FR2907465A1

FR2907465A1 - Polynucleotides et polypeptides codes par lesdits polynucleotides impliques dans la voie de biosynthese de la congocidine et ses derives

Info

Publication number: FR2907465A1
Application number: FR0609147A
Authority: FR
Inventors: Maud Juguet; Sylvie Lautru; Francois Xavier Francou; Muriel Gondry; Jean Luc Pernodet
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Universite Paris Sud Paris 11
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Paris Sud Paris 11; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2006-10-18
Publication date: 2008-04-25
Also published as: WO2008047006A8; WO2008047006A9; WO2008047006A3; WO2008047006A2

Abstract

Polynucléotides et polypeptides codés par lesdits polynucléotides, impliqués dans la voie de biosynthèse de la congocidine, un antibiotique de la famille des pyrrolamides, vecteurs comprenant lesdits polynucléotides, microorganismes transformés par lesdits polynucléotides, applications desdits polynucléotides et desdits polypeptides.

Description

1 POLYNUCLEOTIDES ET POLYPEPTIDES CODES PAR LESDITS POLYNUCLEOTIDES

IMPLIQUES DANS LA VOIE DE BIOSYNTHESE DE LA CONGOCIDINE ET SES DERIVES La présente invention est relative à de nouveaux polynucléotides, et aux polypeptides codés par lesdits polynucléotides, impliqués dans la voie de biosynthèse d'un antibiotique de la famille des pyrrolamides, aux vecteurs comprenant lesdits polynucléotides, aux microorganismes transformés par lesdits polynucléotides, aux applications desdits polynucléotides et desdits polypeptides. La congocidine (Figure 1) a été isolée en 1952 par Cosar et al. chez Streptomyces ambofaciens (Cosar et al., 1952). Cette molécule, dont la structure a été déterminée en 1967 (Julia & Preau-Joseph, 1967), est identique à une autre molécule, isolée un an auparavant chez Streptomyces netropsis, la nétropsine (Finlay et al., 1951). Les deux noms sont encore utilisés actuellement. Parfois, cette molécule est également appelée sinanomycine.

La congocidine est un pyrrolamide (également appelé oligopyrrole ou oligopeptide). Cette famille de métabolites secondaires, produits par des bactéries du genre Streptomyces ou autres actinobactéries apparentées, regroupe des molécules caractérisées par la présence dans leur structure de groupements 2-carbonyl-4-aminopyrrole (Figure 1). I1 existe par ailleurs quelques molécules apparentées à cette famille, comme l'amidinomycine et la noformycine. Les pyrrolamides possèdent des activités biologiques variées, résumées dans le Tableau I ci-après. Tableau I : Activités biologiques des composés de la famille des Composé Activités biologiques congocidine (nétropsine) Antivirale, antimicrobienne, cytotoxique Distamycine Antivirale, antimicrobienne, cytotoxique TAN 868A Antifongique, antimicrobienne, cytotoxique Kikumycines Antivirale, antimicrobienne Pyrronamycines Antivirale, antimicrobienne, antitumorale Anthelvencine A Antimicrobienne, anthelmintique Amidinomycine Antivirale Noformycine Antivirale. inhibition de la synthase d'oxyde nitrique inductible. pyrr 2907465 2 De nombreux pyrrolamides (congocidine, distamycine, TAN 868A et kikumycines) possèdent des activités antivirales et antimicrobiennes. La noformycine est un inhibiteur de la synthase inductible d'oxyde nitrique, une enzyme impliquée dans des maladies inflammatoires telles que l'arthrite (Gordon Green et al., 5 1996). Enfin, les deux membres les plus récents de cette famille, les pyrronamycines A et B ont montré une activité antitumorale contre le sarcome 180 dans des modèles de tumeurs murines in vivo (Asai et al., 2000). Une autre activité biologique de ces molécules présentant de l'intérêt est leur capacité à se lier, au moins pour un certain nombre d'entres elles 10 (congocidine, distamycine et pyrronamycines), à l'ADN, dans le petit sillon de la double hélice, avec une certaine spécificité de séquence (trois à quatre bases A/T consécutives, forte discrimination des paires G/C) (Neidle, 2001). Ainsi, la distamycine et la congocidine ont servi et servent encore de modèles pour l'étude de la liaison de petits ligands dans le petit sillon de l'ADN (Aleman et al., 1996 ; Van 15 Hecke et al., 2005). Il a été montré que ces molécules se lient à l'ADN de manière réversible, non covalente, par des liaisons hydrogènes, des contacts de Van der Waals, et des interactions électrostatiques (Dolenc et al., 2005). La congocidine et la distamycine ne sont pas parmi les meilleurs agents anticancéreux se liant dans le petit sillon de l'ADN, car leur liaison n'est pas 20 covalente. Néanmoins, au cours des 15 dernières années, de nombreux analogues ou hybrides de la congocidine et de la distamycine ont été synthétisés, afin de modifier et d'accroître la spécificité de la liaison à l'ADN et de créer des molécules capables de se lier de manière spécifique et covalente à l'ADN (Dyatkina et al., 2002 ; Khalaf et al., 2004). De telles molécules pourraient en effet être utilisées pour réduire l'expression de gènes spécifiques dans des maladies telles que le cancer, ou être couplées à des anticorps monoclonaux, comme cela est déjà le cas pour une autre molécule se liant dans le petit sillon de l'ADN, la calichéamicine liée à l'anticorps monoclonal antiCD33 gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg ) (Harris, 2004). La congocidine et la distamycine ont ainsi déjà été utilisées comme transporteurs à spécificité de séquence d'agents alkylant l'ADN, comme dans le cas de la tallimustine, qui a été étudiée en phases I et II d'essais cliniques en tant qu'agent anticancéreux (Denny, 2001). Des analogues de ces molécules ont également été couplés avec des agents anticancéreux connus tels que l'anthramycine (spécifique de régions riches en G/C), et les molécules hybrides possèdent des propriétés antitumorales (Baraldi et al., 2003). L'évolution des techniques de l'ADN recombinant et les progrès réalisés dans la connaissance et la compréhension des mécanismes de biosynthèse des 2907465 3 produits naturels au cours des 20 dernières années permettent d'envisager une production biotechnologique de produits naturels, production généralement plus économique que la production par synthèse chimique. Les connaissances accumulées depuis une vingtaine d'années montrent que chez les actinobactéries, les gènes 5 dirigeant la biosynthèse d'un métabolite secondaire donné sont en général groupés dans une même région du génome (Chater & Bruton, 1985). L'utilisation de cette propriété, en combinaison avec l'hybridation hétérologue avec des sondes basées sur des séquences en acides aminés hautement conservées d'enzymes biosynthétiques a déjà montré son utilité pour cloner des groupes de gènes de biosynthèse de 10 métabolites secondaires (Hopwood, 1997 ; Turgay & Marahiel, 1994). Toutefois, en ce qui concerne la congocidine, les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la congocidine chez Streptomyces n'ont actuellement pas été identifiés. Or, il existe un réel besoin d'identifier ces gènes, et notamment de caractériser la voie de biosynthèse de la congocidine, pour les raisons suivantes. 15 La caractérisation de cette voie de biosynthèse et l'isolement des gènes codant les enzymes impliquées dans cette biosynthèse pourraient permettre d'améliorer l'efficacité de production de cette molécule, par expression des gènes de la voie de biosynthèse dans un hôte hétérologue facilement manipulable par exemple. Il est également envisageable de dupliquer les gènes codant des enzymes catalysant 20 des étapes cinétiquement limitantes de la biosynthèse de la congocidine, afin d'augmenter le rendement. Une telle approche a déjà été utilisée pour la production de tylosine par Streptomyces fradiae (Baltz et al., 1997). On pourrait aussi sur-exprimer des gènes régulateurs ayant un rôle d'activateur de l'expression des gènes de biosynthèse. On peut aussi envisager de multiplier, par manipulation génétique 25 dirigée, le nombre de copies des gènes, ou du groupe ( cluster ) de gènes, dirigeant la biosynthèse de la congocidine, comme cela est parfois réalisé empiriquement lors de la sélection de souches surproductrices d'antibiotiques (Yanai et al., 2006). De surcroît, la connaissance de la voie de biosynthèse de la congocidine et l'isolement des gènes impliqués dans cette biosynthèse peuvent 30 permettre la manipulation génétique de ce groupe de gènes (inactivation de gènes, mutagénèse, biosynthèse combinatoire, ingénierie métabolique) pour conduire à la production d'intermédiaires spécifiques de biosynthèse et de nouveaux dérivés de cette molécule. De tels dérivés sont en effet hautement désirables, car la toxicité de la congocidine empêche son utilisation clinique. Des analogues de la congocidine 35 possédant une forte activité antimicrobienne ou anticancéreuse mais une toxicité moindre pourraient avoir d'importantes applications biomédicales. 2907465 4 Pour répondre à ces besoins, les inventeurs ont maintenant réussi à mettre en évidence l'existence, chez Streptomyces ambofaciens, d'un locus particulier regroupant plusieurs gènes contrôlant la biosynthèse de congocidine et la résistance à la congocidine. 5 Ce groupe de gènes, ci-après dénommé groupe de gènes cgc, ou groupe cgc, ou encore cluster cgc , comprend 24 phases ouvertes de lecture, ou ORFs ( open reading frame ), numérotées ORF 1 à ORF24, codant pour des polypeptides de la voie de biosynthèse de la congocidine chez S. ambofaciens. Les gènes correspondant à ces 24 ORFs sont respectivement dénommés cgc3*, cgc2*, 10 cgcl*, cgcl, cgc2, cgc3, cgc4, cgc5, cgc6, cgc7, cgc8, cgc9, cgc10, cgcll, cgcl2, cgcl3, cgc14, cgc15, cgc16, cgc17, cgc18, cgc19, cgc2O et cgc2]. Ils ont été séquencés et les séquences polypeptidiques correspondantes ont été déduites des séquences nucléotidiques. Le Tableau II indique la correspondance entre ces ORF 1 à 24, les noms des gènes (cgc3* à cgcl* et cgcl à cgc2l), les noms des polypeptide 15 correspondants (Cgc3* à Cgcl* et Cgcl à Cgc2l) ainsi que les numéros de séquences nucléotidiques et polypeptidiques correspondants de la liste de séquences. 2907465 5 Tableau II cadre de nom du gène séquence nom de la séquence lecture nucléotidique protéine peptidique (ORF) 1 cgc3 * SEQ ID NO: 1 Cgc3* SEQ ID NO: 2 2 cgc2* SEQ ID NO: 3 Cgc2* SEQ ID NO: 4 3 cgcl * SEQ ID NO: 5 Cgcl * SEQ ID NO: 6 4 cgc1 SEQ ID NO: 7 Cgcl SEQ ID NO: 8 5 cgc2 SEQ ID NO: 9 Cgc2 SEQ ID NO: 10 6 cgc3 SEQ ID NO: 11 Cgc3 SEQ ID NO: 12 7 cgc4 SEQ ID NO: 13 Cgc4 SEQ ID NO: 14 8 cgc5 SEQ ID NO: 15 Cgc5 SEQ ID NO: 16 9 cgc6 SEQ ID NO: 17 Cgc6 SEQ ID NO: 18 10 cgc7 SEQ ID NO: 19 Cgc7 SEQ ID NO: 20 11 cgc8 SEQ ID NO: 21 Cgc8 SEQ ID NO: 22 12 cgc9 SEQ ID NO: 23 Cgc9 SEQ ID NO: 24 13 cgc10 SEQ ID NO: 25 Cgc10 SEQ ID NO: 26 14 cgcll SEQ ID NO: 27 Cgcl 1 SEQ ID NO: 28 15 cgc12 SEQ ID NO: 29 Cgc12 SEQ ID NO: 30 16 cgc13 SEQ ID NO: 31 Cgc 13 SEQ ID NO: 32 17 cgc14 SEQ ID NO: 33 Cgc14 SEQ ID NO: 34 18 cgc15 SEQ ID NO: 35 Cgc l S SEQ ID NO: 36 19 cgc16 SEQ ID NO: 37 Cgc16 SEQ ID NO: 38 20 cgc17 SEQ ID NO: 39 Cgc17 SEQ ID NO: 40 21 cgc18 SEQ ID NO: 41 Cgc18 SEQ ID NO: 42 22 cgc19 SEQ ID NO: 43 Cgc 19 SEQ ID NO: 44 23 cgc20 SEQ ID NO: 45 _ Cgc2O SEQ ID NO: 46 24 cgc21 SEQ ID NO: 47 Cgc21 SEQ ID NO: 48 Le groupe de gènes cgc est représenté par la séquence SEQ ID 5 NO:49. Le Tableau III indique, pour chacun desdits gènes, les caractéristiques relatives à la localisation sur ladite séquence SEQ ID NO:49, à l'activité putative du produit de traduction (prédictions basées sur les résultats BLAST (Altschul et al., 1997), PSI-BLAST (Schffer et al., 2001) et CD SEARCH (Marchler-Bauer et Bryant, 2004)), ainsi qu'à la comparaison, en termes de pourcentage d'identité et de 10 similarité, de la séquence polypeptidique correspondante avec la séquence du polypeptide de la base de données Genbank présentant le meilleur score BLAST (Altschul et al., 1997), en utilisant les paramètres par défaut. Dans ce Tableau III, % id correspond au pourcentage d'identité et % sim correspond au pourcentage de similarité entre la séquence de la protéine analysée et la séquence de la protéine 15 identifiée par BLAST comme la plus similaire. 2907465 6 TABLEAU III : Présentation des différents gènes du groupe cgc nom position en nt prédictions Protéine ayant le meilleur score BLAST, numéro %id-%sim gène d'accession start stop cgc3* 29539 31137 acyl-CoA synthétase acyl-CoA synthetase-like [Streptomyces netropsis], 52-60 AA U 04846 cgc2' 27700 29535 protéine de liaison à l'ATP d'un netropsin resistance protein subunit 2 [Streptomyces 75-84 transporteur ABC netropsis], AAU04845 cgc l' 25841 27700 protéine transmembranaire d'un netropsin resistance protein subunit 1 [Streptomyces 74-83 transporteur ABC netropsis], AAU04844 cgcl 25100 24429 régulateur putatif (famille HTH LuxR) two component response regulator-like [Streptomyces 61_71 netropsis], AAU04843 cgc2 24089 22677 domaine de condensation de NRPS non-ribosomal peptide synthetase [Myxococcus 35-48 xanthus DK 1622], Y P_631823 cgc3 21867 20410 aldéhyde déshydrogénase Betaine-aldehyde dehydrogenase [Frankia sp. 48-62 EANlpec], ZP_00567763 cgc4 20413 19868 cytidine désoxyribosyltransférase hypothetical protein plu3918 [Photorhabdus 54-71 luminescens subsp. laumondii TTO1], NP_931119 cgc5 19871 18978 Dihydroorotate déshydrogénase hypothetical protein plu3917 [Photorhabdus 50-67 luminescens subsp. laumondii TTO1], NP_931118 cgc6 18976 18146 créatininase hypothetical protein plu3916 [Photorhabdus 55-72 luminescens subsp. laumondii TTO1], NP_931117 cgc? 18098 16965 béta-glucosidase 6-phospho-beta-glucosidase [Erwinia carotovora 31-46 subsp. atroseptica SCRI1043], YP_049968 cgc8 16921 15611 acide udp-n-acétyl-d-mannosaminuronate UDP-glucose 6-dehydrogenase [Syntrophomonas 38-56 déshydrogénase wolfei str. Goettingen], ZP_00662730 cgc9 15618 14635 épimérase ou déshydratase NAD nucleoside-diphosphate-sugar epimerase [Salinibacter 44-58 dépendante ruber DSM 13855], YP_444743 cgc10 14638 13556 glycosyltransférase Glycosyl transferase, group 1 [Roseiflexus sp. RS-1], 33-47 ZP_01356370 cgcll 13559 12795 nucléoside-diphosphate-sucre Nucleotidyl transferase [Methanococcoides burtonii 43-65 pyrophosphorylase DSM 6242], YP_566238 cgc12 12798 11653 aminotransférase, enzyme phosphate nucleotide-sugar aminotransferase [Syntrophus 46-60 dépendante aciditrophicus SB], YP_460446 cgc13 11665 9740 Endo-béta-mannanase /béta hypothetical protein TTE0061 [Thermoanaerobacter 25-44 galactosidase tengcongensis MB4], NP_621764 cgcl4 9743 8835 amidohydrolase / hydrolase métal- hypothetical protein DSM3645_18596 [Blastopirellula 30-48 dépendant marina DSM 3645], ZP_01093181 cgcl 5 8828 8022 méthylase / méthyltransférase ubiquinonehnenaquinone biosynthesis methyltransferase 32-46 [uncultured methanogenic archaeon RC-II, CAJ36215 cgc16 7998 6661 domaine de condensation de NRPS related proteins [Nostoc punctiforme PCC 73102], 37-55 ZP_00110264 cgc17 6664 5618 déshydrogénase d'alcool Zinc dépendante Alcohol dehydrogenase superfamily, zinc-containing:GroES- 38-50 related [Geobacter sp. FRC-32], ZP_01389290 cgc18 5621 2418 domaine d'adénylation, PCP et de non-ribosomal peptide synthetase [Myxococcus 39-54 condensation de NRPS xanthus DK 1622], YP_631823 cgc19 2360 1995 domaine PCP de NRPS pyoverdine sidechain peptide synthetase I, epsilon-Lys 50-55 module [Pseudomonas syringae pv. tomate str. DC3000], NP_791969 cgc20 1664 999 facteur sigma, sous-unité de RNA polymerase ECF-subfamily sigma factor 56-68 l'ARN-polymérase [Streptomyces avermitilis MA-4680], NP_825065 cgc2l 654 1 protéine hypothétique hypothetical protein SAV3889 [Streptomyces 38-52 avermitilis MA-4680], NP_825066 2907465 7 Parmi ces 24 ORF, au moins 23 sont impliquées dans la voie de biosynthèse de la congocidine (ORF 1 à 23), qui inclut la biosynthèse proprement dite de la congocidine, la résistance à la congocidine, et la régulation de la biosynthèse de la congocidine. 5 Les comparaisons de séquences présentées dans le Tableau III révèlent les éléments suivants : le gène cgc3* (ORF 1) code pour un polypeptide présentant une homologie de séquence avec une acyl-CoA synthétase, ce qui suggère qu'il pourrait activer le groupement carboxyle d'un précurseur guanidino-acétate ; 10 les quatre gènes cgc2, cgc16, cgc18 et cgc19 (ORFs 5, 19, 21 et 22) codent pour des protéines présentant des homologies avec des NRPS ( Non Ribosomal Peptide Synthetase , Synthétase de Peptides Non Ribosomique) ou avec des domaines de NRPS, ce qui suggère un rôle de catalyseur de l'assemblage de la congocidine en participant à la formation des trois liaisons 15 amides présentes dans cette molécule ; les Inventeurs ont en outre montré que l'inactivation du gène cgc18 bloque la biosynthèse de la congocidine chez S. ambofaciens ; - de manière inattendue, les produits des gènes cgc7 à cgc13 (ORF 10 à ORF 16) présentent des homologies avec des enzymes impliquées dans la 20 biosynthèse ou le transfert de sucre, et on ne pouvait donc pas a priori prévoir leur intervention dans la biosynthèse de la congocidine, puisque cette molécule ne comporte pas de sucre ; les Inventeurs ont en outre montré que l'inactivation d'un des gènes cgc7 ou cgclO bloque la biosynthèse de la congocidine dans un système d'expression hétérologue chez S. lividans ; 25 les gènes cgc3, cgc4, cgc5, cgc6, cgc14 et cgcl7 (ORF 6 à 9, 17 et 20) codent pour des polypeptides ayant probablement une fonction enzymatique. Toutefois leur rôle dans la biosynthèse de la congocidine n'aurait pas pu être déterminé a priori ; le gène cgc15 (ORF 18) code pour un polypeptide présentant une homologie 30 de séquence avec une méthyltransférase, ce qui suggère l'intervention du polypeptide Cgc15 dans la méthylation de l'atome d'azote des deux groupements pyrroles de la congocidine ; les gènes cgcl* et cgc2* (ORF 3 et ORF 2) codent pour des polypeptides (Cgcl * et Cgc2*) susceptibles d'être des transporteurs de type ABC ( ATP 35 Binding Cassette ). Ces polypeptides présentent des homologies avec les polypeptides NetP2 et NetP1, impliqués dans la résistance à la congocidine chez Streptomyces netropsis. Les inventeurs ont en outre montré 2907465 8 expérimentalement que ces gènes cgc2* et cgcl * sont effectivement impliqués dans la résistance à la congocidine ; les gènes, cgcl et cgc20 (ORF 4 et ORF 23) codent pour des polypeptides présentant des homologies de séquences respectivement avec un régulateur de 5 la famille LuxR à motif Hélice-Boucle-Hélice (Cgcl) et un facteur sigma (Cgc20), suggérant qu'ils pourraient réguler au niveau transcriptionnel la biosynthèse de la congocidine. Il est à noter que ces deux gènes sont les seuls du groupe cgc à contenir un codon UUA, codon rare chez les Streptomyces. L'analyse de la séquence du groupe de gènes cgc, premier groupe de 10 gènes isolé dirigeant la biosynthèse d'un pyrrolamide, a mis en évidence une voie de biosynthèse originale pour la congocidine. En effet, l'analyse de la structure de la congocidine ne fait pas apparaître de façon évidente l'implication d'enzymes apparentées aux NRPS dans la biosynthèse et l'origine des précurseurs putatifs, inusuels, ne peut être prédite. L'isolement et la caractérisation des gènes du groupe de gènes cgc, impliqué dans la résistance, la régulation, et la biosynthèse de congocidine permet : - d'introduire certains des gènes cgc, ou bien la totalité desdits gènes, dans une cellule hôte, de façon à lui conférer la capacité à synthétiser la congocidine ; - d'utiliser les gènes de résistance dans un système d'expression hétérologue afin de conférer à l'hôte la résistance à la congocidine (gènes cgc2* et cgcl *) ; - en outre, il est possible de réguler la biosynthèse de congocidine en agissant notamment sur les gènes cgcl et/ou cgc20, par exemple en les inactivant de 25 manière à réduire ou inhiber ladite biosynthèse, ou bien en les surexprimant de manière à augmenter ladite biosynthèse. Par ailleurs, l'isolement du groupe de gènes cgc permet de sélectionner de nouvelles voies de biosynthèse de pyrrolamides. La recherche, chez les actinobactéries, de séquences homologues aux séquences des ORFs dudit groupe 30 cgc pourrait en effet permettre l'isolement et la caractérisation d'autres gènes et/ou groupes de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse d'autres pyrrolamides que la congocidine, ou bien de molécules dérivées de la congocidine, telles que des dérivés non toxiques. La présente invention a donc pour objet un polynucléotide isolé, 35 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe constitué par : 15 20 2907465 9 a) l'une quelconque des phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 codant pour les polypeptides de la voie de biosynthèse de la congocidine Cgc3* (SEQ ID NO: 2), Cgc2* (SEQ ID NO: 4), Cgcl* (SEQ ID NO: 6), Cgcl (SEQ ID NO: 8), Cgc2 (SEQ ID NO: 10), Cgc3 (SEQ ID NO: 12), Cgc4 (SEQ ID NO: 14), 5 Cgc5 (SEQ ID NO: 16), Cgc6 (SEQ ID NO: 18), Cgc7 (SEQ ID NO: 20), Cgc8 (SEQ ID NO: 22), Cgc9 (SEQ ID NO: 24), Cgc10 (SEQ ID NO: 26), Cgcl l (SEQ ID NO: 28), Cgc12 (SEQ ID NO: 30), Cgc13 (SEQ ID NO: 32), Cgc14 (SEQ ID NO: 34), Cgc15 (SEQ ID NO: 36), Cgc16 (SEQ ID NO: 38), Cgc17 (SEQ ID NO: 40), Cgcl8 (SEQ ID NO: 42), Cgc19 (SEQ ID NO: 44), Cgc2O (SEQ ID NO: 46) et Cgc2l (SEQ 10 ID NO: 48), l'une ou plusieurs desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; b) une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 ; 15 c) une séquence codant pour l'un quelconque des analogues desdits polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 ; d) une séquence comprenant au moins deux séquences d'acide nucléique de a), b) ou c) ; et e) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à l'une 20 quelconque des phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 et pouvant remplacer la (les) phase(s) ouverte(s) de lecture à laquelle (auxquelles) elle s'hybride spécifiquement, pour diriger la biosynthèse de la congocidine. Définitions : - Le terme hybridation est connu de l'homme du métier, et se 25 réfère au mécanisme de couplage d'acides nucléiques, en fonction notamment de leurs séquences respectives. L'hybridation peut être totale ou partielle. L'acide nucléique s'hybridant au polynucléotide selon l'invention est donc utilisable pour remplacer l'une des séquences d'acide nucléique telle que définie ci-dessus, ainsi qu'également selon sa longueur, comme sondes ARN ou ADN dans des analyses respectivement de 30 type Northern blot ou Southern blot . Il peut également être utilisé comme amorce dans des analyses de type PCR (réaction de polymérisation en chaîne). Dans ce dernier cas, l'amorce comprend de préférence au moins 15 nucléotides. L'homme du métier est en mesure de réaliser des expériences et analyses basées sur l'hybridation de polynucléotides. Il sait sur quels paramètres il 35 doit agir pour faire varier les conditions d'hybridation. Il sait également quelles conditions d'hybridation doivent être utilisées pour réaliser l'invention. Ces conditions d'hybridation sont décrites dans des ouvrages de référence tels que Sambrook et al., 2907465 10 Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2'd édition 1989 et 3ème édition 2001 ; Gerhardt et al., Methods for General and Molecular Bacteriology ; ASM Press, 1994 ; Lefkovits ; Immunology Methods Manual : The Comprehensive Sourcebook of Techniques ; Academic Press, 1997 ; Golemis ; 5 Protein-Protein Interactions : A Molecular Cloning Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002 et d'autres ouvrages ou manuels de référence connus de l'homme du métier. - L'expression en conditions stringentes se réfère par exemple à une incubation pendant une nuit à 60 C dans une solution comprenant 6x SSC (NaCl 10 900 mM, citrate de sodium 90 mM), 5x de solution de Denhart, 0,5 % (poids/volume) de SDS, 100 g/ml d'ADN de sperme de saumon cisaillé et dénaturé, suivi par exemple d'un lavage dans une solution de 0,2 x SSC à 65 C. - Au sens de la présente invention, l'expression dérivé de la congocidine est utilisée pour désigner toute molécule bioactive susceptible d'être 15 synthétisée par les polynucléotides selon l'invention, ladite molécule bioactive pouvant être par exemple un antibiotique de la famille des pyrrolamides autre que la congocidine ; il peut également s'agir de toute molécule structurellement et/ou fonctionnellement proche de la congocidine. De préférence, il s'agit d'un dérivé non toxique de la congocidine. 20 - L'expression voie de biosynthèse de la congocidine est utilisée pour désigner l'ensemble des protéines codées par le groupe de gènes cgc et conduisant à la synthèse de la congocidine. La voie de biosynthèse englobe notamment : - la biosynthèse proprement dite de la congocidine, c'est-à-dire l'assemblage des 25 différents constituants de cette molécule. Cette synthèse peut avoir lieu aussi bien dans un microorganisme comprenant de façon endogène le groupe de gènes cgc (par exemple Streptomyces ambofaciens), que dans un système d'expression hétérologue convenable, tel qu'une cellule recombinante (par exemple Streptomyces lividans) transformée par un vecteur d'expression 30 comprenant un ou plusieurs des gènes dudit groupe de gènes cgc. Cette synthèse peut également avoir lieu, partiellement ou totalement, dans un système acellulaire ; - les éléments de régulation de ladite biosynthèse. La régulation peut notamment avoir lieu au niveau transcriptionnel, traductionnel, ou bien au niveau de 35 l'activité enzymatique. Il peut s'agir d'une inhibition ou d'une augmentation de la transcription, de la traduction ou de l'activité enzymatique ; et 2907465 11 - les éléments de résistance à la congocidine. En effet, dans un système d'expression hétérologue d'un ou plusieurs gène(s) du groupe de gènes cgc, il peut être nécessaire de conférer à l'hôte le caractère de résistance à la congocidine, sans lequel la biosynthèse de congocidine pourrait ne pas avoir 5 lieu de façon satisfaisante. Cela pourrait notamment être le cas pour un hôte naturellement sensible à la congocidine. - Au sens de la présente invention, les termes polypeptide(s) et protéine(s) sont interchangeables et peuvent être indifféremment utilisés pour désigner les produits de traduction des ORF. 10 - Au sens de l'invention, le terme analogue se réfère à un polypeptide structurellement proche d'un polypeptide codé par un gène cgc et pouvant participer à la voie de biosynthèse de la congocidine ou d'un dérivé de la congocidine tel que décrit plus haut, par exemple un dérivé non toxique de la congocidine. Ainsi : 15 - un analogue du polypeptide Cgc3* (SEQ ID NO: 2) présente au moins 53% d'identité et au moins 60% de similarité, de préférence au moins 60% d'identité et au moins 65% de similarité, de manière encore préférée au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore plus préférée, au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 20 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 2. 25 - un analogue du polypeptide Cgc2* (SEQ ID NO: 4) présente au moins 76% d'identité et au moins 84% de similarité, de préférence au moins 80% d'identité et au moins 84% de similarité, de manière encore préférée au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de manière encore plus préférée, au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au 30 moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 4. - un analogue du polypeptide Cgc1 * (SEQ ID NO: 6) présente au moins 75% d'identité et au moins 83% de similarité, de préférence au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% 35 d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 6. 2907465 12 - un analogue du polypeptide Cgcl (SEQ ID NO: 8) présente au moins 62% d'identité et au moins 71% de similarité, de préférence au moins 65% d'identité et au moins 71% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% 5 d'identité et au moins 80% de similarité, de manièreencore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 8. 10 - un analogue du polypeptide Cgc2 (SEQ ID NO: 10) présente au moins 36% d'identité et au moins 48% de similarité, de préférence au moins 40% d'identité et au moins 48% de similarité, de préférence encore au moins 45% d'identité et au moins 48% de similarité, de manière plus préférée au moins 50% d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 15 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 20 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 10. - un analogue du polypeptide Cgc3 (SEQ ID NO: 12) présente au 25 moins 49% d'identité et au moins 62% de similarité, de préférence au moins 55% d'identité et au moins 62% de similarité, de préférence encore au moins 60% d'identité et au moins 62% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% 30 d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 12. 35 - un analogue du polypeptide Cgc4 (SEQ ID NO: 14) présente au moins 55% d'identité et au moins 71% de similarité, de préférence au moins 60% d'identité et au moins 71% de similarité, de préférence encore au moins 65% 2907465 13 d'identité et au moins 71% de similarité, de manière plus préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% 5 d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 14. - un analogue du polypeptide CgcS (SEQ ID NO: 16) présente au moins 51% d'identité et au moins 67% de similarité, de préférence au moins 55% 10 d'identité et au moins 67% de similarité, de préférence encore au moins 60% d'identité et au moins 67% de similarité, de manière plus préférée au moins 65% d'identité et au moins 67% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au 15 moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 16. - un analogue du polypeptide Cgc6 (SEQ ID NO: 18) présente au 20 moins 56% d'identité et au moins 72% de similarité, de préférence au moins 60% d'identité et au moins 72% de similarité, de préférence encore au moins 65% d'identité et au moins 72% de similarité, de manière plus préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 25 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 18. - un analogue du polypeptide Cgc7 (SEQ ID NO: 20) présente au 30 moins 32% d'identité et au moins 46% de similarité, de préférence au moins 40% d'identité et au moins 46% de similarité, de préférence encore au moins 45% d'identité et au moins 50% de similarité, de manière plus préférée au moins 50% d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% 35 d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% 2907465 14 d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 5 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 20. - un analogue du polypeptide Cgc8 (SEQ ID NO: 22) présente au moins 39% d'identité et au moins 56% de similarité, de préférence au moins 40% d'identité et au moins 56% de similarité, de préférence encore au moins 45% d'identité et au moins 56% de similarité, de manière plus préférée au moins 50% 10 d'identité et au moins 56% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% 15 d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 22. 20 - un analogue du polypeptide Cgc9 (SEQ ID NO: 24) présente au moins 45% d'identité et au moins 58% de similarité, de préférence au moins 50% d'identité et au moins 58% de similarité, de préférence encore au moins 55% d'identité et au moins 58% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% 25 d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% 30 d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 24. - un analogue du polypeptide Cgc 10 (SEQ ID NO: 26) présente au moins 34% d'identité et au moins 47% de similarité, de préférence au moins 35% d'identité et au moins 47% de similarité, préférentiellement au moins 40% d'identité 35 et au moins 47% de similarité, de préférence encore au moins 45% d'identité et au moins 50% de similarité, de manière plus préférée au moins 50% d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 55% d'identité et 2907465 15 au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au 5 moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 26. 10 - un analogue du polypeptide Cgcl l (SEQ ID NO: 28) présente au moins 44% d'identité et au moins 65% de similarité, de préférence au moins 50% d'identité et au moins 65% de similarité, de préférence encore au moins 55% d'identité et au moins 65% de similarité, de manière plus préférée au moins 60% d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% 15 d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% 20 d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 28. - un analogue du polypeptide Cgc 12 (SEQ ID NO: 30) présente au moins au moins 47% d'identité et au moins 60% de similarité, de préférence au moins 50% d'identité et au moins 60% de similarité, de préférence encore au moins 55% 25 d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 30 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 30. - un analogue du polypeptide Cgc13 (SEQ ID NO: 32) présente au 35 moins 26% d'identité et au moins 44% de similarité, de préférence au moins 30% d'identité et au moins 44% de similarité, préférentiellement encore au moins 35% d'identité et au moins 44% de similarité, de manière encore préférée au moins 40% 2907465 16 d'identité et au moins 44% de similarité, de préférence encore au moins 45% d'identité et au moins 50% de similarité, de manière plus préférée au moins 50% d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% 5 d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% 10 d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 32. - un analogue du polypeptide Cgc14 (SEQ ID NO: 34) présente au moins 31% d'identité et au moins 48% de similarité, de préférence au moins 35% 15 d'identité et au moins 48% de similarité, préférentiellement encore au moins 40% d'identité et au moins 48% de similarité, de préférence encore au moins 45% d'identité et au moins 48% de similarité, de manière plus préférée au moins 50% d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% 20 d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70%

d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% 25 d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 34. - un analogue du polypeptide Cgcl5 (SEQ ID NO: 36) présente au moins 33% d'identité et au moins 46% de similarité, préférentiellement au moins 35% 30 d'identité et au moins 46% de similarité, de préférence au moins 40% d'identité et au moins 46% de similarité, de préférence encore au moins 45% d'identité et au moins 50% de similarité, de manière plus préférée au moins 50% d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% d'identité et au moins 65% 35 de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de 2907465 17 similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 5 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 36. - un analogue du polypeptide Cgc16 (SEQ ID NO: 38) présente au moins 38% d'identité et au moins 55% de similarité, de préférence au moins 40% d'identité et au moins 55% de similarité, de préférence encore au moins 45% d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée au moins 50% 10 d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% 15 d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 38. 20 - un analogue du polypeptide Cgc17 (SEQ ID NO: 40) présente au moins 39% d'identité et au moins 50% de similarité, de préférence au moins 45% d'identité et au et au moins 50% de similarité, de manière plus préférée au moins 50% d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% 25 d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% 30 d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 40. - un analogue du polypeptide Cgc18 (SEQ ID NO: 42) présente au moins 40% d'identité et au moins 54% de similarité, de préférence au moins 45% 35 d'identité et au moins 54% de similarité, de préférence encore au moins 50% d'identité et au moins 54% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% 2907465 18 d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 5 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 42. - un analogue du polypeptide Cgc19 (SEQ ID NO: 44) présente au 10 moins 51% d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au 15 moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 44. 20 - un analogue du polypeptide Cgc2O (SEQ ID NO: 46) présente au moins 57% d'identité et au moins 68% de similarité, de préférence au moins 60% d'identité et au moins 68% de similarité, de préférence encore au moins 65% d'identité et au moins 68% de similarité, de manière plus préférée au moins 70% d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% 25 d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 46. 30 - un analogue du polypeptide Cgc2l (SEQ ID NO: 48) présente au moins 39% d'identité et au moins 52% de similarité, de préférence au moins 45% d'identité et au moins 52% de similarité, de préférence encore au moins 50% d'identité et au moins 52% de similarité, de manière plus préférée au moins 50% d'identité et au moins 55% de similarité, de manière plus préférée encore au moins 35 55% d'identité et au moins 60% de similarité, plus préférentiellement au moins 60% d'identité et au moins 65% de similarité, plus préférentiellement encore au moins 65% d'identité et au moins 70% de similarité, de manière encore préférée au moins 70% 2907465 19 d'identité et au moins 75% de similarité, préférentiellement encore au moins 75% d'identité et au moins 80% de similarité, de manière encore plus préférée au moins 80% d'identité et au moins 85% de similarité, plus préférentiellement au moins 85% d'identité et au moins 90% de similarité, de préférence encore au moins 90% 5 d'identité et au moins 95% de similarité, et de manière encore plus préférée, au moins 95% d'identité et au moins 99% de similarité avec la séquence SEQ ID NO: 48. Par x% d'identité entre un polypeptide P et une séquence de référence, on entend que lorsque les deux séquences sont alignées, x% des acides aminés de P sont identiques à l'acide aminé correspondant de ladite séquence de 10 référence. Par x% de similarité entre un polypeptide P et une séquence de référence, on entend que lorsque les deux polypeptides sont alignés, x% des acides aminés de P sont identiques à l'acide aminé correspondant de ladite séquence de référence ou sont remplacés par un acide aminé du même groupe. Par acide aminé de même groupe, on entend un acide aminé possédant des propriétés chimiques sensiblement identiques. En particulier, on entend par ce terme des acides aminés ayant sensiblement la même charge et/ou la même taille, et/ou la même hydrophilie ou hydrophobie et/ou la même aromaticité. De tels groupes d'acides aminés incluent notamment ; (i) glycine, alanine (ii) isoleucine, leucine, valine (iii) tryptophane, tyrosine, phénylalanine (iv) acide aspartique, acide glutamique (v) arginine, lysine, histidine (vi) sérine, thréonine D'autres substitutions peuvent être envisagées, dans lesquelles on remplace un acide aminé par un autre acide aminé comparable mais non naturel (hydroxyproline, norleucine, ornithine, citrulline, cyclohexylalanine, acides aminés dextrogyres, ....). 30 Selon un mode de réalisation avantageux dudit polynucléotide, il comprend une séquence d'acide nucléique sélectionnée dans le groupe constitué par : al) au moins les phases ouvertes de lecture ORF 1 et 5 à 22 codant pour les polypeptides de la voie de biosynthèse de la congocidine Cgc3* (SEQ ID NO: 2), Cgc2 (SEQ ID NO: 10), Cgc3 (SEQ ID NO: 12), Cgc4 (SEQ ID NO: 14), 35 CgcS (SEQ ID NO: 16), Cgc6 (SEQ ID NO: 18) Cgc7 (SEQ ID NO: 20), Cgc8 (SEQ ID NO: 22), Cgc9 (SEQ ID NO: 24), Cgc10 (SEQ ID NO: 26), Cgcl 1 (SEQ ID NO: 28), Cgc 12 (SEQ ID NO: 30); Cgc 13 (SEQ ID NO: 32), Cgc 14 (SEQ ID NO: 34), 15 20 25 2907465 20 Cgc15 (SEQ ID NO: 36), Cgc16 (SEQ ID NO: 38), Cgc17 (SEQ ID NO: 40), Cgc18 (SEQ ID NO: 42) et Cgc 19 (SEQ ID NO: 44), l'une ou plusieurs desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; 5 b l) une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 et 5 à 22 ; c 1) une séquence codant pour l'un quelconque des analogues desdits polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 et 5 à 22 ; et dl) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à l'une 10 quelconque des phases ouvertes de lecture ORF 1 et 5 à 22 et pouvant remplacer la (les) phase(s) ouverte(s) de lecture à laquelle (auxquelles) elle s'hybride spécifiquement, pour diriger la biosynthèse de la congocidine. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit polynucléotide comprend en outre une séquence d'acide nucléique sélectionnée dans 15 le groupe constitué par : a2) une séquence comprenant les deux phases ouvertes de lecture ORF 2 et ORF 3, impliquées dans la résistance à la congocidine, codant pour les polypeptides Cgc2* (SEQ ID NO: 4) et Cgcl* (SEQ ID NO: 6), l'une et/ou l'autre desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) 20 séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; b2) une séquence codant pour les polypeptides codés par lesdites deux phases ouvertes de lecture ORF 2 et 3 ; c2) une séquence codant pour les analogues desdits polypeptides codés par lesdites deux phases ouvertes de lecture ORF 2 et 3 ; et 25 d2) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à la séquence définie en a2) et pouvant remplacer l'acide nucléique auquel elle s'hybride spécifiquement, pour conférer la résistance à la congocidine. Un tel polynucléotide confère à un microorganisme hôte le caractère de résistance à la congocidine. 30 Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit polynucléotide comprend en outre une séquence d'acide nucléique sélectionnée dans le groupe constitué par : a3) les phases ouvertes de lecture ORF 4 et/ou ORF 23, impliquées dans la régulation de la biosynthèse de la congocidine, codant pour les polypeptides 35 Cgcl (SEQ ID NO: 8) et Cgc20 (SEQ ID NO: 46), l'une et/ou l'autre desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; 2907465 21 b3) une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 ; c3) une séquence codant pour l'un quelconque des analogues desdits polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 ; et 5 d3) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à l'une quelconque phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 et pouvant remplacer la (les) phase(s) ouverte(s) de lecture à laquelle (auxquelles) elle s'hybride spécifiquement, pour réguler la biosynthèse de la congocidine. Le polynucléotide incluant les phases ouvertes de lecture ORF 1 et 4 10 à 23, c'est-à-dire les phases ouvertes de lecture utiles pour la biosynthèse ainsi que les phases ouvertes de lecture utiles pour la régulation, est apte à réguler la biosynthèse de congocidine chez un microorganisme ayant la capacité de synthétiser la congocidine. En particulier, un tel polynucléotide permet d'augmenter la biosynthèse de congocidine. Il peut également être utilisé pour conférer à un hôte la capacité à 15 produire la congocidine, dans le cas notamment où l'hôte ne possède pas, initialement, les gènes cgcl et cgc20 endogènes, ou bien lorsque ces gènes endogènes sont initialement inactivés. Comme précisé ci-dessus, ledit polynucléotide peut comprendre en outre optionnellement les phases ouvertes de lecture ORF 2 et ORF 3 impliquées dans la résistance à la congocidine. 20 Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit polynucléotide comprend en outre une séquence d'acide nucléique sélectionnée dans le groupe constitué par : a4) la phase ouverte de lecture ORF 24 codant pour le polypeptide impliqué dans la voie de biosynthèse de la congocidine, Cgc21 (SEQ ID NO: 48), 25 ladite phase ouverte de lecture étant optionnellement remplacée par la séquence complémentaire correspondante ; b4) une séquence codant pour lepolypeptide codé par la phase ouverte de lecture ORF 24 ; c4) une séquence codant pour un analogue dudit polypeptide codé 30 par ladite phase ouverte de lecture ORF 24 ; et d4) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à la phase ouverte de lecture ORF 24 et pouvant remplacer la phase ouverte de lecture à laquelle elle s'hybride spécifiquement, pour diriger la biosynthèse de la congocidine. Ainsi, lorsque ledit polynucléotide comprend l'ensemble du groupe 35 de gènes cgc, il peut inclure l'une des séquences suivantes : a5) l'ensemble des phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 impliquées dans la voie de la biosynthèse de la congocidine, l'une ou plusieurs 2907465 22 desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; b5) la séquence SEQ ID NO: 49 ; c5) une séquence codant pour l'ensemble des polypeptides codés par 5 lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 ; d5) une séquence codant pour des analogues de l'ensemble des polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 ; et e5) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à la séquence définie en a5) et pouvant remplacer l'acide nucléique auquel elle s'hybride 10 spécifiquement, pour diriger la biosynthèse de la congocidine. Un tel polynucléotide, comprenant l'ensemble des phases ouvertes de lecture ORFs 1 à 24, quelles que soient leurs orientations, confère à un hôte à la fois la capacité à produire la congocidine et le caractère de résistance à la congocidine. Un tel polynucléotide est notamment utile lorsque l'hôte choisi pour la production de 15 congocidine n'est initialement pas résistant à la congocidine. Selon un autre mode de réalisation avantageux du polynucléotide, celui-ci comprend une séquence d'acide nucléique sélectionnée dans le groupe constitué par : a6) une séquence comprenant les deux phases ouvertes de lecture 20 ORF2 et ORF 3, impliquées dans la résistance à la congocidine, codant pour les polypeptides Cgc2* (SEQ ID NO: 4) et Cgcl * (SEQ ID NO: 6), l'une et/ou l'autre desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; b6) une séquence codant pour les polypeptides codés par lesdites 25 phases ouvertes de lecture ORF 2 et 3 ; c6) une séquence codant pour les analogues desdits polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 2 et 3 ; et d6) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à l'acide nucléique défini en a6) et pouvant remplacer l'acide nucléique auquel elle 30 s'hybride spécifiquement, pour conférer la résistance à la congocidine. Un tel polynucléotide code uniquement pour les polypeptides impliqués dans la résistance à la congocidine. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du polynucléotide de l'invention, celui-ci comprend une séquence d'acide nucléique 35 sélectionnée dans le groupe constitué par : a7) les phases ouvertes de lecture ORF 4 et/ou ORF 23, impliquées dans la régulation de la biosynthèse de la congocidine, codant pour les polypeptides 2907465 23 Cgcl (SEQ ID NO: 8) et Cgc20 (SEQ ID NO: 46), l'une et/ou l'autre desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; b7) une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides 5 codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 ; c7) une séquence codant pour l'un quelconque des analogues desdits polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 ; et d7) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à l'une quelconque des phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 et pouvant remplacer la 10 (les) phase(s) ouverte(s) de lecture à laquelle (auxquelles) elle s'hybride spécifiquement, pour réguler la biosynthèse de la congocidine. Un tel polynucléotide code uniquement pour les séquences de régulation de la biosynthèse de congocidine. L'invention a également pour objet un groupe de gènes comprenant 15 les phases ouvertes de lecture codant pour les polypeptides Cgc3* (SEQ ID NO: 2), Cgc2* (SEQ ID NO: 4), Cgcl * (SEQ ID NO: 6), Cgc1 (SEQ ID NO: 8), Cgc2 (SEQ ID NO: 10), Cgc3 (SEQ ID NO: 12), Cgc4 (SEQ ID NO: 14), CgcS (SEQ ID NO: 16), Cgc6 (SEQ ID NO: 18), Cgc7 (SEQ ID NO: 20), Cgc8 (SEQ ID NO: 22), Cgc9 (SEQ ID NO: 24), Cgc10 (SEQ ID NO: 26), Cgc11 (SEQ ID NO: 28), Cgc12 (SEQ ID NO: 20 30), Cgc13 (SEQ ID NO: 32), Cgc14 (SEQ ID NO: 34), Cgc15 (SEQ ID NO: 36), Cgc16 (SEQ ID NO: 38), Cgcl7 (SEQ ID NO: 40), Cgc18 (SEQ ID NO: 42), Cgc19 (SEQ ID NO: 44), Cgc20 (SEQ ID NO: 46) et Cgc2l (SEQ ID NO: 48). Un autre objet de la présente invention est un vecteur comprenant un polynucléotide selon l'invention. 25 Avantageusement, ledit vecteur est un plasmide, un cosmide, un chromosome artificiel bactérien (BAC), un vecteur dérivé d'un élément intégratif d'actinobactérie, un virus ou un bactériophage. La présente invention a également pour objet une cellule recombinante caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon 30 l'invention. De manière préférée, ladite cellule recombinante est une actinobactérie. De manière encore plus préférée, il s'agit d'une actinobactérie du genre Streptomyces, telle que Streptomyces lividans. Selon un mode de réalisation de la cellule recombinante selon 35 l'invention, celle-ci est apte à synthétiser la congocidine, et ledit vecteur est un vecteur d'expression comprenant au moins un polynucléotide comprenant les ORFs de la biosynthèse de la congocidine tel que décrit plus haut. 2907465 24 Selon un autre mode de réalisation, ladite cellule recombinante est résistante à la congocidine, et ledit vecteur est un vecteur d'expression comprenant au moins un des polynucléotides comprenant les ORFs impliquées dans la résistance à la congocidine, tels que décrits plus haut. 5 L'invention a également pour objet un fragment d'au moins 15 nucléotides d'un polynucléotide selon l'invention, ledit fragment étant utilisable comme sonde ou amorce. De préférence, ledit fragment comprend au plus 100 nucléotides. De manière encore plus préférée, il comprend au plus 60 nucléotides. Avantageusement, ledit fragment comprend une séquence 10 sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 52, 53 et 56 à 59. La présente invention a en outre pour objet un polypeptide isolé, impliqué dans la voie de la biosynthèse de la congocidine ou d'un dérivé de la congocidine, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par : - les polypeptides Cgc3* (SEQ ID NO: 2), Cgc2* (SEQ ID NO: 15 4), Cgcl * (SEQ ID NO: 6), Cgcl (SEQ ID NO: 8), Cgc2 (SEQ ID NO: 10), Cgc3 (SEQ ID NO: 12), Cgc4 (SEQ ID NO: 14), CgcS (SEQ ID NO: 16), Cgc6 (SEQ ID NO: 18), Cgc7 (SEQ ID NO: 20), Cgc8 (SEQ ID NO: 22), Cgc9 (SEQ ID NO: 24), Cgc10 (SEQ ID NO: 26), Cgcl l (SEQ ID NO: 28), Cgc12 (SEQ ID NO: 30), Cgc13 (SEQ ID NO: 32), Cgcl4 (SEQ ID NO: 34), Cgc15 (SEQ ID NO: 36), Cgc16 (SEQ 20 ID NO: 38), Cgc17 (SEQ ID NO: 40), Cgc18 (SEQ ID NO: 42), Cgc19 (SEQ ID NO: 44), Cgc2O (SEQ ID NO: 46) et Cgc2l (SEQ ID NO: 48) ; et - les analogues desdits polypeptides. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention, d'un vecteur selon l'invention, d'une cellule 25 recombinante selon l'invention, d'un ou plusieurs fragment(s) selon l'invention, seuls ou en combinaison, et/ou d'un ou plusieurs polypeptide(s) selon l'invention, seuls ou en combinaison, pour la production de congocidine in vitro. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention, pour conférer à un microorganisme (par exemple une actinobactérie 30 telle que Streptomyces lividans) la capacité à synthétiser la congocidine. Avantageusement, ledit microorganisme exprime des phosphopantothéinyle transférases (PPTases). Le microorganisme peut par exemple exprimer de manière naturelle lesdites PPTases. S'il n'exprime pas de manière naturelle lesdites PPTases, ledit microorganisme peut être modifié de manière à 35 exprimer lesdites PPTases. Il existe des PPTases capables de modifier un grand nombre de protéines contenant des domaines PCP, et qui peuvent être exprimées dans des hôtes hétérologues (Suo et al., 2001). 2907465 25 L'invention a en outre pour objet l'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention pour conférer à un microorganisme (par exemple une actinobactérie) la résistance à la congocidine. Dans ce cas, ledit polynucléotide est de préférence choisi parmi ceux des polynucléotides décrits plus haut qui comprennent les phases de 5 lecture ouvertes ORF2 et ORF3. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention pour augmenter in vitro la biosynthèse de congocidine par un micro-organisme (par exemple une actinobactérie) capable de synthétiser la congocidine. L'invention a en outre pour objet l'utilisation d'un polynucléotide 10 selon l'invention pour la préparation d'un dérivé de la congocidine. De préférence, il s'agit d'un dérivé non toxique de la congocidine. L'invention a encore pour objet un procédé de production in vitro de congocidine ou d'un dérivé de congocidine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à mettre en culture une cellule recombinante selon l'invention apte à 15 synthétiser la congocidine, dans des conditions permettant la synthèse de congocidine ou du dérivé de congocidine. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux 20 dessins annexés, dans lesquels : La Figure 1 représente la structure des molécules de la famille des pyrrolamides et molécules apparentées. La Figure 2 est une représentation schématique du groupe de gènes cgc ( cluster cgc ) impliqué dans la voie de biosynthèse de la congocidine. 25 La Figure 3 illustre l'analyse par HPLC des souches de Streptomyces. A) Souche SPM 110 ; B) souche CGCA004 ; C) souche TK23 ; D) souche CGCL006 et E) souche CGCLO10. La congocidine est éluée à 14,2 min (identifiée par son temps de rétention, identique à celui de la congocidine standard, et par sa masse). La Figure 4 est une représentation schématique des différents gènes 30 présents dans l'insert des BAC pCGCOOI (A), pCGC017 (B) et pCGC019 (C). Les gènes appartenant au groupe cgc sont représentés par des flèches noires alors que les gènes extérieurs au groupe sont symbolisés par des flèches blanches. Les gènes représentés par des rectangles sont incomplets. Tous les gènes du groupe cgc ne sont pas représentés, le schéma n'est pas dessiné à l'échelle. 35 Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. 2907465 26 EXEMPLE 1 : Matériels et Méthodes 1) Souches, vecteurs, oligonucléotides Les souches et vecteurs (plasmides, BAC) utilisés dans cette étude sont présentés dans le Tableau IV et les oligonucléotides dans le Tableau V. 5 TABLEAU IV : Souches, plasmides utilisés dans la présente Demande Nom Propriétés Source/référence Souches E. coli S17.1 Souche utilisée pour la conjugaison E. coli / Streptomyces Simon et al., 1983 E. coli DH5î Souche utilisée comme hôte pour les clonages Yu et al., 2000 E. coli DY330 Souche hyper-recombinante utilisée dans les expériences de Karray, 2005 ATCC23877 PCR-targetting Kieser et al., 2000 SPM110 Souche sauvage de S. ambofaciens produisant la spiramycine Demande en S.lividans TK23 et la congocidine instance CGCA004 Souche de S. ambofaciens, dérivée de ATCC23877, ne Demande en CGCL001 produisant plus de spiramycine instance CGCL006 Souche hôte Streptomyces pour l'expression hétérologue des Demande en CGCL009 gènes cgc instance CGCL010 Souche de S. ambofaciens SPM110 où cgc18 a été interrompu Demande en CGCL016 S. lividans TK23 contenant pCGC502 intégré dans le instance CGCL017 chromosome S. lividans TK23 contenant pCGC002 intégré dans le chromosome S. lividans TK23 contenant pCGC017 intégré dans le chromosome S. lividans TK23 contenant pCGC019 intégré dans le Demande en chromosome instance S. lividans TK23 contenant pCGC209 intégré dans le Demande en chromosome instance S. lividans TK23 contenant pCGC213 intégré dans le Demande en chromosome instance Plasmides et BAC pCGC001 BAC, pBeloBAC11 contenant l'insert cgc Demande en instance 2907465 27 pCG0002 pCGCO16 pCGCO17 pCGCO18 pCGCO19 pCGC208 pCGC209 pCGC212 pCGC213 pCGC502 pOSV202 pJMC101 pOSV010 pPAOI6 pOSV201 pOSV234 pOSInt3 BAC dérivé de pCGC001 avec le gène de l'intégrase de cl )C31, attP de cDC31, .Qhyg, oriT BAC dérivé de pCG0002 avec la cassette att3aac remplaçant la séquence entre cgc2l et l'extrémité de l'insert (Fig. 4). BAC dérivé de pCGCO16 après excision de la cassette att3aac BAC dérivé de pCGCO17 avec la cassette att3aac remplaçant la séquence entre cgc3* et l'extrémité de l'insert (Fig. 4). BAC dérivé de pCGCO18 après excision de la cassette att3aac BAC dérivé de pCG0002 avec remplacement de cgc7 par la cassette FRTaac BAC dérivé de pCGC208 après excision de FRTaac, cgc7 délété en phase BAC dérivé de pCG0002 avec remplacement de cgclO par la cassette FRTaac BAC dérivé de pCGC212 après excision de FRTaac, cgc10 délété en phase Vecteur plasmidique pSET152 portant les gènes cgcl* et cgc2*, réplicatif chez E. coli, intégratif chez Streptomyces. Vecteur plasmidique pBC-SK+ portant la cassette S2aac et oriT au niveau du site Ncol Plasmide dérivé de pOSV202 portant un fragment interne au gène cgc18 Vecteur plasmidique dérivant de pTrc99A et contenant l'intégrase de pSAM2, attP de pSAM2, S2hyg, oriT Vecteur plasmidique contenant le gène de l'intégrase de (DC31, attP de (DC31, aac(3)IV, oriT Plasmide dérivé de pPAOI6 avec S2hyg-oriT de pOSV010 à la place de aac(3)IV - oriT Plasmide dérivé de pGP704/Not et contenant la cassette att3aac Plasmide dérivé de pTrc99A et exprimant Xis et Int de pSAM2 Demande en instance Demande en instance Demande en instance Demande en instance Demande en instance Demande en instance Demande en instance Demande en instance Demande en instance Demande en instance Demande en instance Demande en instance Demande en instance Nalin et al., 2004 Demande en instance Karray, 2005 Raynal et al., 1998 2907465 28 TABLEAU V : Oligonucléotides utilisés dans la présente Demande Nom Séquence 5'-3' Utilisation Cgc7-DIS-FOR (SEQ ID NO:50) Cgc7-DIS-REV (SEQ ID NO:51) Cgc7-SC-FOR (SEQ ID NO:52) Cgc7-SC-R EV (SEQ ID NO:53) Cgcl O-DISFOR (SEQ ID NO:54) cgcl O-DISREV (SEQ ID NO:55) cgcl O-SC-FOR (SEQ ID NO:56) cgc10-SC-REV (SEQ ID NO:57) CONGO-R (SEQ ID NO:58) CONGO-D (SEQ ID NO:59) OMEGA Al (SEQ ID NO:60) OMEGA A2 (SEQ ID NO:61) OMEGA HYG2 (SEQ ID NO:62) SEQ ID NO:63 SEQ ID N0:64 SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:66 CTCGTGCACCGCGCGCCTTCGACCAGAGGAGAACCCATGA TTCCGGGGATCCGTCGACC CGGTCAGCAGAGCGACCTCGTTGCCGAAGCCGTAGATCAT GTAGGCTGGAGCTGCTTC GCGCGTCCAGACCGAGTTTC GGGAGCGCCTGTTCTGGCAC ACGCGCAGGACATCGCGGCCCGCGGAACCGGGGCGTGAG CATTCCGGGGATCCGTCGACC AGTCGGCGTCCCTCGCCTCCGGCCAGTACCACTGCTCTCA TGTAGGCTGGAGCTGCTTC CAGCTGCGTGAGGATG GGTTGCGGGAACTGAC ACCGCCTCCCTGGTCCGGCGCAGCAGCT GAGCACGCGCTCCAAC AGGTCGTCCGGC AGATCCTTGACCCGCAGTTG ACTACCTTGGTGATCTCGCCT TCCTCGAACACCTCGAAGTC CCGCTCGACCCGCTCCGCCCACTCCGGGTGGCCCGCCTTG ATCGCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAA CCTGTGGCCCGCCACTTCCAGCAAGGCCGTCGCGCCCGAC ATCTGCCTCTTCGTCCCGAAGCAACT CTGCCCCGGCCCATGCCGCCAAGGCCAGGTGTTCCGCAGG ATCGCGCGCGCTTCGTTCGGGACGAA CTCTAGAGGATCCTGTTCGCCACCGGCCGCGFCCCCCGCA ATCTGCCTCTTCG TCCCGAAGCAACT amorce pour le remplacement de cgc7 par la cassette FRTaac amorce pour le remplacement de cgc7 par la cassette FRTaac amorce de vérification pour la délétion de cgc7 amorce de vérification pour la délétion de cgc7 amorce pour le remplacement de cgclO par la cassette FRTaac amorce pour le remplacement de cgclO par la cassette FRTaac amorce de vérification pour la délétion de cgclO amorce de vérification pour la délétion de cgclO amorce d'amplification d'un fragment interne à cgc18 amorce d'amplification d'un fragment interne à cgc18 amorce d'amplification pour la détection de f2aac et S2hyg amorce d'amplification pour la détection de S2aac amorce d'amplification pour la détection de .f2hyg amorce pour le remplacement des gènes SAMR0897 à SAMR0888 par la cassette att3aac amorce pour le remplacement des gènes SAMR0897 à SAMR0888 par la cassette att3aac amorce pour le remplacement des gènes SAMR0926 à SAMR0922 par la cassette att3aac amorce pour le remplacement des gènes SAMR0926 à SAMR0922 par la cassette att3aac 2907465 29 2) Milieux et conditions de culture Les souches d'Escherichia coli et de Bacillus subtilis sont cultivées en milieu LB ou en milieu SOB contenant 30 mM de MgSO4 au lieu de 10 mM (Sambrook et Russell, 2001). 5 Les souches de Streptomyces sont cultivées pour les manipulations génétiques et la préparation de stock de spores en milieu solide sur HT (Kieser et al., 2000) à 30 C. La production de congocidine s'effectue en milieu liquide MP5 (Extrait de levure : 7g/1 ; NaCl : 5g/1 ; NaNO3 : lg/l ; Glycérol : 40g/l; MOPS : 100 mM, pH 7,5) (Pernodet et al., 1993) à 30 C pendant 3 jours. 10 3) Antibiotiques et produits chimiques L'acétonitrile Lichrosolv et l'acide formique sont achetés chez Merck , le L-arabinose chez Aldrich , l'apramycine et le chloramphenicol chez Sigma , 1'hygromycine chez Euromedex , l'ampicilline et l'IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) chez Q-biogene . 15 4) Préparation et manipulation d'ADN Les procédés d'obtention et de manipulation d'ADN de plasmides et de BAC (extractions, purifications, digestions, ligations, etc) à partir de cellules d'E. coli sont décrits par Sambrook et Russell (Sambrook et Russell, 2001). Les transformations des souches d'E. coli sont effectuées par 20 électroporation à 2500V, 60052 et 10 F grâce à l'appareil Electroporator d'Eppendorf . La préparation de cellules électrocompétentes d'E. coli DH5a ou E. coli DY330 est réalisée comme suit : les cellules sont cultivées à 37 C pour E. coli DH5a en milieu LB ou à 30 C pour E. coli DY330 en SOB-MgSO4 20mM sous une agitation de 180 rpm jusqu'à ce qu'elles atteignent une densité optique de 0,6 à 600 25 mn. Les cellules sont alors centrifugées à 4 C, 4000 rpm pendant 10 minutes puis lavées une première fois dans un demi-volume de glycérol 10% puis dans un quart de volume de glycérol 10%. Finalement les cellules sont conservées à -70 C dans du glycérol 10%. L'introduction d'ADN dans Streptomyces lividans et Streptomyces 30 ambofaciens, soit par conjugaison interspécifique entre E. coli et Streptomyces, soit par transformation de protoplastes se fait selon les protocoles décrits par Kieser et al. (Kieser et al., 2000). Lors des amplifications d'ADN par la Taq Polymérase (Qiagen), les mélanges réactionnels sont constitués de 1 L d'ADN matrice d'une concentration 35 approximative de 10 à 50 ng/ L, 1 L de chacun des oligonucléotides à 30 M, de 1 L de dNTP à 10 mM chacun, de 5 L de tampon 1OX de la Taq Polymérase 2907465 30 (Qiagen), de 10 tL de la solution Q (Qiagen) et de 0,25 tL de Taq Polymérase (Qiagen) dans un volume final de 50 L. Les purifications d'ADN se font grâce au kit GFX-PCR & Gel Band Purification Kit de GE Healthcare suivant le protocole du fournisseur. 5 5) Protocole de PCR pour l'amplification des cassettes att3aac, Qaac et .Qhyg a) Préparation de la cassette att3aac pour l'inactivation de gènes par PCR targeting Les amplifications de la cassette att3aac utilisée pour déléter des 10 gènes s'effectuent en utilisant la Taq Polymérase de Qiagen et le programme suivant : 4 minutes à 97 C, 1 minute à 80 C, dix cycles de 30 secondes à 97 C, 30 secondes à 58 C et 2 minutes à 72 C puis 20 cycles de 30 secondes à 97 C, 30 secondes à 68 C et 2 minutes à 72 C puis dix minutes à 72 C. La matrice utilisée est pOSV234 (Karray et al., 2005), un plasmide constitué du vecteur pGP704/Notl décrit par Miller et 15 Mekalanos (Miller & Mekalanos, 1988) dans lequel la cassette excisable att3aac a été clonée. Cette cassette qui confère la résistance à l'apramycine est similaire à celles décrites par Raynal et collaborateurs (Raynal et al., 2006), en particulier à att3f2aac (SEQ ID NO:67), mais est dépourvue des séquences du terminateur du phage T4. b) Vérification des clones transformés : amplification des cassettes 20 .Qaac et Qhyg La vérification que les clones résistants à l'hygromycine ou à l'apramycine sont bien des clones transformés et pas des résistants spontanés s'effectue par PCR. Les amorces OMEGA Al (SEQ ID NO:60) et OMEGA A2 (SEQ ID NO:61) sont utilisées pour l'amplification de la cassette Qaac et les amorces 25 OMEGA Al (SEQ ID NO:60) et OMEGA HYG2 (SEQ ID NO:62) sont utilisées pour l'amplification de la cassette Qhyg. Ces PCR, réalisées à partir d'une suspension de mycélium de Streptomyces, nécessitent le thermocycle préliminaire suivant : 30 secondes à 65 C, 30 seconde à 8 C, 90 secondes à 65 C, 180 secondes à 97 C, 60 secondes à 8 C, 180 secondes à 65 C, 60 secondes à 97 C, 60 secondes à 65 C, 4 30 minutes à 80 C. L'amplification des cassettes s'effectue ensuite à partir d'un microlitre du surnageant de cette suspension suivant le programme : 4 cycles de 1 minute à 97 C, 1 minute à 60 C et 1 minute à 72 C suivis de 5 cycles de 1 minute à 97 C, 1 minute à 52 C et 1 minute à 72 C et enfin 25 cycles de 1 minute à 97 C, 1 minute à 55 C et 1 minute à 72 C. 35 6) Tests biologiques Les tests biologiques sont réalisés après 5 jours de croissance à 30 C d'une colonie de la souche de Streptomyces à analyser sur milieu HT solide en 2907465 31 ajoutant une sur-couche de milieu contenant les microorganismes indicateurs : E. coli ou Bacillus subtilis. Le halo d'inhibition de croissance est observé après une nuit d'incubation à 37 C. 7) Méthode d'analyse HPLC de la congocidine 5 Les différentes souches analysées sont cultivées en milieu MP5 3 jours à 30 C. Après centrifugation, une fraction du surnageant est filtrée sur ultrafree-MC (0,1 pm, Millipore) et analysée par HPLC. L'analyse des échantillons s'effectue sur une chaîne HPLC Agilent 1200 munie d'un détecteur à barrette de diodes. Les échantillons (100 pl) sont injectés sur colonne Atlantis dC18, 5 m ; 4.6 mm x 250 10 mm (Waters). L'élution se fait à lml/min de la manière suivante : 7 min à 95% solvant A (eau + 0.1% acide formique) / 5% solvant B (acétonitrile + 0.1% acide formique), suivi d'un gradient jusqu'à 40% solvant A / 60% solvant B en 23 minutes. La détection s'effectue à 236 nm et 297 nm. EXEMPLE 2 : Mise en évidence du groupe de gènes cgc 15 Cet Exemple montre l'identification du groupe de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la congocidine chez Streptomyces ambofaciens. 1) Analyse de la séquence et identification des gènes du groupe de gènes cgc Une banque d'ADN génomique de Streptomyces ambofaciens 20 ATCC23877 a été construite dans le chromosome bactérien artificiel pBe1oBAC11 décrit par Kim et al. (Kim et al., 1996). Cette banque a ensuite été utilisée pour déterminer la séquence des régions terminales du chromosome linéaire de S. ambofaciens ATCC23877 (environ 1,3 Mégabases de chaque coté). Ces séquences sont analysées grâce aux programmes GLIMMER ( Gene Locator and Interpolated 25 Markov Modeler Delcher et al., 1999), FRAME (Ishikawa & Hotta, 1999) et GeneMark (Lukashin et Borodovsky, 1998). Les régions codantes et les séquences protéiques correspondantes ont ainsi pu être définies avec précision. La recherche de gènes dont les produits présentent des similitudes avec des enzymes généralement impliquées dans le métabolisme secondaire (par 30 exemple les NRPS : Synthétase de Peptides Non Ribosomiques et les PKS : Synthétase de PolyCétide) a permis de mettre en évidence 12 groupes de gènes dirigeant potentiellement la biosynthèse de métabolites secondaires. Parmi eux, un groupe de 24 gènes (gènes de SAMR0898 à SAMR0921, selon la nomenclature de Choulet et al., 2006 ; 31,3 kb) sur le bras droit du chromosome de S. ambofaciens est 35 situé dans une zone de rupture de synténie avec le chromosome de Streptomyces coelicolor. Ce groupe contient deux gènes codant des homologues de NetP1 et NetP2 qui confèrent la résistance à la congocidine chez Streptomyces netropsis (Stumpp et 2907465 32 al., 2005). Ce groupe, isolé à partir de l'ADN génomique de S. ambofaciens dirige la biosynthèse de ce métabolite dont la voie de biosynthèse était inconnue jusqu'à présent. Ces 24 gènes sont nommés cgc3* à cgcl * d'une part et cgcl à cgc2l d'autre part. La Figure 2 illustre le positionnement et l'orientation de ces gènes sur le 5 chromosome de S. ambofaciens. Le Tableau III présente les différentes fonctions prédites pour les protéines déduites des 24 gènes impliqués dans la biosynthèse de congocidine. 2) Identification du BAC pCG0001 et construction du BAC pCG0002 10 A partir de la banque d'ADN génomique (Exemple 2.1), les extrémités des inserts d'environ 5000 BAC ont été séquencées, et la comparaison des séquences de ces extrémités avec les séquences des régions flanquant le groupe de gènes cgc a permis d'identifier un BAC contenant le groupe de gènes cgc entier, ce BAC a été nommé pCG0001. Outre les 24 gènes du groupe de gènes cgc, l'insert de 15 43377pb de ce BAC contient d'autres gènes complets de part et d'autre du groupe (Figure 4). Afin de pouvoir utiliser ce BAC chez Streptomyces, il est nécessaire de le modifier pour permettre son transfert, son intégration à un site spécifique dans le chromosome de Streptomyces et la sélection des clones de Streptomyces transformés. 20 Pour cela, un fragment d'ADN contenant la cassette Qhyg (Blondelet-Rouault et al., 1997) conférant la résistance à l'hygromycine (permettant la sélection des Streptomyces transformés), le gène de l'intégrase de (DC31 (Combes et al.,

2002), la séquences attP de (DC31 (nécessaire à l'intégration, promue par l'intégrase, du BAC dans le chromosome à un site spécifique ) et la séquence oriT de 25 RK2 (nécessaire à son passage par conjugaison de E. coli à Streptomyces) sont introduits par ligation (Sambrook et Russell, 2001) au niveau du site unique Hpal de pCGC001. Ce fragment a été obtenu comme décrit ci-après. Le vecteur pPAOI6 décrit par Nalin et al. (Nalin et al., 2004) comprend une cassette contenant le gène de l'intégrase de (DC31, le site attP, oriT et 30 le gène de résistance à l'apramycine aac. Néanmoins, du fait de l'utilisation ultérieure du gène aac pour l'inactivation de gènes cgc, il était nécessaire de remplacer aac par un autre marqueur : le gène de résistance à l'hygromycine porté par la cassette .Qhyg. Le vecteur pPAO16 est donc digéré par digestions séquentielles par les enzymes BamHl, Klenow et Xbal, et le fragment contenant oriT et aac est éliminé. La digestion 35 Hindlll / Klenow / Xbal du plasmide pOSV010 (SEQ ID NO:68) permet d'obtenir, après purification, un fragment de 3,1 kb contenant la cassette .flhyg et oriT. La ligation de ce fragment avec ledit plasmide pPAOI6 digéré par digestions 2907465 33 séquentielles par les enzymes BamHl, Klenow et Xbal (et dépourvu du fragment contenant oriT et aac) permet d'obtenir le plasmide pOSV201 contenant la cassette souhaitée. Cette cassette (5,3 kb) est extraite de pOSV201 par digestion par 5 Pvu11 et clonée dans le plasmide pCGC001 au niveau du site unique Hpal. Le BAC ainsi obtenu est nommé pCGC002. EXEMPLE 3 : Interruption du gène cgc18 Pour vérifier si ce groupe de 24 gènes est bien impliqué dans la voie de biosynthèse de la congocidine, le gène cgc18, qui code une protéine similaire aux 10 NRPS (contenant les domaines d'adénylation, de condensation et PCP (Protéine de transport de Peptidyle), a été interrompu dans une souche de S. ambofaciens ne produisant plus de spiramycine. 1) Interruption de cgc18 Un fragment dugène cgc18 est amplifié par PCR dans les conditions 15 décrites dans l'Exemple 1.4 à partir de l'ADN génomique de S. ambofaciens (ATCC23877) en utilisant la Taq Polymérase (Qiagen) et les oligonucléotides CONGO-R (SEQ ID NO: 58) et CONGO-D (SEQ ID NO: 59) durant 30 cycles constitués des étapes suivantes : 30 secondes à 96 C, 30 secondes à 60 C, 2 minutes à 72 C. Le produit d'amplification, un fragment de 815 pb, qui correspond aux 20 nucléotides 2767 à 3581 de la séquence SEQ ID NO :49, est purifié puis cloné dans le vecteur pGEM-T-Easy de Promega. Le fragment de cgc18 est extrait du plasmide obtenu par digestion par EcoRI. Les extrémités du fragment obtenu sont ensuite rendues franches grâce à l'action du fragment de Klenow, puis le fragment est introduit, au niveau du site EcoRI, dans le plasmide pOSV202, un dérivé de 25 pBluescript (pBC-SK+) portant la cassette de résistance à l'apramycine Qaac (Blondelet-Rouault et al., 1997) et la séquence oriT de RK2 clonées au niveau du site Ncol de ce vecteur. Le plasmide obtenu est nommé pJMC101. Après conjugaison entre E. coli S17.1 contenant le plasmide pJMC 101 et des spores germées de S. ambofaciens SPM110 (souche dérivée de la souche ATCC23877 mutée dans un des 30 gènes de biosynthèse de la spiramycine ; Karray et al., 2005) les clones résistants à l'apramycine sont sélectionnées et la présence du gène de résistance à l'apramycine est vérifiée par PCR. Cette amplification est réalisée avec les oligonucléotides OMEGA Al (SEQ ID NO: 60) et OMEGA A2 (SEQ ID NO: 61) selon le protocole décrit dans l'Exemple 1.5.b). Un clone présentant la bande attendue à 1,1 kb 35 correspondant au fragment de la cassette S2aac amplifié est choisi et analysé. Cette souche est nommée CGCA004. Des expériences d'hybridation de type Southern effectuées sur l'ADN total de CGCA004 et sur celui de la souche SPM110 ont permis 2907465 34 de vérifier que, dans la souche CGCA004, le plasmide pJMC 101 était bien intégré par recombinaison homologue dans le gène cgc18. 2) Résultat : preuve expérimentale de l'implication du groupe de gènes cgc dans la biosynthèse de congocidine 5 Le test biologique décrit dans l'Exemple 1.6 montre qu'une colonie de la souche SPM110 est entourée d'un halo d'inhibition de croissance de la souche indicatrice (E. coli ou B. subtilis), alors que pour la souche CGCA004, aucune inhibition de croissance de E. coli et B. subtilis n'est détectée suggèrant que la production de congocidine est abolie. L'analyse comparative des profils métaboliques 10 des souches S. ambofaciens SPM110 et CGCA004 (Figure 3) confirme bien que la souche CGCA004 ne produit pas de congocidine (disparition d'un pic ayant le même temps de rétention et la même masse que la congocidine standard). Ceci démontre l'implication du groupe cgc dans la biosynthèse de congocidine. EXEMPLE 4 : Expression hétérologue du groupe de gènes cgc chez Streptomyces 15 lividans Afin de vérifier que les 24 gènes du groupe de gènes cgc sont bien suffisants à la production de congocidine, ils sont introduits dans le chromosome d'un hôte hétérologue, S. lividans TK23 qui ne produit pas cette molécule. 1) Système d'expression hétérologue 20 L'introduction de pCGC00I dans le chromosome de S. lividans TK23 dans les conditions définies à l'exemple 1.4, a nécessité au préalable le clonage dans ce BAC d'une cassette contenant le gène de l'intégrase de (I)C31, le site attP correspondant, la séquence oriT et la cassette .e-2hyg conférant la résistance à l'hygromycine. Le BAC résultant, pCGC002, obtenu comme indiqué ci-dessus, est 25 introduit dans S. lividans TK23 par conjugaison avec une souche de E. coli S17.1 contenant pCGC002. Les transconjugants sont sélectionnés par la résistance à l'hygromycine et la présence du gène Qhyg est vérifiée par PCR en utilisant les oligonucléotides OMEGA Al (SEQ ID NO: 60) et OMEGA HYG2 (SEQ ID NO: 62) comme indiqué plus haut. La souche de S. lividans TK23 contenant le vecteur 30 pCGC002 intégré dans son chromosome ainsi obtenu est nommé CGCL006. 2) Résultat : le groupe de gènes cgc est suffisant à la production de congocidine chez S. ambofaciens SPM110 Les analyses de l'activité biologique et HPLC ont révélé la production de congocidine par le clone CGCL006, alors que la souche S. lividans 35 TK23 sauvage n'en produit pas (Figure 3). L'insert de pCGC002 intégré dans le chromosome de S. lividans TK23 est donc suffisant à la production de congocidine en quantité comparable à celle de la souche S. ambofaciens SPM110. Il est donc clair que 2907465 35 cet hôte hétérologue peut être utilisé lors de l'étude plus approfondie du groupe de gènes cgc. Il faut toutefois noter que les protéines de la famille des PCP nécessitent pour être actives leur modification par addition d'un bras 5 phosphopantothéinyle par une enzyme de la famille des phosphopantothéinyle transférases (PPTases). Les produits des gènes cgc18 et cgc19 possèdent de tels domaines PCP. Leur modification par une PPTase est probablement nécessaire. Aucun gène du groupe de gènes cgc n'est prédit comme codant une PPTase. Chez S. ambofaciens une PPTase codée par un gène localisé en dehors du groupe de gènes cgc 10 est probablement responsable de la modification des domaines PCP. S. lividans possède probablement une PPTase capable de modifier les protéines Cgc18 et Cgcl9. EXEMPLE 5 : Définition des limites du groupe de gènes cgc 1) Délétion dans l'insert du BAC pCG0002 des séquences ne faisant pas partie du groupe de gènes cgc 15 Outre les 24 gènes du groupe cgc, le BAC pCG0002 contient d'autres gènes de part et d'autre de ce groupe : 1 gène tronqué et 4 gènes complets d'un coté, 1 gène tronqué et 9 gènes complets de l'autre (Figure 4A). Ces gènes sont homologues de gènes de S. coelicolor et font partie de régions de synténie avec cette souche. Ils ne semblent donc pas être impliqués dans la biosynthèse de congocidine.

20 Pour vérifier qu'ils n'ont aucun rôle dans la production de congocidine, les séquences d'ADN présentes entre cgc2l et pBe1oBAC11 d'une part, et cgc3* et pBeloBACll d'autre part, sont excisées de pCG0002. Brièvement, à partir de pCGC002, la séquence présente entre cgc2l et pBeloBACl1 est excisée pour donner le BAC pCGCOI 7 et la souche CGCL009. A 25 partir de pCGC017 la séquence présente entre cgc3* et pBeloBAC11 est excisée pour donner le BAC pCGC019 et la souche CGCLO10. Cette approche est exposée plus en détail ci-après. La délétion des séquences présentes dans l'insert de pCG0002 mais ne faisant pas partie du groupe cgc tel que défini par analyse bioinformatique est 30 assurée par le remplacement des séquences à éliminer par une cassette excisable att3aac (conférant la résistance à l'apramycine). Ce remplacement résulte d'un double événement de recombinaison homologue entre les séquences flanquant la cassette excisable (séquences ajoutées lors de l'amplification de la cassette par PCR, voir ci-dessous) et les bornes de la région à déléter. Cette recombinaison est obtenue par 35 PCR-targeting (Yu et al., 2000 ; Chaveroche et al., 2000 Gust et al., 2003), La cassette utilisée, att3aac, obtenue comme indiqué plus haut, est similaire à celles décrites par Raynal et al. (Raynal et al., 2006) mais dépourvue des séquences du 2907465 36 terminateur du phage T4. Cette cassette, qui comprend de part et d'autre du gène de résistance les séquences attL et attR de pSAM2, est ensuite excisée par un événement de recombinaison spécifique de site promu par l'intégrase et l'excisionase de pSAM2 (Raynal et al., 1998). Le BAC résultant est ensuite introduit chez S. lividans.

5 L'élimination des fragments situés entre cgc2l et pBe1oBAC11 (c'est-à-dire, dans pCGC001, la région de l'insert en aval - en référence à la Figure 3 - de cgc2l qui ne fait pas partie du groupe cgc) d'une part, et entre cgc3* et pBe1oBAC11 (c'est-à-dire dans pCGC00I la région de l'insert en amont û en référence à la Figure 3 - de cgc3* qui ne fait pas partie du groupe cgc) d'autre part 10 sont effectuées successivement. Pour l'élimination du premier fragment, la cassette de résistance à l'apramycine est amplifiée par PCR comme décrit précédemment en utilisant les oligonucléotides de séquences SEQ ID NO: 63 et SEQ ID NO: 64 (pour le deuxième fragment, les oligonucléotides de séquences SEQ ID NO: 65 et SEQ ID NO: 66 sont utilisés). Après amplification, le produit PCR obtenu est constitué de la 15 cassette flanquée de part et d'autre de séquences de 40 nucléotides identiques aux séquences bordant le fragment d'ADN à éliminer. La souche hyper-recombinante E. coli DY330 contenant le BAC pCGC002 est transformée par électroporation avec le produit PCR purifié. Les clones sont ensuite sélectionnés pour leur double résistance au chloramphénicol (résistance conférée par le BAC) et à l'apramycine (résistance 20 conférée par la cassette). L'intégration de la cassette et la délétion du fragment ciblé sont vérifiées par digestion enzymatique (BamHl), et le BAC résultant, dénommé pCGC016, est introduit dans la souche E. coli DH5a contenant le plasmide pOSInt3 (Raynal et al., 1998) afin d'exciser la cassette att3aac. L'induction de la production des protéines Xis et Int nécessaires à l'excision s'effectue en présence d'IPTG à 20 25 g/mL. Dans les clones résultants de la transformation / excision, il peut y avoir une coexistence du BAC pCGC016 (avec la cassette att3aac) et du plasmide dans lequel cette cassette a été excisée. Une nouvelle étape de transformation dans E. coli DH5a est donc nécessaire pour l'obtention d'un clone ne contenant que le BAC avec la délétion (c'est-à-dire le BAC dépourvu de la cassette apramycine). Le BAC ainsi 30 obtenu, dénommé pCGC017, est vérifié par digestion enzymatique (BamHl) puis introduit dans S. lividans TK23 par conjugaison pour donner la souche CGCL009. Ce protocole est répété à partir de pCGC017 afin d'éliminer le fragment d'ADN situé entre cgc3* et pBeloBAC11 (BAC résultants pCGC018 et pCGC019, voir Tableau 3). Le BAC pCGC019 est introduit dans S. lividans TK23 par 35 conjugaison pour donner la souche CGCL010. 2907465 37 2) Résultat : les gènes situés en amont de cgc3* et en aval de cgc2l ne sont pas nécessaires à la production de congocidine La production de congocidine par la souche CGCL009, visualisée à l'aide d'un test biologique tel que décrit dans l'Exemple 1.6, démontre que les gènes 5 présents en aval de cgc2l ne sont pas nécessaires à la biosynthèse de congocidine. De plus, l'analyse par test biologique et HPLC (Figure 3) de la souche CGCLO10 montre que ce nouveau BAC permet toujours la production de congocidine, ce qui montre que les gènes situés en amont de cgc3* et en aval de cgc2l ne sont pas nécessaires à la production de congocidine.

10 EXEMPLE 6 : Inactivation des gènes cgc7 et cgclO 1) Inactivation des gènes cgc7 et cgclO Les gènes cgc7 (phospho beta-glucosidase putative) et cgclO (glycosyl-transférase putative) ont été inactivés par la méthode REDIRECT basée sur la PCR (Gust et al., 2003). Les oligonucléotides utilisés pour les inactivations sont 15 cgc7-DIS-FOR (SEQ ID NO: 50) et cgc7-DIS-REV (SEQ ID NO: 51) pour cgc7, et cgcl0-DIS-FOR (SEQ ID NO: 54) et cgc10-DIS-REV (SEQ ID NO: 55) pour cgclO. La cassette FRTaac utilisée pour les inactivations a été amplifiée par PCR en utilisant le kit GC-rich PCR system (Roche) et le plasmide pW60 (SEQ ID NO:69) comme matrice. Ce plasmide provient du vecteur pGEM-T easy (Promega) 20 dans lequel a été cloné la cassette FRTaac contenant le gène de résistance à l'apramycine aac flanqué des séquences FRT (FLP recognition targets) pour la recombinaison par la FLP recombinase de levure chez E. coli. Le remplacement des gènes cgc7 et cgclO par la cassette FRTaac dans le BAC pCG0002 a donné les BACs pCGC208 et pCGC2I2 respectivement, voir Tableau IV, pour l'expression 25 hétérologue chez Streptomyces lividans TK23. L'excision de la cassette a été effectuée en suivant le protocole REDIRECT (BACs résultants : pCGC209, pCGC213 respectivement, voir Tableau 4). Les constructions ont été vérifiées par PCR en utilisant les amorces cgc7-SC-FOR (SEQ ID NO: 53) et cgc7-SC-REV (SEQ ID NO: 54) pour la délétion de cgc7 et cgcl0-SC-FOR (SEQ ID NO: 56) et cgclo-SC-REV 30 (SEQ ID NO: 57) pour la délétion de cgclO. Les BAC pCGC209 et pGCG213 ont été introduits dans S. lividans TK23 par conjugaison à partir de E. coli S17-1 (voir Exemple 1.4) et sélectionnés pour leur résistance à l'hygromycine. 2) Résultat : les gènes cgc7 et cgclO sont nécessaires à la biosynthèse de la congocidine chez Streptomyces lividans 35 L'analyse par test biologique (Exemple 1.6) et par HPLC (Exemple 1.7) des souches CGCL016 et CGCL017 contenant le groupe cgc intégré dans le chromosome de S. lividans TK23 et où cgc7 et cgclO respectivement ont été délétés 2907465 38 en phase montre que ces souches ne produisent plus de congocidine. Les gènes cgc7 et cgclO, qui comptent parmi les gènes de biosynthèse ou de transfert de sucres, sont donc impliqués dans la biosynthèse de la congocidine. Il semble ainsi probable que l'ensemble de ces gènes (cgc7 à cgc13) soient bien impliqués dans la biosynthèse de 5 congocidine, ce qui ne pouvait être prédit d'après la structure de la molécule de congocidine. EXEMPLE 7 : Expression hétérologue des gènes de résistance 1) Expression hétérologue de cgcl* et cgc2* Les gènes cgcl* et cgc2* codent un transporteur ABC putatif. La 10 protéine Cgcl* pourrait constituer la protéine de liaison à l'ATP et la protéine Cgc2* son partenaire transmembranaire. Ces deux protéines sont fortement similaires à celles identifiées par Stumpp et al. (Stumpp et al., 2005) codées par les gènes netPl et netP2 présents sur le chromosome de S. netropsis. Les deux protéines NetP 1 et NetP2 correspondantes forment un transporteur ABC et confèrent la résistance à la 15 congocidine. Les deux gènes cgcl* et cgc2* sont donc introduits dans le chromosome de S. lividans TK23 pour vérifier leur capacité à induire la résistance à la congocidine chez un hôte hétérologue sensible. Pour ce faire, un fragment d'ADN de 5,4 kb contenant cgcl* et cgc2* en totalité et cgc3* tronqué ainsi que cgcl tronqué, obtenu par digestions 20 séquentielles avec les enzymes Till et Klenow de pCGCOOI, est cloné dans le plasmide pSET152 (vecteur navette réplicatif chez E. coli et intégratif chez Streptomyces, (Bierman et al., 1992) au niveau du site EcoRV. Cet insert présente ainsi toute la région entre cgcl* et cgcl susceptible de contenir le promoteur de cgcl * qui pourrait être co-transcrit avec cgc2*. Le plasmide résultant est nommé pCGC502, 25 et la présence de l'insert est vérifiée par digestion enzymatique (Pstl). Le plasmide pCGC502 est introduit dans S. lividans TK23 par transformation de protoplastes d'après le protocole de Kieser et al. (Kieser et al., 2000). Le vecteur pSET152 vide a aussi été introduit dans S. lividans TK23 (témoin négatif). La souche contenant le vecteur pCGC502 est dénommée CGCL001. La résistance à la congocidine de ces 30 souches ainsi que celle de la souche S. lividans TK23 transformée par le vecteur pSET152 vide est ensuite testée sur milieu HT contenant de la congocidine à 20 g/ml. Les transformants sont sélectionnés pour leur résistance à l'apramycine. Les cultures sont examinées après quatre jours d'incubation à 30 C. 2) Résultat : Cgcl* et Cgc2* confèrent la résistance à la 35 congocidine Le clone CGCLOOI, qui contient les gène cgcl* et cgc2* est le seul à pousser en présence de congocidine. Ces résultats montrent donc clairement que les 2907465 39 deux gènes cgcl * et cgc2* confèrent la résistance à la congocidine, quand ils sont présents à une copie par chromosome et exprimés sous contrôle de leur propre promoteur dans un hôte hétérologue.

5 Références : Alcman, C., Vega, M. C., Navarro, E. & Puiggali, J. (1996). Towards the understanding of the folding of methylene units in the glutamine residue. JPept Sci 2, 364-370. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, 10 Z., Miller, W. & Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25, 3389-3402. Asai, A., Sakai, Y., Ogawa, H., Yamashita, Y., Kakita, S., Ochiai, K., Ashizawa, T., Mihara, A., Mizukami, T., Nakano, H. (2000) Pyrronamycin A and B, novel antitumor antibiotics containing pyrrole-amide 15 repeating unit, produced by Streptomyces sp. J. Antibiot., 53, 66-69. Baltz, R. H., McHenney, M. A., Cantwell, C. A., Queener, S. W. & Solenberg, P. J. (1997). Applications of transposition mutagenesis in antibiotic producing streptomycetes. Antonie Van Leeuwenhoek 71, 179-187. Baraldi P.G., Tabrizi M.A., Preti D., Fruttarolo F., Avitabile B., 20 Bovero A., Pavani G., del Carmen Nunez Carretero M. & Romagnoli R. (2003) DNA minor-groove binders. Design, synthesis, and biological evaluation of ligands structurally related to CC-1065, distamycin and anthramycin. Pure Appl. Chem., 75, 187-194. Bierman, M., Logan, R., O'Brien, K., Seno, E. T., Rao, R. N. & 25 Schoner, B. E. (1992). Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp. Gene 116, 43-49. Blondelet-Rouault, M. H., Weiser, J., Lebrihi, A., Branny, P. & Pernodet, J. L. (1997). Antibiotic resistance gene cassettes derived from the omega interposon for use in E. coli and Streptomyces. Gene 190, 315-317.

30 Chater, K. F. & Bruton, C. J. (1985). Resistance, regulatory and production genes for the antibiotic methylenomycin are clustered. Embo J 4, 1893-1897.

2907465 Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M. & d'Enfert, C. (2000). A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res 28, E97. Choulet F., Gallois A., Aigle B., Mangenot S., Gerbaud C., 5 Truong C., Francou F-X., Borges F., Fourrier C., Guérineau M., Decaris B., Barbe V., Pernodet J-L., Leblond P. (2006). Intraspecific variability of the terminal inverted repeats of the linear chromosome of Streptomyces ambofaciens. Journal of Bacteriology 188: 6599-6610. Combes, P., Till, R., Bee, S. & Smith, M. C. (2002). The 10 streptomyces genome contains multiple pseudo-attB sites for the (phi)C31-encoded site-specific recombination system. J Bacteriol 184, 5746-5752. Cosar, C., Ninet, L., Pinnert-Sindico, S. & Preud'Homme, J. (1952). [Trypanocide action of an antibiotic produced by a Streptomyces]. C R Hebd Seances Acad Sci 234, 1498-1499.

15 Delcher, A. L., Harmon, D., Kasif, S., White, O. & Salzberg, S. L. (1999). Improved microbial gene identification with GLIMMER. Nucleic Acids Res 27, 4636-4641. Denny, W. A. (2001). DNA minor groove alkylating agents. Curr Med Chem 8, 533-544.

20 Dolenc J., Borstnik U Hodoscek, M., Koller, J. & Janezic, D. (2005) An ab initio QM/MM study of the conformationalstability of complexes formed by netropsin and DNA. the importance of van der Waals interactions and hydrogen bonding. Theochem, 718, 77-85. Dyatkina, N. B., Roberts, C. D., Keicher, J. D., Dai, Y., 25 Nadherny, J. P., Zhang, W., Schmitz, U., Kongpachith, A., Fung, K., Novikov, A. A., Lou, L., Velligan, M., Khorlin, A. A. & Chen, M. S. (2002). Minor groove DNA binders as antimicrobial agents. 1. Pyrrole tetraamides are potent antibacterials against vancomycin resistant Enterococci [corrected] and methicillin resistant Staphylococcus aureus. JMed Chem 45, 805-817.

30 Finlay, A. C., Hochstein, F.A. Sobin, B. A. and Murphy F. X. (1951) Netropsin, a new antibiotic produced by a streptomyces. J. Am. Chem. Soc. 73, 341-343.

2907465 41 Gordon Green B., Chabin R. & Grant S. K. (1996) The natural product noformycin is an inhibitor of inducible-nitric oxide synthase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 225, 621-626. Gust B., Challis G. L., Fowler K., Kieser T., Chater K. F. (2003).

5 PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. PNAS, 100,1541-1546 Harris, M. (2004). Monoclonal antibodies as therapeutic agents for cancer. Lancet Oncol 5, 292-302. Hopwood, D. A. (1997). Genetic Contributions to Understanding 10 Polyketide Synthases. Chem Rev 97, 2465-2498. Ishikawa, J. & Hotta, K. (1999). FramePlot: a new implementation of the frame analysis for predicting protein-coding regions in bacterial DNA with a high G + C content. FEMS Microbiol Leu 174, 251-253. Julia, M. & Preau-Joseph, N. (1967). [Amidines and guanidines 15 related to congocidine. I. Structure of congocidine]. Bull Soc Chim Fr 11, 4348-4356. Karray, F. (2005). Etude de la biosynthèse de l'antibiotique spiramycine par Streptomyces ambofaciens. Thèse Université Paris-Sud 11. Khalaf, A. I., Ebrahimabadi, A. H., Drummond, A. J., Anthony, N. G., Mackay, S. P., Suckling, C. J. & Waigh, R. D. (2004). Synthesis and 20 antimicrobial activity of some netropsin analogues. Org Biomol Chem 2, 3119-3127. Kieser, T., MJ Bibb, MJ Buttner, KF Chater, DA Hopwood (2000). Practical Streptomyces Genetics. Kim, U. J., Birren, B. W., Slepak, T., Mancino, V., Boysen, C., Kang, H. L., Simon, M. I. & Shizuya, H. (1996). Construction and characterization 25 of a human bacterial artificial chromosome library. Genomics 34, 213-218. Lukashin A., Borodovsky M. (1998). GeneMark.hmm: new solutions for gene finding. Nucleic acid Res, 26, 1107-1115. Marchler-Bauer A., Bryant SH. (2004). CD-Search: protein domain annotations on the fly. Nucleic Acids Res. 32 (W) 327-331.

30 Miller, V. L. & Mekalanos, J. J. (1988). A nove] suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane 2907465 42 proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J Bacteriol 170, 2575-2583. Nalin, R., Pujic, P., Tuphile, K., Gillet,B. (2004).Method for the expression of unknown environmental DNA into adapted host cells. In 5 W02004013327, pp. W02004013327. Neidle, S. (2001). DNA minor-groove recognition by small molecules. Nat Brod Rep 18, 291-309. Pernodet, J. L., Alegre, M. T., Blondelet-Rouault, M. H. & Guerineau, M. (1993). Resistance to spiramycin in Streptomyces ambofaciens, the 10 producer organism, involves at least two different mechanisms. J Gen Microbiol 139, 1003-1011. Raynal, A., Karray, F., Tuphile, K., Darbon-Rongere, E. & Pernodet, J. L. (2006). Excisable cassettes: new tools for functional analysis of Streptomyces genomes. Appl Environ Microbiol 72, 4839-4844.

15 Raynal, A., Tuphile, K., Gerbaud, C., Luther, T., Guerineau, M. & Pernodet, J. L. (1998). Structure of the chromosomal insertion site for pSAM2: functional analysis in Escherichia coli. Mol Microbiol 28, 333-342. Sambrook J. & Russell D.W. (2001). Molecular cloning, a laboratory manuel. Third edition. Editions: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 20 New York. Schâffer A., Aravind L., Madden T.L., Shavirin S., Spouge J.L., Wolf Y.I., Koonin E.V., Altschul S.F. (2001). Improving the accuracy of PSIBLAST protein database searches with composition-based statistics and other refinements. Nucleic Acids Res. 29, 2994-3005.

25 Simon, R., Priefer, U., Pülher, A., (1983). A broad host range mobilisation system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria. Bio/technology 1, 784-791 Suo Z, Tseng CC, Walsh CT. (2001). Purification, priming, and catalytic acylation of carrier protein domains in the polyketide synthase and 30 nonribosomal peptidyl synthetase modules of the HMWP1 subunit of yersiniabactin synthetase. Froc Natl Acad Sci USA, 98, 99-104.

2907465 43 Stumpp, T., Himbert, S. & Altenbuchner, J. (2005). Cloning of the netropsin resistance genes from Streptomyces flavopersicus NRRL 2820. J Basic Microbiol 45, 355-362. Turgay, K. & Marahiel, M. A. (1994). A general approach for 5 identifying and cloning peptide synthetase genes. Pept Res 7, 238-241. Van Hecke K, Nam, P.C. Nguyen, M. T., Van Meervelt, L. (2005) Netropsin interactions in the minor groove of d(GGCAATTGG) studied by a combination of resolution enhancement and ab initio calculations). FEBS J. , 272, 3531-3541.

10 Yanai, K., Murakami, T. & Bibb, M. (2006). Amplification of the entire kanamycin biosynthetic gene cluster during empirical strain improvement of Streptomyces kanamyceticus. Proc Natl Acad Sci USA 103, 9661-9666. Yu, D., Ellis, H. M., Lee, E. C., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. & Court, D. L. (2000). An efficient recombination system for chromosome 15 engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 97, 5978-5983.

Claims

REVENDICATIONS

1) Polynucléotide isolé, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique sélectionnée dans le groupe constitué par : a) l'une quelconque des phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 codant pour les polypeptides de la voie de biosynthèse de la congocidine Cgc3* (SEQ ID NO:

2), Cgc2* (SEQ ID NO: 4), Cgc1* (SEQ ID NO: 6), Cgc1 (SEQ ID NO: 8), Cgc2 (SEQ ID NO: 10), Cgc3 (SEQ ID NO: 12), Cgc4 (SEQ ID NO: 14), Cgc5 (SEQ ID NO: 16), Cgc6 (SEQ ID NO: 18), Cgc7 (SEQ ID NO: 20), Cgc8 (SEQ ID NO: 22), Cgc9 (SEQ ID NO: 24), Cgc10 (SEQ ID NO: 26), Cgc1 l (SEQ ID NO: 28), Cgc12 (SEQ ID NO: 30), Cgc13 (SEQ ID NO: 32), Cgc14 (SEQ ID NO: 34), Cgc15 (SEQ ID NO: 36), Cgc16 (SEQ ID NO: 38), Cgc17 (SEQ ID NO: 40), Cgc18 (SEQ ID NO: 42), Cgc19 (SEQ ID NO: 44), Cgc2O (SEQ ID NO: 46) et Cgc21 (SEQ ID NO: 48), l'une ou plusieurs desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; b) une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 ; c) une séquence codant pour l'un quelconque des analogues desdits polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 ; d) une séquence comprenant au moins deux séquences de a), b) ou c) ; et e) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à l'une quelconque des phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 et pouvant remplacer la (les) phase(s) ouverte(s) de lecture à laquelle (auxquelles) elle s'hybride spécifiquement, pour diriger la biosynthèse de la congocidine. 2) Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique sélectionnée dans le groupe constitué par : al) au moins les phases ouvertes de lecture ORF 1 et 5 à 22 codant pour les polypeptides de la voie de biosynthèse de la congocidine Cgc3* (SEQ ID NO: 2), Cgc2 (SEQ ID NO: 10), Cgc3 (SEQ ID NO: 12), Cgc4 (SEQ ID NO: 14), Cgc5 (SEQ ID NO: 16), Cgc6 (SEQ ID NO: 18) Cgc7 (SEQ ID NO: 20), Cgc8 (SEQ ID NO: 22), Cgc9 (SEQ ID NO: 24), Cgc10 (SEQ ID NO: 26), Cgc11 (SEQ ID NO: 28), Cgc12 (SEQ ID NO: 30); Cgc13 (SEQ ID NO: 32), Cgc14 (SEQ ID NO: 34), Cgc15 (SEQ ID NO: 36), Cgc16 (SEQ ID NO: 38), Cgc17 (SEQ ID NO: 40), Cgc18 (SEQ ID NO: 42) et Cgc19 (SEQ ID NO: 44), l'une ou plusieurs desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; 2907465 45 bl) une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 et 5 à 22 ; c 1) une séquence codant pour l'un quelconque des analogues desdits polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 et 5 à 22 ; et 5 dl) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à l'une quelconque des phases ouvertes de lecture ORF 1 et 5 à 22 et pouvant remplacer la (les) phase(s) ouverte(s) de lecture à laquelle (auxquelles) elle s'hybride spécifiquement, pour diriger la biosynthèse de la congocidine.

3) Polynucléotide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il 10 comprend en outre une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par : a2) une séquence comprenant les deux phases ouvertes de lecture ORF 2 et ORF 3 codant pour les polypeptides impliqués dans la résistance à la congocidine, Cgc2* (SEQ ID NO:

4) et Cgc1 * (SEQ ID NO: 6), l'une et/ou l'autre desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) 15 séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; b2) une séquence codant pour les polypeptides codés par lesdites deux phases ouvertes de lecture ORF 2 et 3 ; c2) une séquence codant pour les analogues desdits polypeptides codés par lesdites deux phases ouvertes de lecture ORF 2 et 3 ; et 20 d2) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à la séquence définie en a2) et pouvant remplacer l'acide nucléique auquel elle s'hybride spécifiquement, pour conférer la résistance à la congocidine. 4) Polynucléotide selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence d'acide nucléique sélectionnée 25 dans le groupe constitué par : a3) les phases ouvertes de lecture ORF 4 et/ou ORF 23 codant pour les polypeptides impliqués dans la régulation de la biosynthèse de la congocidine, Cgc1 (SEQ ID NO: 8) et Cgc20 (SEQ ID NO: 46), l'une et/ou l'autre desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) 30 complémentaire(s) correspondante(s) ; b3) une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 ; c3) une séquence codant pour l'un quelconque des analogues desdits polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 ; et 35 d3) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à l'une quelconque phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 et pouvant remplacer la (les) 2907465 46 phase(s) ouverte(s) de lecture à laquelle (auxquelles) elle s'hybride spécifiquement, pour réguler la biosynthèse de la congocidine.

5) Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence d'acide nucléique sélectionnée 5 dans le groupe constitué par : a4) la phase ouverte de lecture ORF 24 codant pour le polypeptide de la voie de biosynthèse de la congocidine Cgc2l (SEQ ID NO: 48), ladite phase ouverte de lecture étant optionnellement remplacée par la séquence complémentaire correspondante ; 10 b4) une séquence codant pour le polypeptide codé par ladite phase ouverte de lecture ORF 24 ; c4) une séquence codant pour un analogue dudit polypeptide codé par ladite phase ouverte de lecture ORF 24 ; et d4) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à la 15 phase ouverte de lecture ORF 24 et pouvant remplacer la phase ouverte de lecture à laquelle elle s'hybride spécifiquement, pour diriger la biosynthèse de la congocidine.

6) Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique sélectionnée dans le groupe constitué par : 20 a5) l'ensemble des phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 impliquées dans la voie de la biosynthèse de la congocidine, l'une ou plusieurs desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; b5) la séquence SEQ ID NO: 49 ; 25 c5) une séquence codant pour l'ensemble des polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 ; d5) une séquence codant pour des analogues de l'ensemble des polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 1 à ORF 24 ; et e5) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à la 30 séquence définie en a5) et pouvant remplacer l'acide nucléique auquel elle s'hybride spécifiquement, pour diriger la biosynthèse de la congocidine.

7) Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique sélectionnée dans le groupe constitué par : a6) une séquence comprenant les deux phases ouvertes de lecture 35 ORF 2 et ORF 3 codant pour les polypeptides impliqués dans la résistance à la congocidine, Cgc2* (SEQ ID NO: 4) et Cgc1 * (SEQ ID NO: 6), l'une et/ou l'autre 2907465 47 desdites phases ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; b6) une séquence codant pour les polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 2 et 3 ; 5 c6) une séquence codant pour les analogues desdits polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 2 et 3 ; et d6) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à l'acide nucléique défini en a6) et pouvant remplacer l'acide nucléique auquel elle s'hybride spécifiquement, pour conférer la résistance à la congocidine. 10

8) Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acide nucléique sélectionnée dans le groupe constitué par : a7) les phases ouvertes de lecture ORF 4 et/ou ORF 23 codant pour les polypeptides impliqués dans la régulation de la biosynthèse de la congocidine, Cgcl (SEQ ID NO: 8) et Cgc20 (SEQ ID NO: 46), l'une et/ou l'autre desdites phases 15 ouvertes de lecture étant optionnellement remplacée(s) par la (les) séquence(s) complémentaire(s) correspondante(s) ; b7) une séquence codant pour l'un quelconque des polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 ; c7) une séquence codant pour l'un quelconque des analogues desdits 20 polypeptides codés par lesdites phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 ; et d7) une séquence s'hybridant dans des conditions stringentes à l'une quelconque phases ouvertes de lecture ORF 4 et ORF 23 et pouvant remplacer la (les) phase(s) ouverte(s) de lecture à laquelle (auxquelles) elle s'hybride spécifiquement, pour réguler la biosynthèse de la congocidine. 25

9) Groupe de gènes comprenant les phases ouvertes de lecture codant pour les polypeptides Cgc3* (SEQ ID NO: 2), Cgc2* (SEQ ID NO: 4), Cgcl (SEQ ID NO: 6), Cgcl (SEQ ID NO: 8), Cgc2 (SEQ ID NO:

10), Cgc3 (SEQ ID NO: 12), Cgc4 (SEQ ID NO: 14), CgcS (SEQ ID NO: 16), Cgc6 (SEQ ID NO: 18), Cgc7 (SEQ ID NO: 20), Cgc8 (SEQ ID NO: 22), Cgc9 (SEQ ID NO: 24), Cgc10 (SEQ ID 30 NO: 26), Cgc11 (SEQ ID NO: 28), Cgc12 (SEQ ID NO: 30), Cgc13 (SEQ ID NO: 32), Cgc14 (SEQ ID NO: 34), Cgc15 (SEQ ID NO: 36), Cgcl6 (SEQ ID NO: 38), Cgc17 (SEQ ID NO: 40), Cgcl8 (SEQ ID NO: 42), Cgcl9 (SEQ ID NO: 44), Cgc20 (SEQ ID NO: 46) et Cgc2l (SEQ ID NO: 48). 10) Vecteur comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque 35 des revendications 1 à 8. 2907465 48 Il) Vecteur selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide, d'un cosmide, d'un chromosome artificiel bactérien (BAC), d'un élément intégratif d'actinobactérie, d'un virus ou d'un bactériophage. 12) Cellule recombinante caractérisée en ce qu'elle est transformée 5 par un vecteur selon la revendication 10 ou la revendication

11. 13) Cellule recombinante selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle est apte à synthétiser la congocidine, et en ce que ledit vecteur est un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 2 à 6. 10 14) Cellule recombinante selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle est résistante à la congocidine, et en ce que ledit vecteur est un vecteur d'expression comprenant au moins un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 3 à 7. 15) Cellule recombinante selon l'une quelconque des revendications 15 12 à 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une actinobactérie. 16) Cellule recombinante selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'il s'agit de Streptomyces lividans.

17) Fragment d'au moins 15 nucléotides d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, utilisable comme sonde ou amorce. 20 18) Fragment selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'une des séquences SEQ ID NO: 52, 53 et 56 à 59. 19) Polypeptide isolé, impliqué dans la voie de la biosynthèse de la congocidine ou d'un dérivé de la congocidine, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par : 25 - les polypeptides Cgc3* (SEQ ID NO: 2), Cgc2* (SEQ ID NO: 4), Cgcl * (SEQ ID NO: 6), Cgcl (SEQ ID NO: 8), Cgc2 (SEQ ID NO: 10), Cgc3 (SEQ ID NO:

12), Cgc4 (SEQ ID NO: 14), CgcS (SEQ ID NO: 16), Cgc6 (SEQ ID NO: 18), Cgc7 (SEQ ID NO: 20), Cgc8 (SEQ ID NO: 22), Cgc9 (SEQ ID NO: 24), Cgc10 (SEQ ID NO: 26), Cgcl 1 (SEQ ID NO: 28), Cgc12 (SEQ ID NO: 30), Cgc13 30 (SEQ ID NO: 32), Cgc14 (SEQ ID NO: 34), Cgc15 (SEQ ID NO: 36), Cgc16 (SEQ ID NO: 38), Cgcl7 (SEQ ID NO: 40), Cgc18 (SEQ ID NO: 42), Cgc19 (SEQ ID NO: 44), Cgc2O (SEQ ID NO: 46) et Cgc21 (SEQ ID NO: 48) ; et - les analogues desdits polypeptides. 20) Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des 35 revendications 1 à 8, d'un vecteur selon la revendication 10 ou la revendication 11, d'une cellule recombinante selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, d'un ou plusieurs fragment(s) selon la revendication 17 ou la revendication 18, seuls ou en 2907465 49 combinaison, et/ou d'un ou plusieurs polypeptide(s) selon la revendication 19, seuls ou en combinaison, pour la production de congocidine. 21) Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 2 à 6 pour conférer à. un microorganisme la capacité à synthétiser la congocidine. 22) Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 3 à 7, pour conférer à un microorganisme le caractère de résistance à la congocidine. 23) Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des 10 revendications 4 à 6 et 8 pour augmenter in vitro la biosynthèse de congocidine par un microorganisme capable de synthétiser la congocidine. 24) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisée en ce que ledit microorganisme est une actinobactérie. 25) Utilisation selon la revendication 24, caractérisé en ce que ledit 15 microorganisme est Streptomyces lividans. 26) Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la préparation d'un dérivé de la congocidine. 27) Procédé de production in vitro de congocidine ou d'un dérivé de la congocidine, caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant à mettre en 20 culture une cellule recombinante selon l'une quelconque des revendications 12 à 16 dans des conditions permettant la synthèse de la congocidine ou dudit dérivé de congocidine.