CN102021187A - Fr-008聚酮抗生素生物合成相关的基因簇 - Google Patents

Abstract

一种链霉菌FR-008中负责FR-008聚酮合成的基因簇，属于基因技术领域，包含fscA、fscB、fscC、fscD、fscE、fscF、fscTI、fscTII、fscRI、fscRII、fscRIII、fscRIV、fscP、fscFE、fscTE、fscMI、fscMII、fscMIII、fscO、pabAB、pabC这一系列共21个基因及其DNA序列，即序列1，并提供了这些基因及其DNA序列所编码FR-008生物合成酶的氨基酸序列，即序列2-22。本发明所提供的基因及其所编码的蛋白质可以用来查找和发展可用于医药，工业，农业的化合物或蛋白。

Description

FR-008聚酮抗生素生物合成相关的基因簇

本发明是由专利申请号为：200310108110.1，专利申请名称为：“负责FR-008聚酮抗生素生物合成的基因簇”，专利申请人为：上海交通大学、韩国高等科学技术学院，专利申请日为：2003年10月23日的专利分案申请。

技术领域

本发明涉及的是一种聚酮抗生素及其生物合成基因，特别是一种链霉菌FR-008中多烯聚酮合酶基因簇，属于生物技术基因领域。

背景技术

抗生素是由微生物、植物和动物等产生的，能够在很低浓度下就可以杀死或抑制其它生物生长的次级代谢产物。如微生物所产生的青霉素、作为抗癌药物的紫杉醇(taxol)等。抗生素通过干扰靶细胞的一个或多个生理代谢过程而发挥作用。聚酮是一类自然产物，很多聚酮类抗生素已应用于医用，兽用及农用，包括红霉素(抗菌)，制霉菌素(抗真菌)，阿维菌素(抗寄生的)，纳巴霉素(免疫抑制剂)和道诺红菌素(抗肿瘤)。革兰氏阳性菌链霉菌是聚酮抗生素的主要产生菌。聚酮的合成与脂肪酸的合成类似，都是经由聚酮合酶介导的简单羧酸单位的缩合过程，而且与聚酮抗生素合成相关的合成基因，调节基因及抗性基因在细菌基因组中往往紧密连锁，成簇排列。负责红霉素大环内酯形成的DEBS聚酮合酶是第一例被发现具有模块结构。随着越来越多大环内酯聚酮的分离与鉴定，它的模块化核心概念始终没有发生改变。I型聚酮合酶的模块结构包括重复的酮基合成酶结构域(KS)，酰基转移酶结构域(AT)，酰基载体蛋白结构域(ACP)(也可能包含酮基还原酶结构域(KR)，脱氢酶结构域(DH)，烯酰还原酶结构域(ER))，每个模块负责聚酮链延伸的一次反应，它们决定着加入的延伸单位的还原步骤。此外，还需要硫酯酶(TE)结构域的作用催化聚酮链的环化与释放。最后，还要经过糖基化、羟基化、甲基化和酰基化等修饰步骤。例如免疫抑制剂FK506通过抑制T细胞激活与生长所需的信号传导途径来阻碍免疫应答。FK506被用来防止移植排拒反应。并被用于某些自动免疫疾病的治疗。在结构上，FK506也是一个大环内酯，可由一些链霉菌产生。

聚酮生物合成PKS的模块结构组成具有一定的可塑性，使得人们能够通过改变模块的数目、延伸模块的特异性或结构域的插入或失活等基因工程操作获得新的聚酮衍生物。

天然大环内酯抗生素多样性的一个重要资源是中心配基特定位点上所结合的糖基。这些糖基组分被发现几乎均与抗生素和其细胞内作用对象之间分子识别有关。许多天然存在的生物活性代谢物携带有不寻常的糖基，作为生物活性分子识别的要素。近来，对于糖苷转移酶及其它糖基合成基因的深入了解越来越多地被用来产生新型糖基杂合的抗生素。糖苷转移酶对底物的一定适应性使糖苷转移酶成为组合生物合成的引人注目的工具。

氨基海藻糖基团存在于很多大环内酯抗生素分子中，大部分多烯抗生素分子携带这种特殊的氨基海藻糖基团。预测的氨基海藻糖合成途径包括来自主代谢中的GDP-甘露糖在GDP-甘露糖脱水酶的作用下转化为GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖，然后异构化为GDP-3-酮基-6-脱氧-D-甘露糖，最后通过GDP-酮糖转氨酶的转氨作用形成GDP-氨基海藻糖。其中异构化可能并不需要酶的参与。

天然抗生素的另一个重要特点是已合成好的中心配基特定位点上可经过氧化酶的后修饰而获得很大范围的结构特征。这些氧化酶介导的后修饰包括羧基化，羟基化，环氧化等。大多数情况下这些后修饰步骤导致产生药效团特性。因而这些后修饰氧化酶基因具有很大的化学和药理学重要性。在组合生物合成中，这些后修饰的氧化酶基因扮演着重要的角色。考虑到聚酮化合物后修饰蛋白在生物活性及结构多样性方面的重要作用，更加广泛的后修饰氧化酶基因可以得到应用并扩大可应用后修饰酶的工具箱。近来，对于后修饰氧化酶基因的深入了解越来越多地被用来产生新型的杂合的抗生素。后修饰氧化酶基因对底物的一定适应性也使其成为组合生物合成的引人注目的工具。

聚酮细胞色素P450单氧化酶催化前体聚酮位点特异性氧化而得到最终的大环内酯抗生素，包括红霉素，泰乐菌素，竹桃霉素，阿维菌素等。这些聚酮细胞色素P450单氧化酶的作用底物以及在相同底物的作用位点都有很大的不同。底物结构的微小变化就会给这些氧化酶作用活性造成很大影响。

另一方面，一直以来，提高产量是抗生素工业生产致力于解决的优先问题。然而，传统的通过改善发酵条件，或通过化学诱变筛选产量提高的抗生素产生菌越来越受到限制，并且很容易达到饱和。随着生物技术的发展特别是基因工程的飞速发展，提供了通过改造抗生素产生菌中相关基因而大幅度提高抗生素产量的途径。这其中增加正调节基因拷贝数或打断负调节基因是最重要的途径之一。

多烯大环内酯是一类在大环内酯中包含3-8个连续双键的聚酮化合物。多烯抗生素通过与真核细胞膜的固醇相互作用形成通道而引起小分子的丢失而导致细胞死亡。

多烯大环内酯类抗生素两性霉素B是结核链霉菌产生的一种在医药上具有重要用途的抗真菌抗生素。两性霉素B对真菌细胞膜中数量最大的固醇麦角固醇具有很大的亲和性，从而对真菌细胞具有选择性的毒性。然而它也会与哺乳动物细胞膜中的胆固醇发生作用而具有毒性，尤其是肾毒性。尽管如此，两性霉素B仍然是人类严重系统性真菌感染最重要的抗生素。两性霉素B还可使培养细胞免受艾滋病毒(HIV)的感染。多烯大环内酯类抗生素制霉菌素也是人类真菌感染重要的医用抗生素。杀念菌素D是由灰色链霉菌IMRU3570产生的一种芳香七烯大环内酯抗生素。它对念珠菌有很强的抑制活性。

发明内容

本发明根据背景技术中存在的不足和需要解决的技术问题，提供一种FR-008聚酮抗生素生物合成相关的基因簇，其产生的一种多烯聚酮抗生素FR-008具有抗真菌活性和对蚊子幼虫的高毒性，而且可以防止前列腺肿大以及可以防止阴道滴虫感染和念珠菌阴道炎。

本发明提供一种链霉菌FR-008中多烯聚酮FR-008生物合成基因簇，即包含fscA，fscB，fscC，fscD，fscE，fscF，fscTI，fscTII，fscRI，fscRII，fscRIII，fscRIV，fscP，fscFE，fscTE，fscMI，fscMII，fscMIII，fscO，pabAB，pabC这一系列共21个基因及其DNA序列，即序列1，并提供了这些基因及其DNA序列所编码FR-008生物合成酶的氨基酸序列，即序列2-22；包括包含序列1中碱基20,927-26,158的基因fscA，包含序列1中碱基60,860-28,983的基因fscC，包含序列1中碱基77,587-60,962的基因fscB，包含序列1中碱基84,132-77,983的基因fscF，包含序列1中碱基107,485-84,170的基因fscE，包含序列1中碱基136,148-107,496的基因fscD的核苷酸序列，编码了聚酮合酶；包括包含序列1中碱基26,333-27,340的基因fscTI，包含序列1中碱基27,561-28,280的基因fscTII，包含序列1中碱基3,818-3,150的基因fscRI，包含序列1中碱基7,205-4,377的基因fscRII，包含序列1中碱基10,320-7,210的基因fscRIII，包含序列1中碱基13,315-10,298的基因fscRIV，包含序列1中碱基16,106-17,287的基因fscP，包含序列1中碱基17,334-17,528的基因fscFE，包含序列1中碱基17,556-18,413的基因fscTE，包含序列1中碱基13,522-14,898的基因fscMI，包含序列1中碱基14,953-16,011的基因fscMII，包含序列1中碱基137,766-136,558的基因fscMIII，包含序列1中碱基1,950-574的基因fscO，包含序列1中碱基18,610-20,781的基因pabAB，包含序列1中碱基3,037-2,264的基因pabC的核苷酸序列，编码了ABC转运蛋白，调节蛋白，细胞色素P450单氧化酶，铁氧化还原蛋白，II型硫脂酶，糖基合成酶，糖苷转移酶，依赖FAD的单氧化酶，对氨基苯甲酸合成酶。共有负责FR-008生物合成的6个聚酮合酶基因，4个调节基因，2个转运基因，2个对氨基苯甲酸合成基因，2个糖基合成酶，1个糖苷转移酶基因和4个修饰基因获得确认，并提供这些基因所编码酶的氨基酸序列。

本发明是根据如下技术方案实现的，本发明提供了一种来自于链霉菌FR-008中编码了聚酮合酶，ABC转运蛋白，调节蛋白，细胞色素P450单氧化酶，铁氧化还原蛋白，II型硫脂酶，糖基合成酶，糖苷转移酶，依赖FAD的单氧化酶，对氨基苯甲酸合成酶的抗生素FR-008基因簇，并提供了这些核苷酸序列所编码FR-008生物合成酶的氨基酸序列，也就是说这些酶由序列2-22提供的氨基酸序列来定义，这些核苷酸序列是分别选自于序列1中包括fscA(20,927-26,158)，fscC(60,860-28,983)，fscB(77,587-60,962)，fscF(84,132-77,983)，fscE(107,485-84,170)，fscD(136,148-107,496)，fscTI(26,333-27,340)，fscTII(27,561-28,280)，fscRI(3,818-3,150)，fscRII(7,205-4,377)，fscRIII(10,320-7,210)，fscRIV(13,315-10,298)，fscP(16,106-17,287)，fscFE(17,334-17,528)，fscTE(17,556-18,413)，fscMI(13,522-14,898)，fscMII(14,953-16,011)，fscMIII(137,766-136,558)，fscO(1,950-574)，pabAB(18,610-20,781)，pabC(3,037-2,264)的一系列基因序列。

包括包含序列1中碱基20,927-26,158的基因fscA，包含序列1中碱基60,860-28,983的基因fscC，包含序列1中碱基77,587-60,962的基因fscB，包含序列1中碱基84,132-77,983的基因fscF，包含序列1中碱基107,485-84,170的基因fscE，包含序列1中碱基136,148-107,496的基因fscD的聚酮合酶基因编码了包含有聚酮合酶模块的酮基合成酶结构域即KS结构域，酰基转移酶结构域即AT结构域，酰基载体蛋白结构域即ACP结构域，也可能包含酮基还原酶结构域即KR结构域，脱氢酶结构域即DH结构域，烯酰还原酶结构域即ER结构域的聚酮合酶。

由序列2-22定义的FR-008生物合成酶对应于FR-008生物合成的每一个合成步骤和后修饰过程以及调节，转运，矫正过程。

本发明还提供了编码包括ATP依赖性羧酸：辅酶A连接酶(CoL)，ACPL，KS1，AT1，ACP1的FR-008聚酮合酶结构域的DNA分子的核苷酸序列，这些结构域分别通过序列2中氨基酸51-465，581-647，661-1,094，1,202-1,509，1,596-1,662来描述，命名为fscA基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括20,927-26,158的一系列碱基。

本发明还提供了编码包括KS10，AT10，DH10，KR10，ACP10，KS9，AT9，DH9，KR9，ACP9，KS8，AT8，DH8，KR8，ACP8，KS7，AT7，DH7，KR7，ACP7，KS6，AT6，DH6，KR6，ACP6，KS5，AT5，DH5，KR5，ACP5的FR-008聚酮合酶结构域的DNA分子的核苷酸序列，这些结构域分别通过序列3中氨基酸8,808-9,221；9,330-9,627；9,680-9,867；10,183-10,366；10,469-10,536；6,966-7,383；7,490-7,792；7,845-8,029；8,331-8,514；8,618-8,685；5,253-5,675；5,775-6,074；6,127-6,310；6,590-6,773；6,874-6,941；3,529-3,954；4,059-4,356；4,407-4,595；4,884-5,063；5,163-5,230；1,787-2,212；2,318-2,617；2,670-2,859；3,155-3,338；3,438-3,505；34-460；576-875；928-1,112；1,417-1,596；1,696-1,763来描述，命名为fscC基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括60,860-28,983的一系列碱基。

本发明还提供了编码包括KS4，AT4，DH4，KR4，ACP4，KS3，AT3，DH3，ER3，KR3，ACP3，KS2，AT2，KR2，ACP2的FR-008聚酮合酶结构域的DNA分子的核苷酸序列，这些结构域分别通过序列4中氨基酸3,703-4,103；4,247-4,550；4,600-4,722；5,103-5,286；5,389-5,456；1,597-2,023；2,139-2,442；2,494-2,684；2,970-3,322；3,325-3,508；3,610-3,677；33-460；571-874；1,224-1,406；1,508-1,574来描述，命名为fscB基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括77,587-60,962的一系列碱基。

本发明还提供了编码包括KS21，AT21，DH21，KR21，ACP21，TE21的FR-008聚酮合酶结构域的DNA分子的核苷酸序列，这些结构域分别通过序列5中氨基酸33-456；545-851；903-1,083；1,378-1,561；1,668-1,735；1,814-2,018来描述，命名为fscF基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括84,132-77,983的一系列碱基。

本发明还提供了编码包括KS20，AT20，DH20，ER20，KR20，ACP20，KS19，AT19，KR19，ACP19，KS18，AT18，DH18，ER18，KR18，ACP18，KS17，AT17，DH17，ER17，KR17，ACP17的FR-008聚酮合酶结构域的DNA分子的核苷酸序列，这些结构域分别通过序列6中氨基酸5,642-6,069；6,158-6,463；6,515-6,693；7,017-7,322；7,330-7,512；7,615-7,682；4,117-4,544；4,633-4,936；5,263-5,445；5,552-5,619；2,071-2,498；2,590-2,896；2,948-3,127；3,428-3,733；3,741-3,924；4,025-4,092；34-460；548-850；902-1,081；1,384-1,689；1,697-1,880；1,982-2,049来描述，命名为fscE基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括107,485-84,170的一系列碱基。

本发明还提供了编码包括KS16，AT16，KR16，ACP16，KS15，AT15，KR15，ACP15，KS14，AT14，KR14，ACP14，KS13，AT13，KR13，ACP13，KS12，AT12，KR12，ACP12，KS11，AT11，DH11，KR11，ACP11的FR-008聚酮合酶结构域的DNA分子的核苷酸序列，这些结构域分别通过序列7中氨基酸7,935-8,352；8,464-8,767；9,099-9,280；9,387-9,452；6,425-6,845；6,935-7,241；7,559-7,725；7,838-7,898；4,872-5,297；5,408-5,720；6,049-6,225；6,331-6,398；3,342-3,765；3,872-4,170；4,499-4,676；4,782-4,849；1,788-2,209；2,313-2,621；2,972-3,150；3,254-3,314；38-452；563-864；921-1,105；1,410-1,592；1,694-1,760来描述，命名为fscD基因的核苷酸序列选自于序列1中的包括136,148-107,496的一系列碱基。

本发明还提供了编码2个ABC转运蛋白的基因的核苷酸序列，这两个ABC转运蛋白分别由序列8和序列9的氨基酸序列组成，命名为fscTI，fscTII基因的核苷酸序列选自于序列1中包括26,333-27,340，27,561-28,280的一系列碱基。

本发明还提供了编码4个调节蛋白的基因的核苷酸序列，这4个调节蛋白分别由序列10，11，12，13的氨基酸序列组成，命名为fscRI，fscRII，fscRIII，fscRIV基因的核苷酸序列选自于序列1中包括3,818-3,150，7,205-4,377，10,320-7,210，13,315-10,298的一系列碱基。

本发明还提供了编码一个细胞色素P450单氧化酶的基因的核苷酸序列，这个细胞色素P450单氧化酶由序列14的氨基酸序列组成，命名为fscP基因的核苷酸序列选自于序列1中包括16,106-17,287的一系列碱基。

本发明还提供了编码一个铁氧化还原蛋白的基因的核苷酸序列，这个铁氧化还原蛋白由序列15的氨基酸序列组成，命名为fscFE基因的核苷酸序列选自于序列1中包括17,334-17,528的一系列碱基。

本发明还提供了编码一个II型硫脂酶的基因的核苷酸序列，这个II型硫脂酶由序列16的氨基酸序列组成，命名为fscTE基因的核苷酸序列选自于序列1中包括17,556-18,413的一系列碱基。

本发明还提供了编码2个糖基合成酶和1个糖苷转移酶的基因的核苷酸序列，糖苷转移酶由序列17的氨基酸序列组成，2个糖基合成酶(GDP-酮糖转氨酶和GDP-甘露糖脱水酶)分别由序列18和序列19的氨基酸序列组成，命名为fscMI，fscMII，fscMIII基因的核苷酸序列选自于序列1中包括13,522-14,898，14,953-16,011，137,766-136,558的一系列碱基。

本发明还提供了编码一个依赖FAD的单氧化酶的基因的核苷酸序列，这个依赖FAD的单氧化酶蛋白由序列20的氨基酸序列组成，命名为fscO基因的核苷酸序列选自于序列1中包括1,950-574的一系列碱基。

本发明还提供了编码2个对氨基苯甲酸合成酶的基因的核苷酸序列，这两个对氨基苯甲酸合成酶分别由序列21和22的氨基酸序列组成，命名为pabAB和pabC基因的核苷酸序列选自于序列1中包括18,610-20,781，3,037-2,264的一系列碱基。

本发明还提供了从至少携带有部分序列1重组载体中，或从微生物文库中，或从微生物染色体DNA中分离FR-008生物合成基因的途径。

本发明还提供了以至少来自于序列1聚酮合酶序列中的一个片段与来自于其它聚酮合酶基因簇的聚酮序列来构建重组载体以获得新型聚酮的途径。

本发明还提供了在基因工程微生物体中提高FR-008或其衍生抗生素产量的途径。

本发明还提供了简化FR-008的有效组分的途径。

本发明还提供了得到至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA载体的途径。

本发明还提供了产生被至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA载体转化进入的宿主细胞的途径，此宿主细胞所产生的聚酮为FR-008或FR-008的结构类似物。

本发明还提供了产生被至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA载体转化进入的宿主细胞的途径，此宿主细胞所产生的FR-008或FR-008的结构类似物产量得到提高或所产生的抗生素或某种代谢产物产量得到提高。

本发明还提供了产生在基因组中有FR-008生物合成基因被打断，缺失或加倍的微生物体的途径，至少其中之一的基因包含有序列1中的核苷酸序列。

本发明还提供了产生在基因组中有FR-008生物合成基因被改造的微生物体的途径。

本发明还提供了产生在基因组中有FR-008生物合成酶中聚酮合酶结构域之一或至少其中之一被缺失或加倍或改造的微生物体的途径。

序列1的互补序列可依据DNA碱基互补原则随时得到。序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的酶切相应的DNA或使用其它合适的技术随时得到。包含发明所提供序列或多个序列的DNA片段或基因可随时得到。通过本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法，从其它生物体得到与FR-008生物合成基因相似的基因。

本发明提供的核苷酸片段可用来从链霉菌FR-008或其它菌种中分离具生物活性的结构域。例如，聚酮合酶结构域和修饰基因的生物活性位点可以通过聚合酶链式反应(PCR)，酶切位点或其它合适的技术得到。

本发明提供的核苷酸序列或多个序列可以与载体序列融合而得到重组序列和相应的DNA分子。

包含本发明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通过打断FR-008生物合成的一个或几个合成步骤而得到新的FR-008衍生物。

包含本发明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通过打断FR-008生物合成的一个或几个修饰步骤而得到新的FR-008衍生物。

包含DNA片段或基因可以用来提高FR-008或其衍生物的产量。例如，转入更多拷贝的正调节基因或打断负调节基因。

包含本发明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆DNA可用来从链霉菌FR-008基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含有本发明中的部分序列，也包含有链霉菌FR-008基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。

本发明所提供的核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入或置换，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，或通过紫外线或化学试剂。

本发明所提供的核苷酸序列可以通过序列的不同部分或其它来源的同源序列进行直接进化(DNA shuffling)。

通过缺失或失活来自于相同或不同聚酮合酶系统的一个或多个聚酮合酶结构域，模块或基因，或增加一个或多个聚酮合酶结构域，模块或基因而产生新的聚酮化合物。包含本发明的序列或至少部分序列的克隆基因可以通过合适的表达系统在外源宿主中表达以得到修饰的聚酮合酶或更高的生物活性或更高的产量。这些外源宿主包括链霉菌，大肠杆菌，芽孢杆菌，酵母，植物和动物等。

包含本发明的核苷酸序列或至少部分序列的片段或结构域或模块或聚酮合酶基因可以用来构建聚酮合酶库或聚酮合酶衍生库或组合库。

包含本发明的核苷酸序列或至少部分序列的修饰基因，调节基因，转运基因或糖基合成和转移酶基因可以用来构建衍生库或组合库。

FR-008生物合成修饰基因，调节基因，转运基因或糖基合成和转移酶基因的核苷酸序列提供了通过缺失或改造这些修饰基因，调节基因，转运基因或糖基合成和转移酶基因而得到FR-008结构衍生物或FR-008及其衍生物产量提高的途径。

含有本发明的核苷酸序列或至少部分序列的一个片段或几个片段可以克隆到改造后的细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)或柯斯载体(Cosmid)或表达载体或其它类型的载体，以应合适的需要。

含有本发明的核苷酸序列或至少部分序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的角色。

包含本发明的氨基酸序列或至少部分序列(序列2-22)的多肽可能在去除或替代某个或某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化蛋白动力学特征或其它致力于得到的性质。

通过合适的技术缺失，连接本发明中的氨基酸序列可以得到新的蛋白或酶，进而产生新的聚酮或相关连的产物。

本发明具有实质性特点和显著的进步，本发明所提供的基因序列可用于产生预期的基因工程抗生素或杂合抗生素或用于提高抗生素或基因工程抗生素的产量。本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离需要的蛋白质并可以用于抗体制备。本发明所提供的氨基酸序列提供了预测聚酮合酶三维结构的可能，进而为改造或改善蛋白活性提供依据。本发明所提供的基因及其所编码的蛋白质蛋白质，相应的抗体或多核苷可以用来查找和发展可用于医药，工业，农业的化合物或蛋白。

附图说明

以下通过附图对本发明进一步描述：

图1为用来测序覆盖整个FR-008基因簇的文库柯斯质粒和亚克隆

图2为负责FR-008生物合成的整个FR-008基因簇的结构。包括结构基因，修饰基因，调节基因，矫正基因及转运基因等，负责FR-008的生物合成及调节和外运。

图3为FR-008化学结构示意图。编号为C1’-C6’的为氨基海藻糖基团。羧基化发生在C-18位，羟基化发生在C-9位。R1代表羟基或酮基，R2代表羟基或H原子。

图4为调节基因突变株基因置换发生的杂交证明。A为基因置换发生的示意图；B为基因突变株的杂交证明。HJ-1，HJ-2，HJ-3与1.5kb杂交的阳性带(4.3kb)比野生型的阳性带(1.5kb)大2.8kb，因为HJ-1，HJ-2，HJ-3的染色体中阿泊拉霉素/红霉素抗性基因置换了调节基因。

图5为调节基因突变株生物活性测定。左右下方3个突变株均不再产生抑菌圈。正上方为野生型对照。

图6为负责FR-008分子中双键和糖基附着的酮基还原酶结构域(KR)控制立体构型特定氨基酸附近的氨基酸的比较。KR8，KR9和KR12的这个特定氨基酸由天冬氨酸分别变为甘氨酸(G)，天冬酰氨(N)和丙氨酸(A)。

具体实施方式

如图1和图2所示，本发明序列列表中序列描述：

序列1为包括21个开放读码框架的138,203bp的核苷酸序列，它们是负责FR-008生物合成的基因fscA，fscB，fscC，fscD，fscE，fscF，fscTI，fscTII，fscRI，fscRII，fscRIII，fscRIV，fscP，fscFE，fscTE，fscMI，fscMII，fscMIII，fscO，pabAB和pabC。

序列2为fscA基因(序列1中核苷酸20,927-26,158)编码的I型聚酮合酶(FscA)的氨基酸序列。

序列3为fscC基因(序列1中核苷酸60,860-28,983)编码的I型聚酮合酶(FscC)的氨基酸序列。

序列4为fscB基因(序列1中核苷酸77,587-60,962)编码的I型聚酮合酶(FscB)的氨基酸序列。

序列5为fscF基因(序列1中核苷酸84,132-77,983)编码的I型聚酮合酶(FscF)的氨基酸序列。

序列6为fscE基因(序列1中核苷酸107,485-84,170)编码的I型聚酮合酶(FscE)的氨基酸序列。

序列7为fscD基因(序列1中核苷酸136,148-107,496)编码的I型聚酮合酶(FscD)的氨基酸序列。

序列8为fscTI基因(序列1中核苷酸26,333-27,340)编码的ABC转运蛋白(FscTI)的氨基酸序列。

序列9为fscTII基因(序列1中核苷酸27,561-28,280)编码的ABC转运蛋白(FscTII)的氨基酸序列。

序列10为fscRI基因(序列1中核苷酸3,818-3,150)编码的调节蛋白(FscRI)的氨基酸序列。

序列11为fscRII基因(序列1中核苷酸7,205-4,377)编码的调节蛋白(FscRII)的氨基酸序列。

序列12为fscRIII基因(序列1中核苷酸10,320-7,210)编码的调节蛋白(FscRIII)的氨基酸序列。

序列13为fscRIV基因(序列1中核苷酸13,315-10,298)编码的调节蛋白(FscRIV)的氨基酸序列。

序列14为fscP基因(序列1中核苷酸16,106-17,287)编码的细胞色素P450单氧化酶(FscP)的氨基酸序列。

序列15为fscFE基因(序列1中核苷酸17,334-17,528)编码的铁氧化还原蛋白(FscFE)的氨基酸序列。

序列16为fscTE基因(序列1中核苷酸17,556-18,413)编码的II型硫脂酶(FscTE)的氨基酸序列。

序列17为fscMI基因(序列1中核苷酸13,522-14,898)编码的糖苷转移酶(FscMI)的氨基酸序列。

序列18为fscMII基因(序列1中核苷酸14,953-16,011)编码的GDP-酮糖氨基转移酶(糖基合成酶)(FscMII)的氨基酸序列。

序列19为fscMIII基因(序列1中核苷酸137,766-136,558)编码的GDP-甘露糖-4，6-脱水酶(糖基合成酶)(FscMIII)的氨基酸序列。

序列20为fscO基因(序列1中核苷酸1,950-574)编码的依赖FAD的单氧化酶(FscO)的氨基酸序列。

序列21为pabAB基因(序列1中核苷酸18,610-20,781)编码的4-氨基-4-脱氧chorismate合成酶(对氨基苯甲酸合成酶)(PabAB)的氨基酸序列。

序列22为pabC基因(序列1中核苷酸3,037-2,264)编码的4-氨基-4-脱氧chorismate合成酶(对氨基苯甲酸合成酶)(PabC)的氨基酸序列。

以下进一步对本发明详细描述：

由于FR-008有抗真菌活性，对蚊子幼虫有高毒性和可以防止前列腺肿大以及可以防止阴道滴虫感染和念珠菌阴道炎以及在其它工业，农业，医药上所具有的应用潜能，本发明分离了负责FR-008生物合成的基因簇，覆盖整个基因簇的五个柯斯质粒，pHZ145，pHZ137，pHZ220，pHZ194和pJTU1连同一个亚克隆质粒pJTU6被用来测序，pJTU6携带了pHZ141的5.2kb和7.5kb BamHI片段，但是7.5kb对5.2kb片段的方向与pHZ141或者说染色体中是相反的，pHZ145，pHZ137，pHZ194和pJTU10的载体为pHZ132，pHZ220的载体为pIJ653，pJTU6的载体为pBluescriptII SK(+)。

测序获得138,203bp的连续核苷酸序列。在全部21个开放读码框架中有6个I型聚酮合酶基因(fscA-fscF)。序列分析是使用FramePlot 2.3.2软件和美国国家生物信息中心的Conserved Domain Database search及其提供的世界范围的Blast引擎。fscA-fscF编码的氨基酸序列通过与已经得到充分了解的一些I型聚酮合酶的氨基酸序列进行比较从而得出这些多肽的功能特征(详见图1)。

聚酮合酶基因序列：

序列1中的20,927-26,158和28,983-136,148碱基是负责FR-008内酯环合成的聚酮合成酶基因的序列，FR-008基因簇中共有6个聚酮合酶基因，在fscA和fscC之间有一段编码两个ABC转运子的核苷酸序列。FR-008基因簇中各聚酮合酶基因的核苷酸序列与相应的氨基酸序列，如表1所示：

表1：

fscA编码FR-008内酯环合成的起始模块和延伸模块1(序列1中碱基20,927-26,158)。

起始模块和延伸模块1中的结构域在FscA的位置如表2所示：

表2：FscA

fscC编码FR-008内酯环合成的六个延伸模块(延伸模块10，9，8，7，6，5序列1中碱基60,860-28,983)

这些延伸模块中的结构域在FscC的位置如表3所示：

表3：FscC

fscB编码FR-008内酯环合成的3个延伸模块(延伸模块4，3，2，序列1中碱基77,587..60,962)

这些延伸模块中的结构域在FscB的位置如表4所示：

表4：FscB

fscF编码FR-008内酯环合成的延伸模块21和一个硫脂酶结构域。

延伸模块中的结构域在FscF的位置如表5所示：

表5：FscF

fscE编码FR-008内酯环合成的4个延伸模块(延伸模块20，19，18，17，序列1中碱基107,485-84,170)。

这些延伸模块中的结构域在FscE的位置如表6所示：

表6：FscE

fscD编码FR-008内酯环合成的6个延伸模块(延伸模块16，15，14，13，12，11，序列1中碱基136,148-107,496)。

这些延伸模块中的结构域在FscD的位置如表7所示：

表7：FscD

FR-008聚酮链的修饰基因

除6个聚酮合酶基因外，在FR-008基因簇中还有15个编码修饰酶，调节蛋白和转运蛋白的基因。

表8显示了它们的核苷酸和氨基酸序列：

表8：

链霉菌FR-008中各基因在FR-008中合成中的功能如表9和表10所示：

表9：

表10：

(ADC为4-氨基-4-脱氧chorismate的缩写)

FR-008生物合成的聚酮合酶基因

fscA与fscC，fscB，fscF，fscE和fscD的转录方向相反，与FR-008碳链合成21个缩合步骤一致，在FR-008基因簇的fscA-fscF基因中有21个延伸模块分布在它们所编码的聚酮合酶中。

FscA蛋白包含一个FR-008生物合成起始的起始模块和延伸模块1，延伸模块1包含KS-AT-ACP结构域，在纳巴霉素，匹马菌素和杀念菌素生物合成基因簇中也发现了类似CoL结构域的存在。

FscB包含了FR-008碳链合成延伸步骤2-4所需的延伸模块2-4，FscB中的3个AT结构域在活性位点GHSXG的N末端都有一个RVDVV×××××××M×S(A)×A××W的保守序列基元，具有这个保守序列基元的AT结构域是甲基丙二酰特异性的(mAT)，即它只识别底物甲基丙二酰，模块2包含KS，mAT，KR和ACP结构域，模块3有一个DH-ER-KR的还原环，模块4中的DH4结构域缺失了N末端的保守序列HPLL并在C末端缺失了56氨基酸，所以是无活性的。

FscC和FscD都是包含6个延伸模块的巨大蛋白。FscC长10,625氨基酸，FscD长9,550氨基酸。其它基因簇中包含6模块的Raps2，NysC，NysI，AmphC，AmphI和PIMS2都是稳定的，但迄今未发现包含7个模块的聚酮合酶，7模块蛋白的保真性和连续性被认为不足以得到准确的翻译。

FscC负责合成6个连续的双键(FR-008分子结构中共有7个连续的双键)，负责延伸步骤5-10的模块5-10都包含相同的DH-KR还原环，其中6个DH结构域都有保守的活性位点基元G×G××G×××A，FscC中所有的AT结构域都是丙二酰特异性的。FscC组装FR-008大部分的多烯结构。

FscD由延伸模块11-16组成，负责FR-008碳链合成的缩合步骤11-16，模块11的结构域结构为(KS-AT-DH-KR-ACP)，合成7个双键中的最后1个双键。模块13有一个甲基丙二酰特异性的AT结构域，它的结构是KS-mAT-KR-ACP，会在延伸步骤13整合一个甲基丙二酰辅酶A延伸单位，模块12，14，15和16都是同样的KS-AT-KR-ACP结构域结构，但KR15是没有活性的。因为在KR15的NADP结合基元缺少两个保守的G残基并在中部有10氨基酸的缺失。这样一个无活性的KR会使C-15上成为一个羰基，进而可以与C-19位的羟基形成FR-008分子中的六元半缩醛环。

FscE蛋白由负责延伸步骤17-20的模块17-20组成，模块18和20都包含一个完整的DH-ER-KR还原环，将导致延伸步骤18和20被完全还原为脂肪链。模块17中的DH与ER结构域是无活性的。模块19的结构域为KS-AT-KR-ACP。KR19的活性位点中的酪氨酸被亮氨酸取代。

FscF包含了模块21和一个位于C末端链延伸终止的硫脂酶(TE)结构域。FscF中的DH结构域在最后的延伸步骤中并不需要，这种完整但没有功能的DH结构域在制霉菌素(NysK)，利福霉素(RifB和RifC)和两性霉素(AmphJ)的聚酮合酶中也有发现。FscF的KS-AT-KR-ACP结构域结构将会在FR-008内酯环的C-3位产生一个羟基(-OH)。而且，也发现有FR-008C-3位是酮基的结构(此时KR21没有功能)存在。说明KR21是部分行使功能的结构域。FscF中的硫脂酶结构域使成熟的FR-008聚酮链从聚酮合酶上掉下来并形成内酯环。

除了FscF中的硫脂酶结构域，在pabAB基因的上游还有一个编码II型硫脂酶的fscTE基因。fscTE显示了与II型硫脂酶基因的高度同源性，可去除ACP巯基上无反应活性的乙酸根，丙酸根或丁酸根。

FR-008起始单位PABA生物合成的基因

PabAB和PabC基因的产物负责合成对氨基苯甲酸(PABA)，对氨基苯甲酸是FR-008聚酮合成起始单位芳香基团的前体，PabAB与其它来源的pabAB具有很高的同源性。PabC在链霉菌中是首次发现。PabAB是4-氨基-4-脱氧chorismate合成酶，将chorismate和谷氨酸盐转化为4-氨基-4-脱氧chorismate和谷氨酸酯。PabC是4-氨基-4-脱氧chorismate裂解酶，将4-氨基-4-脱氧chorismate转化为芳香化的对氨基苯甲酸和丙酮酸盐。PabAB与来自灰色链霉菌IMRU3570的PabAB显示93％的同源性，与来自S.venezuelae的PabAB显示46％的同源性。PabC与Mycobacterium tuberculosis H37Rv和Pseudomonas aeruginosa PA01的PabC均显示32％的同源性。

调节区域的基因

FR-008基因簇中有4个调节基因：fscRI，fscRII，fscRIII和fscRIV，它们的产物均属于LuxR转录调节子家族。

fscRI编码的调节蛋白FscRI是一个222氨基酸的蛋白质，与除虫链霉菌多烯大环内酯生物合成基因簇中的PleR有66％的同一性(基因银行序号AB070949)，与制霉菌素生物合成中的起调节作用的ORF4有59％的同一性。FscRI还与其它双组分的调节子显示同源性。

fscRII编码的调节蛋白FscRII(942氨基酸)与灰色链霉菌中可能对杀念菌素合成起调节作用的595氨基酸的蛋白有很高的同源性(在前595氨基酸84％同一性，但FscRII比它长347氨基酸)。FscRII与制霉菌素中NysRIII(927氨基酸)有42％同一性。

fscRIII编码的调节蛋白FscRIII是1,036氨基酸的蛋白质，与NysRII(953氨基酸)具有34％的同源性。fscRIV编码的调节蛋白FscRIV(1，005氨基酸)与NysRI(966氨基酸)具有46％的同源性，NysRII和NysRI都是制霉菌素基因簇中起正调节作用的基因。

与NysRIII，NysRII和NysRI相似的是，FscRII，FscRIII和FscRIV与链霉菌亚种SA-COO中和胆固醇氧化酶细胞色素P450操纵子相邻的转录调节子具有很高的同源性。

多烯抗生素FR-008基因簇包含非常巨大的聚酮合酶基因(fscC：32kb；fscD：29kb；fscE：23kb)，而且其中一些聚酮合酶基因从它们之间组织结构来说是共转录的。这种转录因而会非常长。转录调节子可能参与维持这些长mRNA的稳定。

氨基海藻糖生物合成和附着基因：

NMR数据显示FR-008分子的糖基是氨基海藻糖。在FR-008基因簇中有3个基因(fscMI，fscMII和fscMIII)负责氨基海藻糖的生物合成与附着。

FscMI(458氨基酸)与真核生物的UDP-葡萄糖苷酰转移酶具有很高的同源性，负责氨基海藻糖在FR-008配基上C-21位的附着。FscMII(352氨基酸)与4，6-二脱氧-4-氨基甘露糖合成中的氨基转移酶相似。fscMIII基因编码的FscMIII(402氨基酸)与GDP-甘露糖-4，6-脱水酶相似。氨基海藻糖(3，6-二脱氧-3-氨基-D-甘露糖)的生物合成途径包括来自主代谢中的GDP-甘露糖在GDP-甘露糖脱水酶的作用下转化为GDP-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖，然后异构化为GDP-3-酮基-6-脱氧-D-甘露糖，最后通过GDP-酮糖转氨酶的转氨作用形成GDP-氨基海藻糖。其中异构化并不需要酶的参与。FscMIII和FscMII分别负责此生物合成途径的脱水和转氨作用。

当在基因银行搜索时，FscMI与AmphDI有54.7％的同一性，与NysDI有52.4％的同一性，与PimK有60.5％同一性。FscMII与CanA有92％的同一性，与AmphDII，NysDII和PimC分别有74-76％的同一性。FscMIII与AmphDIII(66％)，NysDIII(67％)和PimJ(69％)有很高的同一性。以上提到的酶均被认为负责两性霉素(AmphDI，AmphDII和AmphDIII)，制霉菌素(NysDI，NysDII和NysDIII)，匹马菌素(PimK，PimC和PimJ)或杀念菌素(CanA)分子中氨基海藻糖的生物合成。这也符合FscMI，FscMII和FscMIII在FR-008基因簇中负责氨基海藻糖生物合成与附着的功能。

修饰与转运基因：

负责FR-008聚酮链合成的聚酮合酶FscD中的甲基丙二酰特异性的AT13(酰基转移酶结构域)在第13个延伸步骤中导入一个丙酸残基，因而在FR-008分子的C-18位形成一个甲基侧链。细胞色素P450单氧化酶FscP(393氨基酸)，负责将C-18位的甲基侧链氧化为羧基基团。紧邻fscP下游的fscFE基因编码一个小的酸性蛋白(64氨基酸)，是含有铁硫中心簇([3Fe-4S])的铁氧化还原蛋白。它作为一个电子传递蛋白成为P450单氧化酶系统的一部分。FscP与负责匹马霉素后修饰的细胞色素P450单氧化酶PimG显示81％的同源性和69％的同一性，与负责制霉菌素后修饰的细胞色素P450单氧化酶NysN显示77％的同源性和66％的同一性，与负责两性霉素后修饰的细胞色素P450单氧化酶AmphN显示76％的同源性和66％的同一性，与负责杀念菌素后修饰的细胞色素P450单氧化酶显示94％的同源性。

负责FR-008聚酮链合成的聚酮合酶FscE中的模块18是一个包括完整还原环的KS-AT-DH-ER-KR-ACP结构，因而在第18个延伸步骤中被完全还原成脂肪链而在C-9位无基团。fscO所编码依赖FAD的单氧化酶(FscO)负责在C-9位修饰而引入羟基。这与两性霉素和制霉菌素后修饰羟基化中亦由细胞色素P450单氧化酶负责不同。FscO与Agrobacterium tumefaciens C58中的依赖FAD的单氧化酶显示34％的同源性和25％的同一性。与KR21一样，fscO也是部分活性的，因此在FR-008复合物中有C-9位羟基化与不羟基化的两种结构共同存在。

FR-008基因簇与杀念菌素基因簇的序列比较

FR-008含有一个与灰色链霉菌中的杀念菌素D相同的含4-氨基苯乙酮的七烯大环内酯配基，链霉菌FR-008中存在130kb的pHZ227和30kb的pHZ228两个线性质粒，但杀念菌素产生菌灰色链霉菌IMRU3570没有线性质粒，链霉菌FR-008产孢非常好而灰色链霉菌IMRU3570产孢很差，因为FR-008和杀念菌素D具有相似的结构，所以负责合成它们的序列很可能会有很高的同源性，杀念菌素生物合成基因簇只有部分序列获得认定(共39,314bp的序列)，FR-008基因簇(序列1，共138,203bp)中相对应的序列和这39,314bp序列对比发现它们之间有很高的同源性，FR-008基因簇(序列1)中的碱基5,421到44,805(从fscRII到fscB模块4中的KS结构域)与这39，314bp序列除一些小的间隔序列外有98-99％同源性，这些间隔序列在两个序列中没有明显的同源性。

表11显示了这两段序列的对比：

表11：

表12显示了间隔序列及它们在两个基因簇中的位置。

表12：

以上表明FR-008和杀念菌素基因簇来源于很相近的祖先。

以下的应用实例阐明了得到和应用本发明所提供序列和要素的优选的途径。这些实例只是用做说明而并不限制本发明的应用范围。通过基因工程分子操作基因簇中的一些基因序列，可以得到序列改变的衍生的基因工程菌株，或利用本发明序列得到携带FR-008生物合成基因的DNA片段。

应用实例1：

缺失序列1中80kb序列

1,518bp BglII-BamHI片段(序列1中碱基2,293-3,810)和4,075bp BamHI-BglII片段(序列1中碱基83,766-87,840)被选择用来作为基因置换的两臂来缺失基因簇中79,955bp的序列(序列1中3,811-83,765)。这79,955bp序列是从fscRI序列到fscF中模块11的KS21结构域所对应的序列。1,518bp片段是从pHZ145中回收，而4,075bp片段是从pHZ144中回收。它们均被用来与FR-008染色体DNA进行同源重组。在这两个片段中间插入一个阿泊拉霉素抗性基因，然后把得到的结构克隆入pIJ903而得到基因置换质粒pHZ2029。通过接合转移将pHZ2029导入链霉菌FR-008发生双交换后而得到基因置换菌株。通过Southern杂交验证了双交换的发生。另外通过高压脉冲电泳发现基因置换菌株中染色体约300kb VspI片段消失而产生了一个220kb的新片段，显示在此基因置换菌株中FR-008基因簇从fscRI到fscF模块11的KS21结构域的约80kb序列被去除。此基因置换菌株中FR-008的生物合成被阻断了。通过检测发现对啤酒酵母的失去了抑制活性。

此基因置换显示分离到的序列(序列1)确实是负责FR-008抗生素生物合成的。

应用实例2：

缺失聚酮合酶基因序列

下游包含聚酮合酶基因序列的fscA(20,927-26,158)，fscC(60,860-28,983)，fscB(77,587-60,962)，fscF(84,132-77,983)，fscE(107,485-84,170)，fscD(137,148-107,496)负责FR-008配基的生物合成。在fscA和fscC之间有两个ABC转运蛋白(fscTI，fscTII)，它们包括序列1中的碱基26,333到28,280。文库质粒pHZ119携带了pabAB基因序列及其下游包括这两个ABC转运基因在内的聚酮合酶序列。pHZ119BglII酶切后将其上的两个BglII片段置换成大肠杆菌质粒pDH5。这两个BglII片段编码了从fscA中的ATP依赖性Carboxylic acid：辅酶连接酶结构域(CoL)到fscC模块9的ACP9结构域(包括fscTI和fscTII)。所得到的质粒被用来进行基因置换。发生双交换之后，野生型FR-008染色体上序列1中碱基21,537到36,847被pDH5序列所取代。双交换被Southern杂交所证实。生物活性测定实验发现双交换菌株的FR-008生物合成被阻断。这表明在链霉菌FR-008染色体上从fscA中ATP依赖性Carboxylic acid：辅酶连接酶结构域(CoL)到fscC模块9的ACP9结构域所对应的序列被pDH5序列取代后，FR-008抗生素的生物合成被阻断。这些序列被证明对FR-008生物合成是必需的。

应用实例3：

将pHZ168载体序列插入到序列1中的聚酮合酶序列中

有一个1,424bp BamHI片段(序列1中的碱基50,488到51,911)编码fscC模块6中的ACP6结构域。通过BamHI酶切回收pHZ137上包含此1,424bp序列的DNA片段，克隆到pHZ168上。pHZ168是pDH5的衍生质粒，包含RK2中的oriT(接合转移起始位点)。所得到的基因中断结构通过接合转移导入链霉菌FR-008中。因pHZ168没有链霉菌复制子，它及它携带1,424bp片段的衍生结构在链霉菌FR-008中不能复制。这个基因中断结构只有通过其与染色体相同的1,424bp序列同源重组到链霉菌FR-008染色体上才能复制。基因中断菌株被成功的分离得到。这些基因中断突变菌株在负责FR-008生物合成的聚酮合酶DNA序列中插入了pHZ168。更确切地说，pHZ168载体序列被插入到fscC模块6的ACP6结构域序列中。生物活性测定表明这些突变菌株的FR-008生物合成因pHZ168的插入而被阻断。

应用实例2和3都表明本发明所提供的聚酮合酶基因负责FR-008内酯环的合成。由于每一个聚酮合酶模块对应一个缩合步骤，从而对应FR-008的内酯环分子结构，这提供了一个改造链霉菌FR-008中聚酮合酶基因序列而得到FR-008抗生素相应内酯环结构改变的新的抗生素的途径。这种新的抗生素可能具有抗菌活性提高或抗菌谱改变或抗生素化学特性改变或化学毒性改变的特性，从而提高抗生素工业生产的经济效益或扩大临床应用的范围。

应用实例4：

缺失修饰基因序列

pabAB和pabC基因可能参与FR-008组装中起始单位对氨基苯甲酸的生物合成。在pabAB上游，有9个修饰基因和调节基因。与应用实例2中去除FR-008染色体上pabAB下游15,311bp聚酮合酶序列方法类似，将pHZ138上包含序列1中碱基2,293到21,536的19,244bp的BglII片段置换成pDH5。通过基因置换实验，链霉菌FR-008染色体上包括部分pabC一直到pabAB基因的19,244bp序列被pDH5载体序列所取代。生物活性测定表明基因置换菌株中FR-008七烯大环内酯的生物合成被阻断。

而且，1,518bp BglII-BamHI片段和4,290bp BamHI-BglIII片段亦被选来构建基因置换质粒以去除它们中间13,436bp的序列。这13,436bp的序列编码部分fscRI基因到pabAB基因。在此两个片段之间插入阿泊拉霉素抗性基因并克隆到自杀载体pHZ660上。双交换后链霉菌FR-008染色体上此13,436bp序列被阿泊拉霉素抗性基因替代。通过Southern杂交确证了双交换的发生，所得到的基因置换衍生菌株不能产生FR-008抗生素，显示这些修饰基因和调节基因是FR-008生物合成所必需的。

这提供了一个改造链霉菌FR-008中修饰酶基因序列而得到FR-008抗生素相应结构改变的新的抗生素的途径。修饰酶通过作用于FR-008的内酯环而使内酯环的相应结构被修饰。FscP氧化缩合步骤13所形成的甲基成为羧基，而FscO在C-9位加羟基。例如中断或缺失FscP基因而得到C-18位为甲基而非羧基的FR-008抗生素衍生物；或中断或缺失FscO而得到C-9位无羟基的FR-008抗生素衍生物；或同时中断或缺失两个甚至三个修饰基因而得到相应的FR-008抗生素衍生物。还可以转入外源的修饰酶基因而得到相应结构改变的FR-008抗生素衍生物。所有这些新的FR-008抗生素衍生物可能具有抗菌活性提高或抗菌谱改变或抗生素化学特性改变或化学毒性改变的特性，从而提高抗生素工业生产的经济效益或扩大临床应用的范围。

相似的，以5,069bp BamHI片段(序列1中碱基5,090到10,159)和4,290bp BamHI-BglII片段(序列1中碱基17,247到21,537)作为同源重组的片段，序列1中从碱基5,091到17,246编码fscRIV，fscMI，fscMII，fscP和部分fscRIII序列被阿泊拉霉素抗性基因取代。生物活性测定表明这些基因置换菌株衍生菌株也不能产生FR-008抗生素。此7,088bp序列是FR-008生物合成必需的。

应用实例5：

缺失调节基因序列

利用链霉菌FR-008文库柯斯质粒pHZ138上1,518bp BglII-BamHI片段和7,088bpBamHI片段作为同源整合片段，以与天然染色体相同的方向克隆到pHZ1358(硫链丝菌素抗性)上，中间插入了阿泊拉霉素/红霉素抗性基因，得到pHZ2007。将pHZ2007通过接合转移导入链霉菌FR-008中，通过反选择筛选阿泊拉霉素/红霉素抗性而硫链丝菌素敏感的接合转移子。以1.5kb和1.9kb以及阿泊拉霉素/红霉素抗性基因片段为探针的杂交实验表明(图4)，所筛选到的阿泊拉霉素/红霉素抗性而硫链丝菌素敏感的接合转移子(基因置换菌株菌株)均缺失了编码fscRII，fscRIII和部分fscRI的6,414bp序列(序列1中碱基3,811到10,158)而被阿泊拉霉素/红霉素抗性基因所替代。这个区域代表调节基因的序列。生物测定表明调节基因的序列缺失的突变株中FR-008的生物合成被阻断(图5)。显示这些调节基因对FR-008生物合成是必需的。

应用实例6：

缺失起始单位对氨基苯甲酸合成基因序列

从pHZ145中回收携带对氨基苯甲酸合成基因pabAB的4.6kb的BamHI片段，克隆到自杀载体pOJ260上，通过FspI酶切自连缺失外源片段中FspI酶切位点之间1,491bp的片段，即同框缺失了pabAB基因内部的497氨基酸的序列。将得到的基因置换质粒通过接合转移导入链霉菌FR-008中，筛选到发生了预期的pabAB基因缺失1,491bp的突变菌株并通过杂交验证。突变株中未能检测到FR-008的合成。说明缺乏对氨基苯甲酸，FR-008的生物合成不能起始。在培养基中添加0.3M的外来对氨基苯甲酸，突变株又恢复了FR-008的产生。FR-008的生物合成起始单位的选择是非常特异的。

应用实例7：

预测FR-008分子中两个顺式双键的存在

聚酮合酶与动物脂肪酸合成酶中的酮基还原酶结构域组成了SDR还原酶总科中的一个亚科。聚酮合酶中酮基还原酶结构域(KR)负责所合成碳链的立体构型，而这种立体构型的控制是通过酮基还原酶结构域中一个特定位点的天冬氨酸来完成。这个天冬氨酸被认为与酮基还原酶结构域中112位的组氨酸和100位的酪氨酸共同控制所合成碳链的立体构型。当这个特定氨基酸是天冬氨酸(D)时，将酮基还原成D构型的羟基；当这个特定氨基酸是天冬氨酸以外的氨基酸时，将酮基还原成L构型的羟基。在所有的酮基还原，脱水而形成反式双键的反应中，催化酮基还原的酮基还原酶结构域都有这个特定的天冬氨酸。相反，在所有的酮基还原，脱水而形成顺式双键的反应中，催化酮基还原的酮基还原酶结构域都缺少这个特定的天冬氨酸或者这个特定的天冬氨酸改变。而且酮基还原酶结构域这种对所合成碳链的立体构型的控制不依赖于其它的酶或底物或酶促环境。FR-008聚酮合酶负责共扼双键合成的聚酮合酶模块8和模块9中的酮基还原酶结构域KR8和KR9的这个特定氨基酸分别是甘氨酸(G)和天冬酰氨(N)而不是天冬氨酸(D)(图6)，所以它们所负责合成的双键均为顺式双键。即FR-008分子中C28-C29和C30-C31之间的双键是顺式双键。

应用实例8：

预测FR-008分子中糖基附着的方向

聚酮合酶中酮基还原酶结构域(KR)负责所合成碳链的立体构型，而这种立体构型的控制通过酮基还原酶结构域中一个特定位点的氨基酸来完成。当这个特定氨基酸是天冬氨酸(D)时，将酮基还原成D构型的羟基；当这个特定氨基酸是天冬氨酸以外的氨基酸时，将酮基还原成L构型的羟基。而且酮基还原酶结构域这种对所合成碳链的立体构型的控制不依赖于其它的酶或底物或酶促环境。FR-008聚酮合酶负责C-21位羟基形成的聚酮合酶模块12中的酮基还原酶结构域KR12的这个特定氨基酸是丙氨酸(A)而不是天冬氨酸(D)(图6)，所以它所负责合成的C-21位羟基为L构型。而这个C-21位羟基是糖基化作用的位点，决定了糖基位于FR-008内酯环的反面。其它携带氨基海藻糖的多烯大环内酯的糖基也全部位于大环内酯环的反面。

应用实例9：

从链霉菌FR-008文库中钓取新的携带FR-008生物合成基因的柯斯质粒

柯斯质粒pHZ194的序列测定发现它是一个重组的柯斯质粒，有两个载体pHZ132以及一个未知来源与FR-008生物合成无关的DNA片段。这可能是在文库构建过程中DNA重组的结果。

柯斯质粒pHZ194的序列还未覆盖完全的FR-008生物合成基因簇。为了从链霉菌FR-008文库中钓取新的携带FR-008生物合成基因的柯斯质粒，以柯斯质粒pHZ194的最右端的与FR-008生物合成有关的序列(序列1，聚酮合酶序列)设计PCR(聚合酶链式反应)引物。

所设计的PCR引物序列如下：

CS1(5′-TGCCGCGCTCGCCGACA-3′)

CS2(5′-CGCGTCCGGTGCTCACG-3′)

其中CS1的序列是来自于本发明序列1中的118,479-118,463，CS2的序列是来自于本发明序列1中的118,262-118,278。以这两个基于序列1设计的PCR引物，以柯斯质粒pHZ194为底物，成功扩增出了约200bp的DNA片段。

PCR条件如下：

0.1μg底物DNA，两个引物各50pmol，2.5μl DMSO和25μl高保真PCR复合物(High Fidelity PCR Master，罗氏公司)，加无菌超纯水到50μl。PCR仪是日本Takara Shuzo Co.公司的PCR Thermal Cycler MP TP3000。PCR反应的循环条件为95℃(5分钟)，30个循环的95℃(30秒)，65℃(30秒)和72℃(30秒)，最后是72℃7分钟。

序列测定表明此约200bp DNA片段的序列确实来自于本发明序列1中的118,479-118,262共218bp的序列。

以此携带序列1中的118,479-118,262的218bp DNA片段为探针，与链霉菌FR-008基因文库杂交，钓出两个柯斯质粒pJTU1和pJTU2。这两个柯斯质粒与pHZ194重叠并携带此218bp DNA片段。序列测定表明柯斯质粒pJTU1(如图1)携带了负责FR-008生物合成的基因。柯斯质粒pJTU1外源片段的序列构成了本发明序列1中的118,480-138,203的序列。

Claims (4)

1.一种导致链霉菌FR-008中缺乏对氨基苯甲酸的基因，其特征在于，所述基因如pabAB所示，该基因的缺失导致链霉菌FR-008中缺乏对氨基苯甲酸。

2.一种导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008抗生素抗菌活性的基因簇，其特征在于，所述基因簇如fscA、fscB、fscC、fscF以及fscRI所示，该基因簇的缺失导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008抗生素抗菌活性。

3.一种导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008抗生素的基因簇，其特征在于，所述基因簇如fscRII、fscRIII以及fscRIV所示，该基因簇的缺失导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008抗生素。

4.一种导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008抗生素抗菌活性的基因簇，其特征在于，所述基因簇如fscTI、fscTII、fscP、fscFE、fscTE、fscMI、fscMII、pabC、fscD、fscE、fscO以及fscMIII所示，该基因簇的缺失导致链霉菌FR-008中缺乏FR-008抗生素抗菌活性。

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