CN116135967A - 筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法及所获得的共培养体系、通过该体系获得的恶唑霉素类化合物。本发明能够高通量筛选微生物之间的相互作用，快速获得目的基因簇增强表达的培养体系，为链霉菌次级代谢产物的挖掘提供一种有效的方法；所述共培养体系可以方便快捷地实现龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中恶唑霉素类化合物产量的提高，为结构新颖恶唑霉素类化合物的分离和鉴定提供基础。

Description

筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法及其 应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体来说，涉及通过微生物共培养偶联报告系统高通量筛选的方法发现能促进龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中恶唑霉素类化合物产量提高的链霉菌-枯草芽孢杆菌共培养体系，及其在所获得的结构新颖恶唑霉素类化合物制备中的应用。
背景技术
链霉菌作为一种丝状细菌，不仅具有复杂的发育分化过程，还能产生丰富的次级代谢产物，如具有治疗寄生虫病活性的阿维菌素(Campbell WC.History of avermectinand ivermectin,with notes on the history of other macrocyclic lactoneantiparasitic agents[J].Current Pharmaceutical Biotechnology,2012,13:853-865)、具有抗癌活性的盐霉素(Naujokat C,Steinhart R.Salinomycin as a drug fortargeting human cancer stem cells[J].Journal of Biomedicine andBiotechnology,2012,2012:950658)、具有新型冠状病毒蛋白酶抑制活性的亮肽素(Fu L,Shao S,Feng Y,et al.Mechanism of microbial metabolite leupeptin in thetreatment of COVID-19 by traditional Chinese medicine herbs[J].Mbio,2021:e0222021)以及具有抑菌或抗癌等多种活性的恶唑霉素(Oleksak P,Gonda J,NepovimovaE,et al.The oxazolomycin family:a review of current knowledge[J].RSCAdvances,2020,10:40745-40794)等，是活性天然产物最重要的来源之一(Selim MSM,Abdelhamid SA,Mohamed SS.Secondary metabolites and biodiversity ofactinomycetes[J].Journal,Genetic Engineering&Biotechnology,2021,19:72)。同时，链霉菌中丰富的次级代谢过程又受到复杂而严格的分子调控(Liu G,Chater KF,ChandraG,et al.Molecular regulation of antibiotic biosynthesis in Streptomyces[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2013,77:112-143)，自然条件下，链霉菌抗生素的产生具有一定的时空依赖性，产量往往维持在相对较低水平，因此需要通过多种方式提高其产量，才能进行大规模生产和应用(Parekh S,Vinci VA,StrobelRJ.Improvement of microbial strains and fermentation processes[J].AppliedMicrobiology and Biotechnology,2000,54:287-301)。
发明内容
发明人基于革兰氏阴性菌的酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactone，简称AHL)信号分子群感效应构建了适用于链霉菌的可视化基因表达报告系统—VRS-bAHL(visualization reporter system based on acyl-homoserine lactone)，其特征为利用革兰氏阴性菌的AHL信号分子合酶基因cviI作为报告基因，利用AHL指示菌对报告基因的表达情况进行检测，具有背景干净、灵敏度高、易操作、适用范围广及可进行可视化高通量筛选等特点。
基于VRS-bAHL的上述优点，本发明将其与微生物共培养偶联，建立了新的链霉菌抗生素增产的方法，并筛选到了能促进龙胜链霉菌CGMCC4.1101中恶唑霉素类化合物产量显著提高的链霉菌-枯草芽孢杆菌共培养体系，其中8种恶唑霉素相关化合物的产量提高至链霉菌单独培养时的3.3至9.5倍。此外，本发明还分离、鉴定到具有抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌活性的结构新颖的恶唑霉素类化合物。
具体而言，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法，其特征在于，所述方法采用的基础菌为链霉菌A，所述方法包括以下步骤：
a.构建链霉菌A报告菌株，所述链霉菌A报告菌株包含报告基因AHL信号分子合酶基因cviI；
b.用AHL指示菌筛选与链霉菌A报告菌株共培养后，链霉菌A报告菌株目的基因表达增加的共培养菌。
在一些实施方案中，所述链霉菌A为龙胜链霉菌CGMCC 4.1101。
在一些实施方案中，所述报告基因包含核糖体结合位点对应DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一些实施方案中，所述目的基因为结构基因oxaG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一些实施方案中，所述AHL指示菌为CV026。
在一些实施方案中，所述包含自身核糖体结合位点对应DNA序列的AHL信号分子合酶基因cviI与包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR1相连，进而通过同源双交换的策略替换所述oxa簇中结构基因oxaG编码区中的一部分，使结构基因oxaG得到破坏，但保留所述结构基因oxaG的启动子区域用于驱动cviI的表达，使用引入的卡那霉素抗性基因作为重组菌株的筛选标记，筛选获得链霉菌A报告菌株。
在一些实施方案中，通过同源双交换的策略替换所述oxa簇中结构基因oxaG编码区中的一部分，使结构基因oxaG得到破坏的步骤包括：扩增包含自身核糖体结合位点对应序列的cviI，扩增包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR1，扩增oxa簇中结构基因oxaG编码区的上游同源臂，扩增oxaG编码区的下游同源臂，通过Gibson组装的方式将所述oxaG编码区的上游同源臂、cviI、kanR1、oxaG编码区的下游同源臂按顺序与EcoRV酶切的pKC1139质粒连接，获得重组质粒pKDRoxaG，然后导入链霉菌A，筛选获得链霉菌A报告菌株。
在一些实施方案中，用引物RBSI532F和RBSI532R(SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)扩增包含自身核糖体结合位点对应序列的cviI，任选地，所述包含自身核糖体结合位点对应序列的cviI的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一些实施方案中，用引物PKANRF和PKANRR(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)扩增包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR1，任选地，所述包含自身启动子的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一些实施方案中，用引物DROXAGLF和DROXAGLR(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)扩增oxa簇中结构基因oxaG(任选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)编码区的上游同源臂(任选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)。
在一些实施方案中，用引物DROXAGRF和DROXAGRR(SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21)扩增oxaG编码区的下游同源臂(任选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)。
在一些实施方案中，将任意可获取微生物例如细菌或真菌分别与链霉菌A报告菌株共培养，之后(例如通过琼脂块法)比较各体系中报告基因的表达，筛选获得提高链霉菌中恶唑霉素类化合物产量的共培养体系。
在一些实施方案中，与所述链霉菌A报告菌株共培养所用链霉菌选自天蓝色链霉菌M1146(Streptomyces coelicolor M1146)、白色链霉菌CGMCC 4.5716(Streptomycesalbus CGMCC 4.5716)、维吉尼亚链霉菌ATCC 13161(Streptomyces virginiae ATCC13161)、灰色链霉菌IFO 13350(Streptomyces griseus IFO 13350)、委内瑞拉链霉菌ISP5230(Streptomyces venezuelae ISP 5230)、弗氏链霉菌FXJ 1.408(Streptomycesfradiae FXJ1.408)、橄榄色链霉菌FXJ 8.021(Streptomyces olivaceus FXJ 8.021)、链霉菌FXJ 1.088(Streptomyces sp.FXJ 1.088)、变铅青链霉菌TK23(Streptomyceslividans TK23)、圈卷产色链霉菌7100(Streptomyces ansochromogenes 7100)和苍黄链霉菌CGMCC 4.1115(Streptomyces luridus CGMCC 4.1115)。
在一些实施方案中，与所述链霉菌A报告菌株共培养所用链霉菌之外的其他细菌选自枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630(Bacillus subtilis CGMCC1.1630)、金黄色葡萄球菌CGMCC 1.89(Staphylococcus aureus CGMCC1.89)、蜡样芽孢杆菌CGMCC1.1626(Bacilluscereus CGMCC1.1626)、表皮葡萄球菌ATCC 35984(Staphylococcus epidermidis ATCC35984)、肺炎链球菌010(Streptococcus pneumoniae 010)、酿脓链球菌#2(Streptococcuspyogenes#2)、大肠杆菌JM109(Escherichia coli JM109)、海洋棒杆菌CGMCC 1.6998(Corynebacterium marinum CGMCC 1.6998)、谷氨酸棒杆菌CGMCC 1.299(Corynebacterium glutamicum CGMCC 1.299)、生芽红细菌CGMCC 1.3365(Rhodobacterblasticus CGMCC 1.3365)以及嗜粪红球菌CGMCC 4.1813(Rhodococcus coprophilusCGMCC 4.1813)。
在一些实施方案中，与所述链霉菌A报告菌株共培养所用真菌选自毛壳菌TAN01(Chaetomium SP.TAN01)、正青霉菌TAN02(Eupenicillium SP.TAN02)、曲霉菌TAN03(Aspergillus SP.TAN03)、曲霉菌TAN04(Aspergillus SP.TAN04)、曲霉菌TAN05(Aspergillus SP.TAN05)、青霉菌TAN06(Penicillium SP.TAN06)、枝孢菌TAN07(Cladosporium SP.TAN07)、青霉菌TAN08(Penicillium SP.TAN08)、鬼伞菌TAN09(Coprinellus SP.TAN09)、茎点霉菌TAN10(Phoma SP.TAN10)以及曲霉菌TAN11(Aspergillus SP.TAN11)。
另一方面，本发明提供提高链霉菌中恶唑霉素类化合物产量的共培养体系，其特征在于，所述共培养体系包括链霉菌和枯草芽孢杆菌。
在一些实施方案中，所述链霉菌为龙胜链霉菌CGMCC 4.1101，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630。
另一方面，本发明提供通过上述共培养体系提高产量进而分离到的恶唑霉素类化合物。
在一些实施方案中，所述恶唑霉素类化合物包括：
TOXA1(C36H51N3O10)：
Figure BDA0003357688470000051
TOXA5(C36H51N3O9)：
Figure BDA0003357688470000052
TOXA7(C36H51N3O9)：
Figure BDA0003357688470000061
定义
CV026：通过对紫色色杆菌CV31532进行转座突变获得的突变株，CV026中的cviI基因和紫色杆菌素生物合成的阻遏基因被破坏，导致AHL无法合成，但是当外源C6-HSL或结构相近的其他AHL存在时，便能激活其紫色杆菌素的产生，因此CV026被广泛应用于C6-HSL或其结构相近的其他AHL的检测。
cviI：本发明共用到两种cviI，实施例1中构建质粒pPhrdB-cviI用的cviI不包含自身核糖体结合位点对应序列，编号为SEQ ID NO.2；实施例2中构建质粒pKDRoxaG用的包含自身核糖体结合位点对应序列，编号为SEQ ID NO.3。
核糖体结合位点(RBS)：指DNA转录出的mRNA上起始密码子前很短的一段核糖体结合的位点，但是为了表述直观，有文献直接将RBS对应的DNA序列称为核糖体结合位点，此处为了表述更准确，使用“核糖体结合位点对应序列”的表述。
卡那霉素抗性基因：本发明用到两个卡那霉素抗性基因，都是从质粒pCS26-Pac上扩增，但长度略有不同，分别命名为kanR1和kanR2，kanR1用来构建质粒pKDRoxaG，kanR2用来构建整合型质粒pIJ10500K。
有益效果
本发明所涉及的增产策略得益于本实验室所构建的新型可视化报告系统VRS-bAHL的低背景干扰、高灵敏度和广泛适用性，特别适合于对微生物共培养体系的筛选，进而方便、快捷且高通量地实现目的宿主中特定基因簇的增强表达；不同微生物共同存在时彼此之间通常发生相互抑制或促进，传统的生境重叠共培养方法往往会导致具有生存优势的一方逐渐淘汰另一方，而本发明所建立的微孔板固体培养基临近接种共培养法能使不同微生物分布在临近但不重叠的区域，尽可能使其均能获得生长，进而产生相互影响；本发明所筛选到的微生物共培养体系能显著提高龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中恶唑霉素类化合物的产量，为恶唑霉素类化合物大规模制备及结构鉴定提供了基础，文献报道制备与TOXA5结构一致的KSM-2690B时，从22升链霉菌KSM-2690的液体培养基发酵产物中制备了26.2mg单体，而本发明从2.5升龙胜链霉菌CGMCC 4.1101与枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630的固体培养基发酵产物中获得了约20mg TOXA5单体，高效液相色谱(high performance liquidchromatography,HPLC)分析表明该化合物在培养基中的浓度达约17.4mg/L，是目前产量最高的恶唑霉素KSM-2690B(TOXA5)的链霉菌培养体系；获得的结构新颖的恶唑霉素类化合物TOXA1可望成为一个新的广谱抗菌药物先导化合物；本发明测定了TOXA1、TOXA5和TOXA7的生物活性，发现三者均具有抑制革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的活性，而且TOXA1和TOXA5还具有良好的抑制革兰氏阴性植物致病菌-野油菜黄单胞菌的活性，最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)分别是50μg/mL和12.5μg/mL。此外，TOXA5还具有抑制革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌的活性。
本发明增产策略适用范围不仅局限于龙胜链霉菌CGMCC 4.1101的恶唑霉素类化合物生物合成基因簇oxa，而且也适用于VRS-bAHL能适用的其他微生物或高等动植物中不同类型的目的基因簇或基因；本发明所述微生物共培养体系不仅局限于上述培养条件，还适用于其他可行的培养基或培养方式，比如液体培养基中共培养；本发明所述恶唑霉素类化合物TOXA1潜在的适用领域不局限于对病原微生物的抑制，还适用于其他潜在的应用领域，比如抗癌和抗病毒等。
附图说明
为了便于理解本发明的原理、技术方案和产品类型，接下来将通过附图进行进一步说明。
图1是可视化报告系统(VRS-bAHL)的原理及其在龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中应用的可行性分析。图1A是VRS-bAHL的原理；图1B是VRS-bAHL在龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中应用的可行性分析。其中紫色杆菌素产生的多少可从紫色圈(图中显示为固体培养基上，链霉菌菌块周围产生一个深色的圆圈)大小来展示，而紫色圈的面积越大，表明紫色杆菌素产量越高，即AHL的产量越高，反映了报告系统中cviI的表达量越高，进而说明启动子(驱动cviI的表达)的活性越高以及该启动子在基因簇中所控制的基因的转录越强；反之，亦然。
图2是龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中恶唑霉素类化合物生物合成基因簇及已知恶唑霉素生物合成基因簇的基因排布比较。图2A是龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中恶唑霉素类化合物生物合成基因簇oxa的基因排布；图2B是已知恶唑霉素基因簇-白色链霉菌JA3453中ozm基因簇的基因排布。
图3是龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中恶唑霉素类化合物生物合成基因簇的表达情况检测及产物分析。图3A是报告菌株4.1101DRoxaG的构建策略示意图；图3B是通过琼脂块法对4.1101DRoxaG中报告基因cviI表达情况的分析，龙胜链霉菌CGMCC 4.1101野生型菌株4.1101WT作为阴性对照；图3C是4.1101WT、4.1101DRoxaG和4.1101WT衍生的cviI高表达菌株4.1101HcviI发酵产物的HPLC分析。
图4是VRS-bAHL偶联微生物共培养提高龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中恶唑霉素类化合物的产量。图4A是4.1101DRoxaG与不同微生物共培养后报告基因的表达情况比较；图4B是4.1101DRoxaG和枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630单独及共培养后报告基因的表达情况分析；图4C是4.1101WT和枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630单独及共培养后产物的HPLC分析。
图5-7分别是TOXA1、TOXA5和TOXA7的核磁共振谱图。各图中A是1H-NMR谱图；B是13C-NMR谱图；C是DEPT135谱图；D是1H-1H COSY谱图；E是1H-13C HSQC谱图；F是1H-13C HMBC谱图；G是1H-1H ROESY谱图。
图8是TOXA1、TOXA5及TOXA7的化学结构及活性分析。图8A是TOXA1、TOXA5及TOXA7的化学结构；图8B是TOXA1、TOXA5及TOXA7的抑菌活性分析。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明进行恶唑霉素类化合物增产所用的微生物可以商购自公司或购自菌种保藏中心，例如以保藏号表示的微生物为购自保藏中心；本发明与链霉菌报告菌株共培养所用其他菌株可以是可获取的任意微生物例如不同细菌或真菌。
实施例1：可视化报告系统(VRS-bAHL)的原理及其在龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中应用的可行性分析。
VRS-bAHL的基本原理是利用革兰氏阴性菌-紫色色杆菌CV31532的AHL合酶基因cviI作为报告基因，并利用AHL指示菌CV026对报告基因的表达情况，即AHL的合成情况进行检测。
本发明首先验证了VRS-bAHL在龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中应用的可行性。首先构建了具有卡那霉素抗性基因标记的整合型质粒pIJ10500K：合成引物KANRF和KANRR(SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7)，从质粒pCS26-Pac(Tahlan K,Ahn SK,Sing A,et al.Initiation ofactinorhodin export in Streptomyces coelicolor[J].Molecular Microbiology,2007,63:951-961)上扩增卡那霉素抗性基因kanR2的DNA序列(SEQ ID NO.8)，经过HindIII和KpnI双酶切后，与HindIII/KpnI双酶切后的pIJ10500质粒相连，获得具有卡那霉素抗性基因标记的整合型质粒pIJ10500K。接下来构建用于AHL合酶基因cviI组成型表达的质粒pPhrdB-cviI：以天蓝色链霉菌M1146的基因组DNA为模板，用引物PHRDBF和PHRDBR(SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10)扩增强启动子PhrdB的DNA序列(SEQ ID NO.1)，并用NdeI进行酶切；以紫色色杆菌CV31532的基因组DNA为模板，用引物I532F(经过磷酸化)和I532R(SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12)扩增不包含自身核糖体结合位点对应序列的cviI的DNA序列(SEQID NO.2)，并用SpeI进行酶切；然后将酶切后的PhrdB和cviI与经过NdeI/SpeI双酶切的pIJ10500K进行连接，获得质粒pPhrdB-cviI。通过接合转移(Kieser T,Bibb MJ,ButtnerMJ,et al.,Practical Streptomyces Genetics[M].John Innes Foundation Norwich,2000)，将质粒pIJ10500K和pPhrdB-cviI分别导入龙胜链霉菌CGMCC 4.1101，并使其整合到基因组上，分别作为阴性对照菌株4.1101NC和报告基因即AHL合酶基因cviI组成型表达的阳性对照菌株4.1101HcviI。在12孔板中，MS固体培养基上，分别接种(直接点接5μL孢子收集液)4.1101NC和4.1101HcviI并倒置培养3天，然后通过琼脂块法，用AHL指示菌CV026对两个菌株的AHL产生情况进行检测。结果表明，只有4.1101HcviI能显著激活CV026中紫色杆菌素的产生，即报告基因cviI发生了高效表达，而阴性对照菌株4.1101NC完全没有激活作用，说明可视化基因表达报告系统VRS-bAHL在龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中应用时具有良好的可行性，且背景干净(图1)。
琼脂块法的具体操作是：挑取CV026单菌落至3mL LB液体培养基小试管中，28℃，220rpm过夜振荡培养；将长好的菌液按1:100的接种量转接到含有10mL LB液体培养基的大试管中，继续振荡培养5-6h，将长好的菌液按1:10的比例加到溶化后的软琼脂LB培养基(含有1％琼脂的LB培养基)中，倒平板并在超净台吹干30分钟，从待检测菌株固体培养基平板合适位置取琼脂块，放置在上述吹干的平板表面上，培养20-40h后，观察培养基平板上琼脂块周围紫色杆菌素的产生情况。
MS培养基的配方：甘露醇20g/L，黄豆粉20g/L，固体培养基加入1.5％的琼脂，115℃灭菌30分钟。
软琼脂LB培养基的配方：胰蛋白胨(OXOID)10g/L，酵母提取物(OXOID)5g/L，NaCl10g/L，固体培养基按需要加入1.0％的琼脂，121℃灭菌30分钟。
PCR反应的条件如下：DNA聚合酶KOD FX(1U/μL)1μL，PCR缓冲液2×PCR Bufferfor KOD FX 25μL，dNTPs(各2mM)10μL(以上试剂购自TOYOBO，Japan)，DMSO 2.5μL，10μM引物各1.5μL，模板DNA2.5μL(10-50ng)，ddH2O 6μL，总反应体积50μL。PCR循环条件：预变性：94℃，5min；30个循环扩增反应(变性：94℃，30sec；退火：60℃，30sec；延伸：68℃，1kb/min，具体延伸时间根据扩增片段的长度确定)；68℃，5min；4℃，保存。
接合转移方法如下：(1)将目的质粒转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002感受态细胞，涂布在含有相应抗生素的LB培养基平板上，37℃倒置培养；(2)挑取转化子至含有相应抗生素的3mL LB液体培养基小试管中，37℃，220rpm振荡培养；(3)将长好的菌液按1:100的接种量转接至含有相应抗生素的10mLLB液体培养基(接合转移用，含0.1％葡萄糖)大试管，37℃，220rpm振荡培养，至OD600大约为0.4-0.6；(4)4000rpm离心5分钟，收集菌体，用LB培养基洗两到三次菌体，然后用500μL的LB培养基重悬；(5)收集新鲜或取冷冻保存的龙胜链霉菌孢子适量，用LB培养基洗两次，然后用500μL的LB培养基重悬，50℃水浴热激5-10分钟，冷却到室温，1h内使用；(6)将上述大肠杆菌细胞与链霉菌孢子等体积混合均匀，涂布在含有10mM MgCl2或20mM CaCl2的MS培养基平板上，吹干后28℃倒置培养；(7)培养16-20h后，板上涂布萘啶酮酸及卡那霉素至特定终浓度，其中，萘啶酮酸至终浓度25μg/mL，卡那霉素至终浓度50μg/mL，吹干后28℃倒置培养3-7天，得到相应的重组菌株，即接合子。
实施例2：龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中恶唑霉素类化合物生物合成基因簇的表达检测及产物分析
本发明通过antiSMASH分析发现龙胜链霉菌CGMCC 4.1101基因组中包含一个恶唑霉素类化合物的生物合成基因簇，将其命名为oxa。通过与已知恶唑霉素基因簇-白色链霉菌JA3453中的ozm基因簇(Zhao C,Coughlin JM,Ju J,et al.Oxazolomycin biosynthesisin Streptomyces albus JA3453 featuring an"acyltransferase-less"type Ipolyketide synthase that incorporates two distinct extender units[J].Journalof Biological Chemistry,2010,285:20097-20108)进行基因排布的比较和基因功能的注释、比对，发现龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中的oxa簇较为完整，但是与ozm又有一定的差异。因此，本发明决定对oxa进行研究，以期发现新结构的恶唑霉素类化合物(图2)。
为了检测oxa基因簇表达情况的同时方便后续对其产物进行鉴定，我们首先通过同源双交换的策略构建了基于基因簇oxa的双功能报告菌株。具体操作如下：用引物RBSI532F和RBSI532R(SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)扩增包含自身核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)对应序列的cviI(SEQ ID NO.3)，用引物PKANRF和PKANRR(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)扩增包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR1(SEQ IDNO.4)，用引物DROXAGLF和DROXAGLR(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)扩增oxa簇中结构基因oxaG(SEQ ID NO.5)编码区的上游同源臂(SEQ ID NO.19)，用引物DROXAGRF和DROXAGRR(SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21)扩增oxaG编码区的下游同源臂(SEQ ID NO.22)，通过Gibson组装(Gibson DG,Young L,Chuang RY,et al.Enzymatic assembly ofDNAmolecules up to several hundred kilobases[J].Nature.Methods,2009,6:343-345)的方式将上述4段序列与EcoRV酶切的pKC1139质粒连接，获得重组质粒pKDRoxaG，然后通过接合转移的方式导入龙胜链霉菌CGMCC 4.1101，进而通过同源双交换的策略替换结构基因oxaG编码区中的一段，使该基因得到破坏，但保留其启动子区域，用于驱动cviI的表达，与此同时引入卡那霉素抗性基因作为重组菌株的筛选标记，最终获得双功能报告菌株4.1101DRoxaG，即该突变株菌既含有cviI报告基因用以指示结构基因oxaG的表达水平，同时该基因的缺失突变株可作为恶唑霉素不能合成的阴性对照菌株。
随后，本发明选择12孔微孔板，用MS固体培养基，对报告菌株4.1101DRoxaG进行倒置培养(直接点接5μL孢子收集液)，合适时间后通过琼脂块法用AHL指示菌CV026检测其中报告基因cviI的表达情况，选择龙胜链霉菌CGMCC 4.1101野生型菌株(4.1101WT)作为阴性对照。结果显示，培养3天后，4.1101DRoxaG能显著激活CV026中紫色杆菌素的生物合成，而对照菌株4.1101WT完全没有激活作用，表明结构基因oxaG的启动子在上述培养条件下能驱动cviI的表达。随后，对野生型菌株4.1101WT、报告菌株4.1101DRoxaG以及4.1101衍生的cviI高表达菌株4.1101HcviI在MS固体培养基上发酵3天的萃取物进行HPLC分析，发现4.1101WT中产生的8个化合物峰在4.1101DRoxaG中消失了，而4.1101HcviI中的差异峰依然存在，说明差异峰的消失是由于结构基因oxaG的破坏而非报告基因cviI的表达，因此，我们推测这些差异峰可能是oxa基因簇相关的产物，并分别将其命名为TOXA1-TOXA8(图3)，然而，这些化合物的产量都很低，不利于进一步的分离纯化。
PCR反应条件同实施例1；所用培养基配方同实施例1；接合转移实验的操作同实施例1，其中安普霉素的使用终浓度为75μg/mL；琼脂块法的操作同实施例1。
Gibson一步克隆试剂盒购自YEASEN，反应条件如下：2×Hieff Clone MultiSEnzyme Premix 10μL，所连片段各x ng(x＝0.02×片段碱基数)，ddH2O加至总体积20μL；混匀后置于50℃反应50min，然后转化感受态细胞。
同源双交换筛选过程如下：得到的接合子在含安普霉素的MS培养基平板上扩大培养后，转接至含安普霉素的MS培养基平板上置于37℃培养，长出的单交换突变株转接至不含抗生素的MS培养基平板，置于28℃培养两代，之后收集孢子稀释并涂布在不含抗生素的MS培养基平板上，然后挑取单菌落进行抗性验证，选择丢失安普霉素抗性的菌落进行PCR验证，正确的即为目的菌株，扩大培养后用于后续实验。
龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中恶唑霉素类化合物的萃取及分析方式：菌株在12孔板中、MS培养基上倒置培养3天后，将其切碎并转移至5mL离心管中，加入等体积甲醇，置于4℃过夜浸泡，后置于冰水浴中超声30min，最后取上清过滤后用于HPLC分析，所用色谱柱为Zorbax，SB-C18，4.6×250mm，5μm；流动相为乙腈和含0.1％甲酸的水；流速为1mL/分钟；检测波长为280nm；具体条件如表1：
表1龙胜链霉菌中恶唑霉素类化合物的HPLC分离条件
时间(min) 0 43 44 50 51 55
乙腈(％) 37 37 100 100 37 37
含0.1％甲酸的水(％) 63 63 0 0 63 63
实施例3：VRS-bAHL偶联微生物共培养提高龙胜链霉菌CGMCC4.1101中恶唑霉素类化合物的产量
为了方便对TOXAs进行大量制备，我们尝试将VRS-bAHL与微生物共培养进行偶联，构建一种针对特定基因簇的抗生素增产方法，即通过微生物共培养来提高龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中基因簇oxa的表达水平，同时使用报告系统VRS-bAHL进行高通量筛选，最终获得能促进龙胜链霉菌中恶唑霉素类化合物生物合成基因簇表达增强的微生物共培养体系，并用于TOXAs产量的提高及制备。具体过程如下：选择MS培养基，选择多种微生物例如链霉菌、链霉菌之外的其他细菌以及真菌等分别与报告菌株4.1101DRoxaG在12孔板中进行共培养，报告菌株直接点接5μL孢子悬液，在临近位置点接5μL共培养菌株的孢子悬液(链霉菌和真菌)或5μL其他细菌的LB培养基过夜培养物，倒置培养3天之后通过琼脂块法检测各共培养体系中报告基因的表达情况，并与4.1101DRoxaG单独培养时进行比较(通过ImageJ软件计算各培养体系琼脂块诱导CV026产生的紫色杆菌素圈的面积，并将阴性对照(Negativecontrol，NC)—4.1101DRoxaG单独培养时的紫色杆菌素圈面积设为1，其余共培养体系与其相比进行归一化)，结果发现当4.1101DRoxaG与枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630共培养时，琼脂块激活CV026产生的紫色杆菌素圈面积显著增大46％，即报告菌株中AHL的产量显著提高，表明枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630很可能增强了关键结构基因oxaG的表达。
随后，将报告菌株4.1101DRoxaG和枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630分别单独以及共培养，并通过琼脂块法检测AHL的产生情况，进一步证实，共培养后4.1101DRoxaG中AHL的产量与单独培养时相比显著提高，即报告基因cviI的表达增强了。随后对龙胜链霉菌CGMCC4.1101野生型4.1101WT与枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630在12孔板中、MS培养基上单独及共培养的产物进行HPLC分析和峰面积比较，发现共培养后8种TOXAs的产量均显著提高，各化合物提高至单独培养时的倍数分别如下：TOXA1，4.6倍；TOXA2，4.0倍；TOXA3，4.1倍；TOXA4，4.4倍；TOXA5，9.3倍；TOXA6，5.1倍；TOXA7，9.5倍；TOXA8，3.3倍，为其下一步的分离纯化及结构鉴定提供了基础。
所用培养基配方同实施例1；琼脂块法的操作同实施例1；龙胜链霉菌CGMCC4.1101中恶唑霉素类化合物的萃取及分析方式同实施例2；共培养所用不同微生物见表2。
表2与4.1101DRoxaG共培养所用菌株
Figure BDA0003357688470000151
Figure BDA0003357688470000161
实施例4：龙胜链霉菌CGMCC 4.1101中恶唑霉素类化合物TOXAs的分离纯化、结构鉴定及活性分析
为了鉴定龙胜链霉菌CGMCC 4.1101产生的TOXAs的化学结构，我们对其与枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630进行了大规模的共培养和产物萃取。萃取液经两轮HPLC分离，获得三个单体：TOXA1、TOXA5和TOXA7。高分辨质谱分析结果表明TOXA1、TOXA5和TOXA7的相对分子量[M+Na]+分别是708.3482、692.3519和692.3514，推出其分子式分别是C36H51N3O10，C36H51N3O9和C36H51N3O9，结合核磁共振分析(表3，表4，表5，图5，图6和图7)，确定了它们的化学结构，均为恶唑霉素类化合物，其中TOXA5和TOXA7分别与已报道化合物KSM-2690B和KSM-2690C结构一致(Otani T,Yoshida K,Kubota H,et al.Novel triene-beta-lactoneantibiotics,oxazolomycin derivative and its isomer,produced by Streptomycessp.KSM-2690[J].Journal of Antibiotics,2000,53:1397-1400)，而TOXA1为一种结构新颖的恶唑霉素类化合物(图8)。
随后，本发明分别选择了三种革兰氏阳性菌和三种革兰氏阴性菌，测定了TOXA1、TOXA5和TOXA7的抑菌活性，发现三者均具有抑制革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CGMCC 1.89、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.1630和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC1.1626的活性，而且TOXA1和TOXA5还具有良好的抑制革兰氏阴性植物致病菌-野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)Xcc 8004的活性，最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)分别是50μg/mL和12.5μg/mL。此外，TOXA5还具有抑制革兰氏阴性菌-铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA14和洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)CGMCC 1.1813的活性(图8)。
大规模共培养采用90mm直径培养皿，MS固体培养基平板，将龙胜链霉菌野生型菌株和枯草芽孢杆菌临近接种(棉签涂链霉菌孢子或枯草芽孢杆菌菌液)，倒置培养3天后进行萃取，萃取方式同实施案例2，萃取物经浓缩后用甲醇和水等比例混合溶剂溶解后进行HPLC分离，经两轮HPLC分离制备，条件如下：使用半制备反相柱Zorbax SB-C18 column，9.4×250mm，5μm；第一轮HPLC流动相水中含0.1％甲酸，第二轮不含甲酸；流动相组成及比例变化同实施例2中表1；流速3mL/分钟；检测波长280nm。
表3 TOXA1的1H和13C NMR数据
Figure BDA0003357688470000171
Figure BDA0003357688470000181
表4 TOXA5的1H和13C NMR数据
Figure BDA0003357688470000182
Figure BDA0003357688470000191
Figure BDA0003357688470000201
表5 TOXA7的1H和13C NMR数据
Figure BDA0003357688470000202
Figure BDA0003357688470000211
序列表
SEQ ID NO.1天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的组成型启动子PhrdB
ccgccttccg ccggaacggc ggggtccggg cacgccaaac ccctcctgtg gctgtggccggccaccgccg tcaccttcgg accccgtgga gccgctcccg gttccacggg gtccgaaggt gtgatgagcaggctgcgcct tcctcgcgcg gccgcaaggt acgagttgat gaccttgttt atccgcatct gaccaattttgatcgcttac ggggtgtgac tcgggccacg cggattgggc gtaacgctct tgggaacaac acgatgacctaagaggtgac agccgcggag ggaatacgga cgccgttcac ggcgctgtgc atctccccgg cccgcccgcaccgtcggccc attcccaagc cggtggtcgg cccctgtccg ccgtggacgg ggccggaagc cgtttttcaacgttccgaga ggttgttc
SEQ ID NO.2不包含自身核糖体结合位点对应DNA序列的紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)CV31532 AHL信号分子合酶基因cviI的核苷酸序列
gtgaaaaagt tctactcgtt gcaattggat ggtttggtgt tggaccgggt cgaagacgaaagcacgatgc tcgacctgct ggcgttcaga cacaagattt tccgggagaa tctgcgttgg ctgccggtgtgcggcaatgg cttggatagg gatgaatacg acgccatttc cgataatctg gcgatctgcc tggatggccaggtggtgggg tcggtcaggt ttactccggg aaccgagcgt tatatgttgg aaaaggactt ttccaggctattggtgccgg acgagatttt gtacaaaggg ggggcaagcg cggagatctc gcgtttcgcg gtggacacggaaacgctggg caggaaactg accgcttccg cttcccgatt gctgtatctc agcttgtggc aatgggcggagtggaacgag atccgctgga tgtatttcgt ggtagagccg tctatgtacc gccggctggt cgcgcttggtttccccatcc ggcccgtggg ggtcccgcga ccgcttgacg gcggagtgct gtccatggcc ggctatttcgactggggcca gatccgcggc gaggtcattc gttcgctacg gtcgagggtg gcattgccag atgcatgcccagcacaatgg cgtgagtacg attattcgca ttga
SEQ ID NO.3包含自身核糖体结合位点对应DNA序列的Chromobacteriumviolaceum CV31532 AHL信号分子合酶基因cviI的核苷酸序列
aaccaaaatt aggaggcttg agtgaaaaag ttctactcgt tgcaattgga tggtttggtgttggaccggg tcgaagacga aagcacgatg ctcgacctgc tggcgttcag acacaagatt ttccgggagaatctgcgttg gctgccggtg tgcggcaatg gcttggatag ggatgaatac gacgccattt ccgataatctggcgatctgc ctggatggcc aggtggtggg gtcggtcagg tttactccgg gaaccgagcg ttatatgttggaaaaggact tttccaggct attggtgccg gacgagattt tgtacaaagg gggggcaagc gcggagatctcgcgtttcgc ggtggacacg gaaacgctgg gcaggaaact gaccgcttcc gcttcccgat tgctgtatctcagcttgtgg caatgggcgg agtggaacga gatccgctgg atgtatttcg tggtagagcc gtctatgtaccgccggctgg tcgcgcttgg tttccccatc cggcccgtgg gggtcccgcg accgcttgac ggcggagtgctgtccatggc cggctatttc gactggggcc agatccgcgg cgaggtcatt cgttcgctac ggtcgagggtggcattgcca gatgcatgcc cagcacaatg gcgtgagtac gattattcgc attga
SEQ ID NO.4包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR1的核苷酸序列
aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttagacgtcggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac tggatggctttcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcgcatgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgactgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttctttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggctggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgctattgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatggctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcgcatcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcaggggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtgacccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtggccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggcggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttctatcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctggg
SEQ ID NO.5龙胜链霉菌(Streptomyces longshengensis)CGMCC4.1101基因簇oxa中结构基因oxaG的核苷酸序列
atggaagacc cggccgcgcg actggccgtg ctgggagccg gtgtcatggg cgtcagcatcacgacgctcg ccctcggcca gggcgtcccg gtgctcctgg tcgagaccga cccgcagaag cgggcgggggcccgcgccag gatcgagcgc gagctgcgga cggcacacct cctgggggcc cgtccggacg ttccgcagggtcagttggag atcaccgact cgctcggcga ctgccgcgac gccgacgcgg tgatcgaagc ggtcaccgaggacgccgggc tcaaggtcaa ggcactgacc gaggccggtg cgatgaccgg ccccggcacc gtgctggtgaccaacacctc ctccatcccg gtggacgagc tggcgaccca actgccgtat cccgagcggc tggtcggcgtccacttcatg aacccctcgt acctgatccg gacggtcgag gtcatccgcg gcgcccgcac cggcgagccggccgtggagg ccgtccggcg ggtgctcgcg gcactcgacc ggcgcggcgt cttcgtcggc gacggccccggcttcgtcac cagccgggtg ctgcaccgca tgatcaacga cgcggcgcgg gtcgtacagg agggccgggccaccgccgag gacgtggaca ccctgatgca cgactgcctg gggcaccgca ccgggccgct gcgcaccgccgacctgatcg gcctggacaa cctcgtggac tccctgtggg tcctgcacca gcgcaccggc gacgaggggtgccgcccctg cgacctgctg ctgcagaagg tgcgcgacgg cgagcacggc cgcaagaacg gccgcggcttctacacctac ccgggcgcgg tggtctga
SEQ ID NO.6扩增包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR2的引物KANRF
cccaagcttaagggcctcgtgatacgc
SEQ ID NO.7扩增包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR2的引物KANRR
ggggtaccggctaatgcacccagtaagg
SEQ ID NO.8包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR2的核苷酸序列
aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttagacgtcggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac tggatggctttcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcgcatgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgactgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttctttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggctggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgctattgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatggctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcgcatcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcaggggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtgacccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtggccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggcggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttctatcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgagagct cgcttggact cctgttgatagatccagtaa tgacctcaga actccatctg gatttgttca gaacgctcgg ttgccgccgg gcgttttttattggtgagaa tccaagcact agggacagta agacgggtaa gcctgttgat gataccgctg ccttactgggtgcattagcc
SEQ ID NO.9扩增强启动子PhrdB的引物PHRDBF
ggaattccatatgccgccttccgccggaac
SEQ ID NO.10扩增强启动子PhrdB的引物PHRDBR
gaacaacctctcggaacgttgaa
SEQ ID NO.11扩增不包含自身核糖体结合位点对应DNA序列的cviI的引物I532F(经过磷酸化)
gtgaaaaagttctactcgttgc
SEQ ID NO.12扩增不包含自身核糖体结合位点对应DNA序列的cviI的引物I532R
ggactagttcaatgcgaataatcgtactca
SEQ ID NO.13扩增包含自身核糖体结合位点对应DNA序列的cviI的引物RBSI532F
aaccaaaatt aggaggcttg agtg
SEQ ID NO.14扩增包含自身核糖体结合位点对应DNA序列的cviI的引物RBSI532R
tcaatgcgaa taatcgtact cacg
SEQ ID NO.15扩增包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR1的引物PKANRF
caatggcgtg agtacgatta ttcgcattga aagggcctcg tgatacgcct
SEQ ID NO.16扩增包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR1的引物PKANRR
cccagagtcc cgctcagaag
SEQ ID NO.17扩增oxa簇中结构基因oxaG编码区的上游同源臂的引物DROXAGLF
gactctagag gatccgcggc cgcgcgcgat cgccccactt gctgtaactg c
SEQ ID NO.18扩增oxa簇中结构基因oxaG编码区的上游同源臂的引物DROXAGLR
ctttttcact caagcctcct aattttggtt ggtgatctcc aactgaccct gc
SEQ ID NO.19结构基因oxaG编码区的上游同源臂的核苷酸序列
cgccccactt gctgtaactg cggccgtctt tcgcctcggg gtggaagtgc gaatccacgtcccaacggtc ggcgggcacc tcgctgatgc agttccggcc gtcggcgata ttgcgccaca gttcgtccggcgtgcgggcc gaagggtagc gcccggccag cccgatgacc gcgatatcca cgtcggccgc ggtatccggagcggtgggag agccctgctg ctgtacggca gccagcaatt tcaggagaag agcacgcttg tcgtccatagaccttcgtct cgcccgggtg acatagctga acggatatct cgaccggcca ccgcaccgcg ccgtgccgtcaggcagggca gcgctcggta gacattcaaa tgaacaccaa cgaaaacttc aggacttgcg tcgcggaaggcgacgtacgg gcctgctaaa aggcccttgc attggtatgg ggagaactgc cttcgggctt catggccgacagagcccaga caggcggact gcagcaaccc agcatcctca acccccgttg acacactgtc gtcagcagctcaggcggaag gcgcccgcct gctcctctga gacgggaacg taacatcgat tctcaagggg tggcaagtgattcgatcaag ggacatctcg accgactccg ggtctcacct ggagtattac ccggacgccg caggtcacggccagtgcgtc ggcaactccc ccgggcatag tccgaaagtt caccagcgga accggagcgg gctttccggaacgaacgatt ccgagaccaa ctcagaacaa tcatgctacg gtccagactc cggcggaccc aagtggagggttatgacttc gcatcgcaga cccccacgca ttacacccgt gtaattcacg gaacgaagca ctccggattcctcgaccggc gcgtccgcac actggattcg acacccgggc cgggcaaggg gcagcgctcc ccgccccggcccgttcaccc gcgcccgccg cgggtcacac ccctgtcggc cccttgagga attcggtccg cacccggaccgccactttca aactttcaac aaatcacaaa cctcgaccta ctgcctgagc aatgcaatta attgtgctgtcaaccgctag gtaacggagg tatgcggtga caatggaaga cccggccgcg cgactggccg tgctgggagccggtgtcatg ggcgtcagca tcacgacgct cgccctcggc cagggcgtcc cggtgctcct ggtcgagaccgacccgcaga agcgggcggg ggcccgcgcc aggatcgagc gcgagctgcg gacggcacac ctcctgggggcccgtccgga cgttccgcag ggtcagttgg agatcacc
SEQ ID NO.20扩增oxaG编码区的下游同源臂的引物DROXAGRF ttgacgagttcttctgagcg ggactctggg ccgcggcttc tacacctacc
SEQ ID NO.21扩增oxaG编码区的下游同源臂的引物DROXAGRR aaacagctatgacatgatta cgaattcgat cttgaccgtg gtggcgatg
SEQ ID NO.22oxaG编码区的下游同源臂的核苷酸序列
ccgcggcttc tacacctacc cgggcgcggt ggtctgatgg ccgatcaact caccctcgacgaccggctcc gggactacgt ccggcaggtc tcgctgcgcg acgacgacgt cctgcgcgac ctgcgcgccgagacggcggg catgccgatg ctccaggcga tgctggtgct gcccgaggag gcgcagttcc tcgccctcctggtccggctg accggggccg cgaaggtgct ggaggtgggc accttcaccg gctacagcag cctgtgcatggcgcgcgccc tgccgcccca cggcacggtg gtcacctgcg acaacagcga gcgctggacc cgcatcgcggcccgctactg gcagcgcgcc gaggtcgccg accggatcga cctgcggctc ggcgacgcgg ccgaaaccctcgacgccctc ctcgcgcaga gcggccccga cagcttcgac ctggccttca tcgacgccga caaggccaactactcccggt actacgagca gtccctggcg ctggtgcggc cgggcggact gctggtgctg gacaacacgctgttcttcgg ccgggtcgtc gacccggccg tgcaggaccc ggacaccctg gccatccgcg aactcaacagccggctgcgc gacgacgaac gcgtggacat ctccctgctc gccgtggcgg acggcctcac cctcatccacaagaagcccg agaggaagcc gagatgagcg agtcgaccac agagcgccgg ttcgtggcgg aagacgtcgagaccgagctg aagcagttcc tggagaagag caccaagacc agctgggcgt cggacaccga cctgttcgccgacggcggcg tctcctcgat gttcgcgatg gaactggtcg tgcacatcga gcggaccttc ggcctcgccatcgaaggacc ggacctcagg atcgacaact tccgcacggt gaacgacatg accgctctcg tgctccgcctcaccgggtcc gacgccggtg agtgacgacc tcccgggcct gatcagcgcg gaggtcggcg accgggccgcggcctgggac ctggccggca ccataccggt ggaggtgctc cgcaggctcg gcgcggcggg cgcgctgtgcgccgaggtcc ccgccgagta cggcggcccc ggcctgtcga gccgccgcaa cggcgaactc accgcccacaccggggcgct gtgcagttcg ctgcggagcg tgatgacctc ccagggcatg gcggcctgga ccatccagcggttcggcacc tgcccgcagc gcgccgaggc gctgacccgc ctcacccgcg gcgacctcgc cgccgtggcgttcagcgaac cgcaggccgg cagcgacctc tcggccatcg ccaccacggt caag
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0003357688520000011
Figure IDA0003357688520000021
Figure IDA0003357688520000031
Figure IDA0003357688520000041
Figure IDA0003357688520000051
Figure IDA0003357688520000061

Claims (10)

1.筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法，其特征在于，所述方法采用的基础菌为链霉菌A，所述方法包括以下步骤：
a.构建链霉菌A报告菌株，所述链霉菌A报告菌株包含报告基因AHL信号分子合酶基因cviI；
b.用AHL指示菌筛选与链霉菌A报告菌株共培养后，链霉菌A报告菌株目的基因表达增加的共培养菌。
2.根据权利要求1所述的筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法，其特征在于，所述链霉菌A为龙胜链霉菌CGMCC 4.1101。
3.根据权利要求1或2所述的筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法，其特征在于，所述报告基因包含核糖体结合位点对应DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，任选地，所述AHL指示菌为CV026。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法，其特征在于，所述目的基因为结构基因oxaG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法，其特征在于，构建链霉菌A报告菌株的方法包括以下步骤：
扩增包含自身核糖体结合位点对应序列的cviI(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，扩增包含自身启动子的卡那霉素抗性基因kanR1(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，扩增结构基因oxaG编码区的上游同源臂(其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)，扩增oxaG编码区的下游同源臂(其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)，通过Gibson组装的方式将所述oxaG编码区的上游同源臂、cviI、kanR1、oxaG编码区的下游同源臂按顺序与EcoRV酶切的pKC1139质粒连接，获得重组质粒pKDRoxaG，然后导入链霉菌A，筛选获得链霉菌A报告菌株。
6.根据权利要求5所述的筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法，其特征在于，将微生物分别与链霉菌A报告菌株共培养，比较各体系中报告基因的表达量，筛选获得提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系。
7.根据权利要求6所述的筛选提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系的方法，其特征在于，与链霉菌A报告菌株共培养所用微生物是细菌或真菌。
8.提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系，其特征在于，所述培养体系包括链霉菌和枯草芽孢杆菌。
9.根据权利要求8所述的提高恶唑霉素类化合物产量的共培养体系，其特征在于，所述链霉菌为龙胜链霉菌CGMCC 4.1101，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630。
10.恶唑霉素类化合物，其特征在于，所述恶唑霉素类化合物结构如下所示：
TOXA1(C36H51N3O10)：
Figure FDA0003357688460000021
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