながるＮｙｓＣタンパク質の変化、 ならびに該突然変異体のマクロラクトン環の推定構造を図５に示す。ＮｙｓＣのモジュール８におけるＤＨ８ドメインの不活性化 ナイスタチンＰＫＳを遺伝子的に操作する可能性を、さらにＮｙｓＣのモジュ
ール８におけるＤＨドメインを不活性化することにより実証した。プラスミドｐ
ＮＰＲ１．１とＮｙｓＣ遺伝子とを組み換えると、ＤＨ８ドメインをコードする
ＤＮＡ領域がフレーム単位で削除される結果となる。上記プラスミドｐＮＰＲ１
．１は下記のように構成した。
【０１４２】 ３９８９ｂｐのＫｐｎＩ／ＢｃｌＩ ＤＮＡ断片（領域１ＤＮＡ配列（配列識
別番号１）のｎｔ４３００４〜４６９９３）および２４０９ｂｐのＢａｍＨＩ／
ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片（同上のｎｔ４７６８０〜５００８９）を、組換え型フ
ァージＮ１のＤＮＡから切断し、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＧＥＭ
３Ｚｆ（−）ＤＮＡベクターと連結した。連結混合体をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ
に形質転換し、一方の形質転換体からプラスミドｐＧＥＭ−ＮＰＲ１を分離した
。該プラスミドｐＧＥＭ−ＮＰＲ１は、領域１ＤＮＡ配列（配列識別番号１）の
ｎｔ４３００４〜５００８９を表すハイブリッドＤＮＡ断片を含んでおり、ｎｔ
４６９９３からｎｔ４７６８０の間は欠失していた。この欠失により、ＮｙｓＣ
ポリペプチドのａａ１０１５０から１０３７８をコードするＤＮＡ領域が除去さ
れ、それによりモジュール８のＤＨ８ドメイン、およびモジュール８のＤＨ８−
ＫＲドメイン間のリンカーが影響される。Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉにおけるＮｙｓＣ
のＤＨ８ドメインを不活性化するためのベクターを構成するため、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、組換え型ＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−ＮＰＲ
１から切断し、ｐＳＯＫ２０１からの３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
ＤＮＡ断片と連結し（図３および表３参照）、連結混合体をＥ．ｃｏｌｉ Ｄ
Ｈ５αに形質転換した。９．４ｋｂのプラスミドｐＮＰＲ１．１を一方の形質転
換体から分離し、上記引例Ｓｅｋｕｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．、１９９９に準拠し
た方法によりＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５の遺伝子組換えを実践す
る際に使用した。
【０１４３】 上記方法後に選択された組換え型Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ菌株は、ＮＰＲ１．１と
標識した。該Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ組換え型菌株ＮＰＲ１．１は、サザンブロット
法で分析した結果、ＮｙｓＣのＤＨ８をコードする配列において好ましい欠失形
態を有することが分かった。前記Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ組換え型菌株ＮＰＲ１．１
の培養物から抽出した抽出物中の二次代謝生成物を薄層クロマトグラフィー（Ｔ
ＬＣ）で分析したところ、予想されていたマクロライド化合物の存在が明らかに
なった。これら化合物の相対移動度はナイスタチンとは異なり、上記抽出物から
は、ナイスタチンに特有な紫外線領域は検出されなかった。分析により、ＮＰＲ
１組換え体によって新しく生成された分子内において、ナイスタチンアグリコン
上の４つ一組の二重結合が妨害されており、さらにマクロラクトン環がＣ２３に
結合した水酸化基を含有することが示された（表５）。ＮＰＲ１培養抽出物を使
用して製造されたカンジダアルビカンスに対するバイオアッセイが極めて低い抗
真菌活性を示したため、上記化合物をＮＰＲ１から精製する試みはなされなかっ
た。しかし、ＮＰＲ１突然変異体は、ナイスタチンＰＫＳを用いた更なる操作に
有用に使用され得る可能性がある。モジュール７（ＮｙｓＣ）におけるＫＲドメインの不活性化 ４４０４ｂｐのＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩを用いて、
組換え型ファージＮ１のＤＮＡから切断した。ファージＮ１のポリリンカーにお
いて、ＥｃｏＲＩサイトは、領域１ＤＮＡ配列（配列識別番号１）のｎｔ３８３
９８において開始するＳ．ｎｏｕｒｓｅｉＤＮＡ挿入断片の左側に位置し、Ｓｍ
ａＩサイトは領域１ＤＮＡ配列のｎｔ４２８０２に相当する。３３０３ｂｐのＤ
ＮＡ断片を、制限酵素ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩを用いて、同じ組換え型ファー
ジのＤＮＡから切断した。ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素サイトは、それぞ
れ領域１ＤＮＡ配列（配列識別番号１）のｎｔ４３０９９およびｎｔ４６４０２
に位置していた。両ＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化
したｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）ＤＮＡと連結し、連結混合体を大腸菌ＤＨ５αに形質
転換した。１０．７ｋｂのプラスミドｐＧＥＭ−ＮＰＲ２を一方の形質転換体か
ら回収した。該プラスミドｐＧＥＭ−ＮＰＲ２は、領域１ＤＮＡ配列（配列識別
番号１）のｎｔ３８３９８〜４６４０２を表す組換え型ＤＮＡ断片を含有してお
り、ｎｔ４２８０２からｎｔ４３０９９の間は欠失していた。この欠失により、
モジュール７のＫＲドメインにおいて推定ＮＡＤＰ（Ｈ）結合部位を包含するＮ
ｙｓＣタンパク質の、ａａ８７５３から８８５１をコードするＤＮＡ領域が除去
される。Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉにおけるＮｙｓＣのＫＲ７ドメインを不活性化する
ためのベクターを作成するため、組換え型ＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＧＥＭ−ＮＰＲ２から切断し、ｐＳＯＫ２０１か
らの３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片と連結し、連結混合
体をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。１０．７ｋｂのプラスミドｐＮＰ
Ｒ２を一方の形質転換体から分離し、上記引例Ｓｅｋｕｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．
、１９９９に準拠した方法によりＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５の遺
伝子組み換えを実践する際に使用した。
【０１４４】 前記Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ組換え型菌株ＮＰＲ２．１の培養物から抽出した抽出
物中の二次代謝生成物をＴＬＣで分析したところ、予想されていたマクロライド
化合物の存在が明らかになった。これら化合物の相対移動度はナイスタチンとは
異なっており、さらにＮＰＲ１突然変異体から生成された代謝生成物とも異なっ
ていた。上記抽出物からは、ナイスタチンに特有な紫外線領域は検出されなかっ
た。分析により、ＮＰＲ２．１組換え体によって新しく生成された分子内におい
て、ナイスタチンアグリコン上の４つ一組の二重結合が妨害されており、さらに
マクロラクトン環がＣ２５においてケト基を含有することが示された（表５）。
上記化合物をＮＰＲ２．１から精製する試みはなされず、また、培養抽出物ＮＰ
Ｒ２．１を使用しての抗真菌活性を検査するバイオアッセイは行われなかった。
上記突然変異体は、生成する代謝物の利点を有するだけでなく、ナイスタチンＰ
ＫＳを用いた更なる操作に使用することができる。変異ＮｙｓＣタンパク質ＮｙｓＣ＿ＤＨ８のモジュール５におけるＥＲドメイン の不活性化 第二突然変異体を、モジュール８において不活性ＤＨドメイン（ＮｙｓＣ＿Ｄ
Ｈ７）を有するＮｙｓＣタンパク質に導入するため、プラスミドｐＥＲＤ４．２
をＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ突然変異体ＮＰＲ１．１に導入し、上記引例Ｓｅｋｕｒｏ
ｖａ ｅｔ ａｌ．、１９９９の記載に準拠して遺伝子組み換え作業を行った。
これにより、ＮｙｓＣの配列をコードするＥＲ５およびＤＨ８中に突然変異体を
有する、組換え型Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ菌株ＥＲＤＨ９が生成された。この二つの
突然変異体の組合せにより、Ｃ２３に水酸化基を有するペンタエニックナイスチ
ン誘導体が生合成されると推測される（表５）。ＥＲＤＨ９培養抽出物を予備分
析したところ、数量的にはその紫外線スペクトルを正確に認識することは困難で
あるが、上記菌株によってポリエン化合物が生成されていることが確認された。
この予備分析の結果により、さらに上記化合物が好ましくは培養上清に蓄積され
、野生型Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉにより生成されるナイスタチンは大部分が菌糸体と
結合していることが分かった。このことは、ナイスタチン分子上の付加的な水酸
化基が、化合物の水溶性向上の要因であるという仮設と合致する。上記新化合物
の精製はなされず、また、バイオアッセイも行われなかった。
【０１４５】 本発明者は、現在のところ突然変異体ＮＰＲ１．１、ＮＰＲ２．１およびＥＲ
ＤＨ９の生成物の構造を確認できていない。
【０１４６】
【表１５】
【０１４７】
【実施例３】ナイスタチンの大量生成につながる調節遺伝子の操作 Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５における、ＰｅｒｍＥ*プロモーター
制御下のＮｙｓＲ１の発現 ＮｙｓＲ１遺伝子がナイスタチン生合成遺伝子の転写活性化因子をコードする
ことをさらに確認するため、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５において
ＰｅｒｍＥ*プロモーター制御の下、ＮｙｓＲ１遺伝子を発現させた（Ｂｉｂｂ
ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ｖ．１４：４３３−５４５、
１９９４）。まず、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５ゲノムに安定・効
率的に組込まれるプラスミドｐＳＯＫ８０４を調製した（図２）。上記調製は、
ｐＳＥＴ１５２（上記引例Ｂｉｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２）からの３
．０ｋｂのＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片と、部位特異的組込みに必要
な官能基を有するバクテリオファージＶＷＢ（上記引例Ｖａｎ Ｍｅｌｌａｅｒ
ｔ ｅｔ ａｌ．、１９９８）からの２．３ｋｂのＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断
片とを連結することによりなされた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７（ｐＵＺ８
００２）からのｐＳＯＫ８０４をＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１４５５と接合
したところ、上記プラスミドは、特に周波数３〜１０-6において、Ｓ．ｎｏｕｒ
ｓｅｉゲノムの１サイト中に組込まれることが示された。
【０１４８】 ｐＳＯＫ８０４において、ＰｅｒｍＥ*プロモーター制御の下ＮｙｓＲ１遺伝
子をクローンするため、以下の方法を採用した。ＮｙｓＲ１のＮ末端部を、組換
え型ファージＮ１ＤＮＡテンプレートから、オリゴヌクレオチドプライマーＮＲ
１．１（センス）５'−ＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＣＡＣＧ
Ｔ−３'（配列識別番号３１）およびＮＲ１．２（アンチセンス）５'−ＧＧＣＧ
ＣＧＡＣＣＣＧＧＴＴＣＧＧＣＣＴ−３'（配列識別番号３２）を用いて、ＰＣ
Ｒ増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーＮＲ１．１の配列は、配列標識番号
１のｎｔ５１３７６〜５１３９１に対応しており、５'位端部にヌクレオチドＣ
ＧＣＣＧＣＡＴＧＣが接合しているため、ＳｐｈＩエンドヌクレアーゼ用サイト
を形成している。オリゴヌクレオチドプライマーＮＲ１．２は、配列標識番号１
のｎｔ５１９６４〜５１９８２に対して補足的な配列と対応しており、ＡｇｅＩ
エンドヌクレアーゼ用制限酵素認識部位を包含していた。０．６ｋｂ断片を、実
施例１に記載の条件下で、ファージＮ１ＤＮＡをテンプレートとして使用してＰ
ＣＲ増幅し、ＳｐｈＩおよびＡｇｅＩで消化した。消化した０．６ｋｂの断片を
、ファージＮ１挿入断片（ファージのポリリンカーから開始するＥｃｏＲＩサイ
ト）からの２．８ｋｂのＡｇｅＩ／ＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片と共に、ＳｐｈＩお
よびＥｃｏＲＩで消化したｐＧＥＭ７Ｚｆ（−）ベクターに連結した。上記連結
において使用した２．８ｋｂ断片は、配列標識番号１のｎｔ５１９７１〜５４８
１４に対応しており、ＮｙｓＲ１のＣ末端部およびＮｙｓＲ２のＮ末端部（Ｎｙ
ｓＲ２の最初の１６２ａａをコードする）を包含していた。この連結によって得
られた組換え型プラスミドをｐＮＲＥ１と標識した。ｐＮＲＥ１からの３．５ｋ
ｂのＳｐｈＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を、ＰｅｒｍＥ*プロモーターを含
有するｐＧＥＭ７ｅｒｍＥＬｉ（表３参照）からの０．３ｋｂのＥｃｏＲＩ／Ｓ
ｐｈＩ断片と共に、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＳＯＫ８０４ベク
ターに連結した。得られたプラスミドｐＮＲＥ２を、接合（実施例１参照）によ
りＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５中に導入し、組換え型菌株Ｓ．ｎｏ
ｕｒｓｅｉ（ｐＮＲＥ２）を生成した。還元グルコース培養液の入った振盪フラ
スコ内での、上記菌株によるナイスタチン生成を分析したところ、上記菌株によ
るナイスタチン生成は野生型菌株と比較して５０％多いことが分かった。これは
、ＰｅｒｍＥ*プロモーターからのＮｙｓＲ１の過剰発現が原因と思われる。以
上のことから、ＮｙｓＲ１遺伝子は、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ菌株でのナイスタチン
およびその誘導体の生成を向上させるために使用される正の活性化因子をコード
すると思われる。Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５におけるＮｙｓＲ５遺伝子の部分的除 去 ナイスタチン生合成の調節において翻訳領域のＤＮＡ配列の分析（実施例１参
照）を通して推測された、ＮｙｓＲ５遺伝子の機能を確認するため、Ｓ．ｎｏｕ
ｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５ゲノムに特定の突然変異を導入した。ここで報告
されるヌクレオチド配列のｎｔ６２０３７〜６３３６０を包含するＳ．ｎｏｕｒ
ｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５ゲノムからのＤＮＡ断片を、プライマーＮＲ５Ｄ１
（５'−ＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＣＡＡＣＴＣＡ−３'）（
配列認識番号３３）およびＮＲ５Ｄ２（５'−ＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＧ
ＡＣＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＣ−３'）（配列認識番号３４）を用いてＰＣＲ増幅
した。ＰＣＲ増幅の条件は上記の通りである。１３４１ｂｐのＰＣＲ生成物をＮ
ｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１６８８ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ
ＤＮＡ断片（ｎｔ６０３０１〜６１９８９）およびｐＳＯＫ２０１からの３．０
ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結した。得られたプラスミドｐＮＲ
５Ｄは、上記Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＤＮＡ断片を含有しており、ＮｙｓＲ５遺伝
子の翻訳領域において４３ｂｐが欠失していた。この欠失により、ＮｙｓＲ５の
翻訳領域においてフレームシフト突然変異が発生し、生成物の切断につながる。
そのような切断の結果、ＮｙｓＣＲ５の１６５のＣ末端アミノ酸は除去され、別
の読み枠でコードされる１４のアミノ酸で置換される（よって、ＮｙｓＲ５とは
異質となる）。ｐＮＲ５Ｄを用いて、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ１１４５５
における遺伝子組み換え作業を、上記引例Ｓｅｋｕｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．、１
９９９の記載に準拠して行った。
【０１４９】 遺伝子組み換えによって導入された突然変異体により、野生型Ｓ．ｎｏｕｒｓ
ｅｉと比較して、得られる組換え型菌株ＮＲ５Ｄによるナイスタチン生成が５〜
１５％増加した。ナイスタチンの生合成において、ＮｙｓＲ５のＣ末端部を除去
することの、小さいながらも再現性のあるプラス効果は、コンピュータによる分
析（実施例１）に基づき推定する、このタンパク質が担うリプレッサーとしての
機能と関連している。ＮｙｓＲ５遺伝子に対して除去を行っても、該タンパク質
においてＮ末端の位置に確認される推定上のヘリックス・ターン・ヘリックス
モチーフは除去されないことから、切断されたＮｙｓＲ５ポリペプチドの残効抑
制作用は、ナイスタチン生成においての、上記突然変異の比較的小さな効果の要
因となり得る。だが、この結果は、ナイスタチンおよびその誘導体の生成を向上
させるための更なる手段として、リプレッサーをコードする遺伝子に突然変異を
導入することの利点を確認するものである。
【０１５０】
【実施例４】ナイスタチン生合成遺伝子クラスター配列決定の完成 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１からＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の間隙に及ぶＤＮＡ配列
は、この領域をカバーする組換え型バクテリオファージＮ２０，Ｎ３２，Ｎ９５
，Ｎ９８およびＮ９９の重なった組み込み上の両ＤＮＡ鎖に対して決定された。
【０１５１】 配列決定に用いた手段、プローブ生成およびスクリーニングは実施例１に記載
したとおりである。ライブラリースクリーニングに用いたプローブおよび発見さ
れた関連する組換え型バクテリオファージは下記のとおりである： ＰＫＳ ７２ Ｎ２０，Ｎ３２ Ｌ４４ＥＳ３．５ Ｎ９０ Ｌ７６ＳＮ０．５ Ｎ９５ Ｌ２０Ｓ０．６４ Ｎ９８，Ｎ９９プローブの記載 ６． Ｌ４４ＥＳ３．５プローブ． 制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩにて
、バクテリオファージＮ７６から隔離された３．５ｋｂ ＤＮＡフラグメントが
、Ｌ４４ＥＳ３．５プローブとして使用された。
【０１５２】 ７． Ｌ７６ＳＮ０．５プローブ． 制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩにて、
組換え型バクテリオファージＮ４４から隔離された０．５ｋｂ ＤＮＡフラグメ
ントが、Ｌ７６ＳＮ０．５プローブとして使用された。 ８． Ｌ２０Ｓ０．６４プローブ． 制限酵素ＳａｌＩにて、プラスミドｐＬ
２０ＥＢ３．７から隔離された０．６４ｋｂ ＤＮＡフラグメントが、Ｌ２０Ｓ
０．６４プローブとして使用された。
【０１５３】 新しい配列情報が、ｎｙｓＩおよびｎｙｓＤＩＩ遺伝子、並びに新しい遺伝子
であるｎｙｓＪ、ｎｙｓＫ、ｎｙｓＬ、ｎｙｓＭおよびｎｙｓＮの同定を完全な
ものとした（図７参照）。 新しい情報に基づけば、９４７７ ａａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７）のＮｙ
ｓＩタンパクは、６つのモジュールからなるＰＫＳを表し、ナイスタチン ポリ
ケチド主鎖生合成の伸長ステップ９から１４に役割を果たす。これら全てのモジ
ュールは、ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲおよびＡＣＰ領域を含む。モジュール１１の
ｍＡＴ領域の存在は、この伸長ステップにおけるメチルマロニル−ＣｏＡエクス
テンダの転入と一致する。モジュール１０、１１、１２および１４のＤＨ領域は
、活性部位モチーフＨ（Ｘ3）Ｇ（Ｘ4）Ｐの欠如により不活性らしい。ＮｙｓＩ
モジュール１３のＫＲ領域は、保存されたモチーフａＳＲｒＧを欠き、したがっ
て不活性にみえる。後者の特徴は、モジュール１１の不活性ＤＨ領域とともに、
ナイスタチン分子の６員ケタリック環（Ｃ１３とＣ１７との間）の存在を最もよ
く説明する。
【０１５４】 ｎｙｓＪ遺伝子は、ＰＫＳをコードし、ｎｙｓＩの下流に位置して同じ方向に
転写される。ＮｙｓＪ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８）のモジュールの組織から判
断して、後者はナイスタチンのマクロラクトン環集合における伸長ステップ１５
から１７に必要である。ＮｙｓＪ内のモジュール１６および１７のＤＨ領域は、
不活性らしく、またモジュール１５に局在化したＥＲ領域は、Ｃ８およびＣ９間
の二重結合の還元に対して最もよくその役割を果たす。
【０１５５】 ナイスタチンＰＫＳシステムの、最後の１８番目のモジュールは、ｎｙｓＪの
下流に見出されるｎｙｓＫによってコードされたＮｙｓＫタンパク（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．３９）によって表される。２０６６ ａａのＮｙｓＫタンパクは、Ｋ
Ｓ，ＡＴ，不活性ＤＭ，ＡＣＰおよびＴＥ領域からなる。ＮｙｓＫタンパクは、
ＫＲ領域を欠き、見かけ上不活性ＤＨ領域を含む。ＴＥ領域は、ＮｙｓＫのＣ−
末端に同定され、最後のエクステンダ単位の縮合に加えて、このタンパクも、ま
たＰＫＳ錯体から熟成したナイスタチン ポリケチド鎖の脱離に関与することを
示唆する。
【０１５６】 クラスターの遺伝子組織は、図９に示されており、図８は、ナイスタチンの生
合成経路においてコードされた種々のタンパクの提案された関与を表す。 ナイスタチンの生合成において、ｎｙｓＩおよびｎｙｓＪの関与を確認するた
め、これらの遺伝子は、接合自滅ベクターｐＫＮＩ１およびｐＫＮＪ１を用い、
相応する遺伝子組換えを経て、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ中に分裂された。分裂実験の
ための上記ベクターの組み立ては下記の如くであった。ｎｙｓＩの内部にある３
．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ−フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３
５のヌクレオチド２３７１１−２７５４１に相当し、Ｎ６４ ＤＮＡから切り取
られ、プラスミド ｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）の相当部位に連結され、プラスミド
ｐＬ６４ＥＢ３．８となる。ｐＬ６４ＥＢ３．８内でクローン化されたＳ．ｎｏ
ｕｒｓｅｉフラグメントは、このプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩＩにより切り取られ、ベクターｐＳＯＫ２０１からの３．０ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントに連結され、プラスミド ｐＫＮＩ１と
なる。
【０１５７】 ｎｙｓＪの内部にある３．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ−フラグメントは
、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５のヌクレオチド４３２８７−４６９９２に相当し、
バクテリオファージ Ｎ２０ ＤＮＡから切り取られ、プラスミド ｐＧＥＭ３
Ｚｆ（−）の相当部位に連結され、プラスミド ｐＬ２０ＥＢ３．７となる。ｐ
Ｌ２０ＥＢ３．７内でクローン化されたＳ．ｎｏｕｒｓｅｉフラグメントは、こ
のプラスミドから制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより切り取られ、
ベクターｐＳＯＫ２０１からの３．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラ
グメントに連結され、プラスミド ｐＫＮＪ１となる。ｐＫＮＩ１およびｐＫＮ
Ｊ１組み立て体の両者とも、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴ １２５６７（ｐＵＺ８００２
）に変形され、接合により、Ｚｏｔｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．、（２０００） Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６：６１１−６１９に記載されるように、さらに
Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ １１４５５に転移された。ナイスタチンの生成
は、ｐＫＮＩ１およびｐＫＮＪ１分裂変異体のいずれにも検出されず、したがっ
て、ナイスタチン生合成に対する同定されたＰＫＳの必要性が確認された。
【０１５８】 ナイスタチン分子の修飾に恐らく関与するであろうタンパクをコードする３つ
の遺伝子は、ｎｙｓＫとｎｙｓＤＩＩとの間に同定された。ｎｙｓＬおよびｎｙ
ｓＮの両者の遺伝子とも、それぞれ３９４ ａａおよび３９８ ａａ（それぞれ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ．４０および４２）のＰ４５０ モノオキシゲナーゼをコ
ードし、恐らくナイスタチン ポリケチド基のＣ１０位の水酸化およびＣ１６位
メチル基の酸化の役割を果たす。どのタンパクがどの反応に関与するかは、未だ
明確ではなく、ナイスタチン生合成経路におけるｎｙｓＬおよびｎｙｓＮの正確
な配置には、追加実験が必要とされる。ｎｙｓＭ遺伝子は、明らかに６４ ａａ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１）のフェレドキシンをコードし、それは多分、一つ
または両者のＰ４５０ モノオキシゲナーゼ システムを構成し、電子供与体と
して働く［Ｏ‘Ｋｅｅｆｅ，Ｄ．Ｐ ．＆ Ｈａｒｄｅｒ，Ｐ．Ａ． （１９９
１）． Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ
ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５，
２０９９−２１０５］。
【０１５９】 ＤＮＡ配列は、図７（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３５）に表された領域に拡張して
、およそ１０ｋｂ左（組換え型バクテリオファージ Ｎ９０）および５ｋｂ右（
組換え型バクテリオファージ Ｎ６９）であることが決定された。ナイスタチン
の生合成において、信頼できる作用を有する遺伝子は発見することができなかっ
たが、全てのナイスタチン遺伝子クラスターの同定を示唆する。
【０１６０】 このように、ナイスタチン生合成遺伝子クラスターの完全配列情報に基づき、
以下に遺伝子が同定され、それらの役割を以下に記載する（図８および９も参照
）：
【０１６１】
【表１６】
【０１６２】
【実施例５】ナイスタチン生合成遺伝子の操作 以下に、ナイスタチン分子における特異的な化学変化を目的とする、ナイスタ
チン生合成遺伝子の合理的な遺伝子操作に対するガイドラインを予言の実施例と
して提供する。これらの操作は、ポリエン抗生物質、共役二重結合の数および二
つのイオン化可能な基の存在（デオキシ糖マイコサミンに属するエキソサイクリ
ックカルボキシルおよびアミノ基）の構造−作用関係の現時点での理解に基づく
。共役二重結合の数および位置の変化 ナイスタチンのマクロラクトン環内の共役二重結合は、ＰＫＳモジュールとケ
トレダクターゼ（ＫＲ）および脱水酵素（ＤＨ）活性とによる二つの還元ステッ
プの結果として形成される。二重結合のさらなる還元は、このようなＰＫＳモジ
ュールにエノイルレダクターゼ（ＥＲ）活性をもたらすことができる。これは、
ナイスタチン生合成の特定のステップにおいて、二重結合に代えて完全な飽和結
合を形成する結果となる。以下の操作を提案することができる。（これらの操作
の結果、理論的に生産され得る化合物を図１０に示す。） −モジュール３（１）へのＥＲ領域の組込み −モジュール４（２）へのＥＲ領域の組込み； −モジュール５でのＥＲ領域の同時的失活およびモジュール３（３）への ＥＲ領域の組込み； −モジュール５でのＥＲ領域の同時的失活および−モジュール４（４）への ＥＲ領域の組込み； −モジュール５でのＥＲ領域の同時的失活および−モジュール７（５）への ＥＲ領域の組込み； −モジュール５でのＥＲ領域の同時的失活および−モジュール８（６）への ＥＲ領域の組込み； −モジュール５でのＥＲ領域の同時的失活および−モジュール９（７）への ＥＲ領域の組込み； −モジュール５でのＥＲ領域の同時的失活およびモジュール８および ９（８）へのＥＲ領域の組込み； −モジュール５でのＥＲ領域の同時的失活および−モジュール７および ８（９）へのＥＲ領域の組込み； これらの操作は、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ（Ｓｅｋｕｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ， １７７： ２９７−３０４、 １
９９９）に対して記載された遺伝子置換の技術を用いることにより行うことがで
きる。操作材料は、ナイスタチン遺伝子クラスター自身、もしくは他のＰＫＳ遺
伝子クラスターから供給できる。後者が、組換え型株の遺伝子安定性の観点より
優先されうる。ＣＯＯＨ基の脱離／再配置 ポリエン抗生物質のエキソサイクリックカルボキシル基は、これらの化合物の
選択的毒性に決定的な役割を果たすものと信じられている。より具体的には、分
子内および分子間のイオン化可能なカルボキシルとマイコサミンのアミノ基との
干渉が特に重要と考えられる（Ｒｅｓａｔ， Ｈ．， Ｓｕｎｇｕｒ， Ｆ．Ａ
．， Ｂａｇｉｎｓｋｉ， Ｍ．， Ｂｏｒｏｗｓｋｉ， Ｅ．， Ａｖｉｙｅ
ｎｔｅ， Ｖ． ２０００． Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ ｏｆ ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ ａｍｉｄｅ ｄｅｉｖａｔｉｖ
ｅｓ−ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓ
ｉｇｎ， ｖ．１４ ｐ６８９−７０３）。エキソサイクリックカルボキシルを
脱離、またはナスタチン生合成遺伝子の操作を経てナスタチン分子上に再配置す
ることは、いずれも理論上可能である。このとうな操作を経て製造されたナスタ
チン誘導体は、それ自身にとって、もしくはさらなる化学修飾のための基体とし
て有益である。
【０１６３】 以下の操作を提案する（結果としての化合物は、図１１に示す）。 −ナスタチンＰＫＳのモジュール１１のメチルマロニル特異アセチル基転移酵
素（ＡＴ）とマロニル特異ＡＴ領域（１０）との置換； −モジュール１１のメチルマロニル特異ＡＴ領域とマロニル特異ＡＴ領域（１
１）との同時的置換に伴う、モジュール１２のマロニル特異ＡＴ領域とメチルマ
ロニル特異ＡＴ領域との置換； −モジュール１１のメチルマロニル特異ＡＴ領域とマロニル特異ＡＴ領域（１
２）との同時的置換に伴う、モジュール１０のマロニル特異ＡＴ領域とメチルマ
ロニル特異ＡＴ領域との置換； −Ｐ４５０ モノオキシゲナーゼ−コード化遺伝子のｎｙｓＬまたはｎｙｓＮの
失活（ナスタチン分子Ｃ１６位のメチル基の酸化に役割を果たすいずれか）（１
３）。
【０１６４】 エキソサイクリックカルボキシルの見かけの作用に対するＰ４５０ モノオキ
シゲナーゼの特異性の役割は、新規な基体に対しその作用を満足するように操作
され得ることに注意すべきである。部位特異的、または誤りがちなＰＣＲおよび
ＤＮＡの差し替えに伴う無作為な突然変異生成のような方法は、本目的にとって
有益であることが判明するであろう。１．３ 付加的な水酸基の導入（水溶性の増加） ポリエン抗生物質は、主として高度に疎水性である共役二重結合の組により、
水に非常に難溶である。ある場合において、薬の薬理学的な性質を拡張するよう
に、水溶性を増加させることは有利である「Ｇｏｌｅｎｓｅｒ， Ｊ．， Ｆｒ
ａｎｋｅｎｂｕｒｇ， Ｓ．， Ｅｈｒｅｎｆｒｅｕｎｄ， Ｔ． ＆ Ｄｏｍ
ｂ， Ａ．Ｊ． １９９９． Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ ｗｉｔｈ ａ
ｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ−ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ ｗａｔｅｒ−
ｓｏｌｕｂｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎ
ｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．， ｖ．４３： ２２０９−２２１４）。ナスタチ
ンの水溶性を増加させるために、ナスタチン分子に付加的な水酸基（親水性）を
導入することを提案する。ナスタチン生化学遺伝子の以下の修飾は、望ましい効
果をもたらすことができる（結果としての化合物を図１２に示す）。
【０１６５】 −ナスタチンＰＫＳ（１４）モジュール３の脱水酵素（ＤＨ）領域の不活性化
； −モジュール４（１５）のＤＨ領域の不活性化； −モジュール５（１６）のＥＲ領域の同時的不活性化に伴うモジュール３の ＤＨ領域の不活性化； −モジュール５（１７）のＥＲ領域の同時的不活性化に伴うモジュール４の ＤＨ領域の不活性化； −モジュール５（１８）のＥＲ領域の同時的不活性化に伴うモジュール７の ＤＨ領域の不活性化； −モジュール５（１９）のＥＲ領域の同時的不活性化に伴うモジュール８の ＤＨ領域の不活性化； −モジュール５（２０）のＥＲ領域の同時的不活性化に伴うモジュール９の ＤＨ領域の不活性化；マクロラクトン環のエクステンション（伸長）、トランケーション（頭部切断） もしくは再構築 ポリエン抗生物質ナイスタチンの新規誘導体は、やはりナイスタチンＰＫＳの
トランケーションを通じて、より小さいマクロラクトン環（ERD48突然変異の、
実施例２で例示のとおり）とともに誘導体へと誘導して得られる。これは、ナイ
スタチンＰＫＳからの一つあるいはそれ以上のモジュールの欠失を通じて達成さ
れる。このようなトランケーションは、潜在的に更なる修飾および新規薬剤の合
成に有用かもしれない36-ないし6-部分からなるラクトン環とともに、ポリケチ
ドの生成へ導くことができる。ナイスタチンマクロラクトン環のエクステンショ
ンは、付加的なモジュールのナイスタチンＰＫＳへの挿入を通じて達成される。
このような操作は、薬剤用途の誘導化合物の生成へもまた導くこともできる。
【０１６６】 このナイスタチン分子は、ナイスタチンまたは他のＰＫＳの間で、ＰＫＳモジ
ュールをシャッフルする方法により完全に再構築されることができ、よって完全
に新しい誘導体が生成する。この観点では、WO00/77181の特許に開示されている
方法が、この目的を果たす組換えＤＮＡ構築物を製造するのに有用であることを
証明できる。
【０１６７】 最終的に、そのナイスタチン生合成遺伝子は、他のマクロライド抗生物質生合
成経路の操作に有用であることを証明できる。ＰＫＳおよび修飾酵素の両方が、
そのような目的に有用であることを証明できる。ナイスタチン生合成遺伝子は、
ピメリシン（Aparicio, J.F., Fouces, R., Mendes, M.V., Olivera, N., Marti
n, J.F. 2000. ５つのポリケチド合成遺伝子でコードされた複合多酵素システム
が、ストレプトマイセスナタレンシス中で、26-部分からなるポリエンマクロラ
イドピマリシンの生合成に関与する。Chem Biol, v. 7: 895-905）のためなどの
、他のポリエン抗生物質生合成クラスターの操作に最も有用のようである。ナイ
スタチンとピメリシン生合成酵素との間の、蛋白レベル上の高割合の同一性は、
それらのハイブリッドが活性化することを、最も多分確実にするであろう。他方
では、異種の修飾酵素の異なった特異性は、遺伝子的に人工的に作り出された株
によって製造された分子上でのさらなる構造変更のための、新しいツールを提供
するかもしれない。
【０１６８】
【実施例６】ナイスタチンの生産物増加を誘導する調節遺伝子の更なる操作 Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ 11455中におけるＰｅｒｍＥ*プロモーターの制 御下でのｎｙｓＲＩＩの発現 ｎｙｓＲＩＩ遺伝子の、そのコードする配列（実施例１参照）の分析を通じて
予測される機能を確認するために、それをＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ 1145
5中で、ＰｅｒｍＥ*プロモーターの制御下で発現させた。ファージＮ５８（ｎｙ
ｓＲＩＩのＣ末端部を示す）からの2168ｂｐ ＳａｌＩ-ＢｃｌＩフラグメント
は、ｐＧＥＭ11Ｚｆ（−）を消化したＳａｌＩ-ＢａｍＨＩ中に複製され、結果
としてｐＣ１Ａ１となる。ｎｙｓＲＩＩ遺伝子の811ｂｐ Ｎ末端部は、ファージ
Ｎ５８テンプレートから、オリゴヌクレオチドプライマーＮＳＲ２．１（5'-Ｇ
ＣＣＧＧＣＡＴＧＣＧＡＣＧＡＡ ＣＡＧ ＧＡＣＧＡＧＡＧＧＴ-3'）（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．４４．）およびＮＳＲ２．３（5'-ＧＣＣＧＴＧＧＴＣＧＡＣ
ＧＡＡ ＧＧＣ-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５）とともにＰＣＲ-増幅された
。ＰＣＲのための条件は上述の通りである。そのＰＣＲフラグメントは、Ｓｐｈ
ＩおよびＳａｌＩとともに消化され、ｐＣ１Ａ１からの2168ｂｐ ＳａｌＩ-Ｈｉ
ｎｄＩＩＩフラグメントとともに、プラスミドｐＣ２Ａ１を生じさせるｐＧＥＭ
３Ｚｆ（−）ベクターを消化したＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩ中に連結される。後者
からは、３．０ｋｂのＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩフラグメントが、ＰｅｒｍＥ*プ
ロモーターを含む０．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントと、ｐＳＯＫ
８０４ベクター（プラスミドｐＣ３Ａ１を生成する）を消化したＥｃｏＲＩ−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩまたはｐＳＯＫ２０１（プラスミドｐＣ３Ｅ１を生成する）由来の
３．０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのどちらかとともにとも
に、分離されて結合される。ｐＳＯＫ８０４−ベースのベクターは、Ｓ．ｎｏｕ
ｒｓｅｉクロモソーム中で部位特異的に結合するので、ｐＣ３Ａ１プラスミドは
、イン−トランスでのｎｙｓＲＩＩ発現の構成に関与するかもしれない。プラス
ミドｐＣ３Ｅ１は、他方においては、クローン化ｎｙｓＲＩＩ遺伝子を通じて相
同的組換えのみを介してＳ．ｎｏｕｒｓｅｉゲノム中に統合することのできる自
殺ベクターであり、後者はイン−シスでの発現をもたらす。プラスミドｐＣ３Ａ
１およびｐＣ３Ｅ１の導入は、結果としてそれぞれ再結合株Ｃ３Ａ１およびＣ３
Ｅ１になる。前者の株中のＰｅｒｍＥ*プロモーターは、ｎｙｓＲＩＩおよびｎ
ｙｓＲＩＩＩ遺伝子（イン−シス）の両方の上流に位置し、一方後者の株中のＰ
ｅｒｍＥ*プロモーターは、ｎｙｓＲＩＩ遺伝子（イン−トランス）の上流に位
置する。該Ｃ３Ａ１およびＣ３Ｅ１株によるナイスタチン生成物は、それぞれ１
８％および２２％に増加し、野生型のＳ．ｎｏｕｒｓｅｉと比較された。さらに
、発酵実験の間、該Ｃ３Ｅ１株からのナイスタチン生成物が野生型株よりも２４
時間早く最大値に到達したことがわかった。これらのデータは、ｎｙｓＲＩＩ遺
伝子が、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ株中でナイスタチンおよびその誘導体の生成物を増
加させるために使用できる、陽性調節因子をコードするという仮説を裏付ける。Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ 14455中におけるＰｅｒｍＥ*プロモーターの制御 下でのｎｙｓＲＩＶの発現 ｎｙｓＲＩＶの開始コドンは再配置され、本来提示された開始ヌクレオチドの
上流４８ｎｔに位置しやすい。このため、前に示唆したように、ｎｙｓＲＩＶは
おそらく２１０ａａ（短い）よりもむしろ２２６ａａ（長い）のタンパクをコー
ドすると推定される。このｎｙｓＲＩＶ遺伝子の長いおよび短い種類は、それぞ
れ、オリゴヌクレオチドプライマーＮＲ４Ｐ３（5-ＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＡ
ＡＡＧＧＡＴＧＧＣＧＧ-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４６）およびＮＲ４Ｐ５
（5'-ＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＧＣＧＴ-3'）（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．４７）を相手として、または、ＮＲ４Ｐ４（5'-ＣＴＣＡＧＣＡＴＧ
ＣＧＴＡＣＧＡＣＣＧＧＣＧＧＧ-3'）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８）およびＮ
Ｒ４Ｐ５を相手としての、Ｎ５８再結合ファージＤＮＡからのＰＣＲ−増幅であ
る。ＰＣＲの条件は、上述の通りである。０．７８ｋｂおよび０．７３ｋｂの、
対応するＰＣＲ生成物は、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩとともに消化され、そ
してＰｅｒｍＥ*プロモーターを含む０．３ｋｂのＥｃｏＲＩ-ＳｐｈＩフラグメ
ントとともに、ｐＳＯＫ８０４ベクターを消化したＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ
とともに、結合され、結果としてそれぞれプラスミドｐＮＲ４ＥＬおよびｐＮＲ
４ＥＳになる。両方のプラスミドは、変異株ＮＲ４ＥＬおよびＮＲ４ＥＳをそれ
ぞれ生成するＳ．ｎｏｕｒｓｅｉ ＡＴＣＣ 11455中に導入された。ＮＲ４ＥＳ
株（ＰｅｒｍＥ*プロモーターからの２１０ａａタンパクを示す）によるナイス
タチン生成物は、ｐＳＯＫのみを有する野生型Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ由来のものと
明確には異ならず、そのうえＮＲ４ＥＬ再結合（ＰｅｒｍＥ*プロモーターから
の２２６ａａタンパクを示す）は、野生種のレベルより高い３６％レベルでナイ
スタチンを生産した。これらのデータは、長い方のもの、すなわち２２６ａａの
長い種類のものは、事実上のＮｙｓＲＩＶポリペプチドを表すことを示唆する。
さらに、これらのデータは、ｎｙｓＲＩＶ遺伝子が、Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ株中で
ナイスタチンおよびその誘導体の生成物を増加させるために使用できる、陽性調
節因子をコードするという仮説を裏付ける。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ポリエン系抗真菌性抗生物質であるナイスタチンA1の構造を
示す。
【図２】 図２は、実施例１，２および３で使用したE.coli - Streptomycesシ
ャトルベクターpSOK101、pSOK201およびpSOK804の物理地図および機能地図を表
す。
【図３】 図３は、ナイスタチン生合成遺伝子（SEQ ID NO.１および２に関する
）をコードしているS.noursei ATCC11455ゲノムの2つの領域を示す模式図である
。本DNA配列を含む重複組換えファージ（overlapping recombinant phage）は、
前記の領域図に重ねて示される（実施例１参照）。
【図４】 図４は、ナイスタチンPKS NysA（SEQ ID NO.5）、NysB （SEQ ID NO.
6）、NysC（SEQ ID NO.7）、NysI（SEQ ID NO.20）の機能的な組織およびナイス
タチン生合成におけるそれらの役割を示す模式図である。
【図５】 図５は、組換えS.noursei菌株による新しいポリエン化合物生成に至
るNysC PKSのモジュール５に対する遺伝子操作を示す模式図である（実施例２参
照）。
【図６】 図６は、ナイスタチン、ならびに遺伝子改変したNysC PKSを有する組
換えS.noursei菌株から得られた新しいポリエン化合物S44およびS48に関するUV
スペクトル（DMSO中）を示す（実施例２参照）。
【図７】 図７は、ナイスタチン生合成遺伝子クラスター（SEQ ID NO.35に関す
る）をコードしているS.noursei ATC11455ゲノムの領域を示す模式図である。遺
伝子クラスター内の遺伝子組織が示されている。クローン化領域を包囲している
重複組換えファージからの挿入物は、上記物理／遺伝子地図に示されている。ny
s遺伝子はイタリック体の大文字で示され、他の翻訳領域（ORFs）は番号を付け
られている。
【図８】 図８は、S.noursei内でのナイスタチン生合成について提唱されてい
るモデルをしめす表示である。
【図９】 図９は、ナイスタチンPKS NysA(SEQ ID No.5)、NysB(SEQ ID No.6)、
NysC(SEQ ID No.7)、NysI(SEQ ID No.37)、NysJ(SEQ ID No.38)およびNysK(SEQ
ID No.39)タンパク質の機能的な組織を示す模式図である。KSSは、活性部位にお
いてCysからSerへの置換を有するケトシンターゼである。KSは、ケトシンターゼ
である。ATは、アセテート特異的アシルトランスフェラーゼである。mATは、プ
ロピオネート特異的アセチルトランスフェラーゼである。DHは、デヒドラターゼ
である。DHiは、不活性型デヒドラターゼである。ERは、エノイルレダクターゼ
である。KRは、ケトレダクターゼである。KRiは、不活性型ケトレダクターゼで
ある。ACPは、アシルキャリアータンパク質である。
【図１０】 図１０は、ナイスタチン遺伝子クラスター内における下記の操作か
ら理論的に生成されうる化合物を示す。 モジュール３へのERドメインの挿入（１）； モジュール４へのERドメインの挿入（２）； モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール３へのERド
メインの挿入（３）； モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール４へのERド
メインの挿入（４）； モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール７へのERド
メインの挿入（５）； モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール８へのERド
メインの挿入（６）； モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール９へのERド
メインの挿入（７）； モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール８および９
へのERドメインの挿入（８）； モジュール５のERドメインの不活性化と同時に行われるモジュール７および８
へのERドメインの挿入（９）。
【図１１】 図１１は、ナイスタチン遺伝子クラスター内における下記の操作か
ら理論的に生成されうる化合物を示す。 ナイスタチンPKSのモジュール１１内のメチルマロニル基特異的アセチルトラ
ンスフェラーゼ（AT）ドメインと、マロニル基特異的ATドメインとの置換（１０
）； モジュール１２内のマロニル基特異的ATドメインとメチルマロニル基特異的AT
ドメインとの置換と、同時に行われるモジュール１１内のメチルマロニル基特異
的ATドメインとマロニル基特異的ATドメインとの置換（１１）； モジュール１０内のマロニル基特異的ATドメインとメチルマロニル基特異的AT
ドメインとの置換と、同時に行われるモジュール１１内のメチルマロニル基特異
的ATドメインとマロニル基特異的ATドメインとの置換（１２）； P450モノオキシゲナーゼをコードしている遺伝子であるnysLまたはnysN（いず
れかが、ナイスタチン分子上のC16位のメチル基の酸素化の原因である）の不活
性化（１３）。
【図１２】 図１２は、ナイスタチン遺伝子クラスター内における下記の操作か
ら理論的に生成されうる化合物を示す。 ナイスタチンPKSのモジュール３内のデヒドラターゼ（DH）の不活性化（１４
）； モジュール４内のDHドメインの不活性化（１５）； モジュール３内のDHドメインの不活性化と同時に行われるモジュール５内のER
ドメインの不活性化（１６）； モジュール４内のDHドメインの不活性化と同時に行われるモジュール５内のER
ドメインの不活性化（１７）； モジュール７内のDHドメインの不活性化と同時に行われるモジュール５内のER
ドメインの不活性化（１８）； モジュール８内のDHドメインの不活性化と同時に行われるモジュール５内のER
ドメインの不活性化（１９）； モジュール９内のDHドメインの不活性化と同時に行われるモジュール５内のER
ドメインの不活性化（２０）。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０７１ 1/19 1/21 ４Ｃ０８６ 1/21 9/10 ＺＣＣ 5/10 Ｃ１２Ｐ 19/62 9/10 ＺＣＣ Ｃ０７Ｄ 493/08 Ｂ Ｃ１２Ｐ 19/62 493/18 // Ｃ０７Ｄ 493/08 Ｃ０７Ｈ 17/08 Ｋ 493/18 Ｃ１２Ｒ 1:57 Ｃ０７Ｈ 17/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 19/62 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:57） (31)優先権主張番号 ０００９３８７．２ (32)優先日 平成12年４月14日(2000．4．14) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 アルファーマ エイ エス ノルウェー国 エヌ−0275 オスロ ハル ビッツアレーン ３ (71)出願人 シンヴェント エイエス ノールウェー エヌ−7465 トロンハイム ストリンヴァイエン ４ (71)出願人 ゾチェフ，セルゲイ ボリソビッチ ノールウェー エヌ−7030 トロンハイム エルゲスター ゲート 51 (71)出願人 セクロヴァ，オルガ ニコライブナ ノールウェー エヌ−7030 トロンハイム エルゲスター ゲート 51 (71)出願人 フヤルヴィク，エスペン ノールウェー エヌ−7025 トロンハイム リアンファイエン 10 (71)出願人 ブラウタセット，トライヴェ ノールウェー エヌ−7027 トロンハイム マーティン ストッケンス ヴェイ 74 (71)出願人 ストレム，アーネ，ライダー ノールウェー エヌ−7050 トロンハイム コンヴァルヴェゲン 38 (71)出願人 ヴァラ，スヴァイン ノールウェー エヌ−7560 ヴィクハマー ナウスタンヴァイエン ２ (72)発明者 ゾチェフ，セルゲイ ボリソビッチ ノールウェー エヌ−7030 トロンハイム エルゲスター ゲート 51 (72)発明者 セクロヴァ，オルガ ニコライブナ ノールウェー エヌ−7030 トロンハイム エルゲスター ゲート 51 (72)発明者 フヤルヴィク，エスペン ノールウェー エヌ−7025 トロンハイム リアンファイエン 10 (72)発明者 ブラウタセット，トライヴェ ノールウェー エヌ−7027 トロンハイム マーティン ストッケンス ファイ 74 (72)発明者 ストレム，アーネ，ライダー ノールウェー エヌ−7050 トロンハイム コンヴァルヴェゲン 38 (72)発明者 ヴァラ，スヴァイン ノールウェー エヌ−7560 ヴィクハマー ナウスタンファイエン ２ (72)発明者 エリングセン，トロンド，アーリング ノールウェー エヌ−7054 ランハイム マーカップラッセン 273 (72)発明者 スレッタ，ホヴァルド ノールウェー エヌ−7024 トロンハイム ウグラヴァイエン 19 (72)発明者 グリクセン，オレ−マーティン ノールウェー エヌ−0595 オスロ グレ ブリングン． 31 ディー Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA10 BA67 CA03 DA05 EA04 FA15 GA11 HA01 4B050 CC01 CC04 DD02 EE10 LL01 LL05 4B064 AF53 CA03 CA19 CC24 DA02 4B065 AA50X AA50Y AB01 AC14 BA02 CA27 CA29 CA44 4C057 BB02 CC04 DD01 KK24 4C071 AA03 BB01 BB02 CC12 CC13 EE07 FF16 FF18 GG01 HH04 HH05 LL01 4C086 AA01 CA01 CA03 EA12 MA01 MA04 NA14 ZB35

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）SEQ ID No. 35に示されるヌクレオチド配列；または （ｂ）SEQ ID No. 35の相補物であるヌクレオチド配列；または （ｃ）SEQ ID No. 35の縮重物であるヌクレオチド配列；または （ｄ）SEQ ID No. 35に対して高緊縮の条件下でハイブリダイズして、SEQ ID No
    . 35の相補物、またはSEQ ID No. 35由来のハイブリダイゼーションプローブあ
    るいはその相補物になるヌクレオチド配列；または （ｅ）SEQ ID No. 35と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配
    列；または （ｆ）SEQ ID No. 35と少なくとも６５％の配列同一性を有し、当該配列が好ま
    しくはナイスタチンＰＫＳ酵素またはその部分をコードするか、またはそれらを
    コードする配列と相補的であるヌクレオチド配列 を有する核酸分子。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の核酸分子であって、該分子が、 （ａ）SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2に示されるヌクレオチド配列；
    または （ｂ）SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2の相補物であるヌクレオチド配
    列；または （ｃ）SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2の縮重物であるヌクレオチド配
    列；または （ｄ）SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2に対して高緊縮の条件下でハイ
    ブリダイズして、SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2の相補物、またはSE
    Q ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2由来のハイブリダイゼーションプローブ
    あるいはその相補物になるヌクレオチド配列；または （ｅ）SEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2と少なくとも６５％の配列同一
    性を有し、当該配列が好ましくはナイスタチンＰＫＳ酵素またはその部分をコー
    ドするか、またはそれらをコードする配列と相補的であるヌクレオチド配列 を有する請求項１に記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 SEQ ID No. 35、またはSEQ ID No. 1および／またはSEQ ID No. 2と少なくと
    も７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、当該配列が好ましくは
    ナイスタチンＰＫＳ酵素またはその部分をコードするか、またはそれらをコード
    する配列と相補的であることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 請求項１または２で定義されたヌクレオチド配列の部分を有し、当該部分が少
    なくとも１５ヌクレオチド長であることを特徴とする核酸分子。
  5. 【請求項５】 表１に示されたＯＲＦ１をコードするヌクレオチド配列を有さない請求項１に
    記載の核酸分子。
  6. 【請求項６】 表１に示されたＯＲＦ２をコードするヌクレオチド配列を有さない請求項１に
    記載の核酸分子。
  7. 【請求項７】 マクロライド抗生物質またはポリケチド部分の合成において機能的な活性を有
    する、一以上のポリペプチドをコードするか、または一以上の遺伝子要素を有す
    る、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分子。
  8. 【請求項８】 前記マクロライド抗生物質またはポリケチド部分がナイスタチンまたはナイス
    タチン誘導体であることを特徴とする請求項７に記載の核酸分子。
  9. 【請求項９】 請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分子であって、当該分子が、一以上の
    遺伝子、および／または一以上の調節配列、および／または一以上のモジュール
    、あるいは酵素ドメイン、あるいはＰＫＳ遺伝子クラスターのノンコーディング
    あるいはコーディング機能性遺伝子要素を有することを特徴とする請求項１〜６
    のいずれかに記載の核酸分子。
  10. 【請求項１０】 表１に示されたSEQ ID No. 35、1または2内の、いずれかの一以上のヌクレオ
    チドの「開始」および「終了」位置により定義されるヌクレオチド配列を有する
    請求項３〜９のいずれかに記載の核酸分子。
  11. 【請求項１１】 表１に示されたSEQ ID No. 35、1または2内の、「開始」および「終了」位置
    を有する、いずれかの一以上のヌクレオチド配列の間に存在するとして定義され
    るヌクレオチド配列を有する請求項３〜９のいずれかに記載の核酸分子。
  12. 【請求項１２】 SEQ ID No 3〜20または36〜43から選択されるアミノ酸配列の一以上をコード
    するヌクレオチド配列またはそれに相補的であるかあるいはそれと縮重するヌク
    レオチド配列を有するか、またはSEQ ID No 3〜20または36〜43のいずれか一つ
    と少なくとも６０％の配列同一性を示すアミノ酸配列の一以上をコードするヌク
    レオチド配列を有する核酸分子。
  13. 【請求項１３】 SEQ ID No 3〜20または36〜43のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一
    性を示すアミノ酸配列の一以上をコードする請求項１２に記載の核酸分子。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜１３のいずれかで定義された核酸分子によりコードされたポリペプ
    チド。
  15. 【請求項１５】 （ａ）SEQ ID No 3〜20または36〜43のいずれか一つに示されるアミノ酸配列の
    全部または一部；または （ｂ）SEQ ID No 3〜20または36〜43のいずれか一つと少なくとも６０％の配列
    同一性を示すアミノ酸配列の全部または一部 を有する請求項１４に記載のポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 SEQ ID No 3〜20または36〜43のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一
    性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１４に記載のポリペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 マクロライド抗生物質またはポリケチド部分の合成において機能的な活性を有
    する請求項１４〜１６または請求項１１のいずれかに記載のポリペプチド。
  18. 【請求項１８】 SEQ ID No. 3〜20または36〜43のいずれか一つの機能性領域を有し、該機能性
    領域は表２で定義されたものであることを特徴とする請求項１４〜１７のいずれ
    かに記載のポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜１３のいずれかで定義された核酸分子を有する発現ベクター。
  20. 【請求項２０】 請求項１〜１３のいずれかで定義された核酸分子または請求項１９で定義され
    た発現ベクターを有する宿主細胞またはトランスジェニック生物体。
  21. 【請求項２１】 請求項１〜１３のいずれかで定義された核酸分子を宿主細胞内で発現させるこ
    とを含むポリケチドまたはマクロライド分子を製造する方法。
  22. 【請求項２２】 改変ＰＫＳ系の生産、または改変ポリケチド分子の生産における請求項１〜１
    ３のいずれかで定義された核酸分子の用途。
  23. 【請求項２３】 請求項１〜１３のいずれかで定義される核酸分子を改変すること、または請求
    項１〜１３のいずれかで定義される核酸分子を、ＰＫＳをコードするさらなる核
    酸分子に導入することを含む改変ＰＫＳ系または改変ポリケチド分子の生産方法
    。
  24. 【請求項２４】 改変ポリケチドシンターゼ酵素または酵素系をコードするヌクレオチド配列を
    有する核酸分子を生産する方法であって、 （ａ）請求項１〜１３のいずれかで定義される核酸分子を骨格として使用し、酵
    素活性または他の機能性活性をコードする核酸分子の一以上の部分を改変するこ
    と；または （ｂ）酵素活性または他の機能性活性をコードするヌクレオチド配列の一以上の
    部分を代替え（すなわち異なった「２番目」）ＰＫＳ骨格に導入すること を有することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 改変ナイスタチンＰＫＳをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子の生
    産方法であって、前記改変ナイスタチンＰＫＳが請求項１〜１３で定義された核
    酸分子によりコードされたナイスタチンＰＫＳから誘導されるものであって、当
    該核酸分子が酵素活性または他の機能性活性をコードする第１領域と、骨格アミ
    ノ酸配列をコードする第２領域とを有し、該方法は、 前記少なくとも一つの第１領域を改変すること；または 前記少なくとも一つの第１領域を異なったＰＫＳをコードするヌクレオチド配
    列からの骨格をコードする第２領域に取り込ませることを有する請求項２３に記
    載の方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２５で定義されたように生産された核酸分子を、改変ナイスタチンＰＫ
    Ｓが発現するような条件下で宿主細胞中で発現させることを含む請求項２５で定
    義された改変ナイスタチンＰＫＳを生産する方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜１３のいずれかで定義された核酸分子から、請求項２３〜２６のい
    ずれかで定義された方法により誘導された改変ＰＫＳ系。
  28. 【請求項２８】 SEQ ID No. 3〜20または36〜43のポリペプチドの一以上、またはSEQ ID No. 5
    〜7、20、あるいは37〜39の一以上のモジュールの酵素ドメインの一以上が、改
    変されることを特徴とする改変ナイスタチンＰＫＳを有する請求項２７に記載の
    改変ＰＫＳ系。
  29. 【請求項２９】 （ｉ）Nys Cのモジュール５（SEQ ID No. 7のアミノ酸4953-5239）内のＥＲドメ
    インが不活性化され；または （ｉｉ）Nys Cのモジュール（SEQ ID No. 7）が取り除かれ；または （ｉｉｉ）Nys Cのモジュール８（SEQ ID No. 7のアミノ酸10086-10289）内のＤ
    Ｈドメインが不活性化され；または （ｉｖ）Nys Cのモジュール７（SEQ ID No. 7のアミノ酸8812-9086）内のＫＲド
    メインが不活性化されたこと を特徴とする改変ナイスタチンＰＫＳを含む請求項２７に記載の改変ナイスタチ
    ンＰＫＳ系。
  30. 【請求項３０】 コロニーのライブラリーを有する細胞コロニーの取扱方法であって、各ライブ
    ラリーのコロニーが請求項２７〜２９のいずれかで定義された異なった改変ＰＫ
    Ｓを含むことを特徴とする方法。
  31. 【請求項３１】 請求項３０で定義されたコロニーのライブラリーを培養することを含むことを
    特徴とするＰＫＳ複合体のライブラリーまたはポリケチド分子のライブラリーを
    製造する方法。
  32. 【請求項３２】 請求項３１で定義された方法により得られ、または得られ得るＰＫＳ複合体の
    ライブラリーまたはポリケチド分子のライブラリー。
  33. 【請求項３３】 前記ライブラリーのポリケチドの一員が請求項２７〜２９のいずれかで定義さ
    れた改変ＰＫＳ系により合成されることを特徴とするポリケチドの組合せライブ
    ラリー。
  34. 【請求項３４】 （ａ）請求項２３〜２５のいずれかで定義される方法により生産された核酸分
    子、または（ｂ）請求項２７〜２９のいずれかで定義された改変ＰＫＳ系を含む
    宿主細胞またはトランスジェニック生物体。
  35. 【請求項３５】 請求項３４で定義される宿主細胞またはトランスジェニック生物体により製造
    され、または製造され得るポリケチド。
  36. 【請求項３６】 請求項３５で定義されたポリケチドから誘導される抗生物質。
JP2001558462A 2000-02-08 2001-02-08 ナイスタチンポリケチドシンターゼをコードする新規の遺伝子、およびそれらの取扱ならびに用途 Expired - Fee Related JP4902925B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0002840.7 2000-02-08
GB0002840A GB0002840D0 (en) 2000-02-08 2000-02-08 Novel genes and their manipulation and utility
GB0008786.6 2000-04-10
GB0008786A GB0008786D0 (en) 2000-04-10 2000-04-10 Novel genes and their manipulation and utility
GB0009387.2 2000-04-14
GB0009387A GB0009387D0 (en) 2000-04-14 2000-04-14 Novel genes and their manipulation and utility
PCT/GB2001/000509 WO2001059126A2 (en) 2000-02-08 2001-02-08 Gene cluster encoding a nystatin polyketide synthase and its manipulation and utility

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2003528592A true JP2003528592A (ja) 2003-09-30
JP2003528592A5 JP2003528592A5 (ja) 2008-05-08
JP4902925B2 JP4902925B2 (ja) 2012-03-21

Family

ID=27255517

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001558462A Expired - Fee Related JP4902925B2 (ja) 2000-02-08 2001-02-08 ナイスタチンポリケチドシンターゼをコードする新規の遺伝子、およびそれらの取扱ならびに用途

Country Status (7)

Country Link
US (3) US7141660B2 (ja)
EP (1) EP1255840A2 (ja)
JP (1) JP4902925B2 (ja)
AU (2) AU784995B2 (ja)
CA (1) CA2399689A1 (ja)
NO (1) NO332112B1 (ja)
WO (1) WO2001059126A2 (ja)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2907465A1 (fr) * 2006-10-18 2008-04-25 Commissariat Energie Atomique Polynucleotides et polypeptides codes par lesdits polynucleotides impliques dans la voie de biosynthese de la congocidine et ses derives
GB0712881D0 (en) * 2007-07-03 2007-08-15 Biosergen As Compounds
GB0805363D0 (en) 2008-03-20 2008-04-30 Sinvent As Novel NRPS-PKS gene cluster and its manipulation and utility
EP2316937B1 (en) * 2008-06-04 2012-12-05 Eisai R&D Management Co., Ltd. Dna encoding polypeptide involved in biosynthesis of herboxidiene
WO2016112295A1 (en) 2015-01-09 2016-07-14 Warp Drive Bio, Inc. Compounds that participate in cooperative binding and uses thereof
KR102615448B1 (ko) 2016-04-12 2023-12-19 징코 바이오웍스, 인크. 화합물의 제조를 위한 조성물 및 방법
GB2553356A (en) * 2016-09-05 2018-03-07 Geomec Eng Ltd Improvements in or relating to geothermal power plants
CA3042231A1 (en) * 2016-10-28 2018-05-03 Ginkgo Bioworks, Inc. Compositions and methods for the production of compounds
CN110423790B (zh) * 2019-08-16 2021-04-02 上海交通大学 一种抗真菌四霉素b定向高产的代谢工程方法
JP2022553858A (ja) 2019-11-04 2022-12-26 レボリューション メディシンズ インコーポレイテッド Ｒａｓ阻害剤
KR20220109407A (ko) 2019-11-04 2022-08-04 레볼루션 메디슨즈, 인크. Ras 억제제
KR20220109406A (ko) 2019-11-04 2022-08-04 레볼루션 메디슨즈, 인크. Ras 억제제
TW202227460A (zh) 2020-09-15 2022-07-16 美商銳新醫藥公司 Ｒａｓ抑制劑
US20220165359A1 (en) 2020-11-23 2022-05-26 Peptilogics, Inc. Generating anti-infective design spaces for selecting drug candidates
GB202207185D0 (en) 2022-05-17 2022-06-29 Sintef Tto As Novel antibiotic compound

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2654339B1 (fr) * 1989-11-14 1994-10-28 Mayoly Spindler Laboratoires Nouveaux derives solubles et non toxiques des macrolides polyeniques basiques, leur preparation et leurs applications.
US5210226A (en) * 1990-02-02 1993-05-11 Xechem Inc. Method for separating and purifying polyene macrolide antibiotics
ATE125814T1 (de) * 1990-03-07 1995-08-15 Hoffmann La Roche Verfahren zur herstellung von derivaten der ascorbinsäure.
US5712146A (en) 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides
WO1995029253A1 (en) 1994-04-22 1995-11-02 Merck & Co., Inc. Dna encoding cephamycin biosynthesis late enzymes
CA2197524A1 (en) 1996-02-22 1997-08-22 Bradley Stuart Dehoff Polyketide synthase genes
IL132590A0 (en) 1997-04-30 2001-03-19 Kosan Biosciences Inc Combinatorial polyketide libraries produced using a modular pks gene cluster as scaffold
US5981721A (en) * 1997-10-23 1999-11-09 Karykion Corporation Polyene macrolide schiff bases, their alkyl esters and processes for preparing polyene macrolide alkyl ester salts thereof
EP1185668A1 (en) 1999-06-14 2002-03-13 Dsm N.V. Genes encoding enzymes in the biosynthesis of pimaricin and the application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2006206147B2 (en) 2008-12-18
WO2001059126A2 (en) 2001-08-16
NO332112B1 (no) 2012-06-25
US20080119541A1 (en) 2008-05-22
US20040115762A1 (en) 2004-06-17
US7141660B2 (en) 2006-11-28
US7709231B2 (en) 2010-05-04
JP4902925B2 (ja) 2012-03-21
WO2001059126A3 (en) 2002-03-14
AU3203401A (en) 2001-08-20
NO20023741L (no) 2002-10-07
AU784995B2 (en) 2006-08-17
EP1255840A2 (en) 2002-11-13
US20100216870A1 (en) 2010-08-26
US7851183B2 (en) 2010-12-14
CA2399689A1 (en) 2001-08-16
NO20023741D0 (no) 2002-08-07
AU2006206147A1 (en) 2006-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7709231B2 (en) Genes encoding a nystatin polyketide synthase and their manipulation and utility
EP1244800B1 (en) Rapamycin analogs
EP0910633B1 (en) Hybrid polyketide synthase I gene
AU758421B2 (en) Recombinant oleandolide polyketide synthase
JP2000515390A (ja) 新規ポリケチド誘導体およびそれを製造するための組換え方法
CZ20004912A3 (cs) Polyketidy a jejich syntéza
JP2003528592A5 (ja)
CA2328427A1 (en) Recombinant narbonolide polyketide synthase
US20060269528A1 (en) Production detection and use of transformant cells
US6960453B1 (en) Hybrid polyketide synthases combining heterologous loading and extender modules
JP2005512506A (ja) ブテニル−スピノシン殺虫剤生産のための生合成遺伝子
WO2001068867A1 (en) Polyketides and their synthesis
JP2009213479A (ja) ポリケチド類及びそれらの合成

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20040325

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080206

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080206

A524 Written submission of copy of amendment under section 19 (pct)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524

Effective date: 20080324

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101207

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110224

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110303

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110506

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110607

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110825

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110901

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20111107

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20111206

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20120104

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150113

Year of fee payment: 3

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees