CN104024272B - 用于浅灰霉素和甲基浅灰霉素的生物合成的基因簇 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及牵涉浅灰霉素和甲基浅灰霉素生物合成的基因簇，以及所述基因簇包含的基因。本发明还涉及所述基因簇、所述基因簇所包含的基因以及它们所编码的蛋白质在产生抗生素试剂中的用途。

Description

用于浅灰霉素和甲基浅灰霉素的生物合成的基因簇
本发明涉及抗生素领域，更具体而言，涉及牵涉(甲基)浅灰霉素的生物合成的基因和蛋白质。本发明提供通过重组DNA技术产生(甲基)浅灰霉素的重组方法。
发明背景
浅灰霉素是一种由链霉菌属(Streptomyces)微生物产生的、天然存在的抗生素，所述链霉菌属是放线菌(Actinobacteria)中最大的一个属，也是链霉菌科(Streptomycetaceae)的模式属。链霉菌(Streptomycetes)是革兰氏阳性的，具有高GC-含量的基因组。链霉菌以复杂的次生代谢为特征。它们产生在临床上有用的天然来源的抗生素的超过三分之二。浅灰霉素是由Terlain和Thomas在1971年首次描述的抗生素。其是由10个氨基酸依照如下次序构成，即：N-乙酰化的L-N-甲基缬氨酸、L-反式-4-甲基脯氨酸、L-N-甲基苏氨酸、L-亮氨酸、L-反式-4-甲基脯氨酸、L-亮氨酸、L-N-甲基缬氨酸、L-脯氨酸、D-N-甲基亮氨酸和甘氨酸。所述肽链在甘氨酸和L-N-甲基苏氨酸之间通过酯键环化，形成由N-乙酰化的L-N-甲基缬氨酸和L-反式-4-甲基脯氨酸所组成的非环化尾。
浅灰霉素属于非核糖体合成的微生物肽组，所述肽组显示显著的结构多样性，并包含很多种极有效的抗生素和其他重要的药物。尽管结构多样，但非核糖体合成的微生物肽具有共同的合成模式，即多酶硫模板(thiotemplate)机制。由此，肽键的形成发生在同时代表模板和生物合成机器(machinery)的大的多酶复合物上。这类多酶复合物被命名为非核糖体肽合成酶(NRPSs)。对编码NRPS的基因进行测序揭示出其模块化的组织形式。模块(module)是负责将一个确定的单体并入生长中的多肽链的NRPS多肽链的一部分。因此，NRPS被同时用作模板(因为待并入的氨基酸由所述模块确定)和生物合成机器(因为所述模块携带了所有必需的催化功能)。可以将模块进一步分成几个催化域。这些域至少催化底物活化，共价结合以及肽键形成步骤。功能等同的域分享许多高度保守的序列基序(motif)。可以对它们进行修饰以供多肽链内的活性改变，这开启了对NRPS机器进行操纵的前景。
在每个模块内，特定底物(氨基酸)的选择是由腺苷酰化域(A-域)介导的。这种A-域负责选择构成产物的氨基酸，由此控制产物的一级序列。A-域在消耗ATP的同时将氨基酸以及一些羧基底物活化为氨酰腺苷酸。这一反应性中间物进一步被转运到Ppan辅基(Ppanprosthetic group)的末端半胱胺巯基部分(moiety)上，所述Ppan辅基附接于位于同一模块中的A-域下游的肽基载体蛋白(PCP)域，PCP域也被称作巯基化(T)域。PCP域代表接受经活化氨基酸的转运单元，所述经活化的氨基酸共价地束缚(tether)于它的4′PP辅因子硫酯。这一辅因子充当灵活的臂，以使结合的氨酰基和肽基底物在不同的催化中心之间行进。由于A-域和T-域均需要活化并共价束缚用于随后肽合成的第一构件，所以这两个域的组合定义为引发模块。脂肽途径的引发模块携带附加的N-末端C-域，其用于使酰基侧链和第一氨基酸的氨基基团缩合。所述缩合或C-域是非核糖体肽合成的中心实体，这是因为其负责使相邻模块中结合于T-域的氨酰基底物之间形成肽键。所述酶催化结合于下游(就C-域而言)模块的活化氨基酸的氨基(或亚氨基，羟基)亲核攻击到束缚于上游模块的氨基酸或酰基基团上。然后，所得的肽基中间物顺着用于随后的缩合和进一步的修饰步骤的组装线易位(translocate)。在合成过程中，生长中的肽链由一个模块移交给下一个模块直至其到达最后一个模块的T-域。大多数情况下，此模块包含对于产物的释放而言重要的TE(硫酯酶)-域。产物的释放通过两步骤过程实现，其涉及酰基-O-TE-酶中间物，后者随后被肽-内部亲核物质或水所攻击，分别产生大环产物或线性肽。
非核糖体肽的一个尤其显著的特点是出现D-氨基酸。并入D-氨基酸的一种方式是使用D-氨基酸选择性A-域。然而，更为常见的方式是通过使用E(差向异构化)-域，其出现在负责并入D-氨基酸的模块的C-末端。所述酶催化结合于生长中肽链的L-氨基酸的T-域的差向异构化。通过下游缩合域供体位点的对映异构选择性对结合L-氨基酸的T-域的区分，得到干净的D-构型的产物。
一些NRPS包含甲基转移酶(MT域)，其负责氨基酸残基的N-或C-甲基化，由此使得所述肽不易被蛋白水解分解。两种类型的甲基转移酶(N-或C-甲基转移酶，或缩写为N-MT或C-MT)均使用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体。经常发现所述MT域作为A-域的插入物(Finking et Marahiel,2004；Marahiel,2009)。甚至更加引人注目的是非天然氨基酸如甲基-脯氨酸的并入，所述非天然氨基酸通常是在它们应用于组装线之前生物合成的。或者，在经NRPS组装后酶促修饰并入的氨基酸。
浅灰霉素天然地通过链霉菌属的微生物产生。然而，尽管现有技术中已知链霉菌产生浅灰霉素，但是负责浅灰霉素生物合成的遗传位点目前尚未鉴定。因此，对浅灰霉素生物合成进行靶向和修饰仍然受到限制。所以，需要有关浅灰霉素生物合成的遗传信息。
发明内容
除了浅灰霉素之外，链霉菌还产生浅灰霉素的变体形式，称作甲基浅灰霉素。甲基浅灰霉素包含L-反式-4-甲基脯氨酸代替L-脯氨酸。甲基浅灰霉素在其用作抗菌剂时相对于浅灰霉素具有一些优势，如不同的抗菌特异性，但是其由链霉菌类仅作为副组分(sidecomponent)产生。因此，需要有关甲基浅灰霉素生物合成的遗传信息。
浅灰霉素和甲基浅灰霉素所包含的甲基脯氨酸部分，即L-反式-4-甲基脯氨酸的产生是完全未知的。因此，需要有关L-反式-4-甲基脯氨酸生物合成的遗传信息。
现在，已鉴定了编码牵涉(甲基)浅灰霉素生物合成途径的多肽的遗传座位。本发明的发明人由链霉菌DSM 26643基因组DNA成功地分离并克隆出整个浅灰霉素生物合成基因簇。本发明的发明人也成功地阐明了编码牵涉(甲基)浅灰霉素生物合成途径的多肽(包括负责L-反式-4-甲基脯氨酸形成的多肽)的开放阅读框(ORF)。这允许在分子水平确认并影响不同的生物合成步骤。
因此，在一个方面，本发明提供核酸，其包含选自下述的至少一种核酸：
(a)核酸，其包含SEQ ID NO:1中所包含的、编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的开放阅读框(ORF)1-26中的至少一个ORF或其变体或片段，由此所述变体或片段编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的功能活性变体或片段，
(b)核酸，其编码SEQ ID No:2-27的蛋白质中的至少一种蛋白质或其功能活性变体或片段，
(c)核酸，其编码氨基酸序列与(a)或(b)的核酸所编码的蛋白质或片段至少70％、80％、90％、95％或97％同一的蛋白质，
(d)核酸，其在严格条件下与(a)-(c)的核酸杂交，
(e)核酸，其在严格条件下与(a)-(d)的核酸杂交，且有长10-50个核苷酸组成，或
(f)核酸，其与(a)-(f)的核酸互补。
发明详述
包含在本发明中的核酸，在一个实施方案中，是包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成的核酸，SEQ ID NO:1作为链霉菌DSM 26643基因组的一部分包含长66,868个核苷酸的浅灰霉素生物合成基因簇。这一新近发现的基因簇包含至少26个ORF，被命名为ORF 1到ORF 26(ORF 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26)或分别用基因名orf-1、orf-2、orf-3、orf-4、orf-5、orf-6、orf-7、nrps-1、int-1、tnp-1、int-2、tnp-2、tnp-3、dna、nrps-2、nrps-3、mbtH、mps-1、mps-2、mps-3、mps-4、orf-8、orf-9、orf-10、orf-11、orf-12来命名，从SEQ ID NO:1的第837位核苷酸到第66108位核苷酸，长65272个核苷酸。这些ORF分别编码牵涉(甲基)浅灰霉素生物合成的、SEQ ID No:2-27(SEQID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27)的蛋白质。下面给出由浅灰霉素生物合成基因簇编码的蛋白质的结构和功能表征。
在本发明中，术语“(甲基)浅灰霉素”指浅灰霉素，也指甲基浅灰霉素。浅灰霉素是一种由下述10个氨基酸构成的抗生素，即：乙酰化的L-N-甲基缬氨酸(1)、L-反式-4-甲基脯氨酸(2)、L-N-甲基苏氨酸(3)、L-亮氨酸(4)、L-反式-4-甲基脯氨酸(5)、L-亮氨酸(6)、L-N-甲基缬氨酸(7)、L-脯氨酸(8)、D-N-甲基-D-亮氨酸(9)和甘氨酸(10)。图1给出了浅灰霉素以及甲基浅灰霉素的结构式。浅灰霉素及其变体甲基浅灰霉素由牵涉本发明鉴定的(甲基)浅灰霉素生物合成基因簇的相同基因的相同生物合成途径以不同的量产生。甲基浅灰霉素因在第8位存在L-反式-4-甲基脯氨酸而非L-脯氨酸而不同于浅灰霉素。负责将L-反式-4-甲基脯氨酸并入甲基浅灰霉素与将L-脯氨酸并入浅灰霉素的多域-酶是相同的酶，即NRPS-2，且为本发明鉴定的基因nrps-2的蛋白质产物。
在本发明中，术语“基因簇”指位于基因组中邻接的一段序列上的几个基因的组，且其指导(甲基)浅灰霉素的合成。属于该基因簇的基因中的一些是相关并归入基因家族的基因。它们编码结构和功能上相似的蛋白质。其余的基因在结构上不相关且编码具有不同结构和功能的蛋白质。所编码的蛋白质或是催化反应的酶，或是涉及调节或转运之类。总之，所述基因簇所包含的基因编码用于(甲基)浅灰霉素生物合成目的的蛋白质。
术语“核酸”涵盖分别编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的ORF 1-26所定义的核酸，以及天然出现的和非天然出现的变体及其片段(如本发明所定义的)。所述核酸可以是任何由载有遗传信息或在细胞内形成结构的单体核苷酸的链构成的大分子。最常见(因此优选的)核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。所述核酸可以是DNA分子，如基因组DNA分子如SEQ ID NO:1，或为单链或双链cDNA分子如代表ORF并编码蛋白质的核酸，还可为合成的DNA，如合成的单链多核苷酸如引物或探针。本发明的核酸也可为RNA分子。优选地，所述术语也涉及基因的非编码区，其中，这些部分具有特异于该基因的相关大小。这些区的实例是调节元件如启动子。更优选地，术语“核酸”涉及基因、ORF、启动子、DNA、cDNA或mRNA。编码所需遗传信息的核酸(优选DNA)可包含所关注的基因，启动子区，起始密码子和终止密码子，和可用于调节所述基因的表达的可能的其他区。所述调节区与各基因可为异源的，或可与其天然相关。遗传信息可以是持久表达的，或在导入了本发明的核酸的细胞中的阻抑蛋白和/或启动子区的控制下表达。所获得的细胞或直接使用，或用于组织培养，或者可收获所述细胞并通过破坏所述细胞获得包含各蛋白质的样品。或者，DNA或RNA可用于细胞中或用于无细胞表达系统，例如微阵列系统，其中将DNA或RNA固定，并通过添加包含转录和/或翻译所需的因子(酶、核糖体、tRNA、氨基酸、核苷酸、ATP等)的功能性细胞裂解物进行翻译和/或转录。还包括的是人工核酸，包括肽核酸(PNA)、吗啉代(morpholino)和锁定核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些的每一种均通过对分子骨架的改变而区别于天然存在的DNA或RNA。
本申请中所用的术语“包含/包括(comprising)”意指“包括(include)或涵盖(encompass)”所需的特征和不必要特别提及的另外的特征。所述术语“包含/包括”也意指由所需的特征组成(“consist of”)，且不包含所需特征之外的另外的特征。由此，本申请的核酸或蛋白质可以由除所指示的定义之外(例如除了通过ORF或SEQ ID号定义之外)的其他特征所定义，或者仅由所指示的特征组成。
术语“异源的”在涉及核酸序列如编码或控制序列时，指通常不与重组构建体和/或具体细胞的区相关联的序列。“异源的”区是另一核酸内或附接于另一核酸的可鉴定的核酸区段，未发现其在自然界中与所述其他分子相关联。例如，构建体的异源区可为未发现其在自然界中与本发明所鉴定的基因相关联的调节区。类似地，异源序列可为编码序列，其本身因包含例如具有不同于天然基因的密码子的合成序列而未在自然界中被发现。而且，用通常不存在于宿主细胞中的构建体转化的宿主细胞，就本发明而言被认为是异源的。同源核酸序列是如本申请所定义的是变体序列。术语“同源的”可与变体互换使用。术语“同源的”也可以指同一的序列。
在本发明的一个实施方案中，所述核酸包含一种核酸分子，其编码SEQ ID No:2-27的序列所包含的至少一个独特的蛋白质。在一个实施方案中，SEQ ID NO:1所包含的(甲基)浅灰霉素基因簇的整个序列包含在本发明的核酸中。在另一实施方案中，所述核酸是编码SEQ ID No:2-27的至少一种蛋白质的功能活性变体或片段的ORF 1-26的变体或片段。最优选的核酸编码如下详述的天然存在的ORF 1-26的变体蛋白质，更优选天然存在的链霉菌属蛋白，更优选SEQ ID No:2-27的蛋白质，其牵涉(甲基)浅灰霉素的合成。
术语“核酸”可包括本申请所公开的全长ORF 1-26，也可包含ORF 1-26的片段或部分序列。所述ORF 1-26的片段或部分序列分别编码具有SEQ ID No:2-27所示的氨基酸序列的蛋白质的片段。这可包括具有短的内部和/或C-和/或N-末端缺失的片段化蛋白质，由此本申请定义的所得蛋白质的活性保留至如ORF 1-26所编码的野生型蛋白质的活性的5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上，95％以上，97％以上，或100％以上，例如多于150％，200％，300％，400％或500％。因此，编码此种片段的各核酸包含ORF 1-26之内和/或5’和/或3’末端的缺失，例如缺失最多50％，45％，40％，35％，30％，25％，20％，15％，10％，5％或更少。在本发明语境中，编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的功能活性片段的片段化核酸序列意指编码片段的序列，所述片段指导(甲基)浅灰霉素的合成和/或可取代编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的各ORF以指导(甲基)浅灰霉素的合成。
术语“核酸”可指本申请所公开的ORF 1-26的变体，其编码本申请所定义的SEQ IDNo:2-27的蛋白质的功能活性变体。此种功能活性变体与SEQ ID No:2-27具有高于50％，高于60％，优选高于70％，更优选高于80％，更优选高于85％，更优选高于90％，更优选高于95％，最优选高于97％的序列同一性，和/或具有SEQ ID No:2-27的蛋白质的活性的5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上，95％以上，97％以上，或100％以上，例如SEQ ID No:2-27的蛋白质的活性的多于150％，200％，300％，400％或500％。因此，编码此类变体的核酸包含在ORF 1-26之内和/或5`和/或3`末端的缺失、插入、取代和/或添加，同时显示出与ORF 1-26的序列50％以上，60％以上，70％以上，优选80％以上，更优选85％，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选97％以上的同一性。在本发明的语境中，编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的功能活性变体的变体核酸序列意指编码变体的序列，所述变体指导(甲基)浅灰霉素的合成和/或取代编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的各ORF以指导(甲基)浅灰霉素的合成。
需注意的是以上所提及的修饰可组合。例如，本发明所包含的核酸可为包含ORF1-26的一个或多个变异的片段。还应注意的是，片段或变体包括本申请所定义的与ORF 1-26或其片段或变体天然相关联的启动子或调节序列的片段或变体。这些变体具有功能活性，因为它们调节与之相关联的基因的转录或翻译。
ORF是开放阅读框，其是可潜在地编码蛋白质的DNA序列。在本发明的语境中，术语“ORF”表示分离自链霉菌DSM 22643的(甲基)浅灰霉素生物合成基因簇中的开放阅读框(ORF 1-26)。本发明人成功地鉴定了链霉菌DSM22643的浅灰霉素生物合成基因簇，并在65272个核苷酸的一段鉴定出26个ORF。将这些ORF分别命名为orf-1、orf-2、orf-3、orf-4、orf-5、orf-6、orf-7、nrps-1、int-1、tnp-1、int-2、tnp-2、tnp-3、dna、nrps-2、nrps-3、mbtH、mps-1、mps-2、mps-3、mps-4、orf-8、orf-9、orf-10、orf-11或orf-12。链霉菌DSM22643的整个浅灰霉素生物合成基因簇长66868个核苷酸，包含ORF 1-26以及分别位于ORF1和ORF 26的5’和3’端的另外的核苷酸。
SEQ ID NO:1所包含的26个ORF从链霉菌DSM 26643的SEQ ID NO:1中第837位的核苷酸延伸至第66108位的核苷酸。表1中显示了具体的推定ORF，相应基因的名称，SEQ IDNO:1内的起始和终止核苷酸，以核苷酸(nt)表示的基因的长度，链型，推定所编码的蛋白质的氨基酸数(aa)，蛋白质名称以及所述蛋白质的SEQ ID号的列表。表2显示以可从NCBI(National Centre for Biotechnology Information；National Library of Medicine38A,Bethesda,MD20894；USA；www.ncbi.nih.gov)获得的其GenBank登录号命名的蛋白质。已基于同源性搜索对这些蛋白质进行了鉴定，显示出其与SEQ ID No:2-27的蛋白质的最高同一性/相似性。这些蛋白质通过它们的功能、它们的登录号以及它们的来源进行定义。表2还显示e-值以及SEQ ID No:2-27的蛋白质和上述通过同源性搜索鉴定的蛋白质之间的同一性和相似性程度。所述e-值涉及预计数目的随机比对(chance alignment)，所述随机比对具有至少等于所观察到的比对分数的比对分数。e-值为0.00指示完全同源。e-值的计算如Altschul S.F.等1997中所述。e-值帮助确定两条序列是否显示充分的相似性，以证明同源性推断的正确性。同一性指示在相比较的蛋白质中各自位点上存在同一的氨基酸，而相似性显示在各自的位点上存在如下述定义的保守氨基酸取代。而且，还指示由ORF 1-26编码的蛋白质的推定的功能。
变体核酸取代ORF 1-26以指导(甲基)浅灰霉素的合成意指此变体核酸可插入链霉菌DSM 22643的基因组中代替变体所来源的ORF(ORF to which it is a variant)，由此表达变体蛋白，所述变体蛋白接管了SEQ ID No:2-27的各蛋白质的功能并指导(即参与)(甲基)浅灰霉素的合成。所述变体接管所述功能的程度如本申请中所定义。
在另一个实施方案中，所述核酸编码SEQ ID No:2-27的蛋白质。如表1所示，所述核酸可包含带有起始和终止核苷酸(nt)的SEQ ID NO:1中所包含的ORF 1-26的序列。所述核酸也可编码与SEQ ID No:2-27的蛋白质具有相同氨基酸的蛋白质，但是由于遗传密码的简并性所述核酸在其核苷酸组成上不同。
在又一个实施方案中，所述核酸在严格条件下与核酸杂交，所述核酸包含于SEQID NO:1所鉴定的(甲基)浅灰霉素基因簇，或构成ORF 1-26，或编码具有SEQ ID NO:2-27或其功能活性变体或者片段的蛋白质。在本发明中，术语“在严格条件下杂交”指在两个核酸分子之间在允许形成所谓特异性杂合体而基本上不形成非特异性杂合体的条件下形成杂合体。所述条件的例子包括如下条件，在该条件下高度同一的核酸的互补链，即由与SEQ IDNO.1或ORF 1-26中所示的核苷酸序列具有70％或以上，优选80％或以上，更优选85％或以上，还更优选90％或以上，甚至更优选95％或以上同一性的核苷酸序列构成的DNA杂交，而低于上述的同一性程度的互补性较低的核酸链不杂交。更具体而言，所述严格条件指钠盐浓度为15-750mM，优选50-750mM，更优选300-750mM，温度为25-70℃，优选50-70℃，更优选55-65℃，且甲酰胺浓度为0-50％，优选20-50％，更优选35-45％的条件。此外，在严格条件下，杂交后洗涤滤器的条件通常包括下述：钠盐浓度为15-600mM，优选50-600mM，更优选300-600mM，温度为50-70℃，优选55-70℃，更优选60℃。可例如通过升高反应温度和/或降低反应缓冲液的离子浓度来提高严格性从而提高特异性。例如，低严格条件包括在3x SSC中在室温到65℃杂交，高度严格条件包含在0.1x SSC中在68℃杂交。示例性的中等严格条件(就核酸的密码子组成而言，如果它们为最大限度简并，则核酸在中等严格条件下杂交)包括50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS于42℃，并在1x SSC中于45℃洗涤。高度严格条件包括于42℃,50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS温育(例如50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS，50mM磷酸钠,5x登哈特氏(Denhardt’s)溶液，10x硫酸右旋糖酐，20mg/ml经剪切的鲑鱼精DNA)或5x SSC和1％SDS于65℃温育，并于0.2x SSC和0.1％SDS中于约65℃洗涤(1x SSC代表0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸三钠缓冲液)。在本发明中优选的是中等和高度严格条件，最优选高度严格条件。在本发明的语境中，“杂交(hybridizing)”序列意指序列，所述序列编码指导(甲基)浅灰霉素合成的蛋白质，和/或可替代能与其特异性杂交的ORF从而指导(甲基)浅灰霉素的合成。
在本发明的又一优选实施方案中提供了与上述鉴定的核酸在严格条件下杂交并由长5到100个核苷酸组成的核酸。本申请所提供的序列信息可用来设计特异的核苷酸探针和引物，后者可用于鉴定和分离产生(甲基)浅灰霉素并携带SEQ ID No:2-27的任意蛋白质或其变体的微生物。因此，所述核酸探针具有序列，其见于或因遗传密码子的简并性衍生自SEQ ID NO:1或其变体所包含的(甲基)浅灰霉素基因簇中的序列，或编码任意SEQ ID No:2-27或其功能活性变体。术语“探针”指DNA，优选单链的，或者RNA分子，或其修饰物或组合，其在上述定义的严格条件下与核酸分子或它们的互补或有义序列杂交，所述核酸分子包含于SEQ ID NO:1或其变体所鉴定的(甲基)浅灰霉素基因簇中或编码SEQ ID No:2-27的任何蛋白质或其功能活性变体。通常，探针显著短于全长序列。它们可包含5-100，优选10-80个核苷酸，更优选10-50个核苷酸，还更优选10-40个核苷酸且还更优选15-25个核苷酸。具体而言，此种探针可具有序列，其与SEQ ID NO:1所包含的编码序列(ORF 1-26)或非编码序列至少70％，至少75％，优选至少85％，更优选至少95％并最优选100％同源，或依上述程度与其互补。它们可包含经修饰的碱基，例如肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、脱氧尿苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷或二氨基-2,6-嘌呤。糖或磷酸残基也可如本领域已知的修饰或取代。例如，脱氧核糖残基可以被聚酰胺替代，磷酸残基可被酯基如二磷酸酯、烷基(alky)、芳基磷酸酯或硫代磷酸酯替代。可替换地或此外，核糖核苷酸上的2’-羟基基团可通过包括基团如烷基、O-烷基或卤素基团而修饰。本发明的探针可用于任何常规的杂交技术，例如斑点印迹、Southern印迹、Northern印迹或夹心技术，后者为使用具有彼此间至少部分不同的核苷酸序列的特异捕获和/或检测探针的技术(Sambrook等,Molecular cloning:A laboratorymanual.Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)。引物用于在扩增(例如PCR)、延长或反转录方法中起始DNA的酶促聚合反应。用于涉及PCR的诊断方法的引物通过本领域已知的方法标记。它们也可被用作探针。原则上，引物可具有与探针相同的特征。它们可包含5-100个，优选10-80个核苷酸，更优选10-50个核苷酸，还更优选10-40个核苷酸，且还更优选15-25个核苷酸。在本发明的语境中，所述引物或探针可用于检测、鉴定和/或分离产生(甲基)浅灰霉素特别是包含SEQ ID No:2-27的任何蛋白质或其功能活性变体的微生物，用于检测、鉴定和/或分离编码SEQ ID No:2-27的蛋白质或其功能活性变体的DNA或RNA，和/或用于扩增编码SEQ ID No:2-27的蛋白质或其功能活性变体的DNA或RNA。因此，在本发明的一个实施方案中包含一种试剂，所述试剂含有用于以上概述的检测、鉴定和/或纯化目的的引物或探针。
或者，鉴定编码在(甲基)浅灰霉素生物合成途径中具有活性的蛋白质的核酸可以通过筛选与抗体的反应性或交叉反应性来实现，所述抗体是针对具有SEQ ID No:2-27或其功能活性变体或片段的氨基酸序列的蛋白质产生的。所述步骤如下：针对SEQ ID No:2-27的蛋白质或其功能活性变体或片段、融合多肽(例如，MBP、GST或His-标签系统的表达产物)或由SEQ ID No:2-27的蛋白质或其已知变体或片段衍生的合成肽特异地产生抗体。可通过多种方法包括Western印迹,斑点印迹和ELISA确定特异的抗原性。一旦产生了特异性的抗体，此抗体即可用于鉴定编码蛋白质的核酸，所述蛋白质携带产生所述抗体所针对的免疫源性肽，由此鉴定本申请所定义的作为SEQ ID No:2-27的蛋白质或其功能活性片段或其变体的蛋白质。本申请所使用的特异的抗原性或特异性抗体的意指所述抗体仅与产生该抗体所针对的免疫源性肽结合。
在又一实施方案中，所述核酸互补于核酸序列，所述核酸序列包含于SEQ ID NO:1中，或编码SEQ ID NO:2-27的蛋白质或其功能活性片段或变体。
在一个实施方案中，所述核酸包含至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个或以上的ORF，所述ORF选自编码浅灰霉素生物合成基因簇的SEQ ID No:2-27所示的多肽的ORF 1-26，或其功能活性片段或其变体。在一个优选的实施方案中，所述核酸包含特定的ORF或特定ORF的组合，所述ORF或其组合牵涉(甲基)浅灰霉素生物合成过程中限定的步骤，或者一起在(甲基)浅灰霉素生物合成过程中限定的步骤中起作用。在一个更优选的实施方案中提供了选自ORF 1-27的ORF的组合，其编码管理(甲基)浅灰霉素生物合成的多肽。在一个还更优选的实施方案中，所述ORF是ORF 8，15或16，或者所述组合包含编码非核糖体蛋白质合成酶(NRPS)的亚基分别命名为nrps-1、nrps-2和nrps-3的ORF 8、15或16中的至少两个。在另一实施方案中，所述核酸包含ORF 18、19或21，或L-反式-4-甲基脯氨酸生物合成所需的构成分别命名为mps-1、mps-2、mps-3和mps-4的基因的ORF 18-21中至少两个或者构成分别命名为mps-1、mps-2和mps-4的基因的ORF 18、19和21中至少两个的组合。在又一实施方案中，ORF 8、15和/或16可与ORF 18、19、20和/或21，或与ORF 18、19和/或21组合以增强L-反式-4-甲基脯氨酸和(甲基)浅灰霉素(特别是甲基浅灰霉素)的产生。由此，任何ORF1-26均可与ORF 1-26的任何变体或片段组合以指导(甲基)浅灰霉素的合成。在本发明的又一实施方案中，所述ORF可能是不变的，但是控制元件(例如，启动子，核糖体结合位点，终止子，增强子等)可被修饰。
在另一实施方案中提供了一种核酸，其包含浅灰霉素生物合成基因簇或由浅灰霉素生物合成基因簇组成，所述浅灰霉素生物合成基因簇具有SEQ ID NO:1的序列或含有ORF1-26中至少一个的变体或片段的SEQ ID NO:1的变体序列，所述变体或片段编码SEQ IDNo:2-27的蛋白质的功能活性变体或片段。SEQ ID NO:1的(甲基)浅灰霉素基因簇内任何ORF 1-26的变体或片段化序列处于不被另外修饰的状态可导致SEQ ID No:2-27的一个或多个变体蛋白质，其修饰(甲基)浅灰霉素合成途径中的特定步骤。这可导致增强的(甲基)浅灰霉素或L-反式-4-甲基脯氨酸的产生，或导致具有增强的抗生素活性的(甲基)浅灰霉素的经修饰的结构。例如，ORF 8、15和16和/或18、19、20和21中的任何ORF均可在上述SEQID NO:1所包含的浅灰霉素簇内被修饰，而剩余的ORF保持不变。可替换地或此外，可对控制元件进行修饰导致ORF1-26中至少一个的经修饰的表达。
由此，在本发明的一个实施方案中提供一种核酸，其包含牵涉(甲基)浅灰霉素生物合成的至少一个ORF，例如ORF 18、19、20和21(或另外称为ORF18-21)，或ORF 18、19和/或21，和/或ORF 8、15和/或16，或者如本申请所定义的这些ORF的功能活性变体或片段。可在异源细胞中表达或过表达一个ORF或者ORF的组合以允许产生各蛋白质，所述蛋白质可例如用作发酵辅助物以增强浅灰霉素，特别是甲基浅灰霉素在内源或异源产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的生物中的产生。或者，可在产生(甲基)浅灰霉素的细胞或生物中表达或过表达本发明包含的ORF或者ORF的组合以增强各蛋白质的产生，从而增强(甲基)浅灰霉素的产生和/或有利于甲基浅灰霉素的产生。例如，ORF 18-21或者ORFs 18、19和21可伴随表达以允许合成L-反式-4-甲基脯氨酸。L-反式-4-甲基脯氨酸的增强产生可用于增强相对于浅灰霉素产生的甲基浅灰霉素产生，如可通过下述证明的：提供4-甲基脯氨酸而获得5倍高量的甲基浅灰霉素。因此，在本发明的一个优选的实施方案中，可通过根据本领域已知或本申请描述的方法引入核酸并允许表达所述基因以及(甲基)浅灰霉素基因簇的基因来增强链霉菌DSM 22643或者产生(甲基)浅灰霉素的其他生物中甲基浅灰霉素的产量/产率(yield)，所述核酸包含牵涉L-反式-4-甲基脯氨酸生物合成的基因，特别是ORF18-21，更特别是ORF 18、19和21。可替换地或此外，可表达至少一个nrps核酸(ORF 8、15和/或16)用于在异源生物中合成(甲基)浅灰霉素，或者在内源表达(甲基)浅灰霉素的生物中增强其表达。可替换地或此外，可表达调节(甲基)浅灰霉素合成的变体核酸以增强(甲基)浅灰霉素的合成，从而有利于甲基浅灰霉素的合成或者产生氨基酸组成不同于(甲基)浅灰霉素的(甲基)浅灰霉素的衍生物，其为例如更有效的抗生素。例如，可通过诱变或通过肽合成酶之间的域交换来改变NRPS蛋白质的A域的氨基酸的特异性，由此允许选择不同的氨基酸并产生天然(甲基)浅灰霉素的衍生物。或者，可使编码NRPS2的模块8的A-域的核酸突变以产生变体核酸，其导致增强L-反式-4-甲基脯氨酸插入到新生肽链中，由此导致与野生型相比增强的甲基浅灰霉素的产生。或者，可交换整个模块8，或者交换或突变模块8的C-域以优选地浓缩甲基脯氨酸。
在浅灰霉素的第2位和第5位，甲基浅灰霉素的第2、5和8位包含L-反式-4-甲基脯氨酸。L-反式-4-甲基脯氨酸可通过化学产生，然而，化学产生是成本密集型的且耗费时间。因而，本发明的一方面提供包含牵涉L-反式-4-甲基脯氨酸生物合成的基因的核酸，特别是ORF 18-21或ORF 18、19和21，或是本申请所定义的这些ORF的功能活性变体或片段。可在异源细胞中表达或过表达这些ORF的组合以允许产生L-反式-4-甲基脯氨酸，用作例如发酵辅助物以增强浅灰霉素，特别是甲基浅灰霉素在内源或异源产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的生物中的产生。或者，在天然产生(甲基)浅灰霉素的细胞或生物中表达或过表达这些基因的组合以增强L-反式-4-甲基脯氨酸的产生从而有利于甲基浅灰霉素的产生。因此，在本发明的一个优选实施方案中，可通过根据本领域已知或本申请所述的方法，向内源或异源产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的生物，例如链霉菌DSM 22643中引入包含牵涉L-反式-4-甲基脯氨酸的生物合成的基因，特别是ORF 18-21，更特别是ORF 18、19和21的核酸，并允许表达所述基因以及浅灰霉素生物合成基因簇的基因，从而在链霉菌DSM 22643中增强甲基浅灰霉素的产量。
可通过任何已知的方法提供本发明的核酸。使用本申请所提供的序列信息，可根据本领域技术人员已知的标准方法确定适合于扩增/分离一个或多个ORF的引物。本申请所定义的适合于扩增/分离一个或多个ORF的引物根据序列表中提供的核苷酸序列信息设计。所述步骤如下：选择可由10-40个，优选15-25个核苷酸组成的引物。有利的是选择以足以保证有效杂交的比例包含C和G核苷酸的引物；即C和G核苷酸的量为总核苷酸含量的至少40％，优选50％。通常，所述扩增将利用包含必需基因的生物(如链霉菌属，尤其是链霉菌DSM 22643)的DNA或RNA作为模板。将进行标准的PCR反应，其通常含有0.5-5个单位的TaqDNA聚合酶每100μl体积，20-200μM每种脱氧核苷酸，优选以相同的浓度，高于总脱氧核苷酸浓度的镁0.5-2.5mM，105-106个靶分子，以及每种引物约20pmol。进行约25-50个PCR循环。更严格的退火温度提高对不正确地退火的引物的辨别力并减少不正确的核苷酸在引物的3’端并入。95℃-97℃的变性温度是典型的，尽管更高的温度可适合于富含G+C的靶物的变性。所实施的循环数依赖于靶物分子的起始浓度，尽管通常不建议多于40个循环，因为往往会积累非特异性背景产物。使用本申请所定义的引物和探针对DNA或RNA文库进行杂交筛选是用于提取编码本申请所定义的变体多肽的多核苷酸的替代方法。杂交步骤是已知的，且在本领域和本申请中描述。
可替换地或此外，所述核酸可通过克隆由此将其引入细胞并在细胞中进行扩增来提供。由此，在本发明的另一方面提供包含本申请所定义的核酸的载体以及用所述表达载体转化的宿主细胞。将基因引入受体细胞的过程称作转化。可通过本领域已知的多种手段将所述基因引入所述细胞并适于各细胞类型。术语“细胞”或“宿主细胞”指所述基因在其中表达的细胞，而无论是原核细胞还是真核细胞，也无论所述细胞是否天然表达各基因。由此，在一个优选的实施方案中，所述细胞可以是天然携带表达本发明所包含的蛋白质的基因的细胞，例如链霉菌DSM 22643。本领域中公知的用于引入并表达核酸分子的重组DNA克隆技术可用于引入和表达所述基因，如果所述细胞携带各基因则所述基因是内源的，或者如果所述基因对于所述细胞不是内源的则该基因是异源的。可使用任何适当手段包括基于病毒或噬菌体的载体、化学试剂、电穿孔、磷酸钙共沉淀或者DNA直接扩散转化细胞。载体是将内源或异源基因转运到细胞中的物质，且可包括适当的转录和翻译控制信号如启动子。载体可为质粒、病毒(例如噬菌体)或本领域已知的其他形式。载体能够在宿主细胞中自发复制或可并入染色体DNA中。术语“载体”包括那些主要作用在于将核酸插入到细胞中的载体，或那些主要作用在于细胞中核酸复制的载体(复制载体)，或那些主要作用在于细胞中DNA或RNA的转录和/或翻译的载体。载体的实例包括pBTrp2、pBTac1、pBTac2(全部由Boehringer Mannheim制造),pKK263-2(由Pharmacia制造)、pGEX(由Pharmacia制造)、pSE280(由Invitrogen制造)、pGEMEX-1(由Promega制造)、pQE-8(由Qiagene制造)、pET-3(由Novagen制造)、pBluescriptII SK+(由Stratagene制造)、pBluescript II SK(-)(由Stratagene制造)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pSTV28(由Takara Bio Inc.制造)、pUC118(由Takara Bio Inc.制造)、pHW1520(由MoBiTec制造)、pSET152、pOJ436和pOJ446(Bierman M,等,1992)、pSH19(Herai S,等,2004)、pUWL199、pUWL218和pUWL219(Wehmeier U.F.,1995)以及pIJ6021(Takano E.等,1995)。
所述启动子可以是诱导型的或组成型的，通用的或者细胞特异性的，细胞核或细胞质特异性的，异源的或与所述基因天然相关的。可使用任何类型的启动子只要其能在宿主细胞中起作用。启动子的实例包括来自大肠杆菌或噬菌体的启动子，如trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子或PSE启动子、SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子。此外，也可以使用人工设计和修饰的启动子，如通过将两个Ptrp串连放置的启动子(Ptrp*2)、tac启动子、lacT7启动子或let I启动子。而且，也可以使用用于在芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌中表达的xylA启动子，用于在棒状杆菌属(Corynebacterium)的细菌中表达的P54-6启动子。其他有用的启动子为PermE(Bibb等,1985)、PermE*(Bibb等,1994)，PtipA(Murakami等,1989)、PnitA-NitR表达系统(Herai等,2004)和actII-ORF4/PactI激活子-启动子系统(Ferna′ndez-Moreno等,1991)。启动子、载体和其他元件的选择是常规设计的问题。众多此类元件在文献中有描述并可通过供应商获得。可将单个的基因引入细胞。也可以将多于一个基因引入细胞并在其中表达。当要表达大的基因簇时，优选的是使用噬菌粒、粘粒、P1s、YACs、BACs、PACs、HACs，或类似的克隆载体。如果将多于一个基因引入细胞，所述基因可能受相同的启动子和/和调控元件的调节。或者，所述基因可受不同的启动子和/和调控元件调节。通常，转移方法包括将选择性标记转移到细胞。一般而言，可通过上述的任何手段转化细胞系，其中所述转基因可操作地连接于选择性标记。转化后使细胞生长一段适应期的时间。经转化的细胞显示对选择的抗性并且能够生长，而非转化细胞通常死亡。选择性标记的实例包括嘌呤霉素、零霉素、新霉素和潮霉素B，其分别赋予对嘌呤霉素、零霉素、氨基糖苷G-418和潮霉素B的抗性。
适合本发明语境的宿主细胞的实例源自具有携带并表达重组的浅灰霉素生物合成基因簇，或浅灰霉素生物合成基因簇的一个或多个基因的能力的任何生物。实例包括细菌、酵母、丝状真菌、动物细胞和植物细胞，如但不限于，大肠杆菌菌株的细胞，放线菌目(Actinomycetales)如链霉菌属菌种如链霉菌DSM 22643或天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)的细胞，酵母菌株如酿酒酵母(Streptomyces coelicolor)的细胞，昆虫细胞系鳞翅目(Lepidoptera)如来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的细胞，植物细胞或哺乳动物细胞，如L6细胞、3T3脂肪细胞、HEK 293、745-A、A-431、心房肌细胞、BxPC3、C5N、Caco-2、Capan-1、CC531、CFPAC、CHO、CHO K1、COS-1、COS-7、CV-1、EAHY、EAHY 926。优选的实施方案是细菌细胞，如放线菌目如链霉菌DSM 22643或天蓝色链霉菌的细胞，或者大肠杆菌菌株的细胞。特别优选的实施方案是放线菌目，特别是链霉菌DSM 26643的细胞。
如上所述，用于携带并表达本发明所包含的基因的优选的宿主细胞是细菌细胞。适合携带并表达本发明所包含的基因的其它宿主细胞是经建立的或无限增殖化的细胞系，所述细胞系通过随机突变或有意修饰如端粒酶基因的人工表达而获得无限增殖的能力。存在众多代表特定细胞类型的已建立好的细胞系，而且选择合适的细胞系属于技术人员的知识范围。细胞系是在培养物中繁殖的细胞群体，其源自单个共同的祖细胞并因此在遗传上与其同一。适合于本发明的细胞系是HEK 293细胞(原始人胚肾(primary human embryonickidney))、3T3细胞(鼠胚成纤维细胞)、CHO细胞(中国仓鼠卵巢)、COS-7细胞(非洲绿猴细胞系)、HeLa细胞(人上皮样宫颈癌瘤(human epithelioid cervical carcinoma))、JURKAT细胞(人T-细胞白血病)、BHK 21细胞(仓鼠正常肾，成纤维细胞)，和MCF-7细胞(人乳腺癌)。
或者，可在组织培养物中克隆并表达本申请所定义的核酸。术语“组织培养”指一种方法，其中培养形成三维网络的细胞的组。所述组织可在培养物中由细胞自身形成，或由所述细胞产生的胞外基质形成，所述培养物可在天然的或人工的胞外基质(例如，胶原，弹性蛋白，聚苯乙烯，尼龙，聚赖氨酸)上培养，或者所述组织可由动物包括人获得。所述组织培养物可在合适的温度在培养基中培养。所述培养基可包含营养物(例如糖，盐，氨基酸和脂质)，缓冲系统(常常包含一种或多种无毒或低毒的化学缓冲物质，例如磷酸盐/酯、磷酸氢盐/酯和/或Tris，和/或二氧化碳(CO2)气处理)和/或任选一种或多种抗生素。为了提供足量的营养物和/或去除代谢物，当需要时可改变所述培养基。任选地，所述组织培养可用培养基灌注。所述灌注可以是永久或脉冲灌注。
可通过设计将变异引入核酸，例如对核酸内的核苷酸以特定方式进行修饰，例如将单个的取代基用另外的取代基替代，并由此造成浅灰霉素的部分或全部人工(artificelle)生物合成基因簇。作为另一个示例，技术人员知道称作“合成生物学”的领域，其涉及设计和构建未在自然界中发现的新的生物功能和系统。例如，技术人员能够在计算机芯片上设计并合成与野生型序列在核酸水平没有相似性但编码与野生型序列相同的蛋白质的DNA序列。或者，也可随机地制造变异，例如通过系统地或偶然地替代生物合成途径中一个或多个的ORF来制成(甲基)浅灰霉素分子变体文库。而且，使用已知的方法设计非自然存在的核酸的有用变体和片段。所述变异可为以上概述的任何修饰，例如将单个的取代基用另外的取代基替代。例如，鉴定了可能耐受氨基酸序列改变和/或缺失的多肽的区。作为示例，比较了牵涉从产生(甲基)浅灰霉素的不同物种(species)合成(甲基)浅灰霉素的变体多肽；鉴定了保守序列。相差较大的序列最有可能耐受序列改变。可使用本领域已知的方法分析序列间的同源性。向核酸中引入突变的方法包括易错PCR，定点诱变，使用羟胺的方法，或允许突变剂如UV作用于具有所关注的核酸的细胞的方法。使用易错PCR时，例如用并入了所关注的核酸的质粒作为模板，在锰(Mn)盐浓度高于通常的PCR反应的反应溶液中进行PCR反应。
使用本发明所提供的信息和其它方法克隆所需的序列对本领域技术人员而言是显然的，例如使用重组方法，如通过筛选源自表达所述基因的细胞的cDNA或基因组文库或是从已知包含所述基因的载体中得到该基因，可由表达所述核酸的生物获得包括包含ORF1-26的全部浅灰霉素生物合成基因簇的ORF 1-26中的至少一个，和/或任选地编码所关注的NRPS模块或酶促域的核酸。然后可使用标准的技术分离所述基因或簇并将其与其他所需的生物合成元件组合。如果所讨论的基因或簇已经存在于合适的表达载体中，那么它们可在原位与例如所需的其他域或亚基组合。所关注的基因可合成地而非克隆地产生。可用对于所需的特定氨基酸序列适当的密码子设计核苷酸序列。一般而言，可选择对于将在其中表达所述序列的意欲的宿主优选的密码子。此外，注意的是订制基因合成是商业上可获得的。
在另一方面，本发明涉及蛋白质，其包含选自SEQ ID No:2-27或其功能活性片段或变体的至少一个氨基酸序列或由上述核酸编码。所述蛋白质可以是单个的蛋白质或可为蛋白质的混合物或可为SEQ ID No:2-27中的至少两种蛋白质的融合蛋白。所述蛋白质可以是分离的，其意指其基本上是纯的并且不与与其天然相关的成分相关，或者所述蛋白质存在于产生所述蛋白质的细胞的裂解物中。SEQ ID No:2-27的蛋白质分别由推定的ORF 1-26编码。这些ORF属于并构成浅灰霉素生物合成基因簇。基于序列分析和同源性搜索，本发明人成功地鉴定浅灰霉素生物合成基因簇，成功地鉴定所述基因簇中特异性的推定的ORF，并成功地将鉴定的ORF分配于特定的蛋白质功能和/或分配于编码已知或假定的蛋白质的特定的同源核苷酸序列。
本发明所包含的蛋白质涵盖由SEQ ID NO:1的序列的链霉菌DSM 26643的浅灰霉素生物合成基因簇所编码的SEQ ID No:2-27的蛋白质，并涵盖其存在于产生(甲基)浅灰霉素的其为直向同源物或同源物的其他链霉菌属菌种和菌株和非链霉菌属菌种中的蛋白质，由此这些直向同源物或同源物与链霉菌DSM26643的SEQ ID No:2-27的蛋白质具有相同的功能。优选地，其直向同源物或同源物例如通过添加、缺失、取代和/或插入氨基酸而与SEQID No:2-27的序列不同，并与SEQ ID No:2-27具有高于50％，高于60％,高于70％，优选高于80％，更优选高于85％，甚至更优选高于90％，甚至更优选高于95％，最优选高于97％的序列同一性，和/或具有SEQ ID No:2-27的蛋白质活性的5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上，95％以上，97％以上，或100％以上，例如150％、200％、300％、400％或500％以上的酶活性。
在本发明的语境中，包含于本发明的SEQ ID No:2-27的蛋白质的天然或非天然存在的变体是功能活性蛋白质，因为其保持SEQ ID No:2-27的参照蛋白质的生物功能，即，涉及在自然条件下牵涉参照蛋白质的反应(在非天然变体的情况下，参照蛋白质的生物功能)，如公开了SEQ ID No:2-27的蛋白质的功能的相关章节中所提及的，并如本申请所定义的可以取代SEQ ID No:2-27的蛋白质。
SEQ ID No:2-27的蛋白质的非天然存在的变体和其天然存在的变体可通过有限数目的氨基酸缺失、插入和/或取代获得，特别是缺失、插入和/或取代，例如最多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸由此获得各野生型蛋白质例如如上所述关于SEQ ID No:2-27的活性或序列同一性。
所述变体可能是经修饰的蛋白质或者是包含其他组分的经修饰的蛋白质的变体。因此，所述变体可能是具有天然存在的SEQ ID No:2-27的蛋白质所包含的域的分子，或者本申请所详细论述的变体以及至少一种附加组分。在一个优选的实施方案中，所述变体可能是融合蛋白，其包含(i)SEQ ID No:2-27的蛋白质或功能活性变体，和(ii)其他的蛋白质或肽组分。例如，所述蛋白质可与标记偶联，如用于纯化目的的标签(例如6His(或HexaHis)标签、Strep标签、HA标签、c-myc标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签)。如果需要例如高度纯化的SEQ ID No:2-27的蛋白质或变体，可使用两个或多个标记(例如上述标记或标签的组合)。在此种情况下，所述蛋白质在两个或以上的分离层析步骤中纯化，在每一种情况下使用第一标签然后是第二标签的亲和力。此种双重或串连标签的实例为GST-His-标签(谷胱甘肽-S-转移酶融合于多组氨酸-标签)、6xHis-Strep-标签(6个组氨酸残基融合于Strep-标签)、6xHis-标签100-标签(6个组氨酸残基融合于哺乳动物MAP-激酶2的12-氨基酸蛋白)、8xHis-HA-标签(8个组氨酸残基融合于血凝素-表位-标签)、His-MBP(His-标签融合于麦芽糖-结合蛋白、FLAG-HA-标签(FLAG-标签融合于血凝素-表位-标签)，以及FLAG-Strep-标签。可使用所述标记来检测经标签标记的蛋白质，其中可使用特异性的抗体。合适的抗体包括抗-HA(例如12CA5或3F10)，抗-6His、抗-c-myc和抗-GST。此外，所述蛋白质可以连接于不同类别的标记，如荧光标记如绿色荧光蛋白，结合蛋白如抗生蛋白链菌素(steptavidin)，一种或多种的小分子染料如Cy染料，或者放射性标记，其允许本发明所包含的蛋白质被检测出来。在另一个实施方案中，SEQ ID No:2-27的蛋白质可为融合蛋白的部分，其中第二部分可用于检测，如具有酶促活性的蛋白质组分。
在本发明的另一个实施方案中，SEQ ID No:2-27的蛋白质的变体可能是片段，其中，所述片段仍是功能活性的。这可包括SEQ ID No:2-27的蛋白质或其如上详述的具有短的内部和/或C-和/或N-末端缺失的变体(例如，在所述变体内和/或在C-和/或N-末端缺失最多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、65、4、3、2或1个氨基酸，或者总共缺失5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或上述数值之间的任意数值的氨基酸)。此外，如以上对SEQ ID NO:2-27的蛋白质详述的，所述片段可被进一步修饰。
可替换地或此外，上述SEQ ID No:2-27的蛋白质或其变体可包含一个或多个氨基酸取代。然而，优选半保守尤其是保守氨基酸取代，其中用化学上相关的氨基酸取代某种氨基酸。典型地取代是在脂族氨基酸之间、具有脂族羟基侧链的氨基酸之间、具有酸性残基的氨基酸之间、酰胺衍生物之间、具有碱性残基的氨基酸之间、或具有芳族残基的氨基酸之间的。典型的半保守和保守取代为：
氨基酸 保守取代 半保守取代
A G；S；T N；V；C
C A；V；L M；I；F；G
D E；N；Q A；S；T；K；R；H
E D；Q；N A；S；T；K；R；H
F W；Y；L；M；H I；V；A
G A S；N；T；D；E；N；Q
H Y；F；K；R L；M；A
I V；L；M；A F；Y；W；G
K R；H D；E；N；Q；S；T；A
L M；I；V；A F；Y；W；H；C
M L；I；V；A F；Y；W；C；
N Q D；E；S；T；A；G；K；R
P V；I L；A；M；W；Y；S；T；C；F
Q N D；E；A；S；T；L；M；K；R
R K；H N；Q；S；T；D；E；A
S A；T；G；N D；E；R；K
T A；S；G；N；V D；E；R；K；I
V A；L；I M；T；C；N
W F；Y；H L；M；I；V；C
Y F；W；H L；M；I；V；C
如果新半胱氨酸保留游离的硫醇基，则由A,F,H,I,L,M,P,V,W或Y变为C是半保守的。而且，本领域技术人员可以理解，处于空间结构所要求的位置的甘氨酸不应被取代，P不应被引入到蛋白质中具有α-螺旋或β-折叠结构的部分。如上对SEQ ID No:2-27的蛋白质或其片段或变体所详述的，SEQ ID No:2-26的蛋白质或其片段或具有取代的变体可以被修饰。
注意到SEQ ID No:2-27的蛋白质的上述修饰可以组合。本发明的变体可为例如具有融合标记或者包含一个或多个氨基酸取代的SEQ ID No:2-27的蛋白质的片段。此外注意到，SEQ ID No:2-27的任何蛋白质可与SEQ ID No:2-27的蛋白质的任何变体或片段组合。
本发明所包含的蛋白质可通过任何手段提供，例如通过从天然来源获得所述蛋白质，通过本领域公知的生物技术方法和/或通过合成方法。本申请中术语“提供”可广义地理解而且可包括但可不限于任何本领域已知用于获得其他蛋白质或其他产物的生物化学或生物技术手段。因此，所述蛋白质可通过从天然来源，如含有所述蛋白质的微生物，如链霉菌属菌种，特别是链霉菌DSM 26643提取而获得。本领域技术人员了解如何分离所述蛋白质的方法，可通过本领域已知的但不限于声处理(sonication)，低渗缓冲液，去污剂，UltraTurrax，弗氏压碎器，冻融循环，机械匀浆和刮拭的任何手段来破坏天然携带本发明所包含的蛋白质的细胞。然后可通过已知的方法，例如溶剂提取法、盐析法、溶剂沉淀法、透析法、超滤法、凝胶电泳法、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、反向层析法和亲和层析法，单独或适当地组合来分离所关注的蛋白质。
或者，本发明所包含的蛋白质可为通过重组方法产生的蛋白质，例如通过克隆和表达编码本发明所包含的蛋白质或其功能片段或变体的核酸，并分离所述蛋白质。克隆核酸以及分离所表达的蛋白质的步骤如上公开。
所述蛋白质可与方便的标记一起表达以促进分离。标记(或标签或标记物)是任何类型的能够指示另一种物质或物质的复合物存在的物质。所述标记可为连接于被检测物或引入被检测物的物质。可检测的标记用于分子生物学和生物学技术中以检测例如蛋白质，酶促反应产物，第二信使，DNA，分子的相互作用等。合适的标记或标记物的例子包括荧光团，生色团，放射性标记，金属胶体，酶，或者是化学发光或生物发光分子。荧光团的例子包括荧光素，罗丹明和硫代靛青(sulfoindocyanine)染料Cy5。放射性标记的例子包括3H、14C、32P、33P、35S、99mTc或125I。酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶和脲酶。
本发明的蛋白质包括其功能活性变体和片段可以在细胞中单个表达，或者包括其功能活性变体和片段的几种本发明的蛋白质，例如至少两种，三种，四种，五种或以上的蛋白质可在细胞中同时表达。而且，整个浅灰霉素生物合成基因簇可异源表达。由此，本发明包括变体和非变体蛋白的任意组合。在一个实施方案中，有助于(甲基)浅灰霉素合成途径的某方面的几种蛋白质，如属于相同蛋白质家族的那些如由nrps-1、nrps-2和/或nrps-3基因编码的非核糖体蛋白合成酶或如甲基脯氨酸合成基因mps-1、mps-2、mps-3和mps-4或mps-1、mps-2和mps-4所编码的蛋白质可在细胞中一起表达。由此，(甲基)浅灰霉素合成的特定步骤是特别有利的，从而增强了(甲基)浅灰霉素，尤其是甲基浅灰霉素的产生。或者，可以产生影响(甲基)浅灰霉素合成途径的特定方面由此影响(甲基)浅灰霉素的合成的变体。实例是促进L-反式-4-甲基脯氨酸插入甲基浅灰霉素的SEQ ID No:9、16和17，特别是SEQ ID NO:16，更特别是SEQ ID NO:16的模块8，和/或增强L-反式-4-甲基脯氨酸的合成从而以比不使用所述变体时更高的产量/产率产生甲基浅灰霉素的SEQ ID No:19、20和22以及可能的SEQ ID No:21的一个或多个蛋白质的变体。一个或多个所述变体可与一个或多个SEQ ID No:2-27的非变体蛋白质组合。
在本发明的另一方面提供针对至少一种SEQ ID No:2-27的蛋白质或其功能活性片段或变体的抗体。蛋白质的检测通常涉及使用特异性抗体。因此，至少一种SEQ ID No:2-27的蛋白质或其功能活性变体或片段的检测可包括特异性抗体。可使用已建立的用所制备的抗原形式免疫动物的技术产生抗体。可用多种试剂以帮助抗体产生和纯化，且多家公司专门从事抗体产生服务。根据所实施的应用，在提供的第一抗体中需要不同的纯度水平和特异性类型。仅就几个参数而言，抗体可为单克隆或多克隆的，作为抗血清或亲和纯化的溶液提供的，确认对天然蛋白或变性蛋白的检测有效。它们可为嵌合的、人源化的、多功能的、双特异性的、或寡特异性的(oligospecific)抗体。本发明所包含的抗体可包括完整抗体或抗体片段，例如Fab,F(ab)2或sc(单链)Fv。
识别靶抗原，本申请中SEQ ID No:2-27的蛋白质或其功能活性变体或片段的抗体称作“第一抗体”。如果此抗体用标签标记，则抗原的直接检测是可能的。然而，通常不标记第一抗体用于直接检测。而是在第二步骤中应用已用可检测的标签标记的“第二抗体”以探测与靶抗原结合的所述第一抗体。因此，所述抗原是被间接检测的。另一种间接检测形式涉及使用经亲和标签如生物素标记的第一和或二抗体。然后可将第二(或第三)探针，如用可检测的酶或荧光团标签标记的抗生蛋白链菌素用于探测生物素标签以产生可检测的信号。存在这些探测和检测策略的几种变化形式。然而，每一种依赖于特异性探针(例如，第一抗体)，它们的存在直接或间接与某类可测量的标签(例如，其活性可在与其底物反应后产生有色产物的酶)连接。
在本发明的另一方面中，提供本申请所定义的核酸或蛋白质包括片段或变体、携带所述核酸的表达载体或携带所述表达载体的宿主细胞用于产生(甲基)浅灰霉素的用途。特别地，提供了包含ORF 8、15和16的至少一种核酸或者SEQ ID No:9、16和17的至少一种蛋白质包括片段或变体用于产生(甲基)浅灰霉素的用途。优选地，提供了包含ORF 8、15和16的核酸的组合或SEQ ID No:9、16和17的蛋白质的组合。关于术语“核酸”，“蛋白质”，“ORF8、15和16”以及“SEQ ID No:9、16和17的蛋白质”，指的是在本发明的核酸和蛋白质的语境中提供的定义。
在本发明的另一方面中，提供了包含ORF 18、19和21的至少一种核酸或者SEQ IDNo:19、20和22的至少一种蛋白质包括片段或变体用于产生L-反式-4-甲基脯氨酸的用途。优选地，提供了包含ORF 18、19和21的核酸的组合或者SEQ ID No:19、20和22的蛋白质的组合。关于ORF 18、19和21以及SEQ ID No:19、20和22的蛋白质，指的是在本发明的核酸和蛋白质的语境中提供的定义。关于产生(甲基)浅灰霉素或L-反式-4-甲基脯氨酸的方法，参考其在确定ORF 1-26的变体的语境中的定义。
在本发明的又一方面，提供了产生本申请所定义的至少一种蛋白质或其功能活性变体或片段的方法，包括表达本申请所定义的核酸包括变体形式和片段，并任选地分离所述蛋白质或其功能活性变体或片段。克隆和表达核酸以及分离蛋白质的方法是本领域已知的并在本申请中公开。
在一个优选实施方案中，本发明的涉及上述的核酸或蛋白质，其为分离的。本申请中对于核酸，如DNA或RNA，所用的术语“分离的”是指与多核苷酸的全部或部分不相关联的核酸，该分离的核酸天然发现于所述多核苷酸中。本申请中对于蛋白质所用的术语“分离的”是指与化合物的全部或部分不相关联的蛋白质，该分离的蛋白质天然发现于所述化合物中或者与其一起发现。分离的核酸与分离的蛋白质与天然地陪伴天然人序列或蛋白质的其他细胞组分，例如核糖体，聚合酶，许多其他的人基因组序列和蛋白质以及任何其他类型的细胞物质相分离。该术语包括已经从其天然存在的环境移出的核酸序列或蛋白质，还包括重组的或克隆的DNA分离物或其衍生的蛋白质，以及化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。“分离的核苷酸”意指包括已经从其天然环境移出的核酸片段或并非天然作为片段存在未天然发现的核酸片段。术语“分离的”还指与其它细胞蛋白相分离的蛋白质，并意指还涵盖重组蛋白。术语“分离的”并非意指“纯化的”，后者意指仅通过分离出杂质而将核酸或多肽或者蛋白质从其天然条件纯化。
在本发明的另一方面中提供了确定调节浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素产生的ORF1-26的变体或SEQ ID No:2-27的蛋白质的变体的方法。所述方法包括产生任意ORF 1-26的变体，将所述变体表达为蛋白质，允许使用所述变体蛋白质产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素或其衍生物并确定浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的量，其中浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的量与不存在所述变体蛋白质时产生的量相比增加，但存在所述蛋白质的相应非变体形式，这指示所述变体能够增加浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的产生，或确定浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的衍生物的抗生素活性，其中，与不存在所述变体蛋白质时的抗生素活性相比所述抗生素活性增加，但存在所述蛋白质的相应非变体形式，这指示所述变体能够产生具有增加的抗生素活性的浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的衍生物，其中所述衍生物在氨基酸的组成方面不同于浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素并显示相对于浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素增强的抗生素活性。在另一方面中，本发明包括确定增强L-反式-4-甲基脯氨酸的产生的ORF 1-26或SEQ ID No:2-27的蛋白质的变体的方法，包括产生任意ORF 1-26的变体，将所述变体表达为蛋白质，允许使用所述变体蛋白质产生L-反式-4-甲基脯氨酸，并确定L-反式-4-甲基脯氨酸的量，其中，L-反式-4-甲基脯氨酸的量与不存在所述变体蛋白质时的量相比增加，但存在所述蛋白质的相应非变体形式，这指示所述变体能够增加L-反式-4-甲基脯氨酸的产生。
本申请所用的术语“方法”或“测定法”可按广义理解为试验活动或步骤。其可理解为可用于确定能够调节或增强(甲基)浅灰霉素或L-反式-4-甲基脯氨酸的产生的ORF 1-26或SEQ ID No:2-27的蛋白质的变体的所有手段。术语“ORF 1-26的变体”按本申请所定义的理解为编码一个或多个SEQ ID No:2-27的蛋白质的变体的ORF 1-26的具有一个或多个核酸的取代、添加、插入和/或缺失的变体，只要所述变体编码的蛋白质能够增加携带所述变体的细胞的浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的产量，尤其是增加甲基浅灰霉素的产量，或L-反式-4-甲基脯氨酸的产量，或者能够改变(甲基)浅灰霉素的组成使得具有改变的组成的(甲基)浅灰霉素显示增强的抗生素活性。合适的变体是将浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素，尤其是甲基浅灰霉素，或L-反式-4-甲基脯氨酸的产量增加至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少100％，至少200％，至少300，至少400％或至少500％的那些。或者，合适的变体是能改变(甲基)浅灰霉素的组成使得抗生素活性提高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少100％，至少200％，至少300，至少400％或至少500％的那些。术语“调节浅灰霉素以及甲基浅灰霉素的产生”指增强所产生的浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的量，或者改变浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的组成。因此，1个或2个氨基酸或甚至更多个氨基酸(例如3个或4个氨基酸)或者1个或2个或多个域或者1个或2个或多个的模块可分别被不同的氨基酸或域或模块替代，由此得到的浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的衍生物显示增强的抗生素活性。例如，编码NRPS蛋白质的任何模块的A-域的核酸的变体可导致不同氨基酸的并入，其可得到具有增强的抗生素活性的(甲基)浅灰霉素的衍生物。术语“产生变体”意指通过本领域已知或本申请所述的任何方法产生。所述方法包括通过引入靶向突变的有意突变的核酸或随机突变的核酸。一旦产生了变体核酸，就将所述变体核酸引入细胞。或者，通过对细胞实施突变处理而在细胞内部产生所述变体。所述细胞可天然地携带用于产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素或产生L-反式-4-甲基脯氨酸的基因，或者所述细胞可包含用于产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素或产生L-反式-4-甲基脯氨酸的异源系统。其变体待于细胞中表达的基因优选是通过缺失或者任何其他类型的突变而失活的，或是以活性状态包含于细胞中。例如，所述细胞可携带ORF1-26的核酸中的每一种包括一个或多个待测试的变体核酸，或ORF 1-26中的核酸的组如nrps基因，包括变体nrps基因或变体nrps基因之外的另一种变体基因，或mps基因，包括变体mps基因或是变体mps基因之外的另一种变体基因。在合适的条件下温育携带编码用于(甲基)浅灰霉素或L-反式-4-甲基脯氨酸合成的蛋白质的核酸以及一个或多个变体核酸的细胞以允许合成(甲基)浅灰霉素或其衍生物或L-反式-4-甲基脯氨酸。优选地，(甲基)浅灰霉素或L-反式-4-甲基脯氨酸的产生在中性pH的含水缓冲液中，更优选在pH为约pH 7的缓冲液中，甚至更优选在pH 7的缓冲液中进行，所述缓冲液包含待并入(甲基)浅灰霉素中氨基酸如L-N-甲基缬氨酸、L-亮氨酸、L-N-甲基苏氨酸、L-脯氨酸、L-N-甲基亮氨酸和甘氨酸，或用于产生L-反式-4-甲基脯氨酸的L-亮氨酸。优选地，所述SEQ ID No:2-27的蛋白质及其变体蛋白质在所使用的缓冲液中保持它们的活性，并优选地抑制蛋白质和底物沉淀。任选地，可将所述样品在适合于蛋白质活性的温度，优选在0到50℃的温度，更优选在10到40℃的温度，甚至更优选在20到40℃的温度，最优选在37℃温育。或者，所述变体核酸通过无细胞表达系统表达，然后将所得的蛋白质添加到携带用于产生(甲基)浅灰霉素或L-反式-4-甲基脯氨酸的蛋白质的细胞中。
在另一个优选的实施方案中，确定增强(甲基)浅灰霉素或L-反式-4-甲基脯氨酸的产量/产率或改变(甲基)浅灰霉素组成的任何ORF 1-26的变体的方法可在体外进行。在体外(in vitro)(拉丁语：在玻璃中)实施的步骤是不在活的生物体中而是在受控环境中如试管或培养皿中进行。在体外测定法中，参与反应的组分在试管中组合，允许反应进行并确定产物。对于要发生的此种情况，将如本申请所述产生的变体核酸转录并通过细胞或无细胞翻译方法翻译成各自的变体蛋白质，纯化所述蛋白质或使用细胞裂解物(粗制的、片段化的或纯化的)，并且所述蛋白质与SEQ ID No:2-27所包含的非变体蛋白质一起用于所述测定法中。在所述变体蛋白质牵涉(甲基)浅灰霉素合成途径中的确定步骤时体外测定是有用的，例如如果所述变体蛋白质属于直接进行(甲基)浅灰霉素合成的蛋白质如NRPS蛋白质，并且只有NRPS蛋白质包括所述变体形式参与(甲基)浅灰霉素的合成或L-反式-4-甲基脯氨酸的合成，如由mps基因编码的蛋白质，并且只有这些蛋白质包括所述变体形式参与L-反式-4-甲基脯氨酸的合成。在体外测定法中，参与反应的组分如氨基酸，如L-N-甲基缬氨酸、L-亮氨酸、L-N-甲基苏氨酸、L-脯氨酸、L-N-甲基亮氨酸和甘氨酸和至少一种SEQ ID No:2-27的蛋白质，包括待测定的变体，在确定定义的时间、组分的量、反应缓冲液的组成、温度等下组合以允许(甲基)浅灰霉素或其衍生物或L-反式-4-甲基脯氨酸的合成。可在适合于参与蛋白质的活性的分子环境中进行测量。合适的条件如上文概述。
对于L-反式-4-甲基脯氨酸的体外合成，进行了使用Mps-1、Mps-2和Mps-3的3种后续测定。在Mps-1测定法中将L-亮氨酸转化成5-羟基亮氨酸，在Msp-2测定法中5-羟基亮氨酸转化成γ-甲基谷氨酸γ-半醛，在Msp-4测定法中3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸转化成4-甲基脯氨酸。假定γ-甲基谷氨酸γ-半醛环化成3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸是自发出现的。可能地，Mps-3参与此环化反应。优选地，对于5-羟基亮氨酸的产生，在中性pH的含水缓冲液中，更优选在pH为约pH 7的缓冲液中，甚至更优选在pH 7的缓冲液中进行Mps-1测定法，所述缓冲液含所述底物，亮氨酸或相关化合物，以及Mps-1蛋白。优选地，所述Mps-1蛋白质在所用的缓冲液中保持其活性，并且优选地抑制蛋白质和底物沉淀。任选地，所述样品在适合于蛋白质活性的温度，优选在0到50℃的温度，更优选在10到40℃的温度，甚至更优选在20到40℃的温度，最优选在37℃温育。通常，所述反应时间为几分钟到几小时，优选30分钟到2小时，更优选1小时。优选地，对于γ-甲基谷氨酸γ-半醛的产生，在碱性pH的含水缓冲液中，更优选在pH为约pH 10的缓冲液中，甚至更优选在pH 10的缓冲液中进行Mps-2测定法，所述缓冲液含所述底物，5-羟基亮氨酸，以及Mps-2蛋白。优选地，所述Mps-2蛋白质在所用的缓冲液中保持其活性，并且优选地抑制蛋白质和底物沉淀。任选地，所述样品在适合于蛋白质活性的温度，优选在0到50℃的温度，更优选在10到45℃的温度，甚至更优选在30到42℃的温度温育。通常，所述反应时间为几分钟到几小时，优选30分钟到4小时，更优选1到3小时。优选地，对于4-甲基脯氨酸的产生，在中性pH的含水缓冲液中，更优选在pH为7-8的缓冲液中，甚至更优选在pH 7.5-8的缓冲液中进行Mps-4测定法，所述缓冲液含所述底物，3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸或相关化合物，以及Mps-4蛋白。优选地，所述Mps-4蛋白质在所用的缓冲液中保持其活性，并且优选地抑制蛋白质和底物沉淀。任选地，所述样品在适合于蛋白质活性的温度，优选在0到50℃的温度，更优选在10到45℃的温度，甚至更优选在30到42℃的温度，还更优选在30℃温育。通常，所述反应时间为几分钟到几小时，优选30分钟到4小时，更优选1到3小时。
优选地，对于浅灰霉素的产生，在中性pH的含水缓冲液中，更优选在pH为7-8的缓冲液中，甚至更优选在pH 8的缓冲液中进行测定法，所述缓冲液含所述底物乙酰-CoA、L-缬氨酸、(2S,4R)-4-甲基脯氨酸(或相关化合物)、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-甘氨酸以及蛋白质NRPS-1、NRPS-2、NRPS-3(非核糖体肽合成酶)和MtbH，以及必需时SAM和ATP。优选地，所述蛋白质在所用的缓冲液中保持其活性，并优选地抑制蛋白质和底物沉淀。任选地，所述样品在适合于蛋白质活性的温度，优选在0到50℃的温度，更优选在10到45℃的温度，甚至更优选在20到40℃的温度，还更优选在30℃温育。通常，所述反应时间为1小时到100小时，优选2到72小时。优选地，对于甲基浅灰霉素的产生，如对于浅灰霉素的测定法进行测定法。然而，L-脯氨酸是不需要的并因此一定不能包含在反应中。
本领域中已知多种测定法，通过所述测定法本领域的技术人员可确定化合物的浓度并由此测量化合物的浓度相对于对照反应是否改变。明确提及的是测量并入到底物中的放射性或其从底物的释放的辐射测定法。在这些测定法中最常用的放射性同位素是14C、32P、35S和125I。所述浓度也可以使用针对测试化合物的抗体和抗血清通过Western分析或ELISA测定法来确定。层析测定法通过层析将反应混合物分离成其组分而测量产物形成。这通常通过高效液相层析进行，但是也可以使用薄层层析的更为简便的技术。尽管该方法需要大量的材料，但可通过用放射性或荧光标签标记底物/产物来增加其灵敏度。优选方法是通过HPLC/MS的定量。液相层析-质谱(LC-MS，或HPLC-MS)是将液相层析(或HPLC)的物理分离能力和质谱的质量分析能力组合的分析化学技术。LC-MS是用于具有非常高灵敏度和特异性的多种应用的强大技术。术语“质谱”指使用离子化源以从样品在表面上生成气相离子，并用质谱仪检测所述气相离子。术语“激光解吸质谱”指使用激光作为离子化源以从样品在表面上生成气相离子，并用质谱仪检测所述气相离子。用于生物分子如酰基化的酰基受体的优选质谱方法是基质辅助的激光解吸/离子化质谱或MALDI。另一种优选的方法是表面增强的激光解吸/离子化质谱或SELDI。在质谱法中“表观分子量”指所检测的离子的分子量(以道尔顿表示)比电荷值，m/z。在与HPLC组合时，所述分析物可通过多种多样的API技术如ESI(电喷雾离子化)或APCI(大气压力化学离子化)而离子化。在分析仪中，离子根据它们的质量-对-电荷m/z比相分离。或者，(甲基)浅灰霉素的量可使用本领域已知的测定法通过确定其抗生素活性来测量。在另一实施方案中，(甲基)浅灰霉素的衍生物的抗生素活性可使用本领域已知的测定法测量。技术人员由此知晓如何区分增加的抗生素活性是否由于增加的(甲基)浅灰霉素的量，或者是否产生了具有增强的抗生素活性的(甲基)浅灰霉素的衍生物，例如通过确定所产生的抗生素剂是否为(甲基)浅灰霉素。所述方法在上文中列出。
抗生素测试可为例如纸片扩散法(disk diffusion)抗生素灵敏度试验，其为使用浸渍抗生素的薄片的测试。已知数量的细菌在存在含有抗生素的薄片的琼脂平板上生长。薄片周围细菌所不能生长的透明区(称作抑制区)，其与抗生素扩散的速率一起用于评估特定抗生素的效力。一般而言，较大的区与较小的抗生素最小抑菌浓度(MIC)关联。这一信息可用于评估(甲基)浅灰霉素的衍生物相对于(甲基)浅灰霉素的效力。MIC是抗微生物的最小浓度，其可抑制过夜温育后可见的微生物生长。在诊断实验室中，最小抑菌浓度对于确定微生物对抗微生物试剂的抗性也对于监测新的抗微生物剂的活性是重要的。MIC一般视为针对生物体的抗微生物剂的活性的最基础的实验室量度(measurement)。MIC可通过琼脂或培养液稀释法通常遵循参考方(reference body)如临床和实验室标准协会(CLSI)或英国抗微生物化疗协会(BSAC)的准则来确定。有几种可用的商业方法，包括已经建立的Etest条法。所述Etest系统包含不同抗微生物剂的预定的和连续的浓度梯度，将其施用于接种的琼脂平板并温育时产生微生物抑制的椭圆。当抑制椭圆与所述条交叉时确定MIC，并容易地从所述条上的MIC读数刻度读出MIC。
对照作为所述试验方法的一部分，由于它们可去除非故意的影响(如背景信号)或将其最小化。对照实验用于研究变量对特定系统的作用。在对照试验中，一组样品已经(认为将被)修饰，另一组样品或者预计不显示改变(阴性对照)或者预计显示确定的改变(阳性对照)。对照可在与测试物质一起运行的一个测试中确定，它可在确定测试化合物的作用之前或之后确定或者它可为已知的值。可能的对照实验可为这样的实验，其中将与测试实验中相同的条件用于(甲基)浅灰霉素、其衍生物或L-反式-4-甲基脯氨酸的产生，然而变体核酸被作为用于制备所述变体的起始核酸的核酸替代，例如对照核酸是野生型的核酸。实例是对照实验中作为未修饰状态的ORF 1-26，然而在测试实验中作为修饰的。
变体的核酸序列可通过本领域已知的测序方法确定，由此任何ORF 1-26中的任何突变可负责调节导致增加的(甲基)浅灰霉素或L-反式-4-甲基脯氨酸的产生或(甲基)浅灰霉素的衍生物的产生的所得蛋白质。
在本发明的另一方面，提供了产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的方法，其包括提供本申请所定义的至少一种蛋白质或其功能活性变体或片段或通过用于鉴定所述变体的方法获得的变体蛋白；将所述至少一种蛋白质或其变体或片段与L-N-甲基缬氨酸、L-亮氨酸、L-N-甲基苏氨酸、L-脯氨酸、L-N-甲基亮氨酸、甘氨酸和可能的L-甲基脯氨酸一起温育以产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素。优选地，至少一种蛋白质包含至少NRPS-1、NRPS-2和NRPS-3。在另一方面，本发明提供产生L-反式-4-甲基脯氨酸的方法，其包括提供本申请所定义的至少一种蛋白质或其功能活性变体或片段或通过鉴定所述变体的方法获得的变体蛋白；将所述至少一种蛋白质或其变体或片段与L-亮氨酸、5-羟基亮氨酸、γ-甲基谷氨酸γ-半醛或3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸优选L-亮氨酸一起温育以产生L-反式-4-甲基脯氨酸。优选地，至少一种蛋白质包含至少Mps-1，Mps-2和Mps-4。术语“提供”和“蛋白质或其功能活性变体或片段”是指在本发明的核酸和蛋白质的语境中提供的定义。关于术语“通过所述方法可获得的”是指在确定SEQ ID No:2-27的变体的语境中提供的定义。术语“温育”意指在特定的条件下保持所述蛋白质与其他组分以允许产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素或L-反式-4-甲基脯氨酸。关于特定的条件，参考在确定SEQ ID No:2-27的变体的语境中的定义。
因此，本发明在一个实施方案中涉及分离的核酸序列，其包含选自下组的至少一种核酸：
(a)核酸，其包含分别编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的SEQ ID NO:1的开放阅读框(ORF)1-26的至少一个或其变体或片段，由此所述变体或片段编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的功能活性变体或片段；
(b)核酸，其编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的至少一种或其功能活性变体或片段；
(c)核酸，其编码氨基酸序列与(a)或(b)的核酸所编码的蛋白质或其片段至少70％、80％、90％、95％或97％同一的蛋白质；
(d)核酸，其在严格条件下与任何(a)-(c)的核酸杂交；
(e)核酸，其在严格条件下与任何(a)-(d)的核酸杂交，由长10-50个核苷酸组成；和
(f)核酸，其与任何(a)-(f)的核酸互补。
在另一实施方案中，上述的核酸包含至少2个ORF，其编码任何SEQ ID No:2-27的蛋白质，或如任何(a)-(d)中所述的其功能活性变体或片段。
在又一实施方案中，所述核酸包含分别编码SEQ ID NO:19、20、21和22的蛋白质的ORF 18、19、20和21中的至少一个，或任何(a)-(d)中的其功能活性变体或片段。
在又一实施方案中，所述核酸包含分别编码SEQ ID NO:9、16和17的蛋白质的ORF8、15和16中的至少一个，或任何(a)-(d)中的其功能活性变体或片段。
在又一实施方案中，所述核酸包含具有SEQ ID NO:1的核酸序列或具有SEQ IDNO:1的变体序列的浅灰霉素生物合成基因簇，所述SEQ ID NO:1的变体序列携带ORF 1-26的至少一个的变体或片段，由此所述变体或片段编码SEQ ID No:2-27的蛋白质的功能活性变体或片段。
在另一实施方案中，本发明涵盖包含任何上述的核酸的表达载体。
在另一实施方案中，本发明涵盖用上述的表达载体转化的宿主细胞。
在又一实施方案中，本发明涵盖包含选自下组的至少一个氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID No:2-27或其功能活性变体或片段。
在又一实施方案中，本发明涵盖特异性针对上述的蛋白质或其功能活性变体或片段的至少一种的抗体。
本申请还涵盖有关产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的方法的发明，其包括产生SEQ ID NO:9、16和17的至少一种蛋白质。
在一个实施方案中，本发明涵盖用于产生L-反式-4-甲基脯氨酸的方法，其包括产生SEQ ID NO:19、20、21和22的至少一种蛋白质。
在另一实施方案中，本发明涵盖用于产生上述的蛋白质或其功能活性变体或片段的至少一种的方法，其包括：
a)表达任何上述的核酸，和
b)任选地，分离上述的蛋白质或其功能活性变体或片段。
在又一实施方案中，本发明涵盖用于确定分别编码SEQ ID No:2-27的蛋白质调节浅灰霉素和/和甲基浅灰霉素产生的SEQ ID NO:1的ORF 1-26的一个或多个的变体的方法，其包括如下步骤：
a)产生ORF 1-26的任何一个或多个的变体，
b)将所述变体表达为蛋白质，
c)使用步骤b)的蛋白质产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素或其衍生物，和
d1)确定产生的浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的量，其中产生的浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的量与不存在步骤b)的蛋白质时产生的量相比增加，但存在所述蛋白质的相应非变体形式，这指示所述变体能够增加浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的产生，或
d2)确定所述浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的衍生物的抗生素活性，其中步骤d2)中的抗生素活性与不存在步骤b)的蛋白质时的抗生素活性相比增加，但存在所述蛋白质的相应非变体形式，这指示所述变体能够产生具有增加的抗生素活性的浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的衍生物，
其中，所述衍生物在氨基酸的组成方面不同于浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素，并显示相对于浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素增强的抗生素活性。
在另一实施方案中，本发明涵盖用于确定分别编码SEQ ID No:2-27的蛋白质增强L-反式-4-甲基脯氨酸的产生的SEQ ID NO:1的ORF 1-26的一个或多个的变体的方法，其包括如下步骤：
a)产生ORF 1-26的任何一个或多个的变体，
b)将所述变体表达为蛋白质，
c)使用步骤b)的蛋白质产生L-反式-4-甲基脯氨酸，和
d)确定产生的L-反式-4-甲基脯氨酸的量，其中步骤c)中产生的L-反式-4-甲基脯氨酸的量与不存在步骤b)的蛋白质时产生的量相比增加，但存在所述蛋白质的相应非变体形式，这指示所述变体能够增加L-反式-4-甲基脯氨酸的产生。
在另一实施方案中，本发明涵盖用于产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的方法，其包括如下步骤：
a)提供权利要求8的至少一种蛋白质或其功能活性变体或片段，和
b)将步骤a)的至少一种蛋白质与L-N-甲基缬氨酸、L-亮氨酸、L-N-甲基苏氨酸、L-脯氨酸、L-N-甲基亮氨酸和甘氨酸一起温育以产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素。
在另一实施方案中，本发明涵盖用于产生L-反式-4-甲基脯氨酸的方法，其包括如下步骤：
a)提供权利要求8的至少一种蛋白质或其功能活性变体或片段，和
b)将步骤a)的至少一种蛋白质与L-亮氨酸、5-羟基亮氨酸、γ-甲基谷氨酸γ-半醛和/或3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸一起温育以产生L-反式-4-甲基脯氨酸。
在又一实施方案中，本发明涵盖以保藏号DSM 22643保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSMZ))的链霉菌属菌株。
附图简述
图1显示浅灰霉素(A)和甲基浅灰霉素(B)的结构。
图2显示SEQ ID NO:1中所包含的链霉菌DSM 22643的浅灰霉素生物合成基因簇的图谱和基因排列。推定的ORF由以各自的基因名命名的一组黑色箭头指示。指示了转录方向和相对大小。
图3显示浅灰霉素生物合成的模型。推定的NRPS蛋白NRPS-1、NRPS-2、NRPS-3由白色的方框指示。命名为M1到M10的模块在每个方框之下指示。每个模块划分为域，缩合域命名为C、腺苷酰化域命名为A、甲基转移酶域命名为MT、巯基化域命名为T、差向异构化域命名为E和硫酯酶域命名为TE，由此每个域名称后面的数字指示该域所归属的模块的数字。排列A’-MT-A”指示MT域整合到所述A域中。每个模块名称为被各自的模块引入到浅灰霉素中的氨基酸。Nme-Val代表L-N-甲基缬氨酸，Me-Pro代表L-反式-4-甲基脯氨酸，Nme-Thr代表L-N-甲基苏氨酸，Leu代表L-亮氨酸，Pro代表L-脯氨酸，Nme-D-Leu代表D-N-甲基亮氨酸和Gly代表甘氨酸。模块的下面，各模块的生物合成作用由各氨基酸的结构的展示以及它们并入浅灰霉素而呈现。通过每个模块，一个氨基酸与之前的一个氨基酸缩合导致生长中肽链的延长。产物释放涉及TE10域及接下来的肽环化以得到大环产物。假定模块1的N-末端C域催化缬氨酸的乙酰化作用。
图4显示Nostopeptolide生物合成基因簇(Hoffmann等,2003；上方途径)和浅灰霉素生物合成基因簇(下方途径)内的4-甲基脯氨酸的合成。在两个生物合成途径中，L-亮氨酸被酶Orf1(Nostopeptolide)或Mps-1((甲基)浅灰霉素)转化成5-羟基亮氨酸，其由NosE(Nostopeptolide))或Mps-2((甲基)浅灰霉素)转化为γ-甲基谷氨酸γ-半醛，后者自发地形成3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸。这由NosF(Nostopeptolide)或Mps-4((甲基)浅灰霉素)转化成4-甲基脯氨酸。所述(Nostopeptolide)或((甲基)浅灰霉素)途径的4-甲基脯氨酸合成的每步的产物通过它们关于在5-羟基亮氨酸，γ-甲基谷氨酸γ-半醛和4-甲基脯氨酸的位置4的甲基和在3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸的位置5的甲基的构型而不同，所述不同在于在Nostopeptolide生物合成中所述甲基处于S构型，然而在((甲基)浅灰霉素)生物合成中所述甲基处于R构型。可能地，Mps-在γ-甲基谷氨酸γ-半醛至3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸的转化中起作用。
图5显示Mps-1或亮氨酸-羟化酶测定法的HPLC-MS分析的结果。该图显示在用失活的Mps-1进行的酶测定法中(层析图A)和B))不产生羟基亮氨酸，而在用活性的Mps-1进行的测定法中(层析图C)和D))产生了羟基亮氨酸。A)和C):对于m/z＝273.1(PTC-亮氨酸的[M+Na]+)提取的层析图。B)和D):对于m/z＝289.1(PTC-羟基亮氨酸的[M+Na]+)提取的层析图。
图6显示由突变体nrps-1和nrps-3基因和突变体mps操纵子获得的结果。所述nrps和mps基因由一组箭头指示。插入突变的大约位置以圆圈-交叉符号指示。下面nrps和mps基因的展示是来自野生型、nrps-1突变体、nrps-3突变体和mps-突变体的培养物的上清液的相关UHPLC层析图(UV 210nm)。在野生型中在5.29分钟的峰显示浅灰霉素的存在。相比之下，在三个突变体的培养物上清液中不能检测到浅灰霉素。
图7显示由实施例5获得的mps-突变体的补足/互补(complementation)。
A.通过在第0天向生产培养基中加料20μg/ml(2S,4R)-4-甲基脯氨酸而进行mps突变体的补足。在第1到4天分析(甲基)浅灰霉素的产生(灰色柱:浅灰霉素产生，黑色柱:甲基浅灰霉素产生)。仅在补足培养基中，mps-突变体能够产生(甲基)浅灰霉素。显示当加料甲基-脯氨酸时甲基浅灰霉素相对于浅灰霉素增加的实验在实施例9中和(英文文本)第15页上提及。
B.mps-突变体的遗传补足的相关方面的示意图：mps-操纵子(mps-1、mps-2、mps-3和mps-4基因)在5’插入的组成型的ermE-启动子的表达控制下。
C.mps-突变体的遗传补足。在将P(ermE)-mps-操纵子整合入mps突变体的attB位点后，浅灰霉素生产能力恢复(灰色柱:浅灰霉素产生,黑色柱:甲基浅灰霉素产生)。
图8显示来自mps表达培养物的衍生化的提取物(天蓝色链霉菌/pUWL201-mps；图8A)和阴性对照(天蓝色链霉菌WT；图8B)的HPLC-MS分析。预期的产物(2S,4R)-4-甲基脯氨酸的PITC衍生物(图8A和B的第四层析图)以及两个生物合成中间物5-羟基亮氨酸的PITC衍生物(图8A和B的第二层析图)和γ-甲基谷氨酸γ-半醛的PITC衍生物(图8A和B的第三层析图)可在mps表达培养物的提取物中但不能在天蓝色链霉菌WT中检测到。图8A和B的第一层析图对应于亮氨酸。
图9显示指示NosA-A(mPro)，NcpB-A(mPro)和NosD-A(pro)和NRPS-1-A2，NRPS-1-A5和NRPS-2-A8之间关系的系统树。比例尺(scale bar)代表每个氨基酸位点0.09取代。
图10显示通过体外ATP-Ppi-交换实验对A域的模块2(A2；上图)、模块5(A5；中图)和模块8(A8；下图)的底物特异性的分析。对A5和A8的实验一式三份进行，对A2的实验一式两份进行。最高的活性放大至100％。测试了下述底物：(2S,4R)-4-氟脯氨酸(2S,4R Fpro)、(2S,4S)-4-甲基脯氨酸(2S,4S MePro)、(2S,4R)-4-甲基脯氨酸(2S,4R MePro)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-六氢吡啶羧酸(L-Pip)、L-甘氨酸(L-Gly)、4-亚甲基脯氨酸(Methylen Pro)、4,4-二甲基脯氨酸(Di Me Pro)和4,4-二氟脯氨酸(Di F Pro)。相对活性在Y轴指示。每种底物下面以百分数指示了与作为100％给出的最高活性相比的活性。在对照实验中，无氨基酸存在。
图11：全长调节子Orf-1和Orf-12与DNA片段Pnrps1、Pnrps2和Pmxan_ctrl的结合。显示了EMSA测定法的扫描图。Pnrps1和Pnrps2：使用包含基因nrps1或nrps2的启动子区的DNA片段进行的EMSA测定法。Pmxan_ctrl：使用Hex标记的DNA片段进行的EMSA测定法，所述DNA片段包含侧翼为mxan_3950和mxan_3951的黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)DK1622的基因间区中的双启动子系统。Orf-1-His和Orf-12-His：C-末端6xHis标记的Orf-1和Orf-12。+:有调节子。-:没有调节子。
图12显示调节子Orf-1和Orf-12的预测的域构造。显示了通过在http://smart.embl-heidelberg.de/的SMART工具预测的域。HTH:螺旋-转角-螺旋基序，aa:氨基酸。
图13显示缩短形式的调节子Orf-1和Orf-12与DNA片段Pnrps1、Pnrps2和Pmxan_ctrl的结合。示出EMSA测定法的扫描图片。在所述测定法中，使用的Orf-1和Orf-12的衍生物仅包含预测的HTH域。Pnrps1&Pnrps2：使用包含基因nrps1或nrps2的启动子区的DNA片段进行的EMSA测定法。Pmxan_ctrl：使用Hex标记的DNA片段进行的EMSA测定法，所述DNA片段含有侧翼为mxan_3950和mxan_3951的黄色粘球菌DK1622基因间区中的双启动子系统。Orf-1-HTH1、Orf-1-HTH2、Orf1-HTH12和Orf-12-HTH：C-末端6xHis标记的、仅包含HTH域的Orf-1和Orf-12。-:无调节子。数字描绘了与DNA片段的数量相比，调节子蛋白过量的摩尔数(molar excess)。
实施例的描述
实施例1：链霉菌DSM 22643中浅灰霉素生物合成基因座的鉴定
链霉菌DSM 22643天然地产生抗生素浅灰霉素以及甲基浅灰霉素。然而，牵涉这些抗生素物质的生物合成的遗传基因座先前未鉴定。为了鉴定浅灰霉素基因座，根据标准的微生物技术培养链霉菌DSM 22643。根据标准步骤提取DNA，并根据标准步骤确定全序列。链霉菌DSM 22643的DNA所包含的基因以及由所述基因编码的蛋白质的分析在计算机中(insilico)进行。表1列出以ORF号鉴定的所述基因，其是通过同源性搜索确定的。给予所述ORF号特定的基因名称。基因的位置以及它们在浅灰霉素生物合成基因簇中的排列示意性地指示于图2。
表1
实施例2：牵涉浅灰霉素以及甲基浅灰霉素的生物合成的基因和蛋白质
通过在计算机中分析，确定浅灰霉素生物合成基因簇包含编码26种蛋白质的26个基因。通过每种所鉴定出的蛋白质与NCBI发现的蛋白质的计算机比较，评估所述26种(甲基)浅灰霉素生物合成蛋白的生物功能。表2鉴定了所述浅灰霉素生物合成基因簇所包含的蛋白质以及通过同源性搜索发现的相应的GenBank蛋白质。
表2
在个别的模块和域之间有接头区，即模块间接头和域间接头。在蛋白质的N-末端和C-末端，有单独的NRPS蛋白的相互作用所需的COM或停靠域。沟通-介导(Communication-mediating(COM))域通过短的沟通介导域促进非核糖体肽合成酶之间选择性地相互作用(Hahn M.和Stachelhaus T.；2004)。
基于同源性搜索，命名为nrps-1、nrps-2和nrps-3的基因编码合成浅灰霉素以及甲基浅灰霉素的非核糖体蛋白合成酶(NRPS)的亚基(参见图3)。nrps-1基因具有约26.4kb的长度，并编码分别将(1)L-N-甲基缬氨酸(M1)，(2)L-反式-4-甲基脯氨酸(M2)，(3)L-N-甲基苏氨酸(M3)，(4)L-亮氨酸(M4)，(5)L-反式-4-甲基脯氨酸(M5)和(6)L-亮氨酸(M6)并入(甲基)浅灰霉素中所需的6个模块。模块1或M1和模块3或M3各自编码C-域、被MT-域中断的A-域和T-域，而模块2或M2、模块4或M4、模块5或M5和模块6或M6各自编码C-域，A-域和T-域。此外，其包含模块7或M7的缩合域。M1的缩合域C1负责N-乙酰化作用。nrps-2基因具有约12.5kb的长度，并编码(7)L-N-甲基缬氨酸(M7)，(8)L-脯氨酸(浅灰霉素)或L-反式-4-甲基脯氨酸(甲基浅灰霉素)(M8)和(9)D-N-甲基亮氨酸(M9)的并入所需的模块8和9以及模块7的部分。所述模块7的部分包括被MT-域中断的A-域和T-域，模块8或M8包含C-域、A-域和T-域，模块9或M9包含C-域、被MT-域中断的A-域、T-域和E-域。D-氨基酸在(甲基)浅灰霉素第9位的存在与模块9中催化D-N-甲基亮氨酸插入的E-域的存在相符。nrps-3基因具有约4kb的长度，并编码模块10，其将甘氨酸并入所述分子且管理线性肽链在甘氨酸和L-N-甲基苏氨酸之间通过酯键的环化。模块10包括C-域、A-域、T-域和TE-域。
同源性搜索结果允许生物合成作用分配于NRPS蛋白质的重复单元、模块。图3显示模块1到10分配于NRPS蛋白，剖分为域，和通过指示氨基酸及它们并入生长中的浅灰霉素链的生物合成活性。模块10由所述NRPS-3蛋白释放链，然后是链环化。在表3中指示了在蛋白质DNA水平上模块和域相对于它们在单独的NRPS蛋白质中的位置的大致边界。由此，C代表缩合域，A代表腺苷酰化域，MT代表甲基转移酶域，T代表巯基化域。所述MT整合到所述A域中，这通过排列A’-MT-A”指示。
表3
nt:核苷酸,aa:氨基酸
基于同源性搜索和生化分析，命名为mps-1、mps-2-和mps-4的基因编码L-反式-4-甲基脯氨酸的生物合成所需的蛋白质。L-反式-4-甲基脯氨酸包含于浅灰霉素的第2和5位，及甲基浅灰霉素的第2、5和8位。所述mps-1基因编码与4-脯氨酸羟化酶(41％同一性/57％相似性)和植烷酰-CoA双加氧酶具有最高同源性的蛋白质，但是通过生化分析可显示mps-1基因编码使L-亮氨酸羟基化为(2S,4R)-5-羟基亮氨酸的亮氨酸羟化酶。基因mps-2编码醇脱氢酶，其与牵涉L-顺式-4-甲基脯氨酸的合成的Nostopeptolide基因簇的nosE基因(Luesch等2003)具有34％同一性/55％相似性。Mps-2催化(2S,4R)-5-羟基亮氨酸脱氢为(2S,4R)-γ-甲基谷氨酸γ-半醛。在自发的环形成后，由mps-4编码的蛋白质可能催化(3S,5R)-3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原为(2S,4R)-4-甲基脯氨酸。所述mps-4基因与Sib(55％同一性/70％相似性)和LmbY显示最高的同源性，所述Sib和LmbY均编码黄素依赖的单加氧酶并催化类似的反应(Li等2009；Peschke等1995)。mps-3基因显示与α,β-水解酶的最高同源性，其与Friulimycin生物合成基因簇中的lipE基因产物具有最高同源性(50％同一性/68％相似性)(Müller等2007)。所编码的蛋白质可能充当在错误引发的(misprimed)NRPS的再生中具有功能的II型硫酯酶。mps-3基因产物牵涉4-甲基脯氨酸生物合成途径中吡咯啉衍生物的环化。基于这些结果，本发明的发明人成功地阐明了用于浅灰霉素或甲基浅灰霉素的生物合成的L-反式-4-甲基脯氨酸的生物合成途径。图4显示蓝细菌念珠藻属菌种(Nostoc sp.)GSV264的Nostopeptolide生物合成途径(Hoffmann等2003)中以及本发明所鉴定的(甲基)浅灰霉素生物合成途径中的4-甲基脯氨酸生物合成途径包括其中涉及的蛋白质的比较。基于序列分析，命名为mps-1到mps-4的基因可能转录为操纵子。
此外，基于同源性搜索，鉴定了下述基因。有两个基因orf-1和orf-12，与所述基因簇中的Xre-家族转录调节子的蛋白同源。所编码的蛋白质在(甲基)浅灰霉素生物合成的调节中起作用。可显示这两个基因的失活导致(甲基)浅灰霉素的产生的显著损失，这证明了他们起直接或间接的调节子的作用。Orf-5编码与推定的转运分子具有同源性的蛋白质并可能牵涉(甲基)浅灰霉素的输出。Orf-6编码具有推定的谷胺酰胺合成酶功能的蛋白质。int-1和int-2编码与整合酶催化区具有同源性的蛋白质，因此假定这些蛋白质具有整合酶功能性。基因nrps-1和nrps-3之间的tnp-1、tnp-2和tnp-3编码与推定的转座酶蛋白质具有同源性的蛋白质并假定具有转座酶活性。另一个开放阅读框具有作为DNA聚合酶III的β亚基的推定功能。此orf命名为dna。直接位于nrps-3下游的小的219bp ORF编码MbtH样蛋白质并因此命名为mbtH。需要MbtH蛋白用于NRPS的校正功能(Barry&Challis,2009)。Orf-8与假定蛋白质Scla2_13611具有同源性并假定属于PNPOx-样超家族。Orf-11编码酰胺水解酶超家族的推定的蛋白质。所提出的基因orf-2、orf-3、orf-4、orf-7、orf-9和orf-10全部编码不同的、保守的、假定蛋白质。
实施例3：L-反式-4-甲基脯氨酸的体外合成
L-反式-4-甲基脯氨酸的体外合成可通过偶联随后的三个测定法来进行，即Mps-1测定法，Mps-2测定法和Mps-3测定法。γ-甲基谷氨酸γ-半醛环化为3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸自发出现或可涉及Mps-3。图4显示使用Mps-1,Mps-2，可能的Mps-3和Mps-4将L-亮氨酸转化为(2S,4R)-4-甲基脯氨酸。
(a)亮氨酸羟化酶测定法
基于在计算机中分析发现mps-1基因编码亮氨酸羟化酶。进行了下述的实验步骤，其确认Mps-1蛋白质编码亮氨酸羟化酶。
使用引物Gri3_for(5’-GCCGCCATATGATGCAGCTCACGGCCGAT-3’)(SEQ ID NO:28)和Gri3_rev(5’-GGTCAGGATCCTCATGCCAGCCTCGATTC-3’)(SEQ ID NO:29)从链霉菌DSM 26643基因组DNA通过Phusion聚合酶扩增推定的亮氨酸羟化酶编码基因mps-1，并通过平端连接克隆入pJET 2.1载体(Fermentas)中。在序列确认后，通过引入的NdeI/BamHI限制位点将所述DNA片段亚克隆入pET28b(+)。将所得的构建体pGris3转化入大肠杆菌Rosetta BL21(DE3)pLysS/RARE用于蛋白质表达。携带所述构建体的新鲜转化体在添加了卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的LB-培养基(以来自10-ml培养物的0.1％接种物开始在37℃生长5小时的1L批次(batches))中生长。全部的细胞在37℃生长至OD600为大约0.8。然后用1M异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导所述细胞至终浓度为0.2mM然后在16℃过夜生长。通过离心(6000rpm，10min，4℃)收获所述细胞并重悬于缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH 7.8，200mM NaCl和10％[v/v]甘油)中。然后裂解(在700psi两次通过，弗氏压碎器,SLM Aminco)所述细胞，并通过离心(21,000rpm，10min，4℃)去除细胞碎片。使用预装的HisTrapTM primeTMplus系统(Ge Healthcare)上通过固定化金属离子亲和层析(IMAC)制备型纯化组氨酸-标记的重组的蛋白质。将15ml蛋白质裂解物过滤通过无菌过滤器并加载于1ml HisTrap柱上。如GE Healthcare手册(HisTrap HP，说明书71-5027-68AF)中所推荐的进行纯化。用缓冲液B(20mM Tris-HCl，pH 7.8，200mM NaCl和10％[v/v]甘油，和60、100、200、300和500mM咪唑，10ml级分)以分步咪唑梯度从柱上洗脱期望的蛋白质。将含有通过SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)确定的纯靶蛋白质的级分合并，并使用Amicon UltraPL-10centricons浓缩至大约200μl。向浓缩的蛋白质中加入800μl的贮存缓冲液(50mMTris-HCl，pH 7.5，50mM NaCl和10％[v/v]甘油)然后在液氮中急速冷冻并在-80℃储存。通过Bradford测定法(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)确定蛋白质浓度。每升培养物获得1-3mg/ml纯化的蛋白质。
以亮氨酸作为底物的测定法在MOPS(50mM),pH7.0中进行，且在总体积200μl中包括底物(1mM)、α-酮戊二酸(1mM)、FeSO4(25μM)、DTT(0.5mM)、抗坏血酸(0.1mM)和Mps1(1μM)。通过添加Mps1启动反应并在30℃温育1小时。用冷乙醇沉淀蛋白质并将上清倾析和用于衍生化。所述溶液通过旋转蒸发干燥并重悬于200μl偶联缓冲液(乙腈:吡啶:三乙胺:H2O10:5:2:3)。将50μl的PITC溶液加入所述溶液中，于室温下5分钟反应后加入50μl H2O终止所述反应。所述溶液通过SpeedVac蒸发而蒸发至干燥。使所得的PTC氨基酸溶解于1ml的水:乙腈(7:2)中，离心，并再次通过SpeedVac蒸发将上清液干燥。然后，将氨基酸溶解于100μl水/乙腈中并用于HPLC/MS分析。PITC-亮氨酸和PITC-羟基亮氨酸在正离子化模式(positive ionization mode)中检测(亮氨酸:[M+H]+＝272.9，羟基亮氨酸:[M+H]+＝288.9)。这显示Msp-1催化由亮氨酸到5-羟基亮氨酸的反应(图5)。
(b)Mps-2测定法
5-羟基亮氨酸到γ-甲基谷氨酸γ-半醛的转化可通过Mps-2或根据Luesch等,2003中所描述的醇脱氢酶测定法进行，Luesch等用功能上类似的蛋白质NosE进行了所述测定法。以5-羟基亮氨酸或相关化合物作为底物的典型的反应混合物可包含100mM甘氨酸(pH10)、2mMβ-NAD、底物(0.1-10mM)、1mM ZnSO4和大约3μg的Mps-2。典型的反应体积可为500μl，通过添加Mps-2启动反应并在30-42℃温育1-3小时。
(c)Mps-4测定法
可在根据Luesch等,2003的Mps-4测定法中进行3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸到4-甲基脯氨酸的转化，Luesch等用功能上类似的蛋白质NosF进行了所述测定法。典型的反应混合物可包含200mM Tris(pH 8)、底物、0.2mMβ-NADH或β-NADPH，和大约5μg的Mps-4。反应体积通常为1ml，通过添加Mps-4启动反应并在30-42℃温育1-3小时。根据Becker等,1997的一种替代的Mps-4测定法包含3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸或相关化合物作为底物，可在50mM Tris/HCl,pH 7.5中进行，并包括底物(0.1-10mM)、0.2mM FAD、0.5mM NADH以及Mps-4的适当稀释物(例如在总体积100-500μl中1μg终浓度)。通过添加Mps-4启动反应并在30℃温育1-3小时。
实施例4：浅灰霉素以及甲基浅灰霉素的体外-合成
浅灰霉素以及甲基浅灰霉素的体外-合成可根据如Gaitatzis N.等,2001中公开的反应条件进行。每1ml培养物可包含25mM Tris HCl(pH 8.0)、50mM NaCl、1mM乙酰-CoA(或1mM乙酰-SNAC)、2mM L-缬氨酸、2至3mM(2S,4R)-4-甲基脯氨酸(或相关化合物)、3mM L-亮氨酸、1mM L-脯氨酸(或对于甲基浅灰霉素合成无L-脯氨酸)、1mM L-苏氨酸、4mM S-腺苷-L-甲硫氨酸、1mM甘氨酸、10mM ATP、0.5-5mM NRPS-1、NRPS-2、NRPS-3和MtbH。在用ATP起始反应后可将反应物在30℃温育2-72小时。
实施例5：基因nrps-1和nrps-3和mps操纵子的基因的失活
根据标准的步骤创建链霉菌DSM 22643的插入突变体。使用表4中所列引物从DSM26643的染色体DNA中通过PCR扩增分别与nrps-1、nrps-3基因和mps-操纵子的部分同源的长度为约3000bp的片段。将这些片段克隆到大肠杆菌克隆载体pBluescript SK+中，得到质粒pMPS、pNRPS-1、pNRPS-3。随后，用表5这个所列引物扩增如Gust等,2003中所述创建的AprR-oriT盒并用RedET技术(Genebridges)将其整合入质粒pMPS,pNRPS-1和pNRPS-3中以给出接合质粒。然后将创建的质粒转入DSM 22643中，并在测试(甲基)浅灰霉素产生前分析所述接合体分别正确地遗传整合入mps-操纵子、nrps-1和nrps-3基因中。
表4：用于扩增同源DNA-片段的引物
加下划线的：限制位点的序列
表5:用于AprR-oriT-盒插入的引物
加下划线的：与AprR-oriT盒同源的序列
为了确认野生型中的浅灰霉素产生以及测试所述插入突变体的浅灰霉素合成的能力，在培养基NL5645(组合物(量以百分比计)：乳糖2.0、大豆粉2.5、NaCl 0.5、CaCO30.1以及酵母提取物0.5，pH 6.8)中在摇瓶中培养不同的菌株。在不同的时间点收集所述培养物上清，过滤并与乙醇1:1混合。沉淀并分离不溶的物质后将所述上清液通过UHPLC(超高效液相层析)分析(甲基)浅灰霉素的产生。
如从图6中可得的，野生型菌株DSM 22643产生浅灰霉素(参见UHPLC层析图(UV210nm)中在5.29分钟标记的“浅灰霉素”峰)，而DSM 22643的nrps-1、nrps-3和mps-突变体不产生浅灰霉素(不存在5.29分钟的峰)。此试验确认了NRPS蛋白质和Mps蛋白对与浅灰霉素和甲基浅灰霉素的合成的重要性。
实施例6：mps-突变体的互补
为了表明mps-操纵子的基因与(2S,4R)-4-甲基脯氨酸的合成相关，(1)通过加料(feeding)(2S,4R)-4-甲基脯氨酸和(2)由于表达构建体的染色体整合所致的遗传互补而补足了mps-突变体，其中mps操纵子是从组成型ermE-启动子表达的。
在加料实验中，将20μg/ml(2S,4R)-4-甲基脯氨酸加入mps-突变体的培养物，并如实施例5中所述分析培养物上清液中(甲基)浅灰霉素的产生。而在无(2S,4R)-4-甲基脯氨酸的正常培养基中，mps-突变体不产生任何(甲基)浅灰霉素产生，20μg的加料导致(甲基)浅灰霉素产生(图7A，还有实施例9)。
对于mps-突变体的遗传补足，在接合载体中创建包含具有在组成型ermE启动子控制下的基因mps-1、mps-2、mps-3和mps-4的mps的操纵子的构建体P(ermE)-mps，所述接合载体具有attP附接位点，其用于整合酶介导的向染色体attB位点的整合(对于ermE-启动子的序列参见图7B)。在此P(ermE)-mps构建体整合入在实施例5中创建的mps-突变体后，对补足的mps-突变体测试浅灰霉素产生。如图7C中所示，浅灰霉素产生可在补足的mps-突变体中恢复。
两个实验清楚地指示了mps操纵子对于之后用于甲基浅灰霉素合成的(2S,4R)-4-甲基脯氨酸的合成是必需的。
实施例7：通过在大肠杆菌和天蓝色链霉菌中mps1-4基因套组的表达而异源产生甲基脯氨酸
为了确认基因套组(set)mps1-4编码4-甲基脯氨酸生物合成的酶促机构(enzymatic machinery)，生成了用于在大肠杆菌(pET28-mps)和天蓝色链霉菌(pUWL201-mps)中表达的构建体。
(a)pUWL201-mps的生成以及在天蓝色链霉菌中的异源表达
将来自黏粒B:L23、携带来自浅灰霉素生物合成基因簇3’端的～5.8kb的EcoRI片段(来自SEQ ID NO:1的54283-60163nt)亚克隆入复制型大肠杆菌/链霉菌穿梭载体pUWL201中，处于组成型PermE*启动子的控制下。使用原生质体法(Kieser等,2000)将所得的表达构建体pUWL201-mps随后转化入宿主菌株天蓝色链霉菌A3(2)中。转化体(天蓝色链霉菌/pUWL201-mps)和野生型菌株在50ml TSB培养基中在30℃在带挡板的摇瓶中平行地培养4天(突变体培养物以硫链丝菌肽(thiostreptone)20μg/ml终浓度补充)。通过离心收获细胞并用50ml甲醇提取(15分钟声处理和30分钟搅拌)。过滤后，使所述提取物蒸发至干燥并如下述衍生化。
(b)pET28-mps的生成和在大肠杆菌中异源表达
将来自黏粒B:L23-CmR的～3.7kb XbaI/EcoRI片段亚克隆入用NheI/EcoRI线性化的表达载体pET28b(Novagen)中，处于诱导型T7启动子的控制下。克隆的3.7kb DNA片段携带基因mps1-4(来自SEQ ID NO:1的56434-60163nt在5’端以序列CTAGA延伸)。通过电穿孔将所得的表达构建体pET28-mps以及空表达载体pET28b随后转化入宿主菌株大肠杆菌BL21(DE3)/Codonplus/pL1SL2中。转化体(大肠杆菌BL21(DE3)/Codonplus/pL1SL2/pET28-mps或pET28b)在含0.2％葡萄糖补充有卡那霉素(50μg/ml终浓度)、氨苄青霉素(50μg/ml终浓度)和氯霉素(25μg/ml终浓度)的50ml LB培养基中在30℃培养。培养物生长直到OD600＝0.6，用IPTG(0.3mM终浓度)诱导表达温育在30℃再继续4小时。通过离心收获细胞并用50ml甲醇提取(15分钟声处理和20分钟搅拌)。过滤后将所述提取物蒸发至干燥并如下述衍生化。
(c)上述提取物的衍生化和HPLC-MS分析
将干燥后的细胞培养物以及(2S,4R)-4-甲基脯氨酸(作为保留时间和片段化谱的参照标准)重悬于200μl偶联缓冲液(乙腈:吡啶:三乙胺:H2O)中。添加50μl的PITC(异硫氰酸苯酯)溶液并在室温反应5分钟后，加入50μl H2O以终止反应。通过SpeedVac蒸发将所述溶液蒸发至干燥。将所得的PITC氨基酸溶解于1ml水:乙腈(7:2)中，离心并通过SpeedVac蒸发干燥上清液。然后将衍生化的提取物和衍生化的(2S,4R)-4-甲基脯氨酸参照溶于100μl水/乙腈中用于HPLC/MS分析。
全部测量在Dionex Ultimate 3000RSLC系统上使用Wators BEH C18,50x 2.1mm,1.7μm dp柱进行。除非另外说明，注射2μl样品。用(A)H2O+0.1％FA到(B)ACN+0.1％FA以600μl/分钟的流速和45℃通过线性梯度实现分离。所述梯度以在5％B、0.33分钟等度步骤起始，然后在9分钟增加至95％B，以1.6分钟95％B的冲洗步骤结束，之后用起始条件再平衡。同时进行UV和MS检测。通过附接于Thermo Fisher Orbitrap的Advion Triversa Nanomatenano-ESI系统支持HPLC与MS偶联。以100-500m/z矩心模式(centroid mode)、R＝30000的分辨率获得质谱。在247.11、249.12、265.12和267.12m/z进行使用碰撞诱导的解离的单一反应监控。全部的亲本离子(parent ions)在2m/z窗内分离并以35％CID能量片段化。
4-甲基脯氨酸的预期的衍生物可在来自携带mps表达构建体(pUWL201-mps和pET28-mps)的培养物的衍生化的提取物中检测到，但不能在阴性对照的衍生化的提取物中检测到，如以天蓝色链霉菌中的异源表达(天蓝色链霉菌/pUWL201-mps与天蓝色链霉菌野生型相比较)例示的图8中所示。通过保留时间和高分辨率质量数据(包括片段化数据)与衍生化的PITC-(2S,4R)-4-甲基脯氨酸参照物质相比较，此化合物可以从mps表达培养物的提取物中清楚地鉴定出来。
这明确地证明了基因套组mps1-4编码浅灰霉素前体4-甲基脯氨酸的生物合成所需的全部必需的酶促活性。此外，只要有所述假定的酶促活动的进一步证据，可检测所述途径的两种所提到的中间物(5-羟基亮氨酸和γ-甲基谷氨酸γ-半醛,参见图8)的衍生物。使用纯化的酶通过体外研究能进一步确认推定的亮氨酸羟化酶的功能(如上述在实施例5中所述)。第三个假定的中间物3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸的衍生物不能检测到，因为此化合物不能以所应用的方法衍生化。
Mps基因在两种不同的宿主菌株(大肠杆菌和天蓝色链霉菌)中成功的异源表达还显示这一策略可应用于生成4-甲基脯氨酸，例如用于针对浅灰霉素的有机合成方法，或者通过向浅灰霉素/甲基浅灰霉素生产培养物中给料所述前体以增强甲基浅灰霉素产量/产率。
实施例8：A域特异性的计算机分析
根据Challis等,2000进行NRPS蛋白质的A域的氨基酸特异性的计算机分析。简要地，将A域的序列与短杆菌肽S合成酶GrsA的苯丙氨酸-活化的A域(PheA)的序列进行比对。基于这一比对，鉴定了顺结合口袋排列的(lining the binding pocket)8个氨基酸，并将其与来自具有已知底物特异性的A域的赋予特异性的氨基酸(specificity-conferringamino acid)相比较。在下述的表6中，示出如计算机中预测的NRPS-1、NRPS-2和NRPS-3的A域相对于底物的特异性。相比之下，列出了它们活化以引入(甲基)浅灰霉素中的实际底物。
“残基位置”是单独A域的所述8个氨基酸，它们被认为是对底物识别重要的(‘赋予特异性的氨基酸’或‘赋予特异性的密码’)。将这些残基与具有已知底物特异性的A域的‘赋予特异性的密码’(http://nrps.igs.umaryland.edu/nrps/blast.html)相比较。
表6
a根据浅灰霉素以及甲基浅灰霉素一级结构
b根据其它A域的赋予特异性的密码的比较(http://nrps.igs.umaryland.edu/nrps/blast.html)
c残基对应于短杆菌肽S合成酶PheA编号(Challis等,2000)
d登录号:AF204805_1(Hoffmann等,2003)
e登录号:AAO26334(Luesch等,2003)
f登录号:AAF17281(Hoffmann等,2003)
A3域，A10域和部分A8域的结果与实际上并入到(甲基)浅灰霉素中的氨基酸一致。其余的结果看上去并未与实际并入的氨基酸对齐，这可能是由于所应用的方法所致。基于被认为是对于要并入浅灰霉素的底物氨基酸的特异性关键的所述合成酶的8个氨基酸残基，不可能区分脯氨酸和甲基脯氨酸特异性的A域。
实施例9：甲基脯氨酸和脯氨酸特异性域的系统发生分析
对于甲基脯氨酸和脯氨酸特异的A域的如图9所示的系统发生分析表明，与脯氨酸并入域(NRPS-2-A8和NosD(mPro))相比，来自并入甲基脯氨酸的NRPS模块(NRPS-1-A2和NRPS-1-A5和NcpB8(mPro)和NosA-A(mPro))的A域彼此之间更紧密相关。这提示所述特异性并不仅由如表6中所示的8个氨基酸残基确定。
应用Geneious Pro 5.4.3软件(树比对选项(Tree Alignment Options)：成本矩阵(Cost Matrix)(Blosum 62)、缺口开放罚分(Gap open penalty)(12)、缺口延伸罚分(Gap extension penalty)(3)和比对类型(Alignment type)(全局比对(Globalalignment))；建树选项(Tree Builder Options)：遗传距离模型(Genetic distancemodel)(Jukes-Cantor)、建树方法(Tree build method)(Neighbor-Joining(邻接法))，外围群(Outgroup)(无外围群))的Geneious Tree Builder功能进行分析。比例尺(scalebar)代表每个氨基酸位点0.09取代。
实施例10：模块2、5和8的A域的特异性
为了洞察模块2、5和8的A域的特异性，重组产生了所述域并通过ATP/Ppi交换体外测定法分析了它们的特异性。结果示于图10。如所预期的，域A2和A5对(2S,4R)-4-甲基脯氨酸的特异性最高。有意思的是，对域A8也是这样的，尽管在浅灰霉素的生物合成过程中L-脯氨酸优选通过模块8并入。显示也存在对L-脯氨酸的高特异性。假定模块8的C域优选缩合脯氨酸，并将其引入生长中的肽链。(甲基)浅灰霉素生物合成过程中甲基脯氨酸的可用性看起来也起到一定作用，如可通过加料实验所显示的。以0.025到1.0g/l的浓度加料4-甲基脯氨酸显示出甲基浅灰霉素多至对照的5倍高的增加。该实验也显示并入速率并不是线性的，但在约0.5g/l时达到饱和。加料反式-羟基脯氨酸和反式氟-脯氨酸也显示出显著的并入。
(a)重组A2,A5和A8域的产生
为了直接研究A域底物特异性，我们旨在将浅灰霉素途径的A域(A2、A5和A8)表达为来自pET28b(+)的N-末端His6-标记的蛋白质。使用寡聚物A2_for5’-CCGACCATATGGATCCGGATGTGACGGTGGG-3’(SEQ ID NO:44)和A2_rev5’-ACCGGGAATTCGCCGACGGCGGGCAGGCCGA-3’(SEQ ID NO:45)从来自链霉菌DSM 22643的基因组DNA扩增编码A2、A5和A8的腺苷酰化域的DNA片段(由于高同源性，全部3个A域均可使用相同的引物对扩增)，并通过平端连接将其克隆入pJET2.1载体中。
测序揭示全部的A域都是正确的。根据浅灰霉素的分子结构以及计算机中分析，预期A域A2和A5并入2S,4R-甲基脯氨酸。预期A域A8显示更广泛的底物特异性，其并入L-脯氨酸或2S,4R-甲基脯氨酸。为了在体外对此进行确定，我们在大肠杆菌Rosetta pLys(RARE)中在16℃过夜表达所述A域。全部3个A域均可在可溶性级分中获得。
使用分步咪唑梯度用Ni+-亲和层析纯化所述蛋白质。对于全部A域，均可在级分8中获得纯蛋白质。尽管蛋白质的量非常低(0.2mg/ml)，其可用于ATP-PPi交换测定法中以确定底物特异性。
使用已建立的ATP-PPi交换测定法(Mootz和Marahiel.1997,Thomas等,2002)评估了3种纯化的腺苷酰化域的底物特异性。简要地，每种蛋白质与一组(a panel)不同的氨基酸包括各域的预期底物一起温育。作为对照，将每种蛋白质在不存在添加的氨基酸的情况下温育，以确定放射性背景反应。测试了9种不同的底物(参见图10)。
(b)通过ATP-[32P]PPi交换测定法确定底物特异性
为了确定底物特异性,在30℃进行含有Tris-HCl(pH 7.5,75mM)、MgCl2(10mM)、dATP(5mM)、氨基酸(5mM)和蛋白质(2μg)的ATP-[32P]PPi反应(100μl)。32P-焦磷酸四钠从Perkin Elmer(NEN#NEX019)获得。通过添加[32P]PPi(0.1μCi最终量)起始反应，进行多至30分钟，然后用炭悬液(500μl，1.6％[w/v]活化的炭，0.1M Na4P2O7，和0.35M高氯酸于H2O中)结束(quench)。所述炭通过离心沉淀，之后用洗涤溶液(0.1M Na4P2O7和0.35M高氯酸，于H2O中)洗涤两次，重悬于H2O(500μl)中，然后通过液体闪烁(Beckman LS6500)记数。
实施例11：由浅灰霉素生物合成基因簇的orf-1和orf-12编码的Xre-型的转录调节子
为了阐明由orf-1和orf-12编码的两种推定的转录调节子在浅灰霉素产生中的牵涉，生成各ORF的失活突变体。随后，通过HPLC/MS分析分别确定野生型菌株ST105671和所述突变体菌株ST105671-orf-1和ST105671-orf-26的提取物对浅灰霉素生产的作用。为了确定失活突变体中观察到的对生产的作用是否由于orf-1和orf-12编码的转录调节子的直接调节，将所述调节子异源表达并纯化。将纯化的蛋白质用于电泳迁移率变动分析(EMSA)，以检查与浅灰霉素生物合成基因簇的推定启动子区的直接相互作用。
(a)orf-1和orf-12的失活
使用通过同源重组整合在orf-1和orf-12中的pKC1132质粒的衍生物破坏基因orf-1和orf-12。构建pKC1132的两种衍生物(分别为pKC1132-orf-1和pKC1132-orf-26)，其携带orf-1或orf-12编码区的中央部分。因此，分别使用引物组合dxregrise_for/dxregrise_rev和dxreIIgrise_for/dxreIIgrise_rev(引物序列参见表8)通过PCR反应扩增orf-1的623bp DNA片段和orf-12的1139bp DNA片段。通过使用的引物EcoRI限制位点由此附接于所述片段的两端。使用EcoRI消化所述DNA片段和质粒pKC1132并随后进行连接。分别将包含所需质粒pKC1132-orf-1和pKC1132-orf-26的连接物转化入电感受态的大肠杆菌DH10B细胞中。在含60μg/ml阿泊拉霉素的LB琼脂平板上选择转化体。使单菌落在60μg/ml阿泊拉霉素存在下在LB液体培养基中生长并制备质粒。通过EcoRI分析性消化鉴定携带正确插入物的质粒(pKC1132-orf-1和pKC1132-orf-26)。然后用正确质粒pKC1132-orf-1和pKC1132-orf-26转化携带非许可质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567细胞。在含60μg/ml阿泊拉霉素的LB琼脂平板上选择转化体以得到菌株大肠杆菌ET12567pUZ8002pKC1132-orf-1和大肠杆菌ET12567pUZ8002pKC1132-orf-26。这些菌株用于通过接合将质粒pKC1132的衍生物递送入菌株ST105671中。进行步骤如下。将2ml的在30℃在浅灰霉素产生培养基5288和在TSB培养基中生长的链霉菌菌株ST105671的2天龄液体培养物和2ml的携带质粒pKC1132-orf-1或pKC1132-orf-26的各大肠杆菌菌株(于含25μg/ml卡那霉素、25μg/ml氯霉素和60μg/ml阿泊拉霉素的LB中生长)沉淀，用无菌水洗涤，并各重悬于500μl TSB中。250μl的链霉菌菌株ST105671和各大肠杆菌菌株混合并在30℃在通气下温育过夜。添加1ml的含60μg/ml阿泊拉霉素和25μg/ml萘啶酮酸的TSB并在30℃在通气下进一步温育过夜。将温育细胞沉淀后，用TSB洗涤一次并铺于含60μg/ml阿泊拉霉素和25μg/ml萘啶酮酸的MS-琼脂上，然后在30℃进一步温育直至缀合物变得可见。质粒pKC1132-orf-1或pKC1132-orf-26分别正确地整合到orf-1或orf-12的编码区通过使用所述缀合物的基因组DNA以及引物lacZ1、lacZ2和(在破坏orf-1的情况下为)grixreI_g1、grixreI_g2或(在破坏orf-12的情况下为)grixreII_g1、grixreII_g2的组合进行PCR验证。由所述步骤产生的ST105671-orf-1和ST105671-orf-26的失活突变体用于确定其与ST105671前任(predecessor)相比对浅灰霉素生产的作用。
(b)ST105671-orf-1和ST105671-orf-26的提取物的HPLC/MS分析
将orf-1的四个独立的失活突变体和orf-12的两个独立的失活突变体的液体培养物在含60μg/ml阿泊拉霉素的TSB液体培养基中生长2天。使用这些培养物，1:50各一式两份接种不含抗生素的100ml新鲜TSB培养基并生长3天。在预培养中不使用阿泊拉霉素等同地处理野生型ST105671细胞。通过离心沉淀细胞并将上清液用于乙酸乙酯提取。为了监测对浅灰霉素生产的作用，随后通过HPLC/MS分析分析了所述提取物。确定了各突变体和野生型菌株ST105671的浅灰霉素相对于每种培养物的总蛋白量的数量。因此，积分各峰面积并相对于沉淀细胞的总蛋白量进行计算。计算平均值和标准偏差。orf-1的失活导致高于200倍的浅灰霉素生产下降。在orf-12失活突变体中检测不到浅灰霉素(参见表7)。所述观察显示由orf-1和orf-12编码的Xre-型转录调节子牵涉浅灰霉素产生的调节。这些作用是否是通过结合Xre-型调节子的浅灰霉素生物合成基因簇中启动子的直接调控的结果还是描绘间接作用应该通过进行DNA蛋白质相互作用研究(电泳迁移率变动分析EMSA)阐明。
表7
菌株 重复的数目 平均(相对强度) 标准偏差
ST105671 4 7.38*109 4.59*109
ST105671-orf-1 8 3.19*107 1.41*107
ST105671-orf-26 8 - -
表7：突变体ST105671-orf-1和ST105671-orf-26中对浅灰霉素产生的作用。各突变体和野生型菌株ST105671的浅灰霉素的量显示为相对于独立生长的重复培养物的全蛋白质含量获得的提取物数量的平均值。
(c)转录调节子Orf-1和Orf-12与nrps1和nrps2的启动子区特异性结合的验证
为检查调节子Orf-1和Orf-12对浅灰霉素生物合成基因的直接转录调节，确定了其与基因nrps1和nrps2的上游的推定的启动子区的可能的结合。因此，使用菌株ST105671的基因组DNA作为模板用引物组合xreI-NdeI-for/xreI-HindIII-rev和xreII-NdeI-for/xreII-HindIII-rev在PCR反应中首先扩增orf-1和orf-12的编码区。NdeI限制位点由此附接于所得DNA片段的5’末端，HindIII限制位点附接于所得DNA片段的3’末端。用NdeI和HindIII消化质粒pET22b和携带基因orf-1和orf-12的扩增的DNA片段。随后，在两个分别的尝试中将NdeI/HindIII消化的orf-1和orf-12与NdeI/HindIII消化的pET22b连接。将连接物转化入大肠杆菌DH10B中并在含200μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。制备质粒并通过HindIII/NdeI消化来确认插入物(分别为orf-1和orf-12)正确整合入质粒。携带所述插入物的质粒最终进行DNA测序以排除DNA序列中的突变。由于所述克隆策略，所得的质粒pET22b-orf-1和pET22b-orf-26分别编码C-末端6个His标记的(6xHis)Orf-1和Orf-12。通过电穿孔将两质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并在含200μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。C-末端6xHis标记的融合蛋白Orf-1-His和Orf-12-His的表达在含200μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中在0.1mM IPTG的存在下在16℃过夜进行。通过声处理裂解细胞并使用Ni2+亲和柱实现Orf-1-His(～33kDa)和Orf-12-His(～47kDa)的纯化。
分别使用引物组合prom4hex2_rev/prom4hex3_for和prom5hex2_rev/prom5hex3_for在PCR反应中扩增基因nrps1的推定的启动子区(nrps1上游581bp区)和基因nrps2推定的启动子区(nrps2上游632bp区)以得到在两末端携带18bp接头区的DNA片段。在第二PCR反应中，这些DNA片段在每条链的5’末端用Hex荧光团标记。在此，使用携带5’Hex荧光团并与第一PCR反应物中附接的18bp接头区反向互补的引物(Hex2和Hex3)。由此生成Hex标记的跨上述基因nrps1和nrps2上游区的DNA片段并称为Pnrps1和Pnrps2。在平行尝试中，使用各自菌株的基因组DNA以引物EH33951_rev/EH33950_rev扩增侧翼为含双启动子系统的黄色粘球菌DK1622的注释的(annotated)基因组的基因mxan_3950和mxan_3951的696bp基因间区。由于所述引物携带如上述的相同18bp接头区，所述DNA片段可随后如上述在两5’末端用Hex荧光团标记。由于不能预期调节子Orf-1-His和Orf-12-His与黄色粘球菌DK1622的基因组之外的此启动子区的特异性结合，所得的称为Pmxan_ctrl的DNA片段在EMSA测定法中作为阴性对照。
这些DNA片段以及两个纯化的调节子(Orf-1-His和Orf-12-His)随后用于EMSA测定法。简要地，所述测定法进行如下。在1x缓冲液HG(25mM HEPES，192mM甘氨酸，用KOH pH7.3)中制备4％天然PAA-凝胶。漂洗所述凝胶的口袋并在1x缓冲液HG中无样品在120V进行电泳30分钟。制备样品(有或没有500倍摩尔过量的Orf-1-His或Orf-12-His的100fMol的每种DNA-片段Pnrps1、Pnrps2和Pmxan_ctrl，以及2.5μg高分子量鲑鱼精DNA作为竞争DNA)并在30℃温育10分钟。将样品上样于所述凝胶且电泳在120V进行2小时。使用Typhoon 9410图像仪(Amersham)在各波长完成DNA片段的检测。与不存在Orf-1-His的尝试相比，存在Orf-1-His时，在电泳中可观察到各Hex标记的DNA片段的滞留，指示调节子Orf-1-His与包含启动子区的DNA的非特异性结合(图11)。另一方面，Orf-12-His未显示与任何DNA片段相互作用的能力，表明对所述测定法中使用的Hex标记的DNA没有特异性。总之，这些结果提示Orf-1-His或Orf-12-His均不是启动子Pnrps1和Pnrps2的直接的转录调节子。
Xre-型调节子Orf-1和Orf-12显示有关它们预测的域组织的卓越方面，其使用在http://smart.embl-heidelberg.de/的SMART工具确定(图12)。如所预期的，两调节子具有N-末端Xre-型螺旋-转角-螺旋(HTH)基序，由此Orf-1明显含有此类的第二域(HTH2)。除此之外，两调节子均通过具有未知功能的延长的C-末端表征。由于可能的是这些不寻常的特征是调节机制的一部分，其影响调节子Orf-1和Orf-12对不同DNA序列的亲和力并由此影响特异性，因而使用C-末端截短形式的所述调节子来重复进行了EMSA测定法。在Orf-1的情况下，这些截短形式仅包含HTH1、HTH2，或两个预测的HTH域。各蛋白质名为ORF1-HTH1(～9.6kDa)、ORF1-HTH2(～9.8kDa)和ORF1-HTH12(16.4kDa)。在Orf-12的情况下，所述截短形式仅含有N-末端HTH域，名为ORF26-HTH(～9.9kDa)。应排除导致C-末端或整个蛋白质的构象变化并由此影响所述调节子的DNA结合亲和力的调节作用(例如，未知辅因子的结合或蛋白质-蛋白质相互作用)。
通过将Orf-1和Orf-12各自5’区作为NdeI/HindIII片段克隆入NdeI/HindIII消化的pET22b中已得到所编码的C-末端6xHis标记的融合蛋白，从而获得所述截短形式的Orf-1和Orf-12。如在全长Orf-1和Orf-12的情况中所述进行克隆。用于扩增待克隆的插入物所用的引物对为xreI-NdeI-for/xreIhth1rev(Orf-1-HTH1)、xreIhth2for/xreIhth12rev(Orf-1-HTH2)、xreI-NdeI-for/xreIhth12rev(Orf-1-HTH12)和xreII-NdeI-for/xreIIhthrev(Orf-12-HTH)。异源表达、纯化和与基因nrps1和nrps2的上述启动子区的结合的后续确认如对全长蛋白所述进行。使用这些截短形式的调节子进行的EMSA测定法揭示ORF1-HTH12对启动子Pnrps1的特异结合，以及Orf-12-HTH对两启动子区Pnrps1和Pnrps2的特异结合(图13)。
仅通过Orf-1-HTH12和Pnrps1的共温育可实现DNA的电泳中的显著滞留。使用阴性对照Pmxan_ctrl不能观察到所述滞留。与Pnrps2的共温育给出较不清楚的结果，由此不能作出关于Orf-1-HTH12与启动子区Pnrps2的直接结合的明确叙述。Orf-12-HTH与Pnrps1或Pnrps2共温育导致DNA片段的明确的滞留，而在阴性对照Pmxan_ctrl的情况中完全不存在移动(shift)。
基于这些实验结果，两调节子的C-末端的作用仍有待阐明，但看起来与Orf-1和Orf-12的DNA结合特异性的修饰有关。尽管如此，基于所观察到的orf-1或orf-12失活后对于浅灰霉素的产生的作用，Orf-1-HTH12对启动子Pnrps1的直接特异性结合、Orf-12-HTH对启动子Pnrps1和Pnrps2的特异性结合、由orf-1和orf-12编码的Xre-型转录调节子在功能上清楚地与浅灰霉素生物合成有关并可被视为次级代谢物簇(secondary metabolitecluster)的一部分。
表8
引物名称 序列5'—>3' SEQ ID NO
dxregrise_for cgGAATTCTGAGAAGCTGCCTGCAC 46
dxregrise_rev cgGAATTCCTCATAGACCTGAGCGGC 47
dxreIIgrise_for cgGAATTCCGTAGGACACGGAAACTGTC 48
dxreIIgrise_rev cgGAATTCGCATCCATCCTGAGCAG 49
EH33950_rev GGAATGGGCCGGGTACTGCAGCCTGCTATTTCTCAGAATC 50
EH33951_rev GGAATGGGCCGGGTACTGAGAGCACGGGGTGTG 51
grixreI_g1 ATCGCCTTCGGCGACAG 52
grixreI_g2 GCTGGGCGTATCCGACTC 53
grixreII_g1 GAAGGGACAGGTCCACCG 54
grixreII_g2 GGTGTCCTGCACGGACAG 55
hex2 GCTCTCGGTGCCCTTGTG 56
hex3 GGAATGGGCCGGGTACTG 57
lacZl CTTGGGCTGCAGGTCGAC 58
lacZ2 GTGTGGAATTGTGAGCGG 59
prom4hex2_rev GCTCTCGGTGCCCTTGTGTTCACTATCCCCATGTTGTTTCC 60
prom4hex3_for GGAATGGGCCGGGTACTGCTGCTGACTGAACCAGATCTCAC 61
prom5hex2_rev GCTCTCGGTGCCCTTGTGGATCGAACACGGCTCAGCTC 62
prom5hex3_for GGAATGGGCCGGGTACTGGCAGCACTTCATGGTCGC 63
xreI-HindIII-rev cgtAAGCTTCTCGTTCGCGCCCGTTTC 64
xreIhthl2rev cgtAAGCTTGGCGATCGACCGGTCTTC 65
xreIhthlrev cgtAAGCTTATCAGTCAGATCGGGCGG 66
xreIhth2for gtaaggCATATGGATCTGTTCCCGCGGTCC 67
xreII-HindIII-rev cgtAAGCTTGGTTGTGCTAATGCCCGTCC 68
xreIIhthrev cgtAAGCTTCTCCGCTTCCGGCTCAC 69
xreII-NdeI-for gtaaggCATATGAGTGAAAACCTGACGCTGGGAG 70
xreI-NdeI-for gtaaggCATATGTCTGCTCGTCACTTCGACCG 71
表8:所述实验中使用的引物的列表。显示了引物名称和按寡核苷酸5’到3’方向的DNA序列。用单下划线标示的字母：附接于所述引物的限制位点。用双下划线标示的字母：附接于各序列的5’接头区。小写字母:附接的核苷酸以增强限制效率。
实施例12:链霉菌DSM 22643
根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty onthe International Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurposes of Patent Procedure)，链霉菌DSM 22643于2009年6月4日由赛诺菲(Sanofi-Aventis Deutschland GmbH,Industriepark 65926Frankfurt/Main,Germany)保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH(DSMZ),Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,德国)。
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Claims (17)

1.核酸，其包含选自下述的至少一种核酸：
(a)核酸，其包含SEQ ID NO:1中所包含的、编码SEQ ID No:2、9、16、17、19-22或27的蛋白质的开放阅读框(ORFs)1、8、15、16、18-21或26中的至少一个ORF，
(b)核酸，其编码SEQ ID No:2、9、16、17、19-22或27的蛋白质中的至少一种蛋白质。
2.权利要求1的核酸，其中所述核酸包含至少2个ORF，所述ORF编码SEQ ID No:2、9、16、17、19-22或27的任意蛋白质，或如权利要求1的(b)项中所述的核酸。
3.权利要求1的核酸，其中所述核酸包含分别编码SEQ ID NO:19、20、21和22的蛋白质的ORF 18、19、20和21中的至少一个ORF，或如权利要求1的(b)项中所述的核酸。
4.权利要求1的核酸，其中所述核酸包含分别编码SEQ ID NO:9、16和17的蛋白质的ORF8、15和16中的至少一个ORF，或如权利要求1的(b)项中所述的核酸。
5.权利要求1的核酸，其包含下述的浅灰霉素生物合成基因簇或由下述的浅灰霉素生物合成基因簇组成，所述浅灰霉素生物合成基因簇具有SEQ ID NO:1的序列。
6.表达载体，其包含权利要求1-5中任一项的核酸。
7.宿主细胞，其被权利要求6的表达载体转化。
8.蛋白质，其包含至少一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自SEQ ID No:2、9、16、17、19-22或27。
9.抗体，其特异性地针对权利要求8中的至少一种蛋白质。
10.权利要求1到5中任一项的核酸，权利要求6的表达载体，权利要求7的宿主细胞或权利要求8的蛋白质，用于浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的产生的用途。
11.权利要求3的核酸，包含权利要求3的核酸的权利要求6的表达载体，由包含权利要求3的核酸的权利要求6的表达载体转化的权利要求7的宿主细胞，或SEQ ID NOs:19、20、21和22中的至少一种蛋白质，用于L-反式-4-甲基脯氨酸的产生的用途。
12.产生权利要求8中的至少一种蛋白质的方法，所述方法包括：
a)表达权利要求1-5中任一项的核酸，和
b)任选地，分离所述蛋白质。
13.产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求8的至少一种蛋白质，和
b)将a)的至少一种蛋白质与L-N-甲基缬氨酸、L-亮氨酸、L-N-甲基苏氨酸、L-脯氨酸、L-N-甲基亮氨酸和甘氨酸一起温育，以产生浅灰霉素和/或甲基浅灰霉素。
14.产生L-反式-4-甲基脯氨酸的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求8的至少一种蛋白质，和
b)将a)的至少一种蛋白质与L-亮氨酸、5-羟基亮氨酸、γ-甲基谷氨酸γ-半醛和/或3-甲基-Δ1-吡咯啉-5-羧酸一起温育，以产生L-反式-4-甲基脯氨酸。
15.链霉菌(Streptomyces)DSM 22643。
16.权利要求2的核酸，其中所述核酸包含编码SEQ ID No:2、9、16、17、19-22或27的任何蛋白质的至少三个ORF，或如权利要求1的(b)项中所述的核酸。
17.权利要求10的用途，其中所述蛋白质是SEQ ID NOs:9、16和17中的至少一种蛋白质。
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