JP2014530609A - グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンの生合成のための遺伝子クラスター - Google Patents

グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンの生合成のための遺伝子クラスター Download PDF

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Abstract

本発明は、グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンの生合成に関わる遺伝子クラスターによって含まれる遺伝子クラスター及び遺伝子に、並びに抗生物質製剤の産生のための、遺伝子クラスター、それによって含まれる遺伝子及びそれによってコードされるタンパク質の使用に関する。

Description

本発明は、抗生物質の分野、及びより具体的には(メチル)グリセリマイシン（（methyl）griselimycin）の生合成に関わる遺伝子及びタンパク質に関する。本発明は組換ＤＮＡ技術により(メチル)グリセリマイシンを産生（produce）する組換法を提供する。
グリセリマイシンは、放線菌門の最大の属でそしてストレプトミセス科の標準属である、ストレプトミセス属の微生物によって産生される天然産抗生物質である。ストレプトミセス菌はグラム陽性であり、そして高いＧＣ含量のゲノムを有する。ストレプトミセス菌は複雑な二次代謝によって特徴付けられる。それらは天然起源の臨床的に有用な抗生物質の２／３以上を産生する。グリセリマイシンは、１９７１年に Terlain及び Thomasによって始めて記述された。それは、Ｎ−アセチル化されたＬ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−トランス−４−メチルプロリン、Ｌ−Ｎ−メチルトレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トランス−４−メチルプロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−プロリン、Ｄ−Ｎ−メチルロイシン及びグリシンの、この順序で存在する１０のアミノ酸で構成されている。ペプチド鎖は、アミノ酸としてＮ−アセチル化されたＬ−Ｎ−メチルバリン、及びＬ−トランス−４−メチルプロリンから成る非環化テール（tail)をもたらすエステル結合を介して、グリシンとＬ−Ｎ−メチルトレオニン間で環化されている。
グリセリマイシンは非リボソーム合成微生物ペプチドの群に属しており、この群のペプチドは著しい構造多様性を示し、そして広範囲の種類の最も強力な抗生物質及び他の重要な医薬品を含んでいる。構造的には多様であるが、非リボソーム合成微生物ペプチドは、共通の合成モードとして、多酵素チオテンプレート機構を共有する。それによって、ペプチド結合形成は、鋳型及び生合成機構（Biosynthesis machinery）を同時に示す、大きな多酵素複合体上で行われる。これらの多酵素複合体は、非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）と呼ばれる。ＮＲＰＳをコードする遺伝子の配列決定は、モジュラー組織（modular organization）を明らかにした。モジュールは、成長するポリペプチド鎖へのある特定のモノマー（one defined monomer）の組込みに関与するＮＲＰＳポリペプチド鎖のセクションである。このように、ＮＲＰＳは、組み込まれようとするアミノ酸がモジュールによって決定されることから鋳型として、そしてすべての必要な触媒機能を固定する（harbor）のはそのモジュールであることから生合成機械として、同時に使われる。モジュールは更に、触媒ドメインに解体（dissect）できる。これらのドメインは、少なくとも基質活性化、共有結合及びペプチド結合形成の工程を触媒する。同等の機能のドメインは、いくつかの高度保存配列モチーフを共有する。それらは、ＮＲＰＳ機構の操作の見込みを切り開くポリペプチド鎖内での活性変化のために修飾することができる。
各モジュール内で、特定の基質（アミノ酸）の選択は、アデニル化ドメイン（Ａドメイン）によって媒介される。このＡドメインは、産物を作り出すアミノ酸の選択に関与し、そして従ってその一次配列を制御する。Ａドメインは、アミノアシルアデニレートとしてアミノ及び同様にある種のカルボキシ基質を活性化し、一方でＡＴＰは消費される。この反応中間体は更に、同じモジュール中のＡドメインの下流に位置するチオール化（Ｔ）ドメインともいわれるペプチジルキャリア蛋白質（ＰＣＰ）ドメインに結合されるＰｐａｎ補欠分子族の末端システアミンチオール部分へ輸送される。それは、４′ＰＰ補因子チオエステルに共有結合的に係留される活性化アミノ酸を受け入れる輸送単位を表す。この補因子は、結合アミノアシル及びペプチジル基質が異なる触媒中心間を移動することを可能にする可撓性アームとして作用する。Ａドメイン及びＴドメインの組み合わせは、両ドメインがそれに続くペプチド合成の第１のビルディングブロックを活性化しそして共有結合的に係留することを必要とされるので、開始モジュールと定義される。リポペプチド経路の開始モジュールは、アシル側鎖の第１のアミノ酸のアミノ基との縮合のために、更なるＮ末端Ｃドメインを固定する。縮合又はＣドメインは、それが隣接モジュールのＴドメインに結合したアミノアシル基質間のペプチド結合形成に関与するので、非リボソームペプチド合成の中心エンティティ（central entity）である。酵素は、アシル基上へ（Ｃドメインに関して）下流のモジュールに結合した活性化アミノ酸、又は上流のモジュールに係留されたアミノ酸のアミノ（又はイミノ、ヒドロキシル）基の求核攻撃を触媒する。得られたペプチジル中間体は次いで、それに続く縮合及び更なる修飾工程用のアセンブリラインの下方へ転座される。合成中に、成長するペプチド鎖は、それが最終モジュールのＴドメインに到達するまで、１つのモジュールから次のモジュールに引き渡される。このモジュールは、ほとんどの場合、産物の遊離にとって重要なＴＥ（チオエステラーゼ）ドメインを含有する。産物放出は、大環状産物又は線形ペプチドそれぞれをもたらす、ペプチド内部求核剤か又は水によって引き続いて攻撃されるアシル−Ｏ−ＴＥ酵素中間体を含む２工程プロセスによって実現される。
非リボソームペプチドの特に顕著な特性は、Ｄ−アミノ酸の出現（occurrence）である。Ｄ−アミノ酸を組み込む１つの方法は、Ｄ−アミノ酸選択的Ａドメインを使用することである。しかしながら、より一般的な方法は、Ｄ−アミノ酸の組込みに関与するモジュールのＣ末端に生じるＥ（エピマー化）−ドメインの使用を通してである。酵素は成長ペプチド鎖のＴドメイン結合Ｌ−アミノ酸のエピマー化を触媒する。下流縮合ドメイン供与部位のエナンチオ選択性を通したＴドメイン結合Ｌ−アミノ酸の識別は、クリーンなＤ−立体配置産物をもたらす。
いくつかのＮＲＰＳは、アミノ酸残基のＮ−又はＣ−メチル化に関与するメチルトランスフェラーゼ（ＭＴドメイン）を含有し、このようにしてペプチドをタンパク質分解的崩壊（proteolytic breakdown）に対して感受性を小さくする。両タイプのメチルトランスフェラーゼ（Ｎ−又はＣ−メチルトランスフェラーゼ又は略してＮ−ＭＴ又はＣ−ＭＴ）は、メチル供与体としてＳ−アデノシルメチオニンを使用する。ＭＴドメインはしばしばＡドメイン中の挿入物として見出される（非特許文献１）。尚更に際立ったことは、アセンブリラインにおけるそれらの使用に先立って通常生合成されるメチルプロリンなどの非天然アミノ酸の組み込みである。あるいは、組み込まれたアミノ酸は、ＮＲＰＳによりアセンブリ後に酵素的に修飾することができる。
グリセリマイシンはストレプトミセス属の微生物により天然に産生される。しかしながら、ストレプトミセスによるグリセリマイシンの産生は当技術分野で公知となっているが、グリセリマイシンの生合成に関与する遺伝子座はこれまで同定されていない。それ故に、グリセリマイシンの生合成のターゲッティング及び修飾は、今も尚限定されている。従って、グリセリマイシンの生合成に関する遺伝情報の必要性が存在する。
Finking et Marahiel, 2004; Marahiel, 2009
グリセリマイシンに加えて、ストレプトミセス菌も同様に、メチルグリセリマイシンと称するバリンアト形のグリセリマイシンを産生する。メチルグリセリマイシンは、Ｌ−プロリンの代わりにＬ−トランス−４−メチルプロリンを含有する。メチルグリセリマイシンは、グリセリマイシンを超える抗菌薬としてのその使用において、例えば異なる抗細菌特異性などのある利点を保有する、しかしながら、ストレプトミセス菌により副成分だけとして産生される。従って、グリセリマイシンの生合成に関する遺伝情報の必要性が存在する。
グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンによって含まれるようなメチルプロリン部分、即ちＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生は全く未知である。従って、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの生合成に関する遺伝情報の必要性が存在する。
（メチル）グリセリマイシンの生合成経路に関与するポリペプチドをコードする遺伝子座は現在同定されている。本発明者らは、ストレプトミセスＤＳＭ２６６４３のゲノムＤＮＡから全グリセリマイシン生合成遺伝子クラスターを単離しそしてクローニングすることに成功した。本発明者らはまた、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの形成に関与するようなものを含む（メチル）グリセリマイシン生合成経路に関与するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を解明するのに成功した。これは分子レベルで明確な生合成工程の同定及び影響を可能にする。
このように、１つの態様において、本発明は以下から選択される少なくとも１つの核酸を含む核酸を提供する：
（ａ）配列番号２〜２７のタンパク質又はそのバリアント若しくはフラグメントをコードし、それによってバリアント又はフラグメントが配列番号２〜２７のタンパク質の機能的に活性なバリアント又はフラグメントをコードする、配列番号１によって含まれるようなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１〜２６の少なくとも１つを含んでなる核酸、
（ｂ）配列番号２〜２７のタンパク質の少なくとも１つをコードする核酸又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメント、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸によってコードされるタンパク質又はそのフラグメントとアミノ酸配列において少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９７％同一であるタンパク質をコードする核酸、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の核酸とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸、
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の核酸とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、そして１０〜５０のヌクレオチド長から成る核酸、又は
（ｆ）（ａ）〜（ｆ）の核酸に相補的な核酸。
本発明によって含まれるような核酸は、１つの実施態様において、６６．８６８ヌクレオチド長のグリセリマイシン生合成遺伝子クラスターを含むストレプトミセスＤＳＭ２６６４３のゲノムの一部である配列番号１を含み又はそれから成る核酸である。この新しく発見された遺伝子クラスターは、６５．２７２ヌクレオチド長の配列番号１のヌクレオチド８３７〜６６．１０８から、それぞれ、ＯＲＦ１〜ＯＲＦ２６（ＯＲＦ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６）と呼ばれ、又はｏｒｆ−１、ｏｒｆ−２、ｏｒｆ−３、ｏｒｆ−４、ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−６、ｏｒｆ−７、ｎｒｐｓ−１、ｉｎｔ−１、ｔｎｐ−１、ｉｎｔ−２、ｔｎｐ−２、ｔｎｐ−３、ｄｎａ、ｎｒｐｓ−２、ｎｒｐｓ−３、ｍｂｔＨ、ｍｐｓ−１、ｍｐｓ−２、ｍｐｓ−３、ｍｐｓ−４、ｏｒｆ−８、ｏｒｆ−９、ｏｒｆ−１０、ｏｒｆ−１１、ｏｒｆ−１２の遺伝子名で呼ばれる、少なくとも２６のＯＲＦを含有する。これらのＯＲＦは、（メチル）グリセリマイシンの生合成に関与する配列番号２〜２７（配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７）のタンパク質をそれぞれコードする。グリセリマイシンの生合成遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質の構造的及び機能的特性解析は下記で与えられる。
本発明の文脈では、用語「（メチル）グリセリマイシン」はグリセリマイシン並びにメチルグリセリマイシンをいう。グリセリマイシンは、アセチル化されたＬ−Ｎ−メチルバリン（１）、Ｌ−トランス−４−メチルプロリン（２）、Ｌ−Ｎ−メチルトレオニン（３）、Ｌ−ロイシン（４）、Ｌ−トランス−４−メチルプロリン（５）、Ｌ−ロイシン（６）、Ｌ−Ｎ−メチルバリン（７）、Ｌ−プロリン（８）、Ｄ−Ｎ−メチル−Ｄ−ロイシン（９）及びグリシン（１０）である、１０個のアミノ酸で構成される抗生物質である。グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンの構造式は図１に示される。グリセリマイシン及びそのバリアントのメチルグリセリマイシンは、本明細書で同定される（メチル）グリセリマイシン生合成遺伝子クラスターと同じ遺伝子を含む同じ生合成経路によって異なる量で産生される。メチルグリセリマイシンは、位置８においてＬ−プロリンの代わりにＬ−トランス−４−メチルプロリンの存在によってグリセリマイシンと異なる。Ｌ−トランス−４−メチルプロリンのメチルグリセリマイシンへの、そしてＬ−プロリンのグリセリマイシンへの組込みに関与するマルチドメイン酵素は、同じ酵素、即ちＮＲＰＳ−２であり、そして本明細書で同定される遺伝子ｎｒｐｓ−２のタンパク質産物である。
本発明の文脈では、用語「遺伝子クラスター」は、ゲノムの近接伸展（contiguous stretch）に位置し、そして（メチル）グリセリマイシンの合成を指示する幾つかの遺伝子のセットをいう。遺伝子クラスターに属する幾つかの遺伝子は、遺伝子ファミリーに関連しそしてグループ分けされる遺伝子である。それらは構造及び機能において類似するタンパク質をコードする。残りの遺伝子は、構造的に無関係でそして異なる構造及び機能を有するタンパク質をコードする。コードされたタンパク質は、反応を触媒する酵素であるか又はとりわけ調節又は輸送に関与するかである。全体として、遺伝子クラスターによって含まれるような遺伝子は、（メチル）グリセリマイシンの生合成の目的に資するタンパク質をコードする。
用語「核酸」は、それぞれ、配列番号２〜２７のタンパク質をコードするＯＲＦ１〜２６によって規定される核酸、並びに天然産及び非天然産のそのバリアント及びフラグメントを包含する(本明細書に記載されるような)。核酸は、遺伝情報を運ぶ単量体ヌクレオチド鎖から構成されるいずれの高分子であってよく、又は細胞内に構造を形成し得る。最も一般的な（そしてそれ故好ましい）核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）である。核酸は、配列番号１などのゲノムＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子、又はＯＲＦを表しそしてタンパク質をコードする核酸などの一本鎖又は二本鎖であってよいｃＤＮＡ分子、並びにプライマー又はプローブなどの合成一本鎖ポリヌクレオチドなどの合成ＤＮＡであってよい。本発明の核酸はまた、ＲＮＡ分子であってよい。好ましくは、本用語はまた、遺伝子の非コード領域に関し、ここでこれらのセクションは、その遺伝子に特異的であるために適切なサイズである。それらの領域の例は、プロモーターなどの調節エレメントである。最も好ましくは、用語「核酸」は、遺伝子、ＯＲＦ、プロモーター、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡに関する。所望の遺伝情報をコードする核酸、好ましくは、ＤＮＡは、関心のある遺伝子、プロモーター領域、開始コドン及び終止コドンを、そしておそらく、遺伝子の発現調節に使用し得る更なる領域を含んでよい。調節領域はそれぞれの遺伝子に対して異種であってよく、又はそれと事実上関連してよい。遺伝情報は、恒久的に又は本発明の核酸がそれに導入される細胞中のレプレッサー及び／又はプロモーター領域の調節下に発現され得る。得られた細胞は、直接使用され得るか又は組織培養に使用され得て、又は細胞は回収され得てそしてそれぞれのタンパク質を含むサンプルは細胞を破壊することによって得られる。あるいは、ＤＮＡ又はＲＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡが固定化され、そして転写及び／又は翻訳に必要とされる因子（酵素、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ヌクレオチド、ＡＴＰなど）を含む、機能性細胞溶解物の添加により翻訳され及び／又は転写される、例えばマイクロアレイシステムなどの細胞中か又は無細胞発現系中かいずれかにおいて使用され得る。またペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む人工核酸も含まれる。これらの各々は、分子の主鎖（backbone）への変化により天然産のＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。
本明細書に使用されるような用語「含む（comprising）」は、所望の特性及び具体的に記載してはいけない更なる特性を「含む又は包含する」ことを意味する。用語「含む」はまた、所望の特性「から成る」こと、そして所望の特性以外の更なる特性を含まないことを意味する。このように、本明細書で言及される核酸又はタンパク質は、示された定義に加えて、例えばＯＲＦ又は配列番号による定義に加えて更なる特性によって規定され得て、又はそのような示された特性だけから成り得る。
用語「異種」は、それがコーディング又は調節配列などの核酸配列に関連するので、組換構築物（construct）及び／又は特殊な細胞の領域と通常関連しない配列を意味する。「異種」領域は、事実上他の分子と関連して見出されない別の核酸内の又はそれに結合された核酸の同定可能なセグメントである。例えば、構築物の異種領域は、事実上本明細書で同定されたような遺伝子と関連することが見出されない調節領域であり得よう。同様に、異種配列は、それが例えば天然の遺伝子と異なるコドンとの合成配列を含有するように、事実上それ自体見出されないコーディング配列であり得よう。その上、宿主細胞中に通常存在しない構築物で形質転換された宿主細胞は、本発明の目的に対して異種と考えられ得よう。相同核酸配列は本明細書に規定されるようなバリアント配列である。用語「相同」はバリアントと交換可能に使用され得る。用語「相同」はまた同一配列を言及してよい。
本発明の実施態様では、核酸は、配列番号２〜２７の配列によって含まれるような少なくとも１つの別個のタンパク質をコードする核酸分子を含む。特定の実施態様では、配列番号１によって含まれるような（メチル）グリセリマイシン遺伝子クラスターの全配列は、本発明の核酸によって含まれる。別の実施態様では、核酸は、配列番号２〜２７の少なくとも１つのタンパク質の機能的に活性なバリアント又はフラグメントをコードするＯＲＦ１〜２６のバリアント又はフラグメントである。最も好ましい核酸は、下記に詳述するようなＯＲＦ１〜２６の天然産のバリアントタンパク質、より好ましくは天然産のストレプトミセスタンパク質、尚更に好ましくは（メチル）グリセリマイシンの合成に関与する配列番号２〜２７のタンパク質をコードする。
用語「核酸」は本明細書に開示のように完全長ＯＲＦ１〜２６を含んでよく、又はＯＲＦ１〜２６のフラグメント又は部分配列を含んでよい。ＯＲＦ１〜２６のそのようなフラグメント又は部分配列は、配列番号２〜２７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のフラグメントを、それぞれ、コードする。これは短い内部及び／又はＣ−及び／又はＮ−末端欠失を持ったフラグメントのタンパク質を含んでよく、それによって本明細書に同定されたような生成したタンパク質の活性は、ＯＲＦ１〜２６によってコードされたような野生型タンパク質の活性の、５％より大きい、１０％より大きい、２０％より大きい、３０％より大きい、４０％より大きい、５０％より大きい、６０％より大きい、７０％より大きい、８０％より大きい、９０％より大きい、９５％より大きい、９７％より大きい又は１００％より大きい、例えば１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％より大きい範囲に維持される。その結果として、そのようなフラグメントをコードするそれぞれの核酸は、ＯＲＦ１〜２６の５｀及び／又は３｀末端内及び／又はそこでの欠失、例えばせいぜい５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％又はそれ以下の欠失を含有する。本発明の文脈では、配列番号２〜２７のタンパク質の機能的に活性なフラグメントをコードするフラグメントの核酸配列は、（メチル）グリセリマイシンの合成を指示し、及び／又は（メチル）グリセリマイシンの合成を指示する配列番号２〜２７のタンパク質をコードするそれぞれのＯＲＦと置換できる、フラグメントをコードする配列を意味する。
用語「核酸」は、本明細書に規定されたような配列番号２〜２７のタンパク質の機能的に活性なバリアントをコードする本明細書に開示されたようなＯＲＦ１〜２６のバリアントを言及してよい。そのような機能的に活性なバリアントは、５０％より大きい、６０％より大きい、好ましくは７０％より大きい、より好ましくは８０％より大きい、尚より好ましく８５％より大きい、尚更に好ましくは９０％より大きい、尚更に好ましくは９５％より大きい、最も好ましくは９７％より大きい、配列番号２〜２７と配列同一性を有し、及び／又は配列番号２〜２７のタンパク質の活性の、５％より大きい、１０％より大きい、２０％より大きい、３０％より大きい、４０％より大きい、５０％より大きい、６０％より大きい、７０％より大きい、８０％より大きい、９０％より大きい、９５％より大きい、９７％より大きい又は１００％より大きい、例えば１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％より大きい活性を有する。その結果、そのようなバリアントをコードする核酸は、ＯＲＦ１〜２６の５｀及び／又は３｀末端内及び／又はそこでの欠失、挿入、置換及び／又は付加を含有し、そして５０％より大きい、６０％より大きい、７０％より大きい、好ましくは８０％より大きい、より好ましくは８５％より大きい、尚より好ましくは９０％より大きい、尚より好ましくは９５％より大きい、最も好ましくは９７％より大きい、ＯＲＦ１〜２６の配列に同一性を示す。本発明の文脈において、配列番号２〜２７のタンパク質の機能的に活性なバリアントをコードするバリアント核酸配列は、（メチル）グリセリマイシンの合成を指示し、及び／又は（メチル）グリセリマイシンの合成を指示する配列番号２〜２７のタンパク質をコードするそれぞれのＯＲＦと置換できる、バリアントをコードする配列を意味する。
なお、上記の修飾は組み合わされ得る。例えば、本発明によって含まれるような核酸は、ＯＲＦ１〜２６の１つ又はそれ以上のバリエーションを含むフラグメントであってよい。なおまた、フラグメント又はバリアントは、明細書に規定されたように、ＯＲＦ１〜２６又はそのフラグメント若しくはバリアントが事実上それと関連するプロモーター又は調節配列のフラグメント又はバリアントを含む。これらのバリアントは、それらがそれと関連する遺伝子の転写又は翻訳を調節することにおいて機能的に活性である。
ＯＲＦは、タンパク質を潜在的にコードし得るＤＮＡ配列であるオープンリーディングフレームである。本発明の文脈では、用語「ＯＲＦ」は、ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３から単離されたような（メチル）グリセリマイシンの生合成遺伝子クラスター中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１〜２６）を表す。本発明者らは、ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３のグリセリマイシン生合成遺伝子クラスターを同定するのに成功し、そして６５２７２ヌクレオチドの伸展を超えて２６のＯＲＦを同定した。これらのＯＲＦは、それぞれ、ｏｒｆ−１、ｏｒｆ−２、ｏｒｆ−３、ｏｒｆ−４、ｏｒｆ−５、ｏｒｆ−６、ｏｒｆ−７、ｎｒｐｓ−１、ｉｎｔ−１、ｔｎｐ−１、ｉｎｔ−２、ｔｎｐ−２、ｔｎｐ−３、ｄｎａ、ｎｒｐｓ−２、ｎｒｐｓ−３、ｍｂｔＨ、ｍｐｓ−１、ｍｐｓ−２、ｍｐｓ−３、ｍｐｓ−４、ｏｒｆ−８、ｏｒｆ−９、ｏｒｆ−１０、ｏｒｆ−１１、ｏｒｆ−１２と命名された。ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３の全グリセリマイシン生合成遺伝子クラスターは、ＯＲＦ１〜２６を含む６６８６８長のヌクレオチド並びにＯＲＦ１及びＯＲＦ２６それぞれに５｀及び３｀に位置する更なるヌクレオチドである。
配列番号１によって含まれる２６のＯＲＦは、ストレプトミセスＤＳＭ２６６４３の配列番号１のヌクレオチド８３７からヌクレオチド６６１０８まで伸長する。表１は、特有の推定ＯＲＦ、対応する遺伝子の名称、配列番号１内の開始及び終止ヌクレオチド、ヌクレオチド中の遺伝子の長さ（ｎｔ）、鎖数（strandedness）、それによってコードされた推定タンパク質のアミノ酸数（ａａ）、タンパク質名称及びタンパク質の配列番号、のリストを示す。表２は、ＮＣＢＩ(National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine 38A, Bethesda, MD20894; USA; www.ncbi.nih.gov) から入手可能なそれらのＧｅｎＢａｎｋ受入番号によって指定されるタンパク質を示す。これらのタンパク質は、配列番号２〜２７のタンパク質に最大の同一性／類似性を示すような、相同性検索に基づいて、同定されている。これらのタンパク質は、それらの機能、それらの受入番号及びそれらの起源によって規定される。表２はその上、配列番号２〜２７のタンパク質と相同性検索によって同定されたようなタンパク質の間の同一性及び相同性のｅ−値及び度合いを示す。ｅ−値は観察アラインメントスコアに少なくとも等しいアラインメントスコアとのチャンスアラインメントの期待数に関する。０.００のｅ−値は、完全な相同体を示す。ｅ−値はAltschul S.F. et al. １９９７に記載のように計算される。ｅ−値は、２つの配列が相同性の推論を正当化するに十分な類似性を示すかどうかの決定に役立つ。同一性は、同一のアミノ酸がそれぞれの部位で比較タンパク質中に存在することを示し、一方で類似性は下記の本明細書に規定されるような保存アミノ酸置換がそれぞれの部位に存在することを示す。その上、ＯＲＦ１〜２６によってコードされるタンパク質の推定機能が示される。
ＯＲＦ１〜２６への（メチル）グリセリマイシンの合成を指示するためのバリアント核酸の置換は、このバリアント核酸が、それがバリアントであるＯＲＦの代わりにストレプトミセスＤＳＭ２２６４３のゲノムに挿入できて、それによって配列番号２〜２７のそれぞれのタンパク質の機能を引き継ぐバリアントタンパク質を発現し、そして（メチル）グリセリマイシンの合成を指示、即ちそれに関与する、ことを意味する。バリアントが機能を引き継ぐ程度は本明細書に規定される。
別の実施態様では、核酸は、配列番号２〜２７のタンパク質をコードする。核酸は、表１に示されるような開始及び終止ヌクレオチド（ｎｔ）を持つ配列番号１によって含まれるようなＯＲＦ１〜２６の配列を含んでよい。核酸はまた、配列番号２〜２７のタンパク質と同じアミノ酸配列のタンパク質をコードし得る、しかしながら、そのヌクレオチド組成は、遺伝コードの縮重が原因で異なる。
更なる実施態様では、核酸は、配列番号１によって同定されるような（メチル）グリセリマイシン遺伝子クラスターによって含まれる、又はＯＲＦ１〜２６を構成し又は配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントをコードする核酸にストリンジェント条件下においてハイブリダイズする。本発明では、用語「ストリンジェント条件下においてハイブリダイズする（こと）」は、いわゆる特異的ハイブリッドの形成を可能にする条件下で２つの核酸分子の間でのハイブリッドの形成を言い、一方で非特異的ハイブリッドは実質的に形成されない。そのような条件の例は、その条件下において高い同一性核酸の相補鎖、即ち、配列番号１のヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、尚より好ましくは９０％以上及び尚更好ましくは９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列から構成され、又はＯＲＦ１〜２６で示されるＤＮＡはハイブリダイズし、一方で上記より同一性の少ない核酸の、相補のより少ない鎖はハイブリダイズしない、条件を含む。より具体的には、そのような条件は、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、そしてより好ましくは３００〜７５０ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、そしてより好ましくは５５〜６５℃であり、そしてホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、そしてより好ましくは３５〜４５％である、条件をいう。更にストリンジェント条件下で、ハイブリダイゼーション後にフィルターを洗浄する条件は通常下記を含む：ナトリウム塩濃度は１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、及びより好ましくは３００〜６００ｍＭであり、そして温度は２５〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、及びより好ましくは６０℃である。ストリンジェンシー、及び従って特異性は、例えば反応温度を増加させること及び／又は反応緩衝液のイオン強度を低下させることにより増加できる。例えば、低ストリンジェント条件は、室温〜６５℃において３ｘＳＳＣでのハイブリダイゼーションを含み、そして高ストリンジェント条件は、６８℃において０．０１ｘＳＳＣでのハイブリダイゼーションを含む。例示的な中程度のストリンジェント条件（核酸はそれらのコドン組成に関して最大に変性する場合、中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズする）は、５０％ホルムアミド、４２℃における５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳ及び４５℃における１ｘＳＳＣでの洗浄を含む。高ストリンジェント条件は、４２℃におけるインキュベーション、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳ（例えば５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０ｘデキストラン硫酸、２０ｍｇ／ｍｌ剪断処理済みサケ精子ＤＮＡ）、又は６５℃における５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳ及び約６５℃における０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム緩衝液を表す）を含む。本発明では中程度又は高ストリンジェント条件が好ましく、高ストリンジェント条件が最も好ましい。本発明の文脈では、「ハイブリダイジング」配列は、（メチル）グリセリマイシンの合成を指示し、及び／又はそれが（メチル）グリセリマイシンの合成を指示するために特異的にハイブリダイズするＯＲＦと置換され得る、タンパク質をコードする配列を意味する。
本発明の更に好ましい実施態様では、上記で同定された核酸とストリンジェント条件下においてハイブリダイズし、そして５〜１００ヌクレオチド長から成る核酸が提供される。本出願で提供される配列情報は、（メチル）グリセリマイシンを産生する微生物を同定し及び単離し、並びに配列番号２〜２７のタンパク質又はそのバリアントのいずれかを固定するのに有用な特異的ヌクレオチドプローブ及びプライマーの設計を可能にする。このように、ヌクレオチドプローブは、配列番号１又はそのバリアントによって含まれるような又は配列番号２〜２７のいずれか又は機能的に活性なそのバリアントをコードする、（メチル）グリセリマイシン遺伝子クラスター内の配列からの遺伝コードの縮重によって見出される又はそれ由来の配列を有する。用語「プローブ」は、配列番号１又はそのバリアントによって同定される又は配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的に活性なそのバリアントのいずれか、又はそれらの相補若しくはセンス配列をコードする、（メチル）グリセリマイシン遺伝子クラスター内に含まれる核酸分子に、上記のように、ストリンジェント条件下においてハイブリダイズする、ＤＮＡ、好ましくは一本鎖、又はＲＮＡ分子又はその修飾若しくは組み合わせを言う。一般的に、プローブは完全長配列よりも顕著に短い。それらは、５〜１００、好ましくは１０〜８０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜５０ヌクレオチド、尚より好ましくは１０〜４０ヌクレオチド及び尚より好ましくは１５〜２５ヌクレオチドを含有してよい。特に、そのようなプローブは、配列番号１によって含まれるような、コードディンング（ＯＲＦ１〜２６）又は非コーディング配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％及び最も好ましくは１００％相同である、又は上記の程度それに相補的である配列を有してよい。それらは、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン又はジアミノ−２，６−プリンなどの修飾塩基を含有してよい。糖又はリン酸残基もまた当技術分野で公知のように修飾又は置換されてよい。例えば、デオキシリボース残基はポリアミドによって置換されてよく、そしてリン酸残基はジホスフェート、アルキル、アリールホスホネート又はホスホロチオエートエステルなどのエステル基によって置換されてよい。代わりに又は加えて、リボヌクレオチド上の２｀−ヒドロキシ基はアルキル、Ｏ−アルキル又はハロゲン基などの基を含むことによって修飾されてよい。本発明のプローブは、少なくとも部分的に互いに異なるヌクレオチド配列を持つ特異的捕獲及び／又は検出プローブを用いる方法である、ドットブロット、サザンブロット、ノーザンブロット又はサンドイッチ技術などのいずれの従来のハイブリダイゼーション技術において使用される（Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。プライマーは、増幅(例えばＰＣＲ)、延長又は逆転写法において、ＤＮＡの酵素的重合を開始するのに使用される。ＰＣＲを含む診断法で使用されるプライマーは当技術分野で公知の方法によって標識され得る。それらはまたプローブとして使用できる。原則として、プライマーはプローブと同じ特性を有してよい。それらは、５〜１００、好ましくは１０〜８０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜５０ヌクレオチド、尚より好ましくは１０〜４０ヌクレオチド及び尚より好ましくは１５〜２５ヌクレオチドを含有し得る。本発明の文脈において、プライマー又はプローブは、（メチル）グリセリマイシンを産生する、特に配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的に活性なそのバリアントをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを検出、同定及び／又は単離するために、及び／又は配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的に活性なそのバリアントをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを増幅するために、配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的に活性なそのバリアントのいずれかを含む、微生物を検出、同定及び／又は単離するために使用できる。このように、本発明の実施態様では、試薬は上記で概略を説明したように検出、同定及び／又は精製の目的でプライマー又はプローブを含んで構成される。
あるいは、（メチル）グリセリマイシン生合成経路において活性を有するタンパク質をコードする核酸の同定は、配列番号２〜２７又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントのアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体との反応性又は交差反応性のスクリーニングによって実現され得る。その手順は次のとおりである：抗体は、配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメント、融合ポリペプチド（例えば、ＭＢＰ、ＧＳＴ、又はＨｉｓ−タグ系の発現産物）、又は配列番号２〜２７のタンパク質又はその公知のバリアント又はフラグメントから誘導される合成ペプチドに対して特異的に惹生じる（raised）。特異的抗原性は、ウェスタンブロット、ドットブロット、及びＥＬＩＳＡを含む多くの方法に従って決定できる。一度特異抗体が生じると、この抗体は、抗体が生じてそれ故本明細書に規定される配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的に活性なそのフラグメント又はバリアントであるタンパク質を同定する、免疫原性ペプチドを固定するタンパク質をコードする核酸を同定するのに使用できる。本明細書に使用される特異的抗原性又は特異抗体とは、抗体は、抗体が生じた免疫原性ペプチドにだけ結合することを意味する。
更なる実施態様では、核酸は、配列番号１によって含まれる、又は配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的に活性なそのフラグメント又はバリアントをコードする核酸配列に相補性である。
１つの実施態様では、核酸は、グリセリマイシン生合成遺伝子クラスターの配列番号２〜２７又は機能的に活性なそのフラグメント又はバリアントに示されるポリペプチドをコードするＯＲＦ１〜２６から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ又はそれ以上のＯＲＦを含む。好ましい実施態様では、核酸は、（メチル）グリセリマイシンの生合成中に規定の工程に関与しそして一緒に機能する、特異的ＯＲＦ又は特異的ＯＲＦの組み合わせを含む。より好ましい実施態様では、（メチル）グリセリマイシンの生合成を統御する（manage）ポリペプチドをコードする、ＯＲＦ１〜２７から選択されるＯＲＦの組み合わせが提供される。尚より好ましい実施態様では、ＯＲＦはＯＲＦ８、１５又は１６であり、又はその組み合わせは、非リボソームタンパク質シンテターゼ（ＮＲＰＳ）のサブユニットをコードする、それぞれ、ｎｒｐｓ−１、ｎｒｐｓ−２及びｎｒｐｓ−３と呼ばれるＯＲＦ８、１５又は１６の少なくとも２つを含む。別の実施態様では、核酸は、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの生合成に必要な、それぞれ、ｍｐｓ−１、ｍｐｓ−２、ｍｐｓ−３及びｍｐｓ−４と呼ばれる遺伝子を構成するＯＲＦ１８、１９又は２１又はＯＲＦ１８〜２１の少なくとも２つの組み合わせ、又はそれぞれｍｐｓ−１、ｍｐｓ−２、及びｍｐｓ−４と呼ばれる遺伝子を構成するＯＲＦ１８、１９及び２１の少なくとも２つを含む。別の実施態様では、ＯＲＦ８、１５及び／又は１６は、Ｌ−トランス−４−メチルプロリン及び（メチル）グリセリマイシン、特にメチルグリセリマイシンの産生を向上させるために、ＯＲＦ１８、１９、２０及び／又は２１、又はＯＲＦ１８、１９及び／又は２１と組み合わされてよい。それにより、ＯＲＦ１〜２６のいずれも、（メチル）グリセリマイシンの合成を指示するためにＯＲＦ１〜２６のバリアント又はフラグメントのいずれかと組み合わされてよい。本発明の別の実施態様では、ＯＲＦは不変であり得て、しかし制御因子（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、エンハンサーなど）は修飾され得る。
別の実施態様では、核酸は、配列番号１の配列を有し、又はＯＲＦ１〜２６の少なくとも１つのバリアント又はフラグメントを固定し、それによってバリアント又はフラグメントは配列番号２〜２７のタンパク質の機能的に活性なバリアント又はフラグメントをコードする配列番号１のバリアント配列を有する、グリセリマイシン遺伝子クラスターを含んで又はそれから成るように提供される。他の非修飾状態において配列番号１の（メチル）グリセリマイシン遺伝子クラスター内でＯＲＦ１〜２６のいずれかのバリアント又はフラグメント配列は、（メチル）グリセリマイシンの合成経路の特定工程を修飾する配列番号２〜２７の１つ又はそれ以上のバリアントタンパク質をもたらし得る。これは、（メチル）グリセリマイシン又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの高産生、又は抗生物質活性の亢進した（メチル）グリセリマイシンの構造修飾をもたらし得る。例として、ＯＲＦ８、１５及び１６及び／又はＯＲＦ１８、１９、２０及び２１は、上記に言及したように配列番号１によって含まれるようなグリセリマイシンクラスター内で修飾されてよく、一方で残存ＯＲＦは非修飾で残る。代わりに又は加えて、制御因子は、修飾され得てＯＲＦ１〜２６の少なくとも１つの修飾発現をもたらす。
このように、本発明は、１つの実施態様において、ＯＲＦ１８、１９、２０及び２１又は別に指定されるＯＲＦ１８〜２１又はＯＲＦ１８、１９及び／又は２１及び／又はＯＲＦ８、１５及び／又は１６又は本明細書に規定されたようなこれらのＯＲＦの機能的に活性なバリアント又はフラグメントなどの、（メチル）グリセリマイシンの生合成に関与している少なくとも１つのＯＲＦを含む核酸を提供する。ＯＲＦの１つ又は組み合わせは、例えば、グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを内因的又は異種的に産生する生物におけるグリセリマイシン及び特にメチルグリセリマイシンの産生を向上させるための発酵補助として使用され得る、それぞれのタンパク質の産生を可能にするために、異種細胞中に発現又は過剰発現され得る。あるいは、発明によって含まれるようなＯＲＦ又はＯＲＦの組み合わせは、（メチル）グリセリマイシンの産生を向上させ及び／又はメチルグリセリマイシンの産生を有利にするために、それぞれの１つ又は複数のタンパク質の産生を向上させるために、（メチル）グリセリマイシンを産生する細胞又は生物中に発現又は過剰発現される。例えば、ＯＲＦ１８〜２１又はＯＲＦ１８、１９及び２１は、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの合成を可能にするように同時に発現されてよい。Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの高産生は、４−メチルプロリンを供給することにより実証され得るようなグリセリマイシンの産生に対するメチルグリセリマイシンの産生を向上させるのに役立ち得て、それによって５倍高い量のメチルグリセリマイシンが得られた。このように、本発明の好ましい実施態様では、メチルグリセリマイシンの収量は、当技術分野において公知の又は明細書に記載の方法に従って、ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３で、又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの生合成に関与する遺伝子、特にＯＲＦ１８〜２１、更に特にＯＲＦ１８、１９及び２１を含む、そして上記遺伝子及び（メチル）グリセリマイシン遺伝子クラスターの遺伝子を発現することを可能にする核酸を導入することにより、（メチル）グリセリマイシンを産生する他の生物で向上できる。代わりに又は加えて、少なくとも１つのｎｒｐｓ核酸（ＯＲＦ８、１５及び／又は１６）は、異種生物において又はその発現を向上させるために（メチル）グリセリマイシンを内因的に発現する生物において、（メチル）グリセリマイシンの合成のために発現され得る。代わりに又は加えて、（メチル）グリセリマイシンの合成を向上させるために、（メチル）グリセリマイシンの合成を有利にするために、又は例えば、より効率的な抗生物質である（メチル）グリセリマイシンと異なるアミノ酸組成の（メチル）グリセリマイシンの誘導体を生成させるために、（メチル）グリセリマイシンの合成を調節するバリアント核酸が発現され得る。例えば、ＮＲＰＳタンパク質のＡドメインのアミノ酸特異性は、突然変異誘発により又はペプチドシンテターゼ間のドメインスワッピングによって変更し得て、それにより種々のアミノ酸の選択を可能にし、そして天然（メチル）グリセリマイシンの誘導体を生成させる。あるいは、ＮＲＰＳのモジュール８のＡドメインをコードする核酸は、新生ポリペプチド鎖へのＬ−トランス−４−メチルプロリンの挿入向上をもたらす、バリアント核酸を産生するように変異され得て、このように野生型と比べてメチルグリセリマイシンの高産生をもたらす。あるいは、完全モジュール８は交換され得て、又はモジュール８のＣドメインは好ましくはメチルプロリンを縮合するように交換され又は変異され得る。
Ｌ−トランス−４−メチルプロリンは、グリセリマイシンによって２及び５位置でそしてメチルグリセリマイシンによって２、５及び８位置で含まれる。Ｌ−トランス−４−メチルプロリンは化学的に産生できる、しかしながら、化学的産生は高コストで時間がかかる。このように、本発明は、１つの態様では、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの生合成に関与している遺伝子、特に本明細書に規定されたようなＯＲＦ１８〜２１又はＯＲＦ１８、１９及び２１又はこれらのＯＲＦの機能的に活性なバリアント又はフラグメントを含む核酸を提供する。これらのＯＲＦの組み合わせは、グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを内因的又は異種的に産生する生物におけるグリセリマイシン及び特にメチルグリセリマイシンの産生を向上させる、例えば発酵補助として使用のためのＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生を可能にするために、異種細胞中に発現又は過剰発現され得る。あるいは、これらの遺伝子の組み合わせは、メチルグリセリマイシンの産生を有利にするために、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの産生を向上させるために、（メチル）グリセリマイシンを天然に産生する細胞又は生物中に発現又は過剰発現される。このように、本発明の好ましい実施態様では、メチルグリセリマイシンの収量は、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの生合成に関与する遺伝子、特にＯＲＦ１８〜２１、更に特別にはＯＲＦ１８、１９及び２１を含む核酸を、内因的又は異種的にグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを産生する生物、例えば当技術分野において公知の又は明細書に記載の方法に従って、例えばストレプトミセスＤＳＭ２２６４３に導入することによりストレプトミセスＤＳＭ２２６４３中で向上することができ、そして上記遺伝子及びグリセリマイシン生合成遺伝子クラスターの遺伝子を発現することを可能にする。
本発明の核酸は当技術分野で公知のいずれの方法によっても提供され得る。本明細書において提供される配列情報を用いて、１つ又はそれ以上のＯＲＦの増幅／単離に適切なプライマーは、当業者に周知の標準法に従って決定できる。本明細書に規定されたようなＯＲＦのいずれか１つ又はそれ以上の増幅／単離に適切なプライマーは、配列表に与えられているヌクレオチド配列情報に従って設計される。その手順は次のとおりである：１０〜４０、好ましくは１５〜２５ヌクレオチドから成り得るプライマーが選択される。効率的なハイブリダイゼーションを確実にするのに十分な割合でＣ及びＧヌクレオチド；即ち、総ヌクレオチド含量の少なくとも４０%、好ましくは５０％のＣ及びＧヌクレオチド量を含有するプライマーを選択することが有利である。通常そのような増幅は、必要な遺伝子を含有する生物（例えばストレプトミセス属、特にストレプトミセスＤＳＭ２２６４３）のＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として利用するであろう。０．５〜５単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／１００μｌ、好ましくは当量濃度で各２０〜２００μＭデオキシヌクレオチド、総デオキシヌクレオチド濃度にわたって０．５〜２．５ｍＭマグネシウム、１０５〜１０６標的分子、及び約２０ｐｍｏｌの各プライマーを、通常含有する、標準ＰＣＲ反応が実施されよう。約２５〜５０ＰＣＲサイクルが行われる。よりストリンジェントなアニーリング温度は、不正確にアニールされたプライマーに対する識別を改善し、そしてプライマーの３’末端における誤ったヌクレオチドの組込みを減少させる。より高い温度がＧ＋Ｃ豊富な標的の変性に適当であり得るが、９５℃〜９７℃の変性温度が標準的である。実施サイクル数は標的分子の開始濃度によって決まるが、通常４０より大きいサイクルは、非特異バックグラウンド産物が蓄積する傾向にあることから推奨されない。本明細書に規定されたようなバリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検索する別の方法は、本明細書に規定されたようなプライマー及びプローブを用いてＤＮＡ又はＲＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによる。ハイブリダイゼーション手順は周知であり、当技術分野において及び本明細書に記載されている。
代わりに又は上記に加えて、核酸は、クローニングによってもたらされてよく、そしてそれにより細胞中にそれを導入し増幅させ得る。このように、本発明の更なる態様では、本明細書に規定されたような核酸を含むベクター及び発現ベクターで形質転換された宿主細胞がもたらされる。遺伝子をレシピエント細胞に導入する手順は形質転換と呼ばれる。遺伝子は当技術分野で公知の様々な手段によって細胞中へ導入されそして各細胞型に適合され得る。用語「細胞」又は「宿主細胞」は、原核細胞であるか又は真核細胞であるかそして細胞がそれぞれの遺伝子を自然に発現するか否かに関係なく、遺伝子が発現される細胞を言う。好ましい実施態様では、それにより細胞は、本発明によって含まれるようなタンパク質を発現する遺伝子を自然に固定する細胞、例えばストレプトミセスＤＳＭ２２６４３であり得る。核酸分子を導入及び発現するための当技術分野で周知の組換ＤＮＡクローニング技術は、細胞がそれぞれの遺伝子を固定する場合は内因性であるか、又は遺伝子が細胞に内因性ではない場合は異種である、遺伝子を導入及び発現するのに使用できる。細胞は、ウイルス又はバクテリオファージに基づくベクター、化学薬剤、エレクトロポレーション、ＤＮＡのリン酸カルシウム共沈殿又は直接拡散を含む、いずれかの適当な手段を用いて形質転換できる。ベクターは内因性又は異種遺伝子を細胞へ輸送する作用物質（agent）であり、そしてプロモーターなどの適当な転写及び翻訳制御シグナルを含んでよい。ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えばバクテリオファージ）又は当技術分野で公知の他のものであってよい。ベクターは宿主細胞中で自律的に複製することができ、又は染色体ＤＮＡへ組み込むことができる。用語「ベクター」は、主として細胞中へヌクレオチドの挿入のために機能するもの、主として細胞中で核酸の複製のために機能するもの(複製ベクター)、又は主として細胞中でＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能するものを含む。ベクターの例は、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（すべてBoehringer Mannheim製）、ｐＫＫ２６３−２（Pharmacia製）、ｐＧＥＸ（Pharmacia製）、ｐＳＥ２８０（Invitrogen製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Promega製）、ｐＱＥ−８（Qiagene製）、ｐＥＴ−３（Novagen製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ （Stratagene製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−） （Stratagene製）、ｐＴｒＳ３０ [大腸菌JM109/pTrS30から調製 （FERM BP-5407）]、ｐＴｒＳ３２ [大腸菌JM109/pTrS32から調製(FERM BP-5408)]、ｐＳＴＶ２８ （Takara Bio Inc. 製）、ｐＵＣ１１８ （Takara Bio Inc. 製）、ｐＨＷ１５２０（MoBiTec製）、ｐＳＥＴ１５２、ｐＯＪ４３６及びｐＯＪ４４６（Bierman M, et al., 1992）、ｐＳＨ１９ （Herai S, et al., 2004）、ｐＵＷＬ１９９、ｐＵＷＬ２１８及びｐＵＷＬ２１９（Wehmeier U. F.,1995）及びｐＩＪ６０２１（Takano E. et al., 1995）を含む。
プロモーターは、誘導型又は構成的、全般的又は細胞特異性、核酸又は細胞質特異的、異種性又は事実上遺伝子関連性であってよい。いずれのタイプのプロモーターもそれが宿主細胞内で機能する限り使用できる。プロモーターの例は、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター又はＰＳＥプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、及びｐｅｎＰプロモーターなどの大腸菌又はファージ由来のプロモーターを含む。また、連続した（in series）２つのＰｔｒｐ（Ｐｔｒｐ*２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター又はｌｅｔＩプロモーターを置くことによって形成されるプロモーターなどの人工的に設計された又は修飾されたプロモーターもまた使用できる。その上、バチルス属のバクテリア中での発現のためのｘｙｌＡプロモーター、又はコリネバクテリウム属のバクテリア中での発現のためのＰ５４−６プロモーターもまた使用できる。更に有用なプロモーターは、ＰｅｒｍＥ(Bibb et al., 1985), ＰｅｒｍＥ* (Bibb et al., 1994)、ＰｔｉｐＡ (Murakami et al., 1989)、ＰｎｉｔＡ−ＮｉｔＲ発現系(Herai et al., 2004) 及びａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４／ＰａｃｔＩアクチベータプロモーター系(Ferna´ndez-Moreno et al., 1991)である。プロモーター、ベクター及び他のエレメントの選択は、ルーチンデザインの事項である。多くのそのようなエレメントは文献に記載されおり、そして商業サプライヤを通して入手可能である。単一遺伝子は細胞中へ導入することができる。また１つより多い遺伝子も細胞中に導入でき、そしてその中で発現できる。大クラスターが発現されようとする場合、ファージミド、コスミド、Ｐ１、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＨＡＣ、又は類似のクローニングベクターが使用される。１つより多い遺伝子が細胞中へ導入される場合、その時遺伝子は同じプロモーター及び／又は調節エレメントの制御下になり得る。あるいは、遺伝子は異なるプロモーター及び／又は調節エレメントの制御下になり得る。通常、転移（transfer）の方法は細胞への選択可能マーカーの転移を含む。一般に、細胞株は、上記のいずれの手段によって形質転換され、ここで導入遺伝子は選択可能マーカーに動作可能に連結される。形質転換に続いて、細胞は適合期間の間増殖される。形質転換細胞は選択に対して抵抗を示し、そして増殖できるが、一方で非形質転換細胞は一般に死滅する。選択マーカーの例は、それぞれ、ピューロマイシン、ゼオシン、ネオマイシン及びピューロマイシン、ゼオシン、アミノグリコシドＧ−４１８及びヒグロマイシンＢ、それぞれに対して耐性を与えるヒグロマイシンＢを含む。
本発明の文脈において適切な宿主細胞の例は、組換グリセリマイシン生合成遺伝子クラスター又はグリセリマイシン生合成遺伝子クラスターの１つ又はそれ以上の遺伝子を固定しそして発現する能力を備えるいずれかの生物から由来する。例は、限定されるものではないが、大腸菌株の、ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３又はストレプトミセスセリカラーなどのストレプトミセス種などの放線菌目の、サッカロミセスセレビシエなどの酵母株の、スポドプテラフルギペルダからのような昆虫細胞株鱗翅目の、植物細胞の又はＬ６細胞、３Ｔ３脂肪細胞、ＨＥＫ２９３、７４５−Ａ、Ａ−４３１、心房筋細胞、ＢｘＰＣ３、Ｃ５Ｎ、Ｃａｃｏ−２、Ｃａｐａｎ−１、ＣＣ５３１、ＣＦＰＡＣ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１、ＥＡＨＹ、ＥＡＨＹ９２６などの哺乳動物細胞のような、バクテリア、酵母、糸状菌、動物細胞及び植物細胞を含む。好ましい実施態様は、ストレプトミセスＤＳＭ２６６４３又はストレプトミセスセリカラー細胞などの放線菌目の細胞、又は大腸菌株の細胞などの細菌細胞である。特に好ましい実施態様は、放線菌目、特にストレプトミセスＤＳＭ２２６４３の細胞である。
上記のように、本発明によって含まれるような遺伝子を固定しそして発現するための好ましい宿主細胞は、細菌細胞である。本発明によって含まれるような遺伝子を固定しそして発現するのに適切な他の宿主細胞は、テロメラーゼ遺伝子の人工発現などの、ランダム突然変異か又は意図的修飾かを通して無限に増殖する能力を獲得している樹立又は固定化細胞株である。特定の細胞型を代表する多数の安定樹立細胞株が存在し、そして適切な細胞株を選択することは当業者にとって周知の範囲内である。細胞株は、単一の共通原細胞から由来し、そしてそれ故に遺伝的に同一である、培養で増殖する細胞集団である。本発明の適切な細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞（初代ヒト胚性腎臓）、３Ｔ３細胞（マウス胚性線維芽細胞）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル細胞株）、ＨｅＬａ細胞（ヒト類上皮子宮頚癌）、ＪＵＲＫＡＴ細胞（ヒトＴ細胞白血病）、ＢＨＫ２１細胞（ハムスター正常腎臓、線維芽細胞）、及びＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌）である。
あるいは、本明細書に規定されたような核酸は、組織培養でクローニングされそして発現され得る。用語「組織培養」は、３次元ネットワークを形成する細胞群がインキュベートされる方法をいう。組織は細胞自体によって培養物中で形成できて、又は細胞で産生される細胞外マトリックスによって形成され得て、培養物は天然又は人工細胞外マトリックス（例えばコラーゲン、エラアスチン、ポリスチレン、ナイロン、ポリリジン）上でインキュベートされ得て、又は組織はヒトを含む動物から取得され得る。組織培養は培地中でそして適切な温度でインキュベートされ得る。培地は栄養分（例えば、糖、塩、アミノ酸、及び脂質）、緩衝系（しばしばリン酸塩、リン酸水素及び／又は低又は非毒性のトリス及び／又は二酸化炭素（ＣＯ2）ガス処理（gassing）などの１つ又はそれ以上の化学的緩衝物質を含む）、及び／又は場合により１つ又はそれ以上の抗生物質を含有し得る。十分量の栄養分を与え及び／又は代謝物を除くために、培地は必要に応じて交換され得る。場合により、組織培養は培地で潅流され得る。潅流は恒久的又はパルス潅流であってよい。
バリエーションは、デザインによって、例えば、特定のやり方で核酸内のヌクレオチドの修飾により、例えば単一置換基をその他と置換することによって核酸中に導入し、そしてそれによりグリセリマイシンの部分的又は完全人工生合成遺伝子クラスターをもたらし得る。更なる例として、当業者は、新しい生物学的機能及び事実上見出されていないシステムのデザイン及び構築に取り組む「合成生物学」と呼ばれる技術の分野を知る。例えば、当業者は、インシリコ（in silico）のＤＮＡ配列をデザインすること、そしてそれを野生型配列の核酸レベルに類似性がないように合成すること、しかしながら、野生型配列と同じ１つ又は複数のタンパク質をコーディングすることができる。あるいは、バリエーションは、例えば、生合成経路において１つ又はそれ以上のＯＲＦを体系的に又は偶然に置換することにより、（メチル）グリセリマイシンの分子バリアントのライブラリーを作ることによってランダムに作ることができる。その上、自然には発生しない核酸の有用なバリアント及びフラグメントが公知方法を用いてデザインされる。そのようなバリエーションは、上記に概説されたようないずれの修飾、例えば、１つの置換基の別物による置換であってよい。例えば、アミノ酸配列の変化及び／又は欠失を許容するように見えるポリペプチドの領域が同定される。例として、（メチル）グリセリマイシンを産生する異なった種類からの（メチル）グリセリマイシンの合成に関与するバリアントポリペプチドが比較され；保存配列が同定される。より発散性の（divergent）配列は、最も配列変化を許容するようである。配列の間の相同性は当技術分野で公知の方法を用いて解析し得る。核酸への突然変異導入方法は、誤りがちなＰＣＲ、部位特異的変異誘発、ヒドロキシルアミンを用いた方法、又はＵＶなどの変異剤が関心のある核酸を有する細胞に作用することを可能にする方法を含む。誤りがちなＰＣＲが使用されるとき、例えば、関心のある核酸が組み込まれているプラスミドは鋳型として使用され、ＰＣＲ反応はマンガン（Ｍｎ）塩濃度が通常のＰＣＲ反応におけるよりも高い反応溶液中で行われる。
本明細書で提供される情報を用いて、所望の配列をクローニングする他のアプローチは当業者に明白には明らかであり、例えば、ＯＲＦ１〜２６を含む全グリセリマイシン生合成遺伝子クラスター、及び／又は場合により関心のあるＮＲＰＳモジュール又は酵素ドメインをコードする核酸を含む、ＯＲＦ１〜２６の少なくとも１つは、例えば１つ又は複数の遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、又は同じものを含むことが知られているベクターから１つ又は複数の遺伝子を誘導することによる、などの組換方法を用いて、そのようなものを発現する、生物から得ることができる。１つ又は複数の遺伝子又はクラスターは次いで単離できて、そして標準的な技術を用いて他の所望の生合成エレメントと組み合わすことができる。問題の、１つ又は複数の遺伝子又はクラスターが、適切な発現ベクター中に既に存在している場合、それ（それら）は例えば要求により他のドメイン又はサブユニットと原位置で組み合わすことできる。関心のある１つ又は複数の遺伝子は、クローニングされるよりもむしろ合成的に産生することができる。ヌクレオチド配列は、所望の特定アミノ酸配列のための適当なコドンでデザインできる。一般に、配列が発現されるであろう所定の宿主のための好ましいコドンを選択し得る。またなお、カスタム遺伝子合成は市販されている。
別の態様では、本発明は、配列番号２〜２７又は機能的に活性なそのフラグメント又はバリアントから選択される、又は上記のような核酸によってコードされた少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質を対象としている。タンパク質は単一タンパク質であってよく又はタンパク質の混合物であってよく、又は配列番号２〜２７の少なくとも２つのタンパク質の融合タンパク質であってよい。タンパク質は分離されてよく、それは実質的に純粋でそして事実上それが関連している成分と関連していないこと、又はタンパク質はタンパク質を産生する細胞の溶解物中に存在することを意味する。配列番号２〜２７のタンパク質は、それぞれ推定ＯＲＦ１〜２６によってコードされる。これらのＯＲＦはグリセリマイシン生合成遺伝子クラスターに属しそしてそれを構成する。配列解析及び相同性検索に基づいて、本発明者らは、グリセリマイシン生合成遺伝子クラスターを同定することに、遺伝子クラスター内の特定の推定ＯＲＦを同定することに、そして同定されたＯＲＦを特異的タンパク質機能及び／又は公知の又は仮説のタンパク質をコードする特異的相同性ヌクレオチド配列に帰属させることに成功した。
半発明によって含まれるタンパク質は、配列番号１の配列のストレプトミセスＤＳＭ２６６４３のグリセリマイシン生合成遺伝子クラスターによってコードされるような配列番号２〜２７のタンパク質を包含し、そしてオルソログ又はホモログである（メチル）グリセリマイシンを産生し、それによりこれらのオルソログ又はホモログはストレプトミセスＤＳＭ２６６４３の配列番号２〜２７のタンパク質と同じ機能を有する、他のストレプトミセス種及び株並びに非ストレプトミセス種にそれらが生じるようなタンパク質を包含する。好ましくは、そのオルソログ又はホモログは、例えばアミノ酸の付加、欠失、置換及び／又は挿入により配列番号２〜２７の配列と異なり、そして５０％より大きい、６０％より大きい、７０％より大きい、好ましくは８０％より大きい、より好ましく８５％より大きい、尚更に好ましくは９０％より大きい、尚更に好ましくは９５％より大きい、最も好ましくは９７％より大きい、配列番号２〜２７と配列同一性を有し、及び／又は配列番号２〜２７のタンパク質の活性の、５％より大きい、１０％より大きい、２０％より大きい、３０％より大きい、４０％より大きい、５０％より大きい、６０％より大きい、７０％より大きい、８０％より大きい、９０％より大きい、９５％より大きい、９７％より大きい又は１００％より大きい、例えば１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％より大きい酵素活性を有する。
本発明の文脈では、本発明によって含まれるような配列番号２〜２７のタンパク質の天然又は非天然産バリアントは、それが配列番号２〜２７の参照タンパク質の生物学的機能、即ち参照タンパク質が、配列番号２〜２７のタンパク質の機能を開示するそれぞれの章に記載のように自然条件下（非天然バリアントの場合には、参照タンパク質の生物学的機能）に関与し、そして本明細書に規定されたようなようにそれと置換されることができる、反応における関与を維持する点において、機能的に活性なタンパク質である。
配列番号２〜２７のタンパク質又はその天然産バリアントの非天然産バリアントは、限定数のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換、特に例えば最大限で１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１の１つ又は複数のアミノ酸の欠失、挿入及び／又は置換によって得られ得て、それにより例えば上記の配列番号２〜２７に対してそれぞれの野生型タンパク質の配列同一性又は活性を得る。
バリアントは、更なる成分を含む修飾タンパク質又は修飾タンパク質バリアントであってよい。従って、バリアントは、本明細書に規定されたような配列番号２〜２７の天然産タンパク質又はそのバリアント及び少なくとも１つの更なる成分から構成されるドメインを有する分子であってよい。１つの好ましい実施態様では、バリアントは、（ｉ）配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的に活性なバリアント及び（ｉｉ）更なるタンパク質又はペプチド成分を含む融合タンパク質であってよい。例えば、タンパク質は精製目的で使用されるタグ（例えば６Ｈｉｓ（又はＨｅｘａＨｉｓ）タグ、連鎖球菌タグ、ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグ又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ）などのマーカーに結合され得る。例えば配列番号２〜２７又はバリアントの高純度タンパク質が要求され得る場合、二重又は多重マーカー（例えば上記マーカー又はタグの組み合わせ）が使用され得る。この場合、タンパク質は２つ又はそれ以上の分離クロマトグラフィー工程で精製され、いずれの場合にも第１及び次いで第２のタグの親和性を利用する。そのような二重又はタンデムタグの例は、ＧＳＴ−Ｈｉｓ−タグ（ポリヒスチジン−タグに融合されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、６ｘＨｉｓ−連鎖球菌−タグ（連鎖球菌−タグに融合された６ヒスチジン残基）、６ｘＨｉｓ−タグ１００−タグ（哺乳動物ＭＡＰ−キナーゼ２の１２−アミノ酸タンパク質に融合された６ヒスチジン残基）、８ｘＨｉｓ−ＨＡ−タグ（ヘマグルチニン−エピトープ−タグに融合された８ヒスチジン残基）、Ｈｉｓ−ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質に融合されたＨｉｓ−タグ）、ＦＬＡＧ−ＨＡ−タグ（ヘマグルチニン−エピトープ−タグに融合されたＦＬＡＧ−タグ）、及びＦＬＡＧ−連鎖球菌−タグである。マーカーはタグ付きタンパク質を検出するために使用され得て、ここで特異抗体が使用され得る。適切な抗体は、抗−ＨＡ（１２ＣＡ５又は３Ｆ１０など）、抗−６Ｈｉｓ、抗−ｃ−ｍｙｃ及び抗−ＧＳＴを含む。更に、タンパク質は、本発明によって含まれるようなタンパク質の検出を可能にする、緑色蛍光タンパク質などの蛍光マーカーなどの異なるカテゴリーのマーカー、ストレプトアビジンのような結合タンパク質、Ｃｙ色素のような１つ又はそれ以上の小分子色素、又は放射性マーカーに連結され得る。更なる実施態様では、配列番号２〜２７のタンパク質は融合タンパク質の一部であり得て、ここで第２の部分は酵素活性を有するタンパク質成分などの、検出に使用され得よう。
本発明の別の実施態様では、配列番号２〜２７のタンパク質のバリアントはフラグメントであってよく、ここでフラグメントは尚機能的に活性である。これは、短い内部及び／又はＣ−及び／又はＮ−末端欠失（例えばバリアント内及び／又はＣ−及び／又はＮ−末端で最大限でも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１のアミノ酸の欠失、又は５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％アミノ酸又はこれらの値間のいずれかの値の全欠失）を持つ上記に詳述したような配列番号２〜２７のタンパク質又はそのバリアントを含んでよい。加えて、フラグメントは配列番号２〜２７のためにタンパク質で上記に詳述したように更に修飾され得る。
代わりに又は加えて、上記のような配列番号２〜２７のタンパク質又はそのバリアントは、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでよい。しかしながら、アミノ酸が化学的関連アミノ酸で置換される、半保存及び特に保存アミノ酸置換が好ましい。代表的置換は、脂肪族アミノ酸間で、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間で、酸性残基を有するアミノ酸間で、アミド誘導体間で、塩基性残基を有するアミノ酸間で、又は芳香族残基を有するアミノ酸間である。代表的半保存及び保存アミノ酸置換は次のようである；
Figure 2014530609
Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＹからＣへの変化は、新しいシステインが遊離のチオールとして残っている場合は、半保存的である。更に、当業者には当然のことながら、立体的要求位置でのグリシンは置換され得ず、そしてＰはαラセン又はβシート構造を有するタンパク質の部分に導入され得ない。置換を持つ配列番号２〜２６のタンパク質又はそのフラグメント又はバリアントは、配列番号２〜２７のタンパク質又はそのフラグメント又はバリアントで上記の詳細のように修飾され得る。
なお、配列番号２〜２７のタンパク質の上記修飾は組み合わせられてよい。本発明のバリアントは、例えばそれに融合されたマーカーを有し又は１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含む配列番号２〜２７のタンパク質のフラグメントであってよい。更になお、配列番号２〜２７のタンパク質のいずれもが、配列番号２〜２７のタンパク質のバリアント又はフラグメントのいずれとも組み合わされてよい。
本発明によって含まれるようなタンパク質は、例えば、自然源からタンパク質を得ることにより、当技術分野で周知のバイオテクノロジー法により及び／又は合成法により、いずれの手段によっても提供され得る。本明細書における用語「提供すること」は最も広い意味において理解されてよく、そして限定されるものではないが、タンパク質又は他の産物を得るのに使用され得る当技術分野で公知の生化学又はバイオテクノロジー手段を含んでよい。従って、タンパク質はストレプトミセス種、特にストレプトミセスＤＳＭ２６６４３などのタンパク質を含有する微生物などの自然源から抽出によって得られてよい。当業者はタンパク質の単離法を知っている。本発明によって含まれるようなタンパク質を自然に固定する細胞は、限定されるものではないが、超音波処理、低張緩衝液、界面活性剤、UltraTurrax、French press、凍結融解サイクル、機械的均質化及びスクラッチングなど当技術分野で公知のいずれの手段によっても破壊され得る。関心のあるタンパク質は次いで、公知の方法、例えば溶媒抽出法、塩析法、溶媒沈殿方法、透析法、超音波法、ゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及びアフィニティクロマトグラフィー、必要に応じて単独か又は組み合わせて単離され得る。
あるいは、本発明によって含まれるようなタンパク質は、組換法によって、例えば本発明によって含まれるようなタンパク質又はその機能的フラグメント又はバリアントをコードする核酸をクローニングしそして発現すること、及びタンパク質を分離することにより、産生されるタンパク質であってよい。
タンパク質は単離を容易にするのに便利なマーカーで発現され得る。マーカー（又はタグ又はラベル）は、別の物質又は物質の複合体の存在を示すことができるいずれの種類の物質でもよい。マーカーは検出されようとする物質に結合している又は導入されている物質であってよい。検出可能なマーカーは、例えば、タンパク質、酵素反応の産物、セカンドメッセンジャー、ＤＮＡ、分子の相互作用などを検出するために分子生物学及びバイオテクノロジーにおいて使用される。適切なマーカー又はラベルの例は、フルオロフォア、発色団、放射性ラベル、金属コロイド、酵素、又は化学発光又はバイオ発光分子を含む。フルオロフォアの例は、フルオレセイン、ローダミン、及びスルホインドシアニン色素Ｃｙ５を含む。放射性ラベルの例は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、99mＴｃ又は125Ｉを含む。酵素の例は、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、及びウレアーゼを含む。
機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントを含む本発明のタンパク質は、細胞中に単独で発現できて、又は少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上のタンパク質などの、本発明によって含まれるような機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントを含む幾つかのタンパク質は、細胞中に同時に発現できる。同様に、全グリセリマイシン生合成遺伝子クラスターは異種発現され得る。それにより、バリアント及び非バリアントタンパク質のいずれの組み合わせも含まれる。１つの実施態様では、ｎｒｐｓ−１、ｎｒｐｓ−２及び／又はｎｒｐｓ−３遺伝子によってコードされる非リボソームタンパク質シンテターゼなどのタンパク質の、又はメチルプロリン合成遺伝子ｍｐｓ−１、ｍｐｓ−２、ｍｐｓ−３及びｍｐｓ−４又はｍｐｓ−１、ｍｐｓ−２及びｍｐｓ−４によってコードされるタンパク質などの、同じファミリーに属するものなどの（メチル）グリセリマイシン合成経路のある態様に寄与する幾つかのタンパク質は、細胞中で一緒に発現され得る。それにより、（メチル）グリセリマイシンの合成の特異的工程は、（メチル）グリセリマイシン及び特にメチルグリセリマイシンの産生が向上させるのに特に好ましい。あるいは、（メチル）グリセリマイシンの合成経路そしてそれ故（メチル）グリセリマイシンの合成の特定の態様に影響を及ぼす、バリアントが産生され得る。例は、配列番号９、１６及び１７、特に配列番号１６、より特別にはＬ−トランス−４−メチルプロリンのメチルグリセリマイシンへの挿入を促進する配列番号１６及び／又は配列番号１９、２０及び２２のモジュール８、及びおそらくメチルグリセリマイシンがそのようなバリアントを使用しない場合よりもより高い収量で産生されるように、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの合成を向上させる配列番号２１の１つ又はそれ以上のタンパク質のバリアントである。１つ又はそれ以上のバリアントは、配列番号２〜２７の１つ又はそれ以上の非バリアントタンパク質と組み合わされてよい。
本発明の更なる態様では、配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的に活性なそのフラグメント又はバリアントの少なくとも１つに対する抗体が提供される。タンパク質の検出は、しばしば特異抗体の使用を含む。従って、配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的なそのバリアント又はフラグメントの少なくとも１つの検出は、特異抗体を含んでよい。抗体は、調製型の抗原を用いて動物を免疫感作するために安定樹立技術を用いて生じさせることができる。様々な試薬が抗体産生及び精製を補助するのに利用でき、そして種々の会社は抗体製造サービスを専門にしている。実施されようとする適用に応じて、異なるレベルの純度及び特異性のタイプが供給される一次抗体で必要となる。２〜３のパラメータを挙げると、抗体は、抗血清又はアフィニティ精製溶液として供給され、そして天然タンパク質又は変性タンパク質検出のために検証される、モノクローナル又はポリクロナールであり得る。それらは、キメラ、ヒト化、多機能性、二重特異性及びオリゴ特異性抗体であり得る。本発明によって含まれるような抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2又はｓｃ（単鎖）Ｆｖなどの全抗体又は抗体フラグメントを含んでよい。
標的抗原を認識する抗体、ここでは配列番号２〜２７のタンパク質又は機能的なそのバリアント又はフラグメントは、「一次抗体」と呼ばれる。この抗体がタグで標識化される場合、抗原の直接検出が可能である。しかしながら、通常一次抗体は直接検出のために標識化されない。その代わりに検出可能タグで標識化されている「二次抗体」が、標的抗原に結合されている一次抗体を探るために二次工程で適用される。このように、抗原は間接的に検出される。別の形態の間接検出は、ビオチンなどのアフィニティタグで標識化される一次又は二次抗体を用いて関与する。次いで、検出可能酵素又はフルオロフォアタグで標識化されるストレプトアビジンなどの二次（又は三次）プローブは、検出可能シグナルを生み出すためにビオチンタグを探るのに使用できる。これらのプロービング及び検出方法の幾つかのバリアントが存在する。しかしながら、各々は、その存在がある種の測定可能タグ（例えば、その活性がその基質との反応時に着色産物を産生することができる酵素）に直接又は間接に結合する（link）特異的プローブ（例えば一次抗体）によって決まる。
本発明の更なる態様では、核酸を固定する発現ベクターの、又は（メチル）グリセリマイシンの産生のための該発現ベクターを固定する宿主細胞の、フラグメント又はバリアントを含む、本明細書に規定されるような核酸又はタンパク質の使用が提供される。特に、ＯＲＦ８、１５及び１６を含む少なくとも１つの核酸の、又は（メチル）グリセリマイシンの産生のためのフラグメント又はバリアントを含む、配列番号９、１６及び１７の少なくとも１つのタンパク質の使用が提供される。好ましくは、ＯＲＦ８、１５及び１６を含む核酸の、又は配列番号９、１６及び１７のタンパク質の組み合わせが提供される。用語「核酸」、「タンパク質」、「ＯＲＦ８、１５及び１６」及び「配列番号９、１６及び１７のタンパク質」に関して、それは本発明の核酸及びタンパク質の文脈において供される定義を言う。
本発明の更なる態様では、ＯＲＦ１８、１９及び２１を含む少なくとも１つの核酸の、又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生のためのフラグメント又はバリアントを含む、配列番号１９、２０及び２２の少なくとも１つのタンパク質の使用が提供される。好ましくは、ＯＲＦ１８、１９及び２１を含む核酸の、又は配列番号１９、２０及び２２のタンパク質の組み合わせが提供される。ＯＲＦ１８、１９及び２１及び配列番号１９、２０及び２２のタンパク質に関して、それは本発明の核酸及びタンパク質の文脈において供される定義を言う。（メチル）グリセリマイシン又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生方法に関して、ＯＲＦ１〜２６のバリアントを決定する文脈においてその定義を説明する。
本発明の別の態様では、本明細書に規定されたようなバリアント型及びフラグメントを含む核酸を発現すること、及びタンパク質又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントを選択的に単離することを含む、本明細書に規定されたようなタンパク質又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントの少なくとも１つを産生する方法が提供される。核酸をクローニング及び発現する、及びタンパク質を単離する方法は、当技術分野で公知でありそして本明細書に記載される。
本発明は、好ましい実施態様において、単離される上記の核酸又はタンパク質を言及する。ＤＮＡ又はＲＮＡなどの、核酸に関して本明細書で使用されるような用語「単離される」は、単離核酸が事実上見出されるポリヌクレオチドのすべて又は一部と関連しない核酸を言う。タンパク質に関して本明細書で使用されるような用語「単離される」は、その中に又はそれにより単離タンパク質が事実上見出される化合物のすべて又は一部と関連しないタンパク質を言う。単離核酸又は単離タンパク質は、自然のヒト配列又はタンパク質、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のヒトゲノム配列及びその他の種類の細胞物質を自然に伴う他の細胞成分から分離される。用語は、その自然発生的環境から除かれている核酸配列又はタンパク質を包含し、そして組換又はクローニングＤＮＡ単離体又はそれから誘導されそして化学的に合成されたアナログ又は異種系によって生物学的に合成されたアナログを含む。「単離核酸」は、その自然環境から除かれている、又はフラグメントとして自然発生的でないそして事実上見出されていない、核酸フラグメントを含むことを意味する。用語「単離される」はまた、他の細胞タンパク質から単離されるタンパク質を言い、そしてまた組換タンパク質を包含することを意味する。用語「単離される」は、核酸又はポリペプチド又はタンパク質が不純物をただ分離することによってその自然の要件から精製されることを意味する「精製される」を意味しない。
本発明の別の態様では、グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの産生を調節する、ＯＲＦ１〜２６の又は配列番号２〜２７のタンパク質のバリアントを決定する方法が提供される。この方法は、ＯＲＦ１〜２６のいずれかのバリアントを産生すること、バリアントをタンパク質中に発現すること、該バリアントタンパク質を用いてグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの又はその誘導体の産生を可能にすること、及びグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの量を決定することを含み、ここでバリアントタンパク質が存在しないで、しかしタンパク質の対応するインバリアント型が存在する場合の産生量に比べたグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの量の増加は、バリアントがグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの産生を増加させること、又はグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの誘導体の抗生物質活性を決定することができることを示し、ここでバリアントタンパク質が存在しないで、しかしタンパク質の対応するインバリアント型が存在する場合の抗生物質活性に比べた抗生物質活性の増加は、バリアントが抗生物質活性を増加したグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン誘導体を産生することができることを示し、そしてここで誘導体はグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンとアミノ酸組成が異なり、そしてグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを超えた抗生物質活性向上を示す。更なる態様では、発明は、ＯＲＦ１〜２６のいずれかのバリアントを産生すること、バリアントをタンパク質中で発現させること、前記バリアントタンパク質を用いてＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生を可能にすること、及びＬ−トランス−４−メチルプロリンの量を決定することを含む、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの産生を向上させる、ＯＲＦ１〜２６の又は配列番号２〜２７のタンパク質のバリアントを決定する方法を含み、ここでバリアントタンパク質が存在しないで、しかしタンパク質の対応するインバリアント型が存在する場合、量で比べたＬ−トランス−４−メチルプロリンの量の増加は、バリアントがＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生を増加させることができることを示す。
本明細書で使用されるように、用語「方法」、又は「アッセイ」は、最も広い意味で実験的活動（experimental activity）又は手順として理解され得る。それは、（メチル）グリセリマイシン又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生を調節又は向上することができる、ＯＲＦ１〜２６の又は配列番号２〜２７のタンパク質のバリアントを決定するのに使用され得るすべての手段として理解され得る。用語「ＯＲＦ１〜２６のバリアント」は、本明細書に規定されたような意味で、即ち配列番号２〜２７の１つ又はそれ以上のタンパク質のバリアントをコードする１つ又はそれ以上の核酸の置換、付加、挿入及び／又は欠失を持つＯＲＦ１〜２６のバリアントと理解され得るが、それはバリアントがグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン、特にメチルグリセリマイシンの、又はバリアントを固定する細胞によりＬ−トランス−４−メチルプロリンの収量を増加させること、又は（メチル）グリセリマイシンの組成を変化させることができるタンパク質をコードさせる限りであり、それで組成の変化した（メチル）グリセリマイシンは抗生物質活性向上を示す。適切なバリアントは、グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン、特にメチルグリセリマイシンの、又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの収量を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％又は少なくとも５００％増加させるバリアントである。あるいは、適切なバリアントは、抗生物質活性が少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％又は少なくとも５００％増加するように、（メチル）グリセリマイシンの組成を変化させるバリアントである。用語「グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンの産生を調節する」は、産生されたグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの量を増加させること又はグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン組成を変化させることを意味する。このように、１つ又は２つのアミノ酸又は更に多くのアミノ酸（例えば３つ又は４つのアミノ酸）、又は１つ又は２つ又はそれ以上のドメイン又は１つ又は２つ又はそれ以上のモジュールは、それぞれ別々のアミノ酸又はドメイン又はモジュールによって置換され、それによって得られたグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの誘導体は、向上された抗生物質活性を示す。例えば、ＮＲＰＳタンパク質のいずれかのモジュールのＡドメインをコードする核酸のバリアントは、向上された抗生物質活性を有し得る（メチル）グリセリマイシンの誘導体をもたらし得る、種々のアミノ酸の組込みをもたらし得る。用語「バリアントを産生すること」は、当技術分野におけるいずれの公知方法による又は本明細書に規定されたような産生を意味する。方法は、標的変異を導入することによる意図的変異核酸又はランダム変異核酸を含む。一度バリアント核酸が産生されると、バリアント核酸は細胞中に導入される。あるいは、バリアントは細胞に変異処理を適用することによって細胞内部で産生される。細胞はグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生のために遺伝子を自然に固定し得て、又は細胞はグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生のために異種系を含み得る。バリアントが細胞中に発現されようとする遺伝子は、好ましくは欠失又はその他の種類の突然変異によって不活性であり、又は細胞により不活性状態で含まれる。例えば、細胞は、試験しようとする１つ又はそれ以上のバリアント核酸、又はバリアントｎｒｐｓ遺伝子又はバリアントｎｒｐｓ遺伝子以外の別のバリアント遺伝子を含むｎｒｐｓ遺伝子、又はバリアントｍｐｓ遺伝子又はバリアントｍｐｓ遺伝子以外の別のバリアント遺伝子を含むｍｐｓ遺伝子などの、ＯＲＦ１〜２６からの核酸のセットを含む、ＯＲＦ１〜２６の核酸の各々を固定してよい。（メチル）グリセリマイシン又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの合成のためのタンパク質をコードする核酸を固定する細胞、及び１つ又はそれ以上のバリアント核酸は、（メチル）グリセリマイシン又はその誘導体又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの合成を可能にするために適当な条件下でインキュベートされる。好ましくは、（メチル）グリセリマイシン又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生は、中性ｐＨの水性緩衝液中で、より好ましくはｐＨ７前後のｐＨの緩衝液中で、尚より好ましくは、Ｌ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルトレオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−Ｎ−メチルロイシン及びグリシンなどのアミノ酸を含むｐＨ７の緩衝液中で行われ、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの産生のために、（メチル）グリセリマイシン又はＬ−ロイシンに組み込まれる。好ましくは、配列番号２〜２７のタンパク質及びバリアントタンパク質は使用緩衝液中でそれらの活性を維持し、そして好ましくはタンパク質及び基質の沈殿は禁じられる。場合により、サンプルはタンパク質活性に好適な温度で、好ましくは０〜５０℃間の温度で、より好ましくは１０〜４０℃間の温度で、尚より好ましくは２０〜４０℃間の温度で、最も好ましくは３７℃でインキュベートされ得る。あるいは、バリアント核酸は、例えば無細胞発現系で発現され、そして得られたタンパク質は次いで、（メチル）グリセリマイシン又はＬ−トランス−４−メチルプロリンを産生するためにタンパク質を固定する細胞に加えられる。
別の実施態様では、（メチル）グリセリマイシン又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの収量を向上させ、又は、（メチル）グリセリマイシンの組成を変更するＯＲＦ１〜２６のいずれかのバリアントを決定する方法は、インビトロで行われ得る。インビトロ（ラテン語：ガラス容器内で）で行われる手順は生体内では行われず、試験管内又はペトリ皿のような制御環境中で行われる。インビトロアッセイでは、反応に関与する成分は試験管内で組み合わされ、反応が進むことが可能となりそして産物が決定される。これが起こるために、本明細に記載のように産生したバリアント核酸は、細胞によるか又は無細胞翻訳法でそれぞれのバリアントタンパク質に転写及び翻訳され、タンパク質は精製され又は細胞溶解物（粗製、分画又は精製された）が使用され、そしてタンパク質は配列番号２〜２７によって含まれるような非バリアントタンパク質と一緒にアッセイに使用される。バリアントタンパク質が（メチル）グリセリマイシン合成経路内の確定工程にかかわる場合、例えばバリアントタンパク質がＮＲＰＳタンパク質のように（メチル）グリセリマイシンの合成を直接行うタンパク質に属する場合、インビトロアッセイは有用であり、そしてバリアント型を含むＮＲＰＳタンパク質だけが、ｍｐｓ遺伝子によってコードされるタンパク質のような（メチル）グリセリマイシンの又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの合成に関与し、そしてバリアント型を含むこれらのタンパク質だけがＬ−トランス−４−メチルプロリンの合成に関与する。インビトロアッセイでは、Ｌ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルトレオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−Ｎ−メチルロイシン及びグリシンなどのアミノ酸のような反応に関与する成分、及び試験しようとするバリアントを含む配列番号２〜２７のタンパク質の少なくとも１つは、時間の規定された定義、成分量、反応緩衝液組成、温度などの下で組み合わされ、（メチル）グリセリマイシン又はその誘導体又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの合成を可能にする。測定は関与タンパク質の活性に適切な分子環境で実施され得る。適切な条件は上記にその概略が説明される。
Ｌ−トランス−４−メチルプロリンのインビトロ合成では、Ｍｐｓ−１、Ｍｐｓ−２及びＭｐｓ−３を用いた３つのそれに続くアッセイが行われる。Ｍｐｓ−１にアッセイにおいて、Ｌ−ロイシンは５−ヒドロキシルロイシンに変換され、Ｍｓｐ−２アッセイにおいて、５−ヒドロキシルロイシンはγ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒドに変換され、そしてＭｓｐ−４アッセイにおいて、３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸は４−メチルプロリンに変換される。γ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒドの３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸への環化は自然に生じると推定される。場合により、Ｍｐｓ−３はこの環化反応に関与する。５−ヒドロキシルロイシンの産生のために、Ｍｐｓ−１アッセイは、基質、ロイシン又は関連化合物、及びＭｐｓ−１タンパク質を含む、中性ｐＨの水性緩衝液中で、より好ましくはｐＨ７前後のｐＨの緩衝液中で、尚更に好ましくはｐＨ７の緩衝液中で行われる。好ましくは、Ｍｐｓ−１タンパク質は使用緩衝液中でその活性を維持し、そして好ましくはタンパク質及び基質の沈殿は禁じられる。場合により、サンプルは、タンパク質活性に適切な温度で、好ましくは０〜５０℃間の温度で、より好ましくは１０〜４０℃間の温度で、尚より好ましくは２０〜４０℃間の温度で、最も好ましくは３７℃でインキュベートされ得る。通常、反応時間は、数分と数時間の間、好ましくは３０分〜２時間及びより好ましくは１時間である。好ましくは、γ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒドの産生のために、Ｍｐｓ−２アッセイは、塩基性ｐＨの水性緩衝液中で、より好ましくはｐＨ１０前後のｐＨの緩衝液中で、尚より好ましくは基質、５−ヒドロキシルロイシン、及びＭｐｓ−２タンパク質を含む、ｐＨ１０の緩衝液中で行われる。好ましくは、Ｍｐｓ−２タンパク質は使用緩衝液中でその活性を維持し、そして好ましくはタンパク質及び基質の沈殿は禁じられる。場合により、サンプルはタンパク質活性に適切な温度で、好ましくは０〜５０℃間の温度で、より好ましくは１０〜４５℃間の温度で、尚より好ましくは３０〜４２℃間の温度でインキュベートされ得る。通常、反応時間は、数分と数時間の間、好ましくは３０分〜４時間及びより好ましくは１〜３時間である。好ましくは、４−メチルプロリンの産生のために、Ｍｐｓ−４アッセイは、中性ｐＨの水性緩衝液中で、より好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液中で、尚より好ましくは基質、３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸又は関連化合物、及びＭｐｓ−４タンパク質を含む、ｐＨ７.５〜８のｐＨの緩衝液中で行われる。好ましくは、Ｍｐｓ−４タンパク質は使用緩衝液中でその活性を維持し、そして好ましくはタンパク質及び基質の沈殿は禁じられる。場合により、サンプルはタンパク質活性に好適な温度で、好ましくは０〜５０℃間の温度で、より好ましくは１０〜４５℃間の温度で、尚より好ましくは３０〜４２℃間の温度でそして尚より好ましくは３０℃でインキュベートされ得る。通常、反応時間は、数分と数時間の間、好ましくは３０分〜４時間及びより好ましくは１〜３時間である。
好ましくは、グリセリマイシンの産生のために、アッセイは、中性ｐＨの水性緩衝液中で、より好ましくは７〜８のｐＨの緩衝液中で、尚更に好ましくは基質、アセチル−ＣｏＡ、Ｌ−バリン、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリン（又は関連化合物）、Ｌ−ロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グリシン及びタンパク質ＮＲＰＳ−１、ＮＲＰＳ−２、ＮＲＰＳ−３（非リボソームペプチドシンテターゼ）及びＭｔｂＨ及び、必要に応じてＳＡＭ及びＡＴＰを含む、ｐＨ８の緩衝液中で行われる。好ましくは、タンパク質は使用緩衝液中でそれらの活性を維持し、そして好ましくはタンパク質及び基質の沈殿は禁じられる。場合により、サンプルはタンパク質活性に好適な温度で、好ましくは０〜５０℃間の温度で、より好ましくは１０〜４５℃間の温度で、尚より好ましくは２０〜４０℃間の温度でそして尚より好ましくは３０℃でインキュベートされ得る。通常、反応時間は、１時間と１００時間の間、好ましくは２〜７２時間である。好ましくは、メチルグリセリマイシンの産生のために、アッセイはグリセリマイシンのアッセイとして行われる。しかしながら、Ｌ−プロリンは必要ではなく、それ故に反応において含有する必要はない。
それによって当業者が化合物の濃度を決定し、そしてそれ故化合物の濃度が対照反応と比べて変化するかを測定する、様々なアッセイが当技術分野で公知である。物質への放射活性の組み込み又は物質からのその放出を測定するラジオメトリアッセイが明白に記載される。これらのアッセイで最も頻繁に使用される放射性同位体は14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、及び125Ｉである。その濃度はまたウェスタン分析又は試験化合物に対する抗体又は抗血清を用いたＥＬＩＳＡアッセイによって決定され得る。クロマトグラフィーアッセイは、反応混合物をクロマトグラフィーでその成分に分離することによって産物形成を測定する。これは通常高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行われる、しかし薄層クロマトグラフィーのより簡便法を使用することもできる。このアプローチは多くの材料を必要とするが、その感度を放射性又は蛍光タグで基質／産物を標識化することによって増加できる。好ましい定量化方法はＨＰＬＣ／ＭＳである。液体クロマトグラフィー−質量分光分析（ＬＣ−ＭＳ、又は代わりにＨＰＬＣ−ＭＳ）は、質量分光分析の質量分析能力と液体クロマトグラフィー（又はＨＰＬＣ）の物理的分離能力を組み合わせる分析化学技術である。ＬＣ−ＭＳは、非常に高い感度及び特異性を有する多くの用途に使用される強力な技術である。用語「質量分光分析」は、表面上でサンプルからの気相イオンを発生させるイオン源の使用、そして質量分析計による気相イオンを検出することをいう。用語「レーザ脱離質量分析」は、表面上でサンプルからの気相イオンを発生するイオン源としてのレーザの使用、そして質量分析計で気相イオンを検出することをいう。アシル化アシル受容体などの生体分子の好ましい質量分光分析の好ましい方法は、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析又はＭＡＬＤＩである。別の好ましい方法は表面増強レーザ脱離／イオン化質量分析又はＳＥＬＤＩである。質量分光分析において用語「見掛けの分子量」は検出イオンの分子量(ダルトン)対電荷値、ｍ／ｚをいう。ＨＰＬＣと組み合わせて、検体は、ＥＳＩ（エレクトロスプレイイオン化）又はＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）のような分散ＡＰＩ技術によってイオン化される。分析器中で、イオンはそれらの質量対電荷値ｍ／ｚ比に従って分離される。あるいは、（メチル）グリセリマイシンの量は当技術分野で周知のアッセイを用いてその抗生物質活性を決定することによって測定され得る。別の実施態様では、（メチル）グリセリマイシンの誘導体の抗生物質活性は当技術分野で周知のアッセイを用いて測定され得る。それにより当業者は、抗生物質活性増加が（メチル）グリセリマイシンの誘導体増加量に因るのか、又は抗生物質活性の向上した（メチル）グリセリマイシンの誘導体は、例えば生成抗生物質製剤が（メチル）グリセリマイシンなのか否かを決定することによって生成されるかについてどのように識別するかを知っている。そのような方法は上に記載される。
抗生物質試験は、例えば抗生物質含浸型のウエハーを使用する検査であるディスク拡散抗生物質感受性試験であってよい。既知量のバクテリアが抗生物質を含有する薄いウエハーの存在下に寒天プレート上で増殖される。透明エリアは、バクテリアが増殖することができないウエハーを囲む（阻止ゾーン（zone of inhibition）と呼ばれる）。抗生物質の拡散速度と一緒になってこれは特定の抗生物質の有効性を評価するのに使用される。一般に、より大きいゾーンは抗生物質のより小さい最小阻止濃度（ＭＩＣ）と相関する。この情報は、（メチル）グリセリマイシンの誘導体ｖｓ.（メチル）グリセリマイシンの有効性を評価するのに使用できる。ＭＩＣは、一夜培養後の微生物の可視増殖を阻害し得る抗菌薬の最も低い濃度である。最小阻止濃度は、抗菌薬に対する微生物の抵抗性を確認するのに、そして新規抗菌薬の活性をモニターするのに診断臨床検査室において重要である。ＭＩＣは一般的に生物に対する抗菌薬の活性の最も基礎的な臨床検査法と見なされている。ＭＩＣは通常、臨床及び検査標準協会（ＣＬＳＩ）又は英国抗菌薬化学療法学会（ＢＳＡＣ）などの、参照体のガイドラインに従う寒天又は液体希釈法によって決定できる。確立したＥｔｅｓｔストリップを含む幾つかの市販方法がある。Ｅｔｅｓｔシステムは、異なる抗菌薬の事前に定義されたそして連続的濃度勾配を含み、接種寒天プレートに適用されそしてインキュベートされたとき、それは微生物の阻止楕円形を作り出す。ＭＩＣは、阻止楕円形がストリップを交差する場合に決定され、そしてストリップ上でＭＩＣの読みスケールを容易に読み取られる。
対照は、それらは予期せぬ影響（バックグラウンドシグナルなどの）を排除又は最小化することができることから試験方法の一部である。対照実験は特定の系に対する変数の効果を検討するために使用される。対照実験では、サンプルの１つのセットは修飾されており（又はそうであると考えられており）、そして他のセットのサンプルは不変（陰性対照）を示すと予想されるか又は明確な変化（陽性対照）を示すことが予想される。対照は試験物質と並行して進む１つの試験において決定できる。それは試験物質の効果を決定する前又は後に決定され得て、又はそれは既知の値であり得る。可能な対照実験は、同じ条件が試験実験におけるように（メチル）グリセリマイシン、その誘導体又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生に使用される、実験であってよい、しかしながら、バリアント核酸は、バリアントを産生するための出発核酸であった核酸によって置換され、例えば対照核酸は野生型核酸である。例は、対照実験において未修飾状態である、しかしながら試験実験において修飾されているＯＲＦ１〜２６である。
バリアントの核酸配列は当技術分野において公知の配列決定方法によって決定され得て、それによりＯＲＦ１〜２６のいずれの突然変異も得られるタンパク質の調節に関与し得て、（メチル）グリセリマイシン又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの増加した産生又は（メチル）グリセリマイシンの誘導体の産生をもたらす。
本発明の別の態様では、グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを産生する方法は、本明細書に規定されたような少なくとも１つのタンパク質又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメント、又はバリアントを同定し、そして少なくとも１つのタンパク質又はそのバリアント又はフラグメントを、Ｌ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルトレオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−Ｎ−メチルロイシン、グリシン及び場合によりＬ−メチルプロリンとインキュベートして、グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを産生する方法によって得られるバリアントタンパク質をもたらすことを含んで提供される。好ましくは、少なくとも１つのタンパク質は、少なくともＮＲＰＳ−１、ＮＲＰＳ−２、ＮＲＰＳ−３を含む。更なる態様では、本発明は、本明細書に規定されたような少なくとも１つのタンパク質又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメント、又はバリアントを同定し、そして少なくとも１つのタンパク質又はそのバリアント又はフラグメントを、Ｌ−ロイシン、５−ヒドロキシルロイシン、γ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒド又は３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸、好ましくはＬ−ロイシンとインキュベートして、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンを産生する方法によって得られるバリアントタンパク質をもたらすことを含む、Ｌ−トランス−４−メチルプロリンを産生する方法を提供する。好ましくは少なくとも１つのタンパク質はＭｐｓ−１、Ｍｐｓ−２及びＭｐｓ−４を含む。用語「提供すること」及び「タンパク質又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメント」に関して、それは本発明の核酸及びタンパク質の文脈において与えられる定義に対していわれる。用語「方法によって得られる」に関して、それは配列番号２〜２７のバリアントを決定する文脈において与えられる定義に対して言われる。用語「インキュベートすること」は、グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生を可能にするために、特定の条件でタンパク質及び他の成分を維持することを意味する。特定の条件に関して、配列番号２〜２７のバリアントを決定する文脈における定義に関するものである。
このように、本発明は１つの実施態様では以下から成る群から選択される少なくとも１つの核酸を含む単離核酸配列を示す：
（ａ）それぞれ配列番号２〜２７のタンパク質、又はそのバリアント又はフラグメントをコードし、それによってバリアント又はフラグメントは配列番号２〜２７のタンパク質の機能的に活性なバリアント又はフラグメントをコードする、配列番号１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１〜２６の少なくとも１つを含む核酸；
（ｂ）配列番号２〜２７のタンパク質の少なくとも１つ、又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントをコードする核酸；
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の工程の核酸によってコードされるタンパク質又はそのフラグメントとアミノ酸配列において少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９７％同一であるタンパク質をコードする核酸；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの工程の核酸とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程の核酸とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、そして１０〜５０のヌクレオチド長から成る核酸；及び
（ｆ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの工程の核酸に相補的な核酸。
更なる実施態様では、前述の核酸は、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程において示される配列番号２〜２７のタンパク質のいずれか、又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントをコードする少なくとも２つのＯＲＦを含む。
尚別の実施態様では、前記核酸は、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程においてそれぞれ配列番号１９、２０、２１及び２２のタンパク質、又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントをコードするＯＲＦ１８、１９、２０及び２１の少なくとも１つを含む。
尚別の実施態様では、前記核酸は、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの工程においてそれぞれ配列番号９、１６及び１７のタンパク質、又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントをコードするＯＲＦ８、１５及び１６の少なくとも１つを含む。
尚別の実施態様では、前記核酸は、配列番号１の核酸配列を有し、又はＯＲＦ１〜２６の少なくとも１つのバリアント又はフラグメントを固定する配列番号１のバリアント配列を有し、それによってバリアント又はフラグメントは配列番号２〜２７のタンパク質の機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントをコードする、グリセリマイシン生合成遺伝子クラスターを含む。
別の実施態様では、本発明はいずれの前述の核酸も含む発現ベクターを包含する。
別の実施態様では、本発明は前述の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を包含する。
尚別の実施態様では、本発明は、配列番号２〜２７、又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質を包含する。
尚別の実施態様では、本発明は、前述のタンパク質の少なくとも１つ、又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントに対して特異的に作られた抗体を包含する。
この利用はまた、配列番号９、１６及び１７のタンパク質の少なくとも１つを産生することを含む、グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを産生する方法に関して本発明を包含する。
１つの実施態様では、本発明は、配列番号１９、２０、２１及び２２のタンパク質の少なくとも１つを産生することを含むＬ−トランス−４−メチルプロリンを産生する方法を包含する。
別の実施態様では、本発明は：
ａ）上記核酸のいずれかを発現すること、及び
ｂ）場合により、少なくとも１つの上記タンパク質又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントを単離すること、
を含む少なくとも上述のタンパク質又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントを産生する方法を包含する。
尚別の実施態様では、本発明はそれぞれに下記の工程を含むグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの産生を調節する、配列番号２〜２７のタンパク質をコードする、配列番号１の１つ又はそれ以上のＯＲＦ１〜２６のバリアントを決定する方法を包含する：
ａ）ＯＲＦ１〜２６のいずれか１つ又はそれ以上のバリアントを産生すること、
ｂ）バリアントをタンパク質中へ発現すること、
ｃ）工程ｂ）のタンパク質を用いてグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン又はその誘導体を産生すること、及び
ｄ１）産生グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン量を決定すること、ここで、工程ｂ）のタンパク質は存在しないで、しかしタンパク質の対応するインバリアント型は存在する場合、産生量で比べた産生グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン量の増加は、バリアントがグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの産生を増加させることができることを示し、又は
ｄ２）グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン誘導体の抗生物質活性を決定すること、ここで工程ｂ）のタンパク質は存在しないで、しかしタンパク質の対応するインバリアント型は存在する場合、抗生物質活性と比べた工程ｄ２）における抗生物質活性の増加は、バリアントが抗生物質活性を増加してグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの誘導体を産生させることができることを示し、そしてここで誘導体はアミノ酸組成においてグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンと異なり、そしてグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを超えた抗生物質活性亢進を示す。
別の実施態様では、本発明はそれぞれに下記の工程を含むＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生を向上する配列番号２〜２７のタンパク質をコードする、配列番号１の１つ又はそれ以上のＯＲＦ１〜２６のバリアントを決定する方法を包含する：
ａ）ＯＲＦ１〜２６のいずれか１つ又はそれ以上のバリアントを産生すること、
ｂ）バリアントをタンパク質中へ発現すること、
ｃ）工程ｂ）のタンパク質を用いてＬ−トランス−４−メチルプロリンを産生すること、及び
ｄ）産生Ｌ−トランス−４−メチルプロリン量を決定すること、ここで、工程ｂ）のタンパク質は存在しないで、しかしタンパク質の対応するインバリアント型は存在する場合、産生量で比べた工程ｃ）において産生したＬ−トランス−４−メチルプロリン量の増加は、バリアントがＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生を増加させることができることを示す。
別の実施態様では、本発明は下記の工程を含むグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを産生する方法を包含する：
ａ）請求項８に記載の少なくとも１つのタンパク質又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントを提供すること、及び
ｂ）グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを産生するために、工程ａ）の少なくとも１つのタンパク質をＬ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルトレオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−Ｎ−メチルロイシン及びグリシンと共にインキュベートすること。
別の実施態様では、本発明は下記の工程を含むＬ−トランス−４−メチルプロリンを産生する方法を包含する：
ａ）請求項８に記載の少なくとも１つのタンパク質又は機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントを提供すること、及び
ｂ）Ｌ−トランス−４−メチルプロリンを産生するために、工程ａ）の少なくとも１つのタンパク質をＬ−ロイシン、５−ヒドロキシロイシン、γ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒド及び／又は３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸と共にインキュベートすること。
尚別の実施態様では、本発明は、ＤＳＭ２２６４３の寄託番号でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh (ＤＳＭＺ) に寄託されているストレプトミセス菌株を包含する。
グリセリマイシン（Ａ）及びメチルグリセリマイシン（Ｂ）の構造を示す。 配列番号１によって含まれるストレプトミセスＤＳＭ２２６４３のグリセリマイシン生合成遺伝子クラスターのマップ及び遺伝子配列を示す。推定ＯＲＦは各遺伝子名で指定される黒ブロック矢印によって示される。転写方向及び相対サイズが示される。 グリセリマイシン生合成のモデルを示す。推定ＮＲＰＳタンパク質、ＮＲＰＳ−１、ＮＲＰＳ−２、ＮＲＰＳ−３は、白ブロックによって示される。Ｍ−１〜Ｍ−１０と指定されたモジュールは各ブロックの下に示される。各モジュールは、ドメインの縮合ではＣ、アデニル化ドメインではＡ、メチルトランスフェラーゼドメインではＭＴ、チオレート化ドメインではＴ、エピマー化ドメインではＥ及びチオエステラーゼドメインではＴＥと指定されたドメイン中で解体され、それにより各ドメイン名称の後ろの数字は、このドメインがそれに帰属されるモジュールの数字を示す。配列Ａ’−ＭＴ−Ａ’’は、ＭＴドメインがＡドメインに組み込まれることを示す。各モジュール記号（designation）の下に、それぞれのモジュールによってグリセリマイシンに導入されるアミノ酸を示す。Ｎｍｅ−ＶａｌはＬ−Ｎ−メチルバリンを表し、Ｍｅ−ＰｒｏはＬ−トランス−４−メチルプロリンを表し、Ｎｍｅ−ＴｈｒはＬ−Ｎ−メチルトレオニンを表し、ＬｅｕはＬ−ロイシンを表し、ＰｒｏＬ−プロリンを表し、Ｎｍｅ−Ｄ−ＬｅｕはＤ−Ｎ−メチルロイシンを表しそしてＧｌｙはグリシンを表す。モジュールの下では、各モジュールの生化学的役割は、それぞれのアミノ酸構造の提示及びグリセリマイシンへのそれらの組み込みによって提示される。各モジュールによって１つのアミノ酸は先行する１つに縮合され、成長するペプチド鎖の延長をもたらす。産物放出は、大環状産物をもたらすためにペプチドのその後の環化によるＴＥ１０ドメインを含む。モジュール１のＮ末端Ｃドメインはバリンのアシル化を触媒すると仮定される。 ノストペプトライド（nostopeptolide）生合成遺伝子クラスター（Hoffmann et al., 2003;上の経路）及びグリセリマイシン生合成遺伝子クラスター（下の経路）内の４−メチルプロリンの合成を示す。両方の生合成経路において、Ｌ−ロイシンは、酵素Ｏｒｆ１（ノストペプトライド）又はＭｐｓ−１（（メチル）グリセリマイシン）によって５−ヒドロキシロイシンに変換され、これはＮｏｓＥ（ノストペプトライド）又はＭｐｓ−２（（メチル）グリセリマイシン）によって、３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸を自然に形成するγ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒドに変換される。これはＮｏｓＦ（ノストペプトライド）又はＭｐｓ−４（（メチル）グリセリマイシン）によって４−メチルプロリンに変換される。（ノストペプトライド）又は（（メチル）グリセリマイシン）経路の４−メチルプロリン合成の各工程の産物は、５−ヒドロキシロイシン、γ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒド及び４−メチルプロリンの４位置における、及び３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸の５位置におけるメチル基に対するそれらの立体配置が異なり、その点ではノストペプトライド生合成においてメチル基はＳ立体配置であり、一方で（（メチル）グリセリマイシン）生合成においてメチル基はＲ立体配置である。場合により、Ｍｐｓ−３は、γ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒドの３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸への変換の役割を果たす。 Ｍｐｓ−１又はロイシン−ヒドロキシラーゼアッセイのＨＰＬＣ−ＭＳ解析の結果を示す。ダイアグラムは、不活性化Ｍｐｓ−１（クロマトグラムＡ）及びＢ））で行われた酵素アッセイにおいて、ヒドロキシロイシンは産生されないが、一方で活性Ｍｐｓ−１（クロマトグラムＣ）及びＤ））で行われたアッセイにおいて、ヒドロキシロイシンは産生される。Ａ）及びＣ）：ｍ／ｚ＝２７３．１（ＰＴＣ−ロイシンの［Ｍ＋Ｎａ］+）に対する抽出イオンクロマトグラム。Ｂ）及びＤ）：ｍ／ｚ＝２８９．１（ＰＴＣ−ヒドロキシロイシンの［Ｍ＋Ｎａ］+）に対する抽出イオンクロマトグラム。 ｎｒｐｓ−１及びｎｒｐｓ−３遺伝子及び突然変異体ｍｐｓオペロンで得られた結果を示す。ｎｒｐｓ及びｍｐｓ遺伝子はブロック矢印によって示される。挿入変異のおおよその位置は円−十字形記号によって示される。ｎｒｐｓ及びｍｐｓの提示の下で、遺伝子は、野生型、ｎｒｐｓ−１突然変異体、ｎｒｐｓ−３突然変異体及びｍｐｓ突然変異体の培養物からの上清の関連ＵＨＰＬＣクロマトグラム（ＵＶ ２１０ｎｍ）である。野生型において５.２９分のピークはグリセリマイシンの存在を示す。対照的に３突然変異体の培養上清にはグリセリマイシンは検出されることができない。 実施例５で得られたｍｐｓ突然変異体の相補性を示す。Ａ．０日目に１回の２０μｇ／ｍｌの（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリンの産生培地への供給によるｍｐｓ突然変異体の相補性。１〜４日目に（メチル）グリセリマイシン産生を解析した（灰色棒：グリセリマイシン産生、黒棒：メチルグリセリマイシン産生）。補完培地中でだけ、ｍｐｓ突然変異体は（メチル）グリセリマイシンを産生できる。メチルプロリンが供給されたとき、メチルグリセリマイシンｖｓ. グリセリマイシンの増加を示している実験は、実施例９及び１５ページに記載される。Ｂ. ｍｐｓ突然変異体の遺伝的相補性の関連態様の概略図：ｍｐｓ−オペロン（ｍｐｓ−１、ｍｐｓ−２、ｍｐｓ−３及びｍｐｓ−４遺伝子）は、５｀挿入構成的ｅｒｍＥ−プロモーターの発現調節下にある。Ｃ. ｍｐｓ突然変異体遺伝的相補性。ｍｐｓ突然変異体のＰ（ｅｒｍＥ）−ｍｐｓ−オペロンのａｔｔＢ部位への組込み後、グリセリマイシン産生能力は回復する（灰色棒：グリセリマイシン産生、黒棒：メチルグリセリマイシン産生）。 ｍｐｓ発現培養物（ストレプトミセスセリカラー／ｐＵＷＬ２０１−ｍｐｓ；図８Ａ）及び陰性対照（ストレプトミセスセリカラーＷＴ；図８Ｂ）からの誘導体化抽出物のＨＰＬＣ−ＭＳ解析を示す。予想産物（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリン（図８Ａ及びＢの４番目のクロマトグラム）のＰＩＴＣ誘導体、並びに２つの生合成中間体５−ヒドロキシロイシン（図８Ａ及びＢの２番目のクロマトグラム）及びγ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒド（図８Ａ及びＢの３番目のクロマトグラム）のＰＩＴＣ誘導体は、ｍｐｓ発現培養物の抽出物中に検出されようが、ストレプトミセスセリカラーＷＴには検出され得ない。図８Ａ及びＢの１番目のクロマトグラムはロイシンに対応する。 ＮｏｓＡ−Ａ（ｍＰｒｏ）、ＮｃｐＢ−Ａ（ｍＰｒｏ）及びＮｏｓＤ−Ａ（ｐｒｏ）とＮＲＰＳ−１−Ａ２、ＮＲＰＳ−１−Ａ５及びＮＲＰＳ−２−Ａ８間の関係を示す系統樹を示す。目盛棒はアミノ酸部位当りの０．０９置換を表す。 インビトロＡＴＰ−Ｐｐｉ−交換実験によるモジュール２（Ａ２；上のパネル）、モジュール５（Ａ５；中間パネル）及びモジュール８（Ａ８；下のパネル）のＡドメインの基質特異性の解析を示す。Ａ５及びＡ８では実験は三重に行われ、Ａ２では二重に行われた。最大活性は１００％までスケールアップされた。以下の基質が試験された：（２Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロプロリン（２Ｓ，４Ｒ Ｆｐｒｏ）、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルプロリン（２Ｓ，４Ｓ ＭｅＰｒｏ）、（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリン（２Ｓ，４Ｒ ＭｅＰｒｏ）、Ｌ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）、Ｌ−ピペコリン酸（Ｌ−Ｐｉｐ）、Ｌ−グリシン（Ｌ−Ｇｌｙ）、４−メチレンプロリン（Ｍｅｔｈｙｌｅｎ Ｐｒｏ）、４，４−ジメチルプロリン（Ｄｉ Ｍｅ Ｐｒｏ）及び４，４−ジフルオロプロリン（Ｄｉ Ｆ Ｐｒｏ）。相対活性はＹ軸で示される。各基質の下において１００%で与えられる最大活性と比べた活性がパーセントで示される。対照実験では、アミノ酸は存在しなかった。 完全長調節因子Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２のＤＮＡフラグメントＰｎｒｐｓ１、Ｐｎｒｐｓ２及びＰｍｘａｎ＿ｃｔｒｌへの結合。ＥＭＳＡアッセイのスキャンした図が示される。Ｐｎｒｐｓ１及びＰｎｒｐｓ２：遺伝子ｎｒｐｓ１又はｎｒｐｓ２のプロモーター領域を含むＤＮＡフラグメントを用いたＥＭＳＡアッセイ。Ｐｍｘａｎ＿ｃｔｒｌ：ｍｘａｎ＿３９５０及びｍｘａｎ＿３９５１によって隣接されるミキソコッカス・ザンサスＤＫ１６２２の遺伝子間領域における、二重プロモーター系を含むＨｅｘ標識化ＤＮＡフラグメントを用いるＥＭＳＡアッセイ。Ｏｒｆ−１−Ｈｉｓ及びＯｒｆ−１２−Ｈｉｓ：Ｃ−末端６ｘＨｉｓタグ付きＯｒｆ−１及びＯｒｆ−１２。＋：調節因子あり。−：調節因子なし。 調節因子Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２の予測ドメイン構成を示す。 http://smart.embl-heidelberg.de/におけるＳＭＡＲＴツールによって予測されるドメインが示される。ＨＴＨ：へリックス−ターン−へリックスモチーフ、ａａ：アミノ酸。 ＤＮＡフラグメントＰｎｒｐｓ１、Ｐｎｒｐｓ２及びＰｍｘａｎ＿ｃｔｒｌへの調節因子Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２の短縮バージョンの結合を示す。ＥＭＳＡアッセイのスキャンした図が示される。アッセイでは、Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２の誘導体は、予測ＨＴＨドメインだけを含んで使用された。Ｐｎｒｐｓ１＆Ｐｎｒｐｓ２：遺伝子ｎｒｐｓ１又はｎｒｐｓ２のプロモーター領域を含むＤＮＡフラグメントを用いるＥＭＳＡアッセイ。Ｐｍｘａｎ＿ｃｔｒｌ：ｍｘａｎ＿３９５０及びｍｘａｎ＿３９５１によって隣接されるミキソコッカス・ザンサスＤＫ１６２２の遺伝子間領域における、二重プロモーター系を含むＨｅｘ標識化ＤＮＡフラグメントを用いるＥＭＳＡアッセイ。Ｏｒｆ−１−ＨＴＨ１、Ｏｒｆ−１−ＨＴＨ２、Ｏｒｆ１−ＨＴＨ１２及びＯｒｆ−１２−ＨＴＨ：ＨＴＨドメインだけを含むＣ−末端６ｘＨｉｓタグ付きＯｒｆ−１及びＯｒｆ−１２。−：調節因子なし。数字はＤＮＡフラグメントの量と比べた調節因子タンパク質のモル過剰を表現する。
〔実施例１〕ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３におけるグリセリマイシン生合成遺伝子座の同定
ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３は抗生物質グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンを自然に産生した。しかしながら、これらの抗生物質の生合成に関与する遺伝子座は以前は同定されていなかった。グリセリマイシン遺伝子座の同定のために、ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３を標準微生物学的技術に従ってインキュベートした。ＤＮＡは標準手順に従って抽出し、そして全配列は標準手順に従って決定した。ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３のＤＮＡによって含まれる遺伝子、及び遺伝子によってコードされるタンパク質の解析は、インシリコで行った。表１は、相同性検索によって決定されたＯＲＦ数によって同定された遺伝子をリストした。特定遺伝子名称はＯＲＦ数に帰属された。グリセリマイシン生合成遺伝子クラスター内の遺伝子の位置及びそれらの配列は図式的に図２に示した。
Figure 2014530609
Figure 2014530609
〔実施例２〕グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンの生合成に関与する遺伝子及びタンパク質
インシリコ解析によって、グリセリマイシン生合成遺伝子クラスターは２６のタンパク質をコードする２６の遺伝子を含むことを決定した。２６の（メチル）グリセリマイシン生合成タンパク質の生物学的機能は、ＮＣＢＩにおいて見出されたタンパク質と各同定タンパク質とのコンピュータ比較によって評価した。表２では、グリセリマイシン生合成遺伝子クラスター及び対応するＧｅｎＢａｎｋタンパク質によって含まれるタンパク質を同定した。
Figure 2014530609
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個々のモジュール及びドメイン間には、リンカー領域、即ちモジュール間リンカー及びドメイン間リンカーが存在した。タンパク質のＮ−末端及びＣ−末端には、個々のＮＲＰＳタンパク質の相互作用に必要なＣＯＭ又はドッキングドメインが存在した。コミュニケーション媒介（ＣＯＭ）ドメインは、短コミュニケーション媒介ドメインによる非リボソームペプチドシンテターゼ間の選択的相互作用を容易にした（Hahn M. and Stachelhaus T.; 2004）。
相同性検索に基づき、ｎｒｐｓ−１、ｎｒｐｓ−２及びｎｒｐｓ−３と呼ばれる遺伝子は、グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンを合成する非リボソームタンパク質シンテターゼ（ＮＲＰＳ）をコードした（図３参照）。ｎｒｐｓ−１遺伝子は、約２６．４ｋｂの長さを有し、そして（１）Ｌ−Ｎ−メチルバリン（Ｍ１）、（２）Ｌ−トランス−４−メチルプロリン（Ｍ２）、（３）Ｌ−Ｎ−メチルトレオニン（Ｍ３）（４）Ｌ−ロイシン（Ｍ４）、（５）Ｌ−ｔｒａｎｓ−４−メチルプロリン（Ｍ５）及び（６）Ｌ−ロイシン（Ｍ６）のそれぞれ（メチル）グリセリマイシンへの組み込みに必要な６モジュールをコードした。モジュール１又はＭ１及びモジュール３又はＭ３の各々はＣ−ドメイン、ＭＴ−ドメインによって遮断されるＡ−ドメイン及びＴ−ドメインをコードし、一方でモジュール２又はＭ２、モジュール４又はＭ４、モジュール５又はＭ５及びモジュール６又はＭ６の各々はＣ−ドメイン、Ａ−ドメイン及びＴ−ドメインをコードした。更に、それは７又はＭ７の縮合ドメインを含有した。Ｍ１、Ｃ１の縮合ドメインはＮ−アセチル化に関与した。ｎｒｐｓ−２遺伝子は約１２．５ｋｂの長さを有し、そして（７）Ｌ−Ｎ−メチルバリン（Ｍ７）、８）Ｌ−プロリン（グリセリマイシン）又はＬ−トランス−４−メチルプロリン（メチルグリセリマイシン）（Ｍ８）及び（９）Ｄ−Ｎ−メチルロイシン（Ｍ９）の組み込みに必要なモジュール７及びモジュール８及び９の一部をコードした。モジュール７の一部はＭＴ−ドメイン及びＴ−ドメインによって遮断されるＡ−ドメインを含み、モジュール８又はＭ８はＣ−ドメイン、Ａ−ドメイン及びＴ−ドメインを含み、そしてモジュール９又はＭ９はＣ−ドメイン、ＭＴ−ドメインによって遮断されるＡ−ドメイン、Ｔ−ドメイン及びＥ−ドメインを含んだ。（メチル）グリセリマイシンの９位置におけるＤ−アミノ酸の存在は、Ｄ−Ｎ−メチルロイシンの挿入を触媒するモジュール９中のＥ−ドメインの存在と一致した。ｎｒｐｓ−３遺伝子は約４ｋｂの長さを有し、そしてグリシンを分子中に組み込むモジュール１０をコードし、そしてエステル結合を介してグリシンとＬ−Ｎ−メチルトレオニン間の線形ペプチドの環化を管理した。モジュール１０はＣ−ドメイン、Ａ−ドメイン、Ｔ−ドメイン及びＴＥ−ドメインを含んでいた。
相同性検索はＮＲＰＳタンパク質の反復単位、モジュールに対する生合成役割の帰属を可能にした。図３では、ＮＲＰＳタンパク質へのモジュール１〜１０の帰属、ドメインへの解体及びアミノ酸を示すことによる生合成活性及びグリセリマイシン成長鎖へのそれらの組込みを示された。モジュール１０はＮＲＰＳ−３タンパク質から鎖を放出して、それに続いて鎖環化をもたらした。表３では、タンパク質上のモジュール及びドメインの近接境界及び個々のＮＲＰＳタンパク質内のそれらの位置に対するＤＮＡレベルが示される。それにより、Ｃは縮合ドメインを示し、Ａはアデニル化ドメインを示し、ＭＴメチルトランスフェラーゼドメインを示し、そしてＴはチオール化ドメインを示した。ＭＴドメインはＡドメインに組み込まれた。これは配列“Ａ’−ＭＴ−Ａ’’によって示された。
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相同性検索及び生化学的解析に基づいて、ｍｐｓ−１、ｍｐｓ−２及びｍｐｓ−４と呼ばれる遺伝子はＬ−トランス−４−メチルプロリンの生合成に必要なタンパク質をコードした。Ｌ−トランス−４−メチルプロリンは、グリセリマイシンの２及び５位置に、そしてメチルグリセリマイシンの２、５及び８位置に含有された。ｍｐｓ−１遺伝子は、４−プロリンヒドロキシラーゼ（４１％同一性／５７％類似性）及びフィタノイル−ＣｏＡジオキシゲナーゼに最大の相同性を有するタンパク質をコードし、しかし生化学的解析によりｍｐｓ−１遺伝子はＬ−ロイシンを（２Ｓ，４Ｒ）−５−ヒドロキシロイシンにヒドロキシル化するロイシンヒドロキシラーゼをコードすることを示し得た。遺伝子ｍｐｓ−２は、Ｌ−シス−４−メチルプロリンの合成に関与するノストペプトライド遺伝子クラスターのｎｏｓＥ遺伝子に対して３４％同一性／５５％類似性有するアルコールでヒドロゲナーゼをコードした(Luesch et al. 2003)。Ｍｐｓ−２は（２Ｓ，４Ｒ）−５−ヒドロキシロイシンの（２Ｓ，４Ｒ）−γ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒドへの脱水素を触媒した。自然環形成後ｍｐｓ−４によってコードされたタンパク質は、恐らく（３Ｓ，５Ｒ）−３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸の（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリンへの還元を触媒した。ｍｐｓ−４遺伝子はＳｉｂ（５５％同一性／７０％類似性）及びＬｍｂＹに対して最大の相同性を示し、両方はフラビン依存性モノオキシゲナーゼをコードしそして類似反応を触媒した (Li et al. 2009; Peschke et al. 1995)。ｍｐｓ−３遺伝子は、フリウリマイシン生合成遺伝子クラスターにおけるｌｉｐＥ遺伝子産物に対して最大の相同性（５０％同一性／６８％類似性）で、α，β−ヒドロラーゼに対して最大の相同性を示した(Muller et al. 2007)。コードタンパク質はミスプライムＮＲＰＳ再生において機能を有するＩＩ型チオエステラーゼとして作用し得た。場合により、ｍｐｓ−３遺伝子産物は、４−メチルプロリンの生合成経路におけるピロリン誘導体の環化に関与した。これらの結果に基づいて、本発明者らは、グリセリマイシン又はメチルグリセリマイシンの生合成でＬ−トランス−４−メチルプロリンの生合成経路を解明するのに成功した。図４では、シアノバクテリウムＮｏｓｔｏｃ属ＧＳＶ２６４ (Hoffmann et al. 2003)のノストペプトライド生合成経路内で、そして本発明によって同定された（メチル）グリセリマイシン生合成経路内で、そこに関与するタンパク質を含む４−メチルプロリンの生合成経路の比較を示した。配列解析に基づいて、ｍｐｓ−１〜ｍｐｓ−４と呼ばれる遺伝子は恐らくオペロンとして転写された。
更に、相同性検索に基づいて、以下の遺伝子を同定した。遺伝子クラスター中にＸｒｅ−ファミリー転写調節因子のタンパク質に相同性を有する２つの遺伝子ｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２が存在した。コードタンパク質は（メチル）グリセリマイシン生合成の調節の役割を果した。両遺伝子の不活性化は、直接又は間接の調節因子としてそれらの機能を証明する、（メチル）グリセリマイシン産生の著明な損失をもたらすことを示すことができた。Ｏｒｆ−５は推定輸送分子に相同性をもつタンパク質をコードし、（メチル）グリセリマイシンの輸出に関与し得た。Ｏｒｆ−６はグルタミンシンテターゼの推定機能を有するタンパク質をコードした。Ｉｎｔ−１及びｉｎｔ−２は、これらのタンパク質がインテグラーゼ機能性を有すると仮定されるように、インテグラーゼ触媒領域に相同性をもつタンパク質をコードした。遺伝子ｎｒｐｓ−１とｎｒｐｓ−３間のＴｎｐ−１、ｔｎｐ−２及びｔｎｐ−３は、推定トランスポサーゼタンパク質と相同性をもつタンパク質をコードし、そしてトランスポサーゼ活性を有すると仮定した。更なるオープンリーディングフレームはＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニットβとしての推定機能を有した。このｏｒｆはｄｎａと呼ばれた。ｎｒｐｓ−３の直接下流の小さな２１９ｂｐのＯＲＦはＭｂｔＨ様タンパク質をコードし、そしてそれ故ｍｂｔＨと呼ばれた。ＭｂｔＨタンパク質はＮＲＰＳ(Barry & Challis, 2009)の正しい機能に必要とされた。Ｏｒｆ−８は仮説タンパク質Ｓｃｌａ２＿１３６１１と相同性を有し、そしてＰＮＰＯｘ−ｌ様スーパーファミリーと仮定した。Ｏｒｆ−１１はアミドヒドロラーゼスーパーファミリーの推定タンパク質をコードした。提案遺伝子ｏｒｆ−２、ｏｒｆ−３、ｏｒｆ−４、ｏｒｆ−７、ｏｒｆ−９及びｏｒｆ−１０はすべて異なる保存仮説タンパク質をコードした。
〔実施例３〕Ｌ−トランス−４−メチルプロリンのインビトロ合成
Ｌ−トランス−４−メチルプロリンのインビトロ合成は、３つの続くアッセイ、即ちＭｐｓ−１アッセイ、Ｍｐｓ−２アッセイ及びＭｐｓ−３アッセイを連結することによって行うことができた。３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸へのγ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒドの環化は自然に起こり、又はＭｐｓ−３にかかわり得た。図４では、Ｍｐｓ−１、Ｍｐｓ−２、場合によりＭｐｓ−３及びＭｐｓ−４を用いて、（２Ｓ，４Ｒ）−５−メチルプロリンへのＬ−ロイシンの変換を示した。
（ａ）ロイシンヒドロキシラーゼアッセイ
インシリコ解析に基づき、ｍｐｓ−１遺伝子はロイシンヒドロキシラーゼをコードすることを見出した。Ｍｐｓ−１タンパク質がロイシンヒドロキシラーゼをコードすることを確認する、以下の実験手順を行った。
遺伝子ｍｐｓ−１をコードする推定ロイシンヒドロキシラーゼは、ストレプトミセスＤＳＭ２６６４３のゲノムＤＮＡ由来の、プライマーＧｒｉ３＿ｆｏｒ（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＣＧＧＣＣＧＡＴ−３’）（配列番号２８）及びＧｒｉ３＿ｒｅｖ（５’−ＧＧＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＡＴＴＣ−３’）（配列番号２９）を用いて、Phusionポリメラーゼで増幅し、そして平滑末端ライゲーションによってｐＪＥＴ２．１ベクター(Fermentas)にクローニングした。配列検証後にＤＮＡフラグメントは、導入ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ制限部位を経てｐＥＴ２８ｂ（＋）へサブクローニングした。得られた構築物ｐＧｒｉｓ３は、タンパク質発現のために大腸菌ロゼッタＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ＲＡＲＥへ形質転換した。構築物を固定する新たな形質転換体は、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）で補足されたＬＢ−培地（３７ ℃で５ｈ増殖した１０−ｍｌ培養物から０．１％接種菌で開始した１ｌバッチ）中で増殖した。全細胞は、３７℃でおおよそ０．８のＯＤ６００まで増殖した。細胞は次いで、１Ｍイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で０．２ｍＭの最終濃度に誘導し、そして次いで１６℃で一夜増殖した。細胞は遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分、４℃）によって回収し、そして緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、２００ｍＭＮａＣｌ、及び１０％［ｖ／ｖ］グリセロール）中に再懸濁した。細胞を次いで溶解し（７００ｐｓｉで２パス，French press, SLM Aminco）、そして細胞デブリは遠心分離（２１，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）によって除去した。プレパックHisTrap(商標)ＨＰカラムは、Akta prime(商標) プラスシステム (Ge Healthcare)で固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって、ヒスチジンタグ付き組換タンパク質の予備的精製に使用した。１５ｍｌのタンパク質溶解物は滅菌フィルターを通して濾過し、そして１ｍｌＨｉｓＴｒａｐカラム上に負荷した。精製はＧＥヘルスケアマニュアル(HisTrap HP, Instructions 71-5027-68 AF)で推奨されたように行った。所望のタンパク質は、緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、２００ｍＭＮａＣｌ、及び１０％［ｖ／ｖ］グリセロール及び６０、１００、２００、３００及び５００ｍＭイミダゾール、１０ｍｌ画分）により、段階的イミダゾール勾配においてカラムから溶出した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で決定した純粋な標的タンパク質を含有する画分は併せて、そしてAmicon Ultra PL-10 centriconsを用いることによって約２００μｌに濃縮した。次いで８００μｌの保存緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０％［ｖ／ｖ］グリセロール）は、液体窒素中で急速冷凍及び−８０℃で保存の前に濃縮タンパク質に加えた。タンパク質濃度はBradford assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いて決定した。１−３ｍｇ／ｍｌの精製タンパク質を培養物のＬ当りで得た。
基質としてロイシンによるアッセイは、ＭＯＰＳ（５０ｍＭ）、ｐＨ７．０で行い、そして２００μｌの総量中には、基質（１ｍＭ）、α−ケトグルタラート（１ｍＭ）、ＦｅＳＯ4（２５μＭ）、ＤＴＴ（０．５ｍＭ）、アスコルビン酸（０．１ｍＭ）及びＭｐｓ１（１μＭ）を含んだ。反応はＭｐｓ１の添加で開始し、そして３０℃で１時間インキュベートした。タンパク質は冷エタノールで沈殿させ、上清をデカンターして誘導体化のために使用した。溶液は回転蒸発によって乾燥し、そして２００μｌの結合緩衝液（アセトニトリル：ピリジン：トリエチルアミン：Ｈ2Ｏ １０：５：２：３）中に再懸濁した。５０μｌのＰＩＴＣ溶液をこの溶液に加え、そして室温で５分後に反応を終了させるために５０μｌのＨ2Ｏを加えた。溶液はspeedvac蒸発によって蒸発させ乾燥した。得られたＰＴＣアミノ酸は１ｍｌの水：アセトニトリル（７：２）に溶解して、遠心分離しそして上清は再びspeed vac蒸発によって乾燥した。次いでアミノ酸は１００μｌの水／アセトニトリルに溶解し、そしてＨＰＬＣ／ＭＳ分析のために使用した。ＰＩＴＣ−ロイシン及びＰＩＴＣ−ヒドロキシロイシンは陽イオン化法で検出した（ロイシン：［Ｍ＋Ｈ］+＝２７２．９及びヒドロキシロイシン：［Ｍ＋Ｈ］+＝２８８．９）。Ｍｓｐ−１はロイシンから５−ヒドロキシロイシンへの反応を触媒することを示した（図５）。
（ｂ）Ｍｓｐ−２アッセイ
５−ヒドロキシロイシンのγ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒドへの変換は、機能的に類似のタンパク質ＮｏｓＥによるアッセイを行ったLuesch et al., 2003に従ってＭｐｓ−２又はアルコールデヒドロゲナーゼアッセイによって行うことができた。基質として５−ヒドロキシロイシン又は関連化合物との典型的混合物は、１００ｍＭグリシン（ｐＨ１０）、２ｍＭβ−ＮＡＤ、基質（０．１−１０ｍＭ）、１ｍＭＺｎＳＯ4、及びおよそ３μｇのＭｐｓ−２を含有し得た。典型的な反応容積は５００μｌであり得て、反応はＭｐｓ−２の添加によって開始し、そして３０−４２℃で１−３時間インキュベートし得た。
（ｃ）Ｍｐｓ−４アッセイ
３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸の４−メチルプロリンへの変換は、機能的に類似のタンパク質ＮｏｓＥによるアッセイを行ったLuesch et al., 2003に従ってＭｐｓ−４アッセイで行うことができる。典型的な反応混合物は、２００ｍＭトリス（ｐＨ８）、基質、０．２ｍＭβ−ＮＡＤＨ又はβ−ＮＡＤＰＨ、及びほぼ５μｇのＭｐｓ−４を含有し得た。反応容積は通常１ｍｌであり、反応はＭｐｓ−４の添加によって開始し、そして３０−４２℃で１−３時間インキュベートし得る。Becker et al., 1997による別のＭｐｓ−４アッセイは、基質として３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸又は関連化合物を含み、そして５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で実施され得て、そして基質（０．１−１０ｍＭ）、０．２ｍＭＦＡＤ、０．５ｍＭＮＡＤＨ及びＭｐｓ−４の適切な希釈（例えば１００−５００μｌの総量中１μｇ最終濃度）を含んだ。反応はＭｐｓ−４の添加によって開始し、そして３０−４２℃で１−３時間インキュベートし得た。
〔実施例４〕グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンのインビトロ合成
グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンのインビトロ合成は、Gaitatzis N. et al., 2001に開示の反応条件に従って行うことができた。各１ｍｌの培養は、２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭアセチル−ＣｏＡ（又は１ｍＭアセチル−ＳＮＡＣ）、２ｍＭＬ−バリン、２〜３ｍＭ（２Ｓ， ４Ｒ）−４−メチルプロリン（又は関連化合物）、３ｍＭＬ−ロイシン、１ｍＭＬ−プロリン（又はメチルグリセリマイシン合成用にＬ−プロリンなし）、１ｍＭＬ−トレオニン、４ｍＭＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、１ｍＭグリシン、１０ｍＭＡＴＰ、０．５−５ｍＭＮＲＰＳ−１、ＮＲＰＳ−２、ＮＲＰＳ−３及びＭｔｂＨを含有し得た。反応はＡＴＰとの反応開始後３０℃で２−７２時間インキュベートし得た。
〔実施例５〕遺伝子ｎｒｐｓ−１及びｎｒｐｓ−３及びｍｐｓオペロンの不活性化
ストレプトミセスＤＳＭ２６６４３の挿入突然変異体は、標準手順に従って作り出した。ｍｐｓ−オペロン、ｎｒｐｓ−１及びｎｒｐｓ−３遺伝子の一部にそれぞれ相同性である約３０００ｂｐ長のフラグメントは、表４に挙げられたプライマーを用いてＰＣＲによりＤＳＭ２６６４３の染色体ＤＮＡから増幅した。これらのフラグメントは、プラスミドｐＭＰＳ、ｐＮＲＰＳ−１、ｐＮＲＰＳ−３を与える、大腸菌クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋中でクローニングした。その結果、Gust et al., 2003に記載のように作り出されたＡｐｒＲ−ｏｒｉＴカセットは、表５に挙げられたプライマーで増幅し、そしてＲｅｄＥＴ技術（Genebridges）によってプラスミドｐＭＰＳ、ｐＮＲＰＳ−１、ｐＮＲＰＳ−３へ組み込まれ、接合性プラスミドを与えた。作出プラスミドは次いでＤＳＭ２２６４３へ移され、接合体について、（メチル）グリセリマイシン産生を試験する前に、それぞれｍｐｓ−オペロン、ｎｒｐｓ−１及びｎｒｐｓ−３遺伝子への正しい遺伝子組込みを解析した。
Figure 2014530609
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野生型でのグリセリマイシンの産生を検証するために、そしてグリセリマイシン合成の能力に対して挿入突然変異体を試験するために、異なる株を、ＮＬ５６４５培地（組成（百分率量）：ラクトース２．０、ダイズミール２．５、ＮａＣｌ ０．５、ＣａＣＯ3０．１及び酵母エキス０．５、ｐＨ６．８）において振盪フラスコ中でインキュベートした。異なる時点で培養上清を回収し、ろ過しそしてエタノールで１：１に混合した。不溶物質の沈殿及び分離後、上清についてＵＨＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）によって（メチル）グリセリマイシン産生を分析した。
図６から見られるように、野生型株ＤＳＭ２２６４３はグリセリマイシン（ＵＨＰＬＣクロマトグラム（ＵＶ２１０ｎｍ）において５．２９分に印のついたピーク「グリセリマイシン」を参照）を産生するが、一方でＤＳＭ２２６４３のｎｒｐｓ−１、ｎｒｐｓ−３及びｍｐｓ−突然変異体はグリセリマイシンを産生しなかった（５．２９分のピークの不存在）。この実験は、グリセリマイシン及びメチルグリセリマイシンの合成のためのＮＲＰＳタンパク質及びＭｐｓタンパク質の重要性を確認した。
〔実施例６〕ｍｐｓ−突然変異体の相補性
ｍｐｓ−オペロンの遺伝子が（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリンの合成に関連することを実証するために、ｍｐｓ−突然変異体は、（１）（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリンを供給することにより、そして（２）ｍｐｓ−オペロンが構成的ｅｒｍＥ−プロモーターから発現する場合、発現構築物の染色体組込みに因る遺伝的相補性により補完した。
食餌実験（feeding experiment）では、２０μｇ／ｍｌの（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリンをｍｐｓ−突然変異体の培養物に供給し、そして（メチル）グリセリマイシン産生を実施例５に記載の培養上清で分析した。（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリン供給のない標準培地では、ｍｐｓ−突然変異体はいずれの（メチル）グリセリマイシンも産生しなかったのに対して、２０μｇ／ｍｌの供給は（メチル）グリセリマイシン産生をもたらした（図７Ａ；同様に実施例９）。
ｍｐｓ−突然変異体の遺伝的相補性では、構成的ｅｒｍＥプロモーターの調節の下に遺伝子ｍｐｓ−１、ｍｐｓ−２、ｍｐｓ−３及びｍｐｓ−４と共にｍｐｓオペロンを含む、構築物、Ｐ（ｅｒｍＥ）−ｍｐｓを、染色体ａｔｔＢ部位へのインテグラーゼ媒介組込みのためにａｔｔＰ結合部位との接合ベクター中に作出した（ｅｒｍＥ−プロモーターの配列は図７Ｂ参照）。実施例５において作出したｍｐｓ−突然変異体へのこのＰ（ｅｒｍＥ）−ｍｐｓの構築物組込み後、相補ｍｐｓ−突然変異体についてグリセリマイシン産生を試験した。図７Ｃに示されるように、グリセリマイシン産生は相補ｍｐｓ−突然変異体において回復できた。
両実験は、ｍｐｓオペロンが（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリンの合成に必要なこと、そして次いでメチルグリセリマイシン合成に使用されることを明瞭に示した。
〔実施例７〕大腸菌及びストレプトミセスセリカラー中にセットされたｍｐｓ１−４遺伝子の発現によるメチルプロリンの異種産生
遺伝子セットｍｐｓ１−４が４−メチルプロリン生合成のために酵素機械をコードすることを確認することために、大腸菌（ｐＥＴ２８−ｍｐｓ）及びＳ．セリカラー（ｐＵＷＬ２０１−ｍｐｓ）において発現する構築物を生成させた。
（ａ）ストレプトミセスセリカラーにおけるｐＵＷＬ２０１−ｍｐｓの産生及び異種発現
グリセリマイシン生合成遺伝子クラスター（配列番号１からの５４２８３−６０１６３ｎｔ）由来の３｀末端を固定するコスミドＢ：Ｌ２３からのＡ〜５．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、構成的ＰｅｒｍＥ*プロモーターの調節下に複製大腸菌／ストレプトミセスシャトルベクターｐＵＷＬ２０１へサブクローニングした。得られた発現構築物ｐＵＷＬ２０１−ｍｐｓは続いて、プロトプラスト法を用いて宿主株ストレプトミセスセリカラーＡ３（２）に形質転換した(Kieser et al., 2000)。形質転換体（Ｓ．セリカラー／ｐＵＷＬ２０１−ｍｐｓ）は、隔壁振盪フラスコ中３０℃で４日間５０ｍｌＴＳＢ培地において野生型株と並行してインキュベートした（突然変異体培養物は最終濃度２０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを補足した）。細胞は遠心分離によって回収し、そして５０ｍｌメタノールで抽出した（１５分超音波及び３０分攪拌）。濾過後抽出液は蒸発乾燥させてそして下記のように誘導体化した。
（ｂ）大腸菌におけるｐＥＴ２８−ｍｐｓの産生及び異種発現
コスミドＢ：Ｌ２３−ＣｍＲからの〜３．７ｋｂのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントは、誘導型Ｔ７プロモーターの調節下にＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩで線形化した発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（Novagen）にサブクローニングした。クローン化３．７ｋｂＤＮＡフラグメントは遺伝子ｍｐｓ１−４（５’末端において配列ＣＴＡＧＡで伸長した配列番号１からの５６４３４−６０１６３ｎｔ）を固定した。得られた発現構築物ｐＥＴ２８−ｍｐｓ並びに空の発現ベクターｐＥＴ２８ｂは続いて、エレクトロポレーションによって宿主株大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／コドンプラス／ｐＬ１ＳＬ２に形質転換した。形質転換体（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／コドンプラス／ｐＬ１ＳＬ２／ｐＥＴ２８−ｍｐｓ又はｐＥＴ２８ｂ）は、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ最終濃度）、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ最終濃度）及びクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ最終濃度）補足の０．２％グルコースを含有する５０ｍｌのＬＢ中３０℃でインキュベートした。培養物はＯＤ600＝０．６まで増殖し、ＩＰＴＧ（０．３ｍＭ最終濃度）で発現誘導し、そして培養は３０℃で更に４時間継続した。細胞は遠心分離によって回収し、そして５０ｍｌメタノールで抽出した（１５分超音波及び２０分攪拌）。濾過後抽出液は蒸発乾燥させてそして下記のように誘導体化した。
（ｃ）抽出物の誘導体化及びＨＰＬＣ−ＭＳ解析
乾燥細胞抽出物並びに（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリン（保持時間及びフラグメンテーションスペクトルの標準品として）は、２００μｌの結合緩衝液（アセトニトリル：ピリジン：トリチルアミン：Ｈ2Ｏ）中で再懸濁した。５０μｌのＰＩＴＣ（フェニルイソチオシアナート）溶液を加えて、そして室温で５分反応後反応を停止するために５０μｌＨ2Ｏを加えた。溶液はspeedvac蒸発によって蒸発乾燥した。得られたＰＩＴＣアミノ酸は１ｍｌ水：アセトニトリル（７：２）中に溶解し、遠心分離しそして上清をspeedvac蒸発によって乾燥した。誘導体化抽出物及び誘導体化（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリン参照基準は次いで、ＨＰＬＣ−ＭＳ解析のために１００μｌ水／アセトニトリル中に溶解した。
全測定は、Waters BEH C18、５０ｘ２．１ｍｍ、１．７μｍｄｐカラムを用いてDionex
Ultimate 3000 RSLCシステムで行った。特に明記しない限り２μｌのサンプルを注入した。分離は、（Ａ）Ｈ2Ｏ＋０．１％ＦＡ〜（Ｂ）ＡＣＮ＋０．１％ＦＡを用いる線形勾配によって６００μｌ／分の流速でそして４５℃において達成した。勾配は、５％Ｂでの０．３３分定組成工程によって開始し、続いて９分で９５％Ｂに増加させ、開始条件との再平衡前に９５％Ｂでの１．６分の水洗工程で終わった。ＵＶ及びＭＳ検出は同時に行った。ＨＰＬＣのＭＳへの連結は、Thermo Fisher Orbitrapに取り付けたAdvion Triversa Nanomate ナノ−ＥＳＩシステムでサポートした。質量スペクトルはＲ＝３００００の解像度で１００−５００ｍ／ｚの範囲で変動するセントロイドモードで得た。衝突誘起解離を用いてモニタリングする単反応は２４７．１１、２４９．１２、２６５．１２、及び２６７．１２ｍ／ｚで行った。全親イオンは２ｍ／ｚウインドウ内で単離し、そして３５％ＣＩＤエネルギーでフラグメンテーションした。
４−メチルプロリンの予想誘導体は、ｍｐｓ発現構築物（ｐＵＷＬ２０１−ｍｐｓ及びｐＥＴ２８−ｍｐｓ）を固定する培養物からの誘導体化抽出物中に検出することができたが、Ｓ．セリカラー（Ｓ．セリカラーＷＴと比べたＳ．セリカラー／ｐＵＷＬ２０１−ｍｐｓ）中の異種発現で例証された図８に示される陰性対照の誘導体化抽出物中には検出できなかった。誘導体化ＰＩＴＣ−（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリン参照物質と保持時間及び高解像度マスデータ（フラグメンテーションデータを含む）の比較により、この化合物はｍｐｓ発現培養物の抽出物中で明瞭に同定することができた。
これは、遺伝子セットｍｐｓ１−４が、グリセリマイシン前駆体４−メチルプロリンの生合成にすべて必要な酵素活性をコードすることを明瞭に証明した。また、経路の２つの提案中間体の誘導体（５−ヒドロキシロイシン及びγ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒド）は検出でき、仮定酵素活性の更なる証明をもたらした。推定ロイシンヒドロキシラーゼの機能は、産生酵素(上記の実施例５)を用いたインビトロ研究によって更に検証できた。第３の仮定中間体３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸は、この化合物が応用方法で誘導体化することができなかったことから、検出できなかった。
２つの異なる宿主株（大腸菌及びＳ．セリカラー）中のｍｐｓ遺伝子の成功した異種発現はまた、この戦略が、例えばグリセリマイシンの有機合成法のために４−メチルプロリンを生成するのに、又はメチルグリセリマイシン収量を増加させるためにグリセリマイシン／メチルグリセリマイシン産生培養物へ前駆体を供給するのに適用することができることを示す。
〔実施例８〕Ａドメイン特異性のインシリコ解析
ＮＲＰＳタンパク質Ａドメインのアミノ酸特異性のインシリコ解析は、Challis et al., 2000に従って行った。簡潔には、Ａドメイン配列は、グラミシジンＳシンテターゼＧｒｓＡのフェニルアラニン−活性化Ａドメイン（ＰｈｅＡ）配列に整列させた。この整列に基づき、結合ポケットにライニングする８アミノ酸を同定し、そして公知の基質特異性を有するＡドメイン由来の特異性付与アミノ酸と比較した。以下の表６では、インシリコで予測された基質に対するＮＲＰＳ−１、ＮＲＰＳ−２及びＮＲＰＳ−３のＡドメインの特異性が示される。比較として、それらが（メチル）グリセリマイシンへの導入のために活性化される実際の基質が挙げられる。
「残基位置は」は、基質認識に重要と考えられる個々のＡドメインの８アミノ酸である（「特異性付与アミノ酸」又は「特異性付与コード」）。これらの残基は公知の基質特異性を有するＡドメインの「特性付与コード」と比較した（http://nrps.igs.umaryland.edu/nrps/blast.html）。
Figure 2014530609
Ａ３ドメイン、Ａ１０ドメイン及び部分的にＡ８ドメインでの結果は、（メチル）グリセリマイシンに実際に組み込まれるアミノ酸と一致した。残りの結果は、応用方法に因ると考えられる実際に組み込まれるアミノ酸と整列していると思われない。グリセリマイシンに組み込まれようとしている基質アミノ酸の特異性に必須と考えられたシンテターゼの８アミノ酸残基に基づいて、プロリンとメチルプロリン特異的Ａドメイン間で異なる可能性はない。
〔実施例９〕メチルプロリン及びプロリン特異的ドメインの系統発生解析
メチルプロリン及びプロリンに特異的なＡドメインの図９に提示される系統発生解析は、ＮＲＰＳモジュール（ＮＲＰＳ−１−Ａ２及びＮＲＰＳ−１−Ａ５及びＮｃｐＢ８（ｍＰｒｏ）及びＮｏｓＡ−Ａ（ｍＰｒｏ））を組み込むメチルプロリン由来のＡドメインが、プロリンを組み込むドメイン（ＮＲＰＳ−２−Ａ８及びＮｏｓＤ（ｍＰｒｏ））のＡドメインに対してよりも互いにより密接に関連していることを示した。これは、特異性が表６に提示される８アミノ酸残基によって決まるだけではないことを示唆した。
解析は、Geneious Pro 5.4.3 ソフトウェアからのGeneious Tree Builder機能(Tree Alignment Options: Cost Matrix (Blosum 62), Gap オープンペナルティ (12), Gap エクステンションペナルティ (3) 及び Alignment タイプ (Global alignment); Tree Builder Options: Genetic 距離モデル (Jukes-Cantor), Tree build method (Neighbor-Joining), Outgroup (No outgroup))を用いて行った。 スケールバーはアミノ酸部位当り０．０９置換を表す。
〔実施例１０〕モジュール２、５及び８のＡドメインの特異性
モジュール２、５及び８のＡドメインの特異性の洞察を得るために、ドメインを組換産生し、そしてそれらの特異性はインビトロにおけるＡＴＰ／ＰＰｉ交換アッセイを経て解析した。結果は図１０に示した。予想どおりに、ドメインＡ２及びＡ５の特異性は（２Ｓ，４Ｒ）−４−メチルプロリンで最大であった。興味深いことに、これはまたドメインＡ８の場合であるが、Ｌ−プロリンは好ましくはグリセリマイシンの生合成中モジュール８に組み込まれた。またＬ−プロリンに対して高い特異性が存在することを示した。モジュール８のＣドメインは好ましくはプロリンと縮合し、そしてそれを成長ペプチド鎖に導入すると仮定した。（メチル）グリセリマイシン生合成中のメチルプロリンの利用可能性はまた、食餌実験によって示すことができるような役割を果すように見えた。０．０２５から１．０ｇ／ｌまでの濃度の４−メチルプロリンの供給は、対照よりも最大で５倍高いメチルグリセリマイシンの増加を示した。この実験はまた組込み速度は直線性ではなく約０．５ｇ／ｌで飽和に達することを示した。またトランス−ヒドロキシプロリン及びトランス−フルオロプロリンによる供給は顕著な組込みを示した。
（ａ）組換Ａ２、Ａ５及びＡ８ドメインの産生
Ａドメイン基質特異性を直接検討するために、ｐＥＴ２８ｂ（＋）由来のＮ−末端Ｈｉｓ６−タグ付きタンパク質としてグリセリマイシン経路からＡドメインのＡ２、Ａ５及びＡ８ドメインを発現させることを目指した。Ａ２、Ａ５及びＡ８のアデニル化ドメインをコードするＤＮＡフラグメントは、ｏｌｉｇｏｓＡ２＿ｆｏｒ ５’−ＣＣＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＧ−３’（配列番号４４）及びＡ２＿ｒｅｖ ５’−ＡＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＣＧＧＣＧＧＧＣＡＧＧＣＣＧＡ−３’（配列番号４５）を用いて、ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３のゲノムＤＮＡから増幅し（高い相同性によりすべての３つのＡドメインは同じプライマーペアを用いて増幅することができ）、そして平滑末端ライゲーションによりｐＪＥＴ２．１にクローニングした。
配列決定により、すべてのＡドメインが正しいことを示した。グリセリマイシンの分子構造及びインシリコ解析によれば、ＡドメインのＡ２及びＡ５は２Ｓ，４Ｒ−メチルプロリンを組み込むことが予想された。ドメインＡ８は、より広い基質特異性を示し、そしてＬ−プロリンか又は２Ｓ，４Ｒ−メチルプロリンを組み込むことが予想された。これをインビトロで決定するために、大腸菌ロゼッタｐＬｙｓ（ＲＡＲＥ）中にＡドメインを一夜１６℃で発現させた。すべての３つのＡドメインを可溶性画分中に得ることができた。
タンパク質は次いで、段階的イミダゾール勾配を用いてＮｉ+−アフィニティクロマトグラフィーで精製した。純粋なタンパク質はすべてのＡドメインで画分８中で得ることができた。タンパク質の量は非常に低かったが（０．２ｍｇ／ｍｌ）、基質特異性を決定するのにＡＴＰ−ＰＰｉ交換アッセイに使用することができた。
３つの精製アデニル化ドメインの基質特異性は、確立したＡＴＰ−ＰＰi交換アッセイ（Mootz and Marahiel. 1997, Thomas et al., 2002) を用いて評価した。簡潔には、各タンパク質は各ドメインの予想基質を含む一団の異なるアミノ酸とインキュベートした。対照として、各タンパク質を更なるアミノ酸の不存在下にインキュベートして、放射能バックグラウンド反応を決定した。９個の異なる基質を試験した(図１０)参照）。
（ｂ）ＡＴＰ−［32Ｐ］ＰＰi交換アッセイによる基質特異性の決定
基質特異性を決定するために、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、７５ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）、ｄＡＴＰ（５ｍＭ）、アミノ酸（５ｍＭ）、及びタンパク質（２μｇ）を含有するＡＴＰ−［32Ｐ］ＰＰi反応（１００μｌ）を３０℃で行った。32Ｐ−四ナトリウムピロリン酸をPerkin Elmer (NEN #NEX019)から得た。反応は、チャコール懸濁液（５００μｌ、１．６％［ｗ／ｖ］活性炭、０．１ＭＮａ4Ｐ2Ｏ7、及び０．３５Ｍ過塩素酸Ｈ2Ｏ溶液）でクエンチング前に、最大３０分間［32Ｐ］ＰＰi（０．１μＣｉの最終量）の添加によって開始した。洗浄液（０．１ＭＮａ4Ｐ2Ｏ7及び０．３５Ｍ過塩素酸Ｈ2Ｏ溶液）で２回洗浄するのに先立って遠心分離によってチャコールをペレット化し、Ｈ2Ｏ（５００μｌ）中で再懸濁し、そして液体シンチレーション(Beckman LS6500)で計数した。
〔実施例１１〕グリセリマイシン生合成クラスターのｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２によってコードされたＸｒｅ−型の転写調節因子
グリセリマイシンの産生においてｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２によってコードされた２つの推定転写調節因子の関与を解明するために、それぞれのＯＲＦの不活性化突然変異体を生成した。その後、グリセリマイシンの産生に対する効果を、それぞれ野生型株ＳＴ１０５６７１及び突然変異株ＳＴ１０５６７１−ｏｒｆ−１及びＳＴ１０５６７１−ｏｒｆ−２６の抽出物のＨＰＬＣ／ＭＳ解析によって決定した。不活性化突然変異体で認められた産生に対する効果がｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２によってコードされた転写調節因子による直接調節に因るかを明らかにするために、調節因子を異種発現してそして精製した。精製タンパク質を電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に使用して、グリセリマイシン生合成クラスターの推定プロモーター領域への直接相互作用を調べた。
（ａ）ｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２の不活性化
ｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２の遺伝子は、相同的組換によりｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２中に組み込むｐＫＣ１１３２プラスミドの誘導体を用いて破壊した。ｐＫＣ１１３２の２つの誘導体（それぞれｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−１及びｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−２６）は、ｏｒｆ−１か又はｏｒｆ−１２のコーディング領域の中心部を運んで構成した。従って、ｏｒｆ−１の６２３ｂｐＤＮＡフラグメント及びｏｒｆ−１２の１１３９ｂｐＤＮＡフラグメントは、プライマー組換ｄｘｒｅｇｒｉｓｅ＿ｆｏｒ／ｄｘｒｅｇｒｉｓｅ＿ｒｅｖ及びｄｘｒｅＩＩｇｒｉｓｅ＿ｆｏｒ／ｄｘｒｅＩＩｇｒｉｓｅ＿ｒｅｖ（プライマー配列は表８参照）をそれぞれ用いて、ＰＣＲ反応によって増幅した。ＥｃｏＲＩ制限部位はその結果使用プライマーによりフラグメントの両端に結合した。ＤＮＡフラグメント及びプラスミドｐＫＣ１１３２はＥｃｏＲＩを用いて消化し、続いてライゲーションにかけた。所望のプラスミドｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−１及びｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−２６をそれぞれ含有するライゲーションは、エレクトロコンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。形質転換体は６０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上で選択した。単コロニーは６０μｇ／ｍｌのアプラマイシンの存在下に液体ＬＢ培地中で増殖し、そしてプラスミドを調製した。正しいインサート（ｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−１及びｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−２６）を運ぶプラスミドは、ＥｃｏＲＩを用いる分析的消化によって同定した。非許容プラスミドｐＵＺ８００２を固定する大腸菌ＥＴ１２５６７細胞は次いで、正しいプラスミドｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−１及びｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−２６を用いて形質転換した。形質転換体は６０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上で選択し、大腸菌株ＥＴ１２５６７ｐＵＺ８００２ｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−１及び大腸菌ＥＴ１２５６７ｐＵＺ８００２ｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−２６を与えた。これらの菌株は、プラスミドｐＫＣ１１３２の誘導体を接合によって菌株ＳＴ１０５６７１に送達するのに使用した。その手順は以下のように実施した。グリセリマイシン産生培地５２８８中そしてＴＳＢ培地中３０℃で増殖したストレプトミセス株ＳＴ１０５６７１の２日齢の２ｍｌを、及びプラスミドｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−１又はｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−２６（２５μｇ／ｍｌのカナマイシン、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び６０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含有するＬＢ中で増殖した）を固定するそれぞれの大腸菌株の２ｍｌをペレット化し、滅菌水で洗浄しそして各々５００μｌのＴＳＢ中で再懸濁化した。２５０μｌのストレプトミセス株ＳＴ１０５６７１及びそれぞれの大腸菌株を混合して、そして３０℃で通気下に一夜インキュベートした。６０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含有するＴＳＢ、及び２０μｇ／ｍｌのナリジクス酸の１ｍｌを加えて、そして３０℃で通気下に一夜更にインキュベートした。培養後細胞をペレット化して、ＴＳＢで１回洗浄しそして６０μｇ／ｍｌのアプラマイシン及び２０μｇ／ｍｌのナリジクス酸を含有するＭＳ寒天でプレートアウトし、続いて接合体が見えるようになるまで３０℃で更なる培養をした。それぞれｏｒｆ−１又はｏｒｆ−１２のコーディング領域中におけるプラスミドｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−１又はｐＫＣ１１３２−ｏｒｆ−２６の正しい組込みは、接合体のゲノムＤＮＡ、及びプライマーｌａｃＺ１、ｌａｃＺ２、及びそれぞれｏｒｆ−１の破壊の場合はｇｒｉｘｒｅＩ＿ｇ１、ｇｒｉｘｒｅＩ＿ｇ２、又はｏｒｆ−１２の破壊の場合はｇｒｉｘｒｅＩＩ＿ｇ１、ｇｒｉｘｒｅＩＩ＿ｇ２の組み合わせを用いて、ＰＣＲを行うことによって検証した。この手順によって生成したＳＴ１０５６７１−ｏｒｆ−１又はＳＴ１０５６７１−ｏｒｆ−２６の不活性化突然変異体を用いて、ＳＴ１０５６７１プレデセサーと比べてのグリセリマイシン産生に対する効果を決定した。
（ｂ）ＳＴ１０５６７１−ｏｒｆ−１又はＳＴ１０５６７１−ｏｒｆ−２６の抽出物のＨＰＬＣ／ＭＳ解析
ｏｒｆ−１の４つの独立不活性化突然変異体及びｏｒｆ−１２の２つの独立不活性化突然変異体の液体培養物は、６０μｇ／ｍｌのアプラマイシンを含有するＴＳＢ液体培地中で２日間増殖させた。これらの培養物を使用して、抗生物質無しの１００ｍｌの新たなＴＳＢ培地は１：５０を各々二重にインキュベートし、それで３日間増殖させた。野生型ＳＴ１０５６７１細胞は、前培養においてアプラマイシンを用いること無しに同等に処理した。細胞は遠心分離によってペレット化しそして上清を酢酸エチル抽出に使用した。グリセリマイシン産生に対する効果をモニターするために、続いて抽出物をＨＰＬＣ／ＭＳ解析によって分析した。各培養物の総タンパク質量に対して各突然変異型及び野生型株ＳＴ１０５６７１のグリセリマイシンの量を決定した。その結果、それぞれのピーク面積を積分し、そしてペレット化細胞の総タンパク質量に対する計数をセットした。平均値及び標準偏差を計算した。ｏｒｆ−１の不活性化はグリセリマイシン産生において２００倍より大きい減少をもたらした。ｏｒｆ−１２の不活性化突然変異体ではグリセリマイシンは検出することができなかった（表７参照）。観察結果から、グリセリマイシン産生の調節においてｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２によりコードされたＸｒｅ型転写調節因子の関与を示した。これらの効果が、Ｘｒｅ型調節因子の結合によるグリセリマイシン産生クラスター内におけるプロモーターの直接調節の結果であるか又は間接効果を表すかについては、ＤＮＡタンパク質相互作用研究（電気泳動移動度シフトアッセイ、ＥＭＳＡ）を行うことによって解明される可能性がある。
Figure 2014530609
（ｃ）ｎｒｐｓ１及びｎｒｐｓ２のプロモーター領域へのＯｒｆ−１及びＯｒｆ−１２の特異的結合検証
調節因子Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２によるグリセリマイシン生合成遺伝子の直接転写遺伝子を調べるために、遺伝子ｎｒｐｓ１及びｎｒｐｓ２上流の推定プロモーター領域へ結合可能性を解明した。それ故、ｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２のコーディング領域を、プライマー組み合わせｘｒｅＩ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ／ｘｒｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｒｅｖ及びｘｒｅＩＩ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ／ｘｒｅＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｒｅｖによるＰＣＲ反応で、鋳型として菌株ＳＴ１０５６７１のゲノムＤＮＡを用いて最初に増幅した。ＮｄｅＩ制限部位は、それにより得られたＤＮＡフラグメントの５’末端に結合し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は３’末端に結合した。プラスミドｐＥＴ２２ｂ及び遺伝子ｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２を運ぶ増幅ＤＮＡフラグメントは、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した。その後、ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２は、２つの別々の試みでＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＥＴ２２ｂによってライゲーションした。ライゲーションは大腸菌ＤＨ１０Ｂへ形質転換し、そして形質転換体は２００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で選択した。プラスミドを調製し、そしてプラスミドへのインサート（それぞれｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２）の正しい組込みをＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｄｅＩ消化物によって検証した。インサートを運ぶプラスミドを最終的に、ＤＮＡ配列における突然変異を排除するためにＤＮＡ配列決定にかけた。クローニング戦略に因り、得られたプラスミドｐＥＴ２２ｂ−ｏｒｆ−１及びｐＥＴ２２ｂ−ｏｒｆ−２６は、それぞれＣ−末端で６倍Ｈｉｓタグ付き（６ｘＨｉｓ）Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２をコードした。両方のプラスミドは、エレクトロポレーションによって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換し、そして形質転換体は２００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で選択された。Ｃ−末端６ｘＨｉｓタグ融合タンパク質Ｏｒｆ−１−Ｈｉｓ及びＯｒｆ−１２−Ｈｉｓの発現は、０．１ｍＭＩＰＴＧの存在下に２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地中において１６℃で一夜行った。細胞は超音波によって溶解し、そしてＯｒｆ−１−Ｈｉｓ（〜３３ｋＤａ）及びＯｒｆ−１２−Ｈｉｓ（〜４７ｋＤａ）の精製はＮｉ2+アフィニティカラムを用いて達成した。
遺伝子ｎｒｐｓ１（ｎｒｐｓ１上流の５８１ｂｐ領域）及びｎｒｐｓ２（ｎｒｐｓ２上流の６３２ｂｐ領域）の推定プロモーター領域は、それぞれプライマー組み合わせｐｒｏｍ４ｈｅｘ２＿ｒｅｖ／ｐｒｏｍ４ｈｅｘ３＿ｆｏｒ及びｐｒｏｍ５ｈｅｘ２＿ｒｅｖ／ｐｒｏｍ５ｈｅｘ３＿ｆｏｒを用いてＰＣＲ反応で増幅し、両端部に１８ｂｐリンカー領域を運ぶＤＮＡフラグメントを与えた。第２のＰＣＲ反応では、これらのＤＮＡフラグメントを各鎖の５’末端でＨｅｘフルオロフォアにより標識化した。ここでは、５’Ｈｅｘフルオロフォアを運び、そして第１のＰＣＲ反応で付着した１８ｂｐリンカー領域に逆相補性であるプライマー（Ｈｅｘ２及びＨｅｘ３）を使用した。遺伝子ｎｒｐｓ１及びｎｒｐｓ２の上記上流領域をスパンニングするＨｅｘ標識化ＤＮＡフラグメントがそれによって生成し、そしてＰｎｒｐｓ１及びＰｎｒｐｓ２と称した。並行試行において、二重プロモーター系を含む、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓＤＫ１６２２のアノテーションゲノムの遺伝子ｍｘａｎ＿３９５０及びｍｘａｎ＿３９５１によってフランキングされた６９６ｂｐ遺伝子間領域は、プライマーＥＨ３３９５１＿ｒｅｖ／ＥＨ３３９５０＿ｒｅｖでそれぞれの菌株のゲノムＤＮＡを用いて増幅した。プライマーは上記のように同じ１８ｂｐリンカー領域を運んだことから、ＤＮＡフラグメントは続いて前述のように両５’末端においてＨｅｘフルオロフォアで標識化した。Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓＤＫ１６２２のゲノム由来のこのプロモーター領域へのＯｒｆ−１−Ｈｉｓ及びＯｒｆ−１２−Ｈｉｓの特異的結合は予想することができなかったので、Ｐｍｘａｎ＿ｃｔｒｌと称する産生ＤＮＡフラグメントはＥＭＳＡアッセイにおける陰性対照としての役割を果した。
これらのＤＮＡフラグメント並びに両方の調節因子（Ｏｒｆ−１−Ｈｉｓ及びＯｒｆ−１２−Ｈｉｓ）は、続いてＥＭＳＡアッセイに使用した。簡潔にはアッセイは以下の通りに行った。４％の自然ＰＡＡ−ゲルを１ｘ緩衝液ＨＧ（２５ｍＭＨＥＰＥＳ、１９２ｍＭグリシン、ＫＯＨでｐＨ７．３）中で調製した。ゲルのポケットをリンスし、そして１ｘ緩衝液ＨＧ中にサンプルなしに１２０Ｖで３０分間電気泳動を行った。サンプル（５００倍モル過剰のＯｒｆ−１−Ｈｉｓか又はＯｒｆ−１２−Ｈｉｓの有り又は無しでの１００ｆＭｏｌの各ＤＮＡフラグメントＰｎｒｐｓ１、Ｐｎｒｐｓ２及びＰｍｘａｎ＿ｃｔｒｌ、及び競合ＤＮＡとして２．５μｇの高分子量のサケ精子ＤＮＡ）を調製して、そして３０℃で１０分間インキュベートした。サンプルをゲル上に負荷して、そして１２０Ｖで２時間電気泳動を行った。ＤＮＡフラグメントの検出はそれぞれの波長でTyphoon 9410 imager (Amersham)を用いて行った。Ｏｒｆ−１−Ｈｉｓの存在下、Ｏｒｆ−１−Ｈｉｓのない試行と比べて各Ｈｅｘ標識化ＤＮＡフラグメントの遅延を、プロモーター領域を含むＤＮＡへの調節因子Ｏｒｆ−１−Ｈｉｓの非特異結合を表す電気泳動で観察することができた。他方で、Ｏｒｆ−１２−Ｈｉｓは、アッセイで使用したＨｅｘ標識化ＤＮＡに対して非特異性を示すいずれかのＤＮＡフラグメントと相互作用する能力を示さなかった。総合すれば、これらの結果は、Ｏｒｆ−１−ＨｉｓもＯｒｆ−１２−ＨｉｓもプロモーターＰｎｒｐｓ１及びＰｎｒｐｓ２の直接転写調節因子ではないことを示唆した。
Ｘｒｅ−型調節因子Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２は、http://smart.embl-heidelberg.de/（図１２）のＳＭＡＲＴツールを用いて決定されたそれらの予想ドメイン体制に関して顕著な態様を示した。予想どおり、両調節因子はＮ末端Ｘｒｅ−型ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフを有し、それによりＯｒｆ−１は明瞭にこの種の第２のドメイン（ＨＴＨ２）を含有した。これに加えて、両調節因子は未知機能をもつ拡張Ｃ末端によって特徴付けられた。
これらの異常特性は、親和性及びそれにより調節因子Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２の特徴のあるＤＮＡ配列に対する特異性に影響を及ぼす調節機構の一部であることが可能であったことから、ＥＭＳＡアッセイは調節因子のＣ−末端短縮バージョンを用いて反復した。Ｏｒｆ−１の場合、これらのバージョンはＨＴＨ１、ＨＴＨ２又は両方の予想ＨＴＨドメインだけを含んだ。それぞれのタンパク質は、ＯＲＦ１−ＨＴＨ１（〜９．６ｋＤａ）、ＯＲＦ１−ＨＴＨ２（〜９．８ｋＤａ）及びＯＲＦ１−ＨＴＨ１２（１６．４ｋＤａ）と命名された。Ｏｒｆ−１２の場合、短縮バージョンだけがＯＲＦ２６−ＨＴＨ（〜９．９ｋＤａ）と命名されたＮ−末端ＨＴＨドメインだけを含有した。Ｃ−末端又は全タンパク質の立体配座変化をもたらし、そしてそれによって調節因子のＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼす、調節効果（例えば未知補因子の結合又はタンパク質−タンパク質相互作用）は除外され得る。
Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２の短縮バージョンは、ＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてＯｒｆ−１及びＯｒｆ−１２の、それぞれ５’領域のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＥＴ２２ｂへのクローニングによって得て、コードＣ−末端６ｘＨｉｓタグ付き融合タンパク質を与えた。クローニングは完全長Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２の場合に記載のように行った。クローニング予定のインサートの増幅に使用されたプライマーペアは、ｘｒｅＩ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ／ｘｒｅＩｈｔｈ１ｒｅｖ（Ｏｒｆ−１−ＨＴＨ１）、ｘｒｅＩｈｔｈ２ｆｏｒ／ｘｒｅＩｈｔｈ１２ｒｅｖ（Ｏｒｆ−１−ＨＴＨ２）、ｘｒｅＩ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ／ｘｒｅＩｈｔｈ１２ｒｅｖ（Ｏｒｆ−１−ＨＴＨ１２）及びｘｒｅＩＩ−ＮｄｅＩ−ｆｏｒ／ｘｒｅＩＩｈｔｈｒｅｖ（Ｏｒｆ−１２−ＨＴＨ）であった。異種発現、精製及び遺伝子ｎｒｐｓ１及びｎｒｐｓ２の上記プロモーター領域への結合のそれに続く検証は、完全長タンパク質に対して記載のように行った。調節因子のこれらの短縮バージョンを用いて行ったＥＭＳＡアッセイは、プロモーターＰｎｒｐｓ１へのＯＲＦ１−ＨＴＨ１２の、及び両プロモーター領域Ｐｎｒｐｓ１及びＰｎｒｐｓ２へのＯｒｆ−１２−ＨＴＨへの特異的結合を示した（図１３）。
Ｏｒｆ−１−ＨＴＨ１２及びＰｎｒｐｓ１の共培養（co-incubation）だけによって、ＤＮＡの電気泳動の顕著な遅延を達成することができた。この遅延は陰性対照Ｐｍｘａｎ＿ｃｔｒｌを用いて観察できなかった。Ｐｎｒｐｓ２との共培養はそれほど明瞭な結果を与えず、それによってプロモーター領域Ｐｎｒｐｓ２へのＯｒｆ−１−ＨＴＨ１２の直接結合について明確な見解はなされ得なかった。Ｐｎｒｐｓ１又はＰｎｒｐｓ２と共培養したＯｒｆ−１２−ＨＴＨは、ＤＮＡフラグメントの明瞭な異なる遅延をもたらしたが、一方で陰性対照Ｐｍｘａｎ＿ｃｔｒｌの場合、シフトは完全に存在しなかった。
これらの実験結果に基づいて、両調節因子のＣ−末端の役割は尚依存として不明であり、しかし、Ｏｒｆ−１及びＯｒｆ−１２のＤＮＡ結合特異性の修飾に関連しているようであった。それにもかかわらず、グリセリマイシンの産生においてｏｒｆ−１又はｏｒｆ−１２の不活性化後に観察した効果に基づいて、プロモーターＰｎｒｐｓ１へのＯｒｆ−１−ＨＴＨ１２の、及びプロモーターＰｎｒｐｓ１及びＰｎｒｐｓ２へのＯｒｆ−１２−ＨＴＨの直接特異的結合、ｏｒｆ−１及びｏｒｆ−１２によってコードしたＸｒｅ−型転写調節因子は、グリセリマイシン生合成と明瞭に機能的に関連し、そして二次代謝物クラスターの一部と考えることができた。
Figure 2014530609
〔実施例１２〕ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３
ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３は、Sanofi-Aventis Deutschland GmbH, Industriepark Hochst, 65926 Frankfurt/Main, Germany によって、２００９年６月４日に、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrase 7B, 38124 Braunschweig, Germany で特許手続きの目的で微生物の寄託の国際的認定に関するブダペスト条約に基づき、２００９年４月６日に寄託された。
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Claims (17)

  1. （ａ）配列番号２〜２７のタンパク質又はそのバリアント若しくはフラグメントをコードし、それによってバリアント又はフラグメントが配列番号２〜２７のタンパク質の機能的に活性なバリアント又はフラグメントをコードする配列番号１に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１〜２６の少なくとも１つを含んでなる核酸、
    （ｂ）配列番号２〜２７のタンパク質の少なくとも１つ、又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントをコードする核酸、
    （ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸によってコードされるタンパク質又はそのフラグメントと、アミノ酸配列において少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９７％同一であるタンパク質をコードする核酸、
    （ｄ）（ａ）〜（ｃ）の核酸とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸、
    （ｅ）（ａ）〜（ｄ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そして長さが１０〜５０のヌクレオチドから成る核酸、又は
    （ｆ）（ａ）〜（ｆ）の核酸に相補的な核酸、
    から選択される少なくとも１つの核酸を含んでなる核酸。
  2. 該核酸は、請求項１の項目（ａ）〜（ｄ）に述べる、配列番号２〜２７のタンパク質のいずれか、又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントをコードする少なくとも２つのＯＲＦ、好ましくは少なくとも３つのＯＲＦを含む、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記核酸は、請求項１の項目（ａ）〜（ｄ）に述べる、配列番号１９、２０、２１及び２２のタンパク質をそれぞれ、又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントをコードするＯＲＦ１８、１９、２０及び２１の少なくとも１つを含む、請求項１又は２に記載の核酸。
  4. 前記核酸は、請求項１の項目（ａ）〜（ｄ）に述べる、配列番号９、１６及び１７のタンパク質をそれぞれ、又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントをコードするＯＲＦ８、１５及び１６の少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
  5. 配列番号１の核酸配列を有し、又はＯＲＦ１〜２６の少なくとも１つのバリアント又はフラグメントを固定する（harboring）配列番号１のバリアント配列を有し、それによってバリアント又はフラグメントが配列番号２〜２７のタンパク質の機能的に活性なそのバリアント又はフラグメントをコードする、グリセリマイシン生合成遺伝子クラスターを含んでなる又はそれから成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
  7. 請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  8. 配列番号２〜２７又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントから選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含んでなる、又は請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸によってコードされる、タンパク質。
  9. 請求項８に記載の、タンパク質の少なくとも１つ、又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントに対して特異的に向けられた抗体。
  10. グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの産生（production）のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、請求項７に記載の宿主細胞又は請求項８に記載のタンパク質、特に配列番号９、１６及び１７のタンパク質の少なくとも１つの使用。
  11. Ｌ−トランス−４−メチルプロリンの産生のための、請求項３に記載の核酸、請求項３に記載の核酸を含んでなる請求項６に記載の発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された請求項７に記載の宿主細胞又は配列番号１９、２０、２１及び２２のタンパク質の少なくとも１つの使用。
  12. ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸を発現すること、及び
    ｂ）場合により、タンパク質又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントを単離すること：
    を含んでなる、請求項８に記載のタンパク質の少なくとも１つ、又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントを産生する方法。
  13. 配列番号２〜２７のタンパク質をコードする配列番号１によって含まれるようなＯＲＦ１〜２６の、又はグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの産生を調節する配列番号２〜２７のタンパク質のバリアントを決定する（determine）方法であって、
    ａ）ＯＲＦ１〜２６のいずれかのバリアントを産生すること、
    ｂ）バリアントをタンパク質中に発現すること、
    ｃ）ｂ）のタンパク質を用いて、グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン若しくはその誘導体の産生を可能にすること、及び
    ｄ１）グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン量を決定すること、ここで、ｂ）のタンパク質は存在しないが、タンパク質の対応するインバリアント型が存在する場合、産生量と比べてグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシン量の増加は、バリアントがグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの産生を増加させることができることを示し、又は
    ｄ２）グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの誘導体の抗生物質活性を決定すること、
    ここでｂ）のタンパク質は存在しないが、タンパク質の対応するインバリアント型は存在する場合、抗生物質活性で比べた抗生物質活性の増加は、バリアントが増加した抗生物質活性でグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンの誘導体を産生することができることを示し、
    そしてここで、誘導体は、アミノ酸組成においてグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンと異なり、そしてグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを超えた抗生物質活性亢進を示す、
    を含んでなる上記決定方法。
  14. 配列番号２〜２７のタンパク質をコードする配列番号１によって含まれるようなＯＲＦ１〜２６の、又はＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生を向上する配列番号２〜２７のタンパク質のバリアントを決定する方法であって、
    ａ）ＯＲＦ１〜２６のいずれかのバリアントを産生すること、
    ｂ）バリアントをタンパク質中へ発現すること、
    ｃ）ｂ）のタンパク質を用いてＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生を可能にすること、及び
    ｄ）Ｌ−トランス−４−メチルプロリン量を決定すること、
    ここで、ｂ）のタンパク質は存在しないが、タンパク質の対応するインバリアント型が存在する場合、産生量と比べてＬ−トランス−４−メチルプロリン量の増加は、バリアントがＬ−トランス−４−メチルプロリンの産生を増加させることができることを示す、
    を含んでなる上記決定方法。
  15. ａ）請求項８に記載の少なくとも１つのタンパク質、又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントを提供すること、又は請求項１３又は１４に記載の方法によって得られるバリアントタンパク質を提供すること、及び
    ｂ）グリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを産生するために、ａ）の少なくとも１つのタンパク質を、Ｌ−Ｎ−メチルバリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−Ｎ−メチルトレオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−Ｎ−メチルロイシン及びグリシンと共にインキュベートすること、
    を含んでなるグリセリマイシン及び／又はメチルグリセリマイシンを産生する方法。
  16. ａ）請求項８に記載の少なくとも１つのタンパク質、又は機能的に活性なそのバリアント若しくはフラグメントを提供すること、又は請求項１４に記載の方法によって得られるバリアントタンパク質を提供すること、及び
    ｂ）Ｌ−トランス−４−メチルプロリンを産生するために、ａ）の少なくとも１つのタンパク質を、Ｌ−ロイシン、５−ヒドロキシロイシン、γ−メチルグルタミン酸γ−セミアルデヒド及び／又は３−メチル−Δ1−ピロリン−５−カルボン酸と共にインキュベートすること、
    を含んでなるＬ−トランス−４−メチルプロリンを産生する方法。
  17. ストレプトミセスＤＳＭ２２６４３。
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