CN101016533A - 一种蒽环类抗生素产生工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蒽环类抗生素产生工程菌及其在制备蒽环类抗生素中的应用。该工程菌是在天蓝淡红链霉菌的dnmV基因核苷酸序列的限制性内切酶位点处插入或替换成抗生素抗性基因和表柔红霉素合成基因，使dnmV基因被阻断的工程菌；或将含有蒽环类抗生素合成基因的表达载体转化变铅青链霉素(S.lividans)TK24，将从S.lividans TK24中提取的表达质粒导入仅用抗生素抗性基因阻断dnmV基因的天蓝淡红链霉菌的基因阻断突变菌。本发明的工程菌可产生柔红霉素和/或其结构类似物，如表柔红霉素等蒽环类抗生素。

Description

一种蒽环类抗生素产生工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种蒽环类抗生素产生工程菌及其应用。

背景技术

柔红霉素及以其为原料合成的阿霉素(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)是目前临床上十分重要的抗肿瘤蒽环类抗生素。表阿霉素的心脏和骨髓毒性比阿霉素更低，而抗肿瘤的效果相当或更高。表柔红霉素(epi-daunorubicin)是工业生产表阿霉素的重要前体，其与柔红霉素的差别仅在于分子中脱氧糖C4位羟基构型不同。由化学合成法从柔红霉素到表柔红霉素需要经过多步条件要求苛刻的反应过程，并会造成环境污染。如果采用微生物发酵方法直接生产将会大大节约成本，提高效率。

抗生素的生物合成一般包括几十步生化反应，涉及几十个基因，包括结构基因，调节基因和抗性基因等。结构基因编码抗生素生物合成过程中的一系列酶，这些酶参与了抗生素或其不同组分的生物合成。若要将柔红霉素的产生菌改造成可以直接在体内合成表柔红霉素的菌株，需要改变TDP-L-柔红糖胺的生物合成过程中的一个步骤。在柔红霉素的生物合成基因簇中，尽管柔红糖胺的生物合成还没有完全清楚，但前人的研究成果表明dnmJ、dnmQ、dnmS、dnmT、dnmU、dnmV、dnmZ、dnmL是必需的。由这些基因推测的蛋白产物与其他生物中的酶的序列相互关系，尤其是一些脱氧糖代谢酶，可以推导出其在柔红糖胺合成步骤中的分工和次序。其中DnmV为TDP-6-脱氧糖C4酮基还原酶，但是与碳霉糖和夹竹桃糖的酮基还原酶即AveBIV及EryBIV立体选择性相反。威斯康星大学Hutchinson教授通过分别克隆aveBIV和eryBIV基因，导入柔红糖胺合成被阻断的柔红霉素产生菌S.peucetius，以及用aveBIV置换基因组上的dnmV，构建的工程菌产生了表柔红霉素和少量表阿霉素(参见Madduri K，et al.Nat Biotechnol，1998，16(1)：69-74.)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是构建一种不能直接产生柔红霉素的柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的基因阻断突变菌，以及在该阻断突变菌中导入某些特定基因时可以重建代谢途径，代谢产生蒽环类抗生素，如表柔红霉素等的蒽环类抗生素产生工程菌。

本发明的天蓝淡红链霉菌的基因阻断突变菌，其是一种在天蓝淡红链霉菌的柔红霉素生物合成基因dnmV基因核苷酸序列的限制性内切酶位点处插入或替换成抗生素抗性基因，使dnmV基因被阻断的基因阻断工程菌。

本发明中所涉及的天蓝淡红链霉菌dnmV基因所编码的酶是TDP-6-脱氧糖C4酮基还原酶，如果dnmV基因功能丧失则菌体不能代谢产生柔红糖胺，也就不能得到柔红霉素。

较佳地，本发明的基因阻断突变菌是通过含有在dnmV基因的限制性内切酶位点处插入或替换成抗生素抗性基因的核苷酸序列的表达载体，进行双交换使dnmV基因被阻断的基因阻断工程菌。

所述的天蓝淡红链霉菌本发明选用天蓝淡红链霉菌(Streptomycescoeruleorubidus)SIPI-1482菌株为例。其中，该菌株中的dnmV和dnmU基因连锁，并且dnmU基因位于dnmV基因的上游，连锁的dnmU和dnmV基因的核苷酸序列已公开(GenBank登录号：AF006633)，也可参见序列表中SEQ ID No.1所示(其中第1-627位为dnmU基因的编码序列，tga为终止密码子；第635-1885位为dnmV基因的编码序列，tga为终止密码子)。该dnmV基因编码的蛋白氨基酸序列也已公开(GenBank登录号：AAB63047)，也可参见序列表中SEQ ID No.2所示，因此，上述dnmV基因的核苷酸序列也包括编码SEQ ID No.2所示的蛋白质序列的其它任何核苷酸序列。

该dnmV中的一段蛋白编码序列可以被任何基因片段所阻断，在本发明中如被能在链霉菌中表达的抗生素抗性基因片断替代所阻断，较佳地为被安普霉素抗性基因Ap^r替代所阻断，主要是由于安普霉素抗性基因Ap^r可作为其后的筛选标记使用。

本发明的具体技术方案为：

首先根据已发表的S.peucetius相应序列(Accession Number AF006633)设计引物，以天蓝淡红链霉菌SIPI-1482的总基因组为模板扩增dnmU及dnmV连锁片段，PCR产物全长1664bp，连接至pUC18后测序，经软件分析，与已发表的S.peucetius相应序列同源性93.6％，氨基酸序列同源性92.5％。

以安普霉素抗性基因替代dnmV基因内部219bp片断(KpnI～NotI)，构建成用于dnmV基因双交换的重组质粒，命名为pYG817。

将该重组质粒pYG817转化天蓝淡红链霉菌的原生质体，挑取在含安普霉素的R2YE平板上的再生菌进行验证。

由于pYG817是基于大肠杆菌质粒pUC18构建而来，质粒中没有链霉菌复制子，因此质粒在链霉菌中不能独立复制，故在含抗平板上得到的再生菌应是质粒进入菌体后通过同源交换整合入染色体，通过在染色体上的复制，转录和表达而使该再生菌具有抗生素抗性。

培养再生菌，提取其染色体，通过dnmV基因两端引物进行PCR验证。区别单交换和双交换菌。通过单交换得到的再生菌染色体上仍然存在完整的dnmV基因，故不能完全灭活dnmV的功能，而通过同源双交换得到的再生菌染色体上已经不存在完整的dnmV基因，可以达到灭活酶功能的目的。

将用PCR验证为双交换菌的阻断突变菌接种至发酵培养基发酵，待至发酵终点时提取发酵液进行HPLC分析，结果表明，dnmV基因阻断的工程突变菌不能产生柔红霉素。

为验证上述阻断突变菌能否在导入某些特定基因时可以重建代谢途径，代谢产生蒽环类抗生素，故同时对上述突变菌也进行了dnmV基因的功能补偿试验，证实其当导入dnmV基因的表达质粒时可以重建该阻断突变菌中的生物合成途径，而得到柔红霉素。

由于本发明的含有蒽环类抗生素基因的质粒需最终导入天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482，是一个工业生产用菌。但其有着比其它菌种更强的限制-修饰系统，所以将上述质粒直接转化SIPI-1482阻断突变菌较困难，需要先转化链霉菌常用宿主变铅青链霉素(S.lividans)TK24，从中提取质粒再转化dnmV受阻断的天蓝淡红链霉菌阻断突变菌。

因此，本发明的蒽环类抗生素产生工程菌，可由下列方法制得：将含有蒽环类抗生素合成基因的表达载体转化变铅青链霉素(S.lividans)TK24，将从S.lividans TK24中提取的表达质粒导入上述的天蓝淡红链霉菌的基因阻断突变菌。

所述的蒽环类抗生素合成基因为天蓝淡红链霉菌的dnmV基因时，从S.lividans TK24中提取的表达质粒为图8所示的pYG812。

所述的蒽环类抗生素合成基因为aveBIV基因时，含有其的表达载体导入上述基因阻断突变菌后构建的蒽环类抗生素产生工程菌，可发酵产生少量表柔红霉素。

本发明研究还发现，可在构建本发明天蓝淡红链霉菌的基因阻断突变菌的同时连入产生除柔红霉素外的蒽环类抗生素合成基因，如表柔红霉素合成基因，即在天蓝淡红链霉菌的柔红霉素生物合成基因dnmV基因核苷酸序列的限制性内切酶位点处插入或替换成抗生素抗性基因及蒽环类抗生素合成基因，直接构建成可发酵产生表柔红霉素等的蒽环类抗生素产生工程菌。其发酵效果更佳。

因此本发明还提供上述工程菌在制备蒽环类抗生素中的应用，如在制备柔红霉素、表柔红霉素中的应用。

本发明的积极进步效果在于：本发明通过分子生物学技术手段，克隆了天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)与柔红霉素中柔红糖胺的生物合成有关的dnmU、dnmV基因，阻断了dnmV基因的功能，构建了稳定的阻断突变菌，当在该阻断突变菌中导入蒽环类抗生素合成基因的表达质粒时，可以重建其代谢途径，产生柔红霉素或其类似物，如表柔红霉素等其它蒽环类抗生素。

附图说明

图1是dnmU与dnmV扩增产物电泳图；

图中，1为Ladder-3K；2为λDNA/HindIII；3为SIPI-1482基因组为模板的扩增产物。

图2是S.peucetius来源DnmV与天蓝淡红链霉菌SIPI-1482来源DnmV氨基酸序列对比图；

图中，“peu DnmV”是指S.peucetius来源的DnmV氨基酸序列；“1482”DnmV是指天蓝淡红链霉菌SIPI-1482来源的DnmV氨基酸序列。

图3是用于dnmV基因双交换的重组质粒pYG817的构建示意图。

图4是PCR验证安普霉素抗性基因电泳图；

图中，1是指阻断突变菌株基因组做模板；2是指DL2000(分子量标准)；3是指SIPI-1482基因组做模板。

图5是PCR验证dnmV基因及交换后的dnmV基因电泳图；

图中，1是指单交换菌株基因组为模板；2是指双交换菌株基因组为模板；3是指对照的SIPI-1482菌株基因组为模板；4是指λDNA/HindIII+DL2000。

图6是dnmV基因双交换原理示意图。

图7A是SIPI-1482菌株发酵产物HPLC分析图。

图7B是dnmV基因阻断突变菌株发酵产物HPLC分析图。

图8是dnmV基因表达质粒pYG812的构建示意图。

图9A是指阻断突变菌株作为对照菌株的发酵产物HPLC分析结果图。

图9B是指阻断突变菌中的dnmV基因的功能补偿发酵产物HPLC分析结果图。

图10A～图10C是指aveBIV基因替换了dnmV基因的重组菌发酵产物的HPLC分析及与原始菌株SIPI-1482的比较，其中图10A为S.coeruleorubidusSIPI-1482菌株发酵产物的HPLC分析图，图10B为表柔红霉素标准品的HPLC分析图；图10C为本发明工程菌发酵产物的HPLC分析图。

图11为重组质粒pYG816的构建示意图。

具体实施方式

下列实施例中的材料为：

所使用的工具酶和DNA分子量Marker均购自Takara公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。

所使用的胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，使用方法参考商品说明书。

大肠杆菌E.coli DH5a(Hanahan D.J.Mol.Biol.，1983，166，557-580)。

天蓝淡红链霉菌(S.coeruleorubidus)SIPI-1482(中国医药工业杂志，2000，31(5)：200)，可从上海医药工业研究院获得。

实施例1天蓝淡红链霉菌SIPI-1482菌株dnmU、dnmV连锁基因的克隆及测序

天蓝淡红链霉菌中的dnmU与dnmV基因连锁，并位于dnmV基因的上游。为了实现对dnmV基因的定向阻断，首先根据已发表的S.peucetius相应序列(Accession Number AF006633)设计引物，分别为dnmUV1：5’-AA CTG CAGGAGCGAAGTGGCGTTG-3’，含PstI位点；dnmUV2：5’-GG GAATTCTCGTCGGAAGCCTGT G-3’，含EcoRI位点。PCR反应条件为：97℃变性5min后添加Taq酶，95℃1min，61℃1min，72℃3min，30个循环后72℃继续延伸10min。以天蓝淡红链霉菌SIPI-1482的总基因组为模板扩增dnmU及dnmV连锁片段，PCR产物全长1664bp(如图1)。将dnmU及dnmV连锁片段PCR产物连接至pUC18(上海生工公司购得)后得到质粒pYG803，送质粒pYG803上海博亚公司测序，经软件分析，所得序列与已发表的S.peucetius相应序列同源性93.6％，氨基酸序列同源性92.5％(如图2)。

实施例2  双交换质粒的构建、转化及阻断子的筛选

将实施例1制得的质粒pYG803(4299bp)用KpnI和NotI酶切，回收4080bp片断。将该片断与同样以KpnI和NotI酶切后的安普霉素抗性基因抗性基因片断(GenBank中发表，约1.3kb，Accession number：AY072040、AY216678、AJ438947、AJ566337)用T4连接酶16℃连接4h后，转化E.coliDH5a。以安普霉素和氨苄青霉素作为筛选标记共同筛选目的克隆，挑取转化子，提取质粒进行酶切验证，构建成功双交换质粒pYG817(5466bp)(如图3所示)。

所得质粒进行碱变性单链化，即110μl质粒稀释溶液体系，浓度约为50ug/ml，1∶1添加0.4M NaOH使终浓度0.2M，37℃10min，立即冰水浴1min，加1/10体积即23ul 3M NaoAc(PH4.8)，700ul无水乙醇，-20℃沉淀20min，沉淀洗涤后10μlTE溶解，继续转化预先制备的天蓝淡红链霉菌原生质体。在含有安普霉素(100μg/ml)的再生平板上培养7天后，挑选能够生长的再生菌落，可在含有相同抗生素的高氏1号培养基上(范秀容、李广武、沈萍，“微生物学实验”，1988，第二版，武汉大学/复旦大学)扩大培养得到丰满孢子。

实施例3  双交换工程菌的筛选

再生菌落的孢子接种至20ml的YMB培养基中，培养收集菌体，提取其染色体。依据GenBank中发表的安普霉素抗性基因序列(Accession number：AY072040、AY216678、AJ438947、AJ566337)，对比其同源性，以同源性较高的区域设计引物：apr1：5’-GATGCAGGAAGATCAACG-3’；apr2：5’-AGGTCTGGACGACGAGC-3’。分别以再生菌基因组DNA、天蓝淡红链霉菌SIPI-1482(对照菌株)基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果从再生菌基因组可扩增出安普霉素抗性基因内部约500bp的片段，而从对照菌株基因组中不能得到任何片段(如图4所示)。

同样以dnmV基因两侧引物dnmV1：5’-GGAGGAAGACATGCGGGTCGTGGT-3’，dnmUV2：5’-GGGAATTCTCGTCGGAAGCCTGTG-3’，扩增以上模板DNA，结果从SIPI-1482菌株基因组及单交换菌株中可得完整的dnmV基因(921bp)，而双交换菌株中可扩增得到约2.0kb条带(dnmV基因加插入其内部的安普霉素抗性基因)，如图5所示。通过单交换得到的重组菌染色体上仍然存在完整的dnmV基因，故不能完全灭活dnmV的功能，而通过同源双交换得到的重组菌染色体上已经不存在完整的dnmV基因，可以达到灭活酶功能的目的(其双交换原理如图6所示)。

实施例4  天蓝淡红链霉菌dnmV基因阻断突变菌株的发酵产物HPLC分析

将双交换的工程菌株，即本发明的天蓝淡红链霉菌dnmV基因阻断突变菌株天蓝淡红链霉菌SIPI-1482/pYG817接种至种子及发酵培养基(参见蒋世春等，中国抗生素杂志，2000，25(6)：409-411)中，种子培养基培养两天后转接发酵培养基(10％接种量)。30℃，230r/m培养5天后，放瓶提取(参见叶逢春等，中国医药工业杂志，1996，27(7)：293-294)。HPLC分析方法中流动相：甲醇∶水＝56∶44，含1％的冰醋酸，0.3％的三乙胺；样品用孔径0.22μm的偏氟膜过滤；流速：1ml/min，检测波长：254nm。HPLC分析结果显示：通过双交换的工程菌发酵产物中已不存在柔红霉素组分，表明该工程菌已达到灭活dnmV基因功能的目的，如图7A和图7B所示。

实施例5  阻断突变菌中的dnmV基因的功能补偿试验

dnmV基因PCR产物(921bp)连入pUCm-T载体(上海生工公司购得)后得到质粒pYG811，该质粒经PstI及XbaI双酶切后，回收约1kb片断，同时pYG43(见《中国医药工业杂志》2004年第35卷第1期第13页)亦用PstI及XbaI双酶切，回收长片断，T4连接酶16℃连接4h后，转化S.lividansTK24，得到转化子经验证构建得到dnmV基因在链霉菌的表达质粒pYG812(图8)。该表达质粒的特征为dnmV基因位于红霉素抗性启动子(PermE)下游。将pYG812转化dnmV基因的阻断突变菌天蓝淡红链霉菌SIPI-1482/pYG817后，得到含有质粒的转化子，按照实施例4中所述发酵条件进行发酵及HPLC分析发酵产物，结果显示发酵产物中可以得到柔红霉素(图9A和图9B)。

实施例6  产表柔红霉素的蒽环类抗生素产生工程菌的构建

用ave1(5’-AACTGCAGGGGGGAAGGGCTCAAGAAG)和ave2(5’-CCGAATTCCTACACGTAAGCCGCCACC)从S.avermitilis(ATCC 31267)的基因组DNA中PCR扩增aveBIV基因并替换pYG812中的dnmV，同实施例5，转化dnmV基因的阻断突变菌天蓝淡红链霉菌SIPI-1482/pYG817后，得到转化子，进行发酵培养，可得到少量表柔红霉素。

上述实施例5、6表明通过导入某些特定基因的表达质粒可以重建该阻断突变菌中的生物合成途径，而得到柔红霉素或其结构类似物，如表柔红霉素。

实施例7  产表柔红霉素的蒽环类抗生素产生工程菌的构建

参照实施例2-4，将aveBIV基因克隆于pYG43的PermE(红霉素抗性基因启动子)后构建得到pYG814，并以此替代dnmU+dnmV基因(实施例1的质粒pYG803)中的NotI-KpnI片段，并同时连上Ap^r(安普霉素抗性基因)构建得到重组质粒pYG816(见图11)，与pYG817有同样的两端交换臂，但中间插入片段除了Ap^r外还有aveBIV。转化SIPI-1482原生质体，在安普霉素抗性平板上筛选到的转化子发酵产物分析表明其不产柔红霉素，只产表柔红霉素(EPIDNR)，且产量与原始菌株SIPI-1482相当，副产物也较少，较文献报道有更好的结果(参见Madduri K，et al.Nat Biotechnol，1998，16(1)：69-74.)。HPLC分析见图10A～图10C。

序列表

<110>上海医药工业研究院

<120>一种蒽环类抗生素产生工程菌及其应用

<130>061979C

<150>CN200510110136.9

<151>2005-11-09

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1558

<212>DNA

<213>天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)

<400>1

atgaaggcgc gggaactggc ggtgcgcggg gcgtacacgt tcgagccgga ggtgtttcct    60

gacgagcggg ggctgttcgt ctcaccgttc cgggaggatg cgttcacggc cgcggtcggc    120

cacccgctct tcccggtgag gcagtcgaat cacagccggt cccggcgtgg ggtggtgcgg    180

ggcgtgcact acaccgtgac gccgccgggc tcggccaagt acgtgtactg cgctcgtggc    240

aggtcgctgg acattgtcgt cgacgtgcgg gtcggctccc cgacgtacgg ccggtgggac    300

gccgtcgagc tggagccgcg tgcgttccgt gcggtgtact tcccggtcgg ggtgggacac    360

gccttcgtgg ccctggagga cgacaccgtc atgtcctaca tgctgtccgg ggagtacgtg    420

caggccaacg aactcgccgt gtccgtgctg gaccaggccc tcggactgcc cgtgccggac    480

gatctggagc ccgtactgtc cggacgggac cgggccgcgc cgctcctgga gcaggcacgg    540

gccgacggga cccttccgga ctacgccgtg tgccgcgcgg tcgaggcgaa gctgtggccg    600

tcggccggac cacgcggaga cgggtgaggc agacatgcgg gtcgtggttc tgggggcgac    660

gggcagcgtc ggccggcagg tgtgcgctgc gtaccaggcg cacgggtggg acgtgcacgg    720

ggtggcccgc cgcccggcgc cgtatctgag cgggtgcggg ttcacggcgc tggacctcgc    780

ggccgctgcg cccgggcgga tcgccacggt gttgggcgat cccccgacgg acgtcgtggt    840

caacgccgcg ggcggctggg gcgacactga ggaggagatg acgtactcgc atctgcgcct    900

ggtgcggcgc ctggtggatg cgctcgcgct gcacccgttc cggacccggc tggtccatct    960

ggggtcggtg cacgaatacg gtcccgtacc ggccggtacc ttgttgcggg aggacctgct    1020

gccggagccg atcacgccgt acgcgcgggt caaactggag acttcgtcgg ccgtcctgac    1080

cgcagcgcgg gccggtatcc tggacgcggt ggtgatgcgc gcggcgaaca tgtcgggccc    1140

acatccgccg caggagagtt ttctggccgc cttgatgacc cgtgtcggca cagccctcgc    1200

gcagggcggg cggctggagt tgagcgtcgc ggacgcacga cgcgacttcg tcgacgtgcg    1260

ggacgtcgcg caggcggtgg tgcgtgccgg gcaggctgcg gcggtcggcg ggctggtcgt    1320

caacatcggg cgcggggacg ccgtgccgat cggtgatctg gtcggctggc tgctggaggc    1380

cgccgctttt ccggaggacc gggtggaccg ccggacggca ccggtgcgga gcaagggcgg    1440

cgactggacc cggctcgaca tcgggcgggc ccggcggttg ctgccctggg cgccgcgcat    1500

cggcatgcgg gactccgtcc acagcatgtg gcggaccgcg cacggctccc cggcctga      1558

<210>2

<211>307

<212>PRT

<213>天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)

<400>2

Met Arg Val Val Val Leu Gly Ala Thr Gly Ser Val Gly Arg Gln Val

1               5                   10                  15

Cys Ala Ala Tyr Gln Ala His Gly Trp Asp Val His Gly Val Ala Arg

            20                  25                  30

Arg Pro Ala Pro Tyr Leu Ser Gly Cys Gly Phe Thr Ala Leu Asp Leu

        35                  40                  45

Ala Ala Ala Ala Pro Gly Arg Ile Ala Thr Val Leu Gly Asp Pro Pro

    50                  55                  60

Thr Asp Val Val Val Asn Ala Ala Gly Gly Trp Gly Asp Thr Glu Glu

65                  70                  75                  80

Glu Met Thr Tyr Ser His Leu Arg Leu Val Arg Arg Leu Val Asp Ala

                85                  90                  95

Leu Ala Leu His Pro Phe Arg Thr Arg Leu Val His Leu Gly Ser Val

            100                 105                 110

His Glu Tyr Gly Pro Val Pro Ala Gly Thr Leu Leu Arg Glu Asp Leu

        115                 120                 125

Leu Pro Glu Pro Ile Thr Pro Tyr Ala Arg Val Lys Leu Glu Thr Ser

    130                 135                 140

Ser Ala Val Leu Thr Ala Ala Arg Ala Gly Ile Leu Asp Ala Val Val

145                 150                 155                 160

Met Arg Ala Ala Asn Met Ser Gly Pro His Pro Pro Gln Glu Ser Phe

                165                 170                 175

Leu Ala Ala Leu Met Thr Arg Val Gly Thr Ala Leu Ala Gln Gly Gly

            180                 185                 190

Arg Leu Glu Leu Ser Val Ala Asp Ala Arg Arg Asp Phe Val Asp Val

        195                 200                 205

Arg Asp Val Ala Gln Ala Val Val Arg Ala Gly Gln Ala Ala Ala Val

    210                 215                 220

Gly Gly Leu Val Val Asn Ile Gly Arg Gly Asp Ala Val Pro Ile Gly

225                 230                 235                 240

Asp Leu Val Gly Trp Leu Leu Glu Ala Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg

                245                 250                 255

Val Asp Arg Arg Thr Ala Pro Val Arg Ser Lys Gly Gly Asp Trp Thr

            260                 265                 270

Arg Leu Asp Ile Gly Arg Ala Arg Arg Leu Leu Pro Trp Ala Pro Arg

        275                 280                 285

Ile Gly Met Arg Asp Ser Val His Ser Met Trp Arg Thr Ala His Gly

    290                 295                 300

Ser Pro Ala

305

Claims (10)

1、一种天蓝淡红链霉菌的基因阻断突变菌，其是一种在天蓝淡红链霉菌的柔红霉素生物合成基因dnmV基因核苷酸序列的限制性内切酶位点处插入或替换成抗生素抗性基因，使dnmV基因被阻断的基因阻断工程菌。

2、根据权利要求1所述的基因阻断突变菌，其特征在于该基因阻断突变菌是通过含有在dnmV基因的限制性内切酶位点处插入或替换成抗生素抗性基因的核苷酸序列的表达载体，进行双交换使dnmV基因被阻断的基因阻断工程菌。

3、根据权利要求2所述的基因阻断突变菌，其特征在于所述的天蓝淡红链霉菌为天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482菌株，其dnmV基因具有序列表中SEQ ID No.1所示的第635-1885位核苷酸序列或编码由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

4、根据权利要求3所述的基因阻断突变菌，其特征在于所述的抗生素抗性基因替换了dnmV基因中限制性内切酶KpnI～NotI之间的基因片段。

5、根据权利要求1所述的基因阻断突变菌，其特征在于所述的抗生素抗性基因为安普霉素抗性基因。

6、一种蒽环类抗生素产生工程菌，该工程菌可由下列方法制得：将含有蒽环类抗生素合成基因的表达载体转化变铅青链霉素(S.lividans)TK24，将从S.lividans TK24中提取的表达质粒导入权利要求1-5任一项所述的天蓝淡红链霉菌的基因阻断突变菌。

7、一种蒽环类抗生素产生工程菌，其是一种在权利要求1-5任一项所述的天蓝淡红链霉菌的基因阻断突变菌的抗生素抗性基因处还接有表柔红霉素合成基因的工程菌。

8、根据权利要求7所述的蒽环类抗生素产生工程菌，其特征在于所述的表柔红霉素合成基因为aveBIV基因。

9、根据权利要求6所述的蒽环类抗生素产生工程菌在合成蒽环类抗生素中的应用。

10、根据权利要求7所述的蒽环类抗生素产生工程菌在合成蒽环类抗生素表柔红霉素中的应用。

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