CN101613712B - 提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法及生产菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法及生产菌株，其是将阿维链霉菌中编码麦芽糖转运蛋白的malEFG基因通过表达载体引入阿维链霉菌中获得麦芽糖转运蛋白过表达的重组菌，通过该重组菌过量表达麦芽糖转运系统基因来提高麦芽糖的利用效率，以提高阿维菌素和/或伊维菌素的产量。本发明的基因工程菌可直接用于阿维菌素和/或伊维菌素的发酵生产，提高阿维菌素和/或伊维菌素的发酵单位，降低生产成本。

Description

提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法及生产菌株

技术领域

本发明涉及提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法，具体地说，涉及提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的基因工程方法。

背景技术

阿维菌素(avermectins)是由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵时产生的一组高效杀虫的十六元环大环内酯类抗生素，它的天然产物共有八个组分(A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a，B2b)，其中B1组分的杀虫活性最强，几乎抗所有与农业有关的线虫和节肢动物，被广泛应用于农业生产上。伊维菌素(ivermectin)是以阿维菌素B1为原料在C22-C23位加氢还原而成，与阿维菌素B1具有相同的杀虫活性，但毒性比阿维菌素低2-3倍，更适用于动物体内外寄生虫的防治，是一类广谱有效的新型抗寄生虫抗生素。阿维菌素和伊维菌素具有独特的作用机制，不易使害虫产生抗性，且易降解、无残留，对作物、牲畜、人类和环境高度安全，被我国农业部推荐为无公害农药，具有非常广阔的市场前景和应用价值。阿维菌素和伊维菌素已在国内实现了产业化，取得了巨大的经济和社会效益。但我国阿维菌素的生产菌株还存在着发酵单位低，生产成本高等问题。伊维菌素的生产还是以化学还原法为主，先从阿维链霉菌发酵液中分离提取阿维菌素B1组分，再利用价格昂贵的氯化铑作为催化剂将其还原为伊维菌素，存在生产成本高，重金属污染严重等问题，限制了伊维菌素的进一步推广和应用。通过利用组合生物合成手段对阿维菌素聚酮合酶基因簇进行改造，获得了直接发酵产生伊维菌素的工程菌株，但所得伊维菌素产量很低，离工业化生产还有很大距离。如何提高阿维菌素和伊维菌素的产量，降低生产成本，是一个很重要的课题。因此，通过基因工程手段改造阿维链霉菌以提高阿维菌素和伊维菌素的产量，具有重要的意义和应用价值。

根据文献报道的麦芽糖转运系统基因的功能推测，在阿维链霉菌中，麦芽糖、麦芽糊精等物质的吸收与利用都是通过麦芽糖转运系统(maltose transporter)完成的。负责跨膜运输麦芽糖的麦芽糖转运系统属于ABC家族的转运器，是一种依赖于ATP的跨膜转运系统，由ATP或核苷酸结合结构域和跨膜结构域构成，跨膜结构域为物质的运输提供通道，ATP结合结构域与细胞质相互作用为物质运输提供能量。麦芽糖系统负责有效地分解和利用α-(1-4)糖苷键的葡萄糖聚合物(如麦芽三糖)，可多至7-8个葡萄糖单元。阿维菌素发酵条件优化的研究表明，淀粉是阿维菌素发酵培养基的最佳碳源，而且工业生产中阿维菌素的发酵培养基也主要以淀粉类物质为碳源。淀粉在发酵过程中，先是在淀粉酶的作用下水解，然后主要将麦芽糖运输到细胞内进行代谢。菌体对这些物质的利用和吸收直接影响了抗生素的发酵产量和发酵周期。

由于菌体对淀粉和麦芽糖的利用都是通过麦芽糖转运系统完成的，本发明尝试在阿维链霉菌野生型菌株及其工程菌中过量表达麦芽糖转运系统基因来提高麦芽糖的利用效率，以提高阿维菌素和伊维菌素的产量。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法。

本发明的另一目的是提供高产阿维菌素和/或伊维菌素的基因工程菌。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本发明通过在阿维链霉菌野生型菌株及其工程菌中过量表达麦芽糖转运蛋白MalEFG来提高麦芽糖的利用效率，结果表明，过表达MalEFG能够提高阿维菌素和/或伊维菌素的表达量。

从而，本发明首先提供malEFG基因在提高菌种的阿维菌素和/或伊维菌素表达量中的应用。

前述的应用，即通过在菌种中过表达麦芽糖转运蛋白MalEFG，以提高阿维菌素和/或伊维菌素表达量。这种菌种可以是任何能够产生阿维菌素和/或伊维菌素的链霉菌，例如阿维链霉菌野生菌，或者经基因工程改造后能够产生阿维菌素和/或伊维菌素的菌种。

基于此，本发明提供一种过表达麦芽糖转运蛋白MalEFG的产阿维菌素和/或伊维菌素的基因工程菌。如前所述，其出发菌可以是任何能够产生阿维菌素和/或伊维菌素的链霉菌，例如阿维链霉菌野生菌，或者经基因工程改造后能够产生阿维菌素和/或伊维菌素的菌种。

本发明还提供一种制备上述基因工程菌的方法，包括如下步骤：构建malEFG基因的表达载体，并将该表达载体引入产阿维菌素和/或伊维菌素的菌种中获得MalEFG过表达的重组菌。

具体可通过如下方法构建基因工程菌：用PCR扩增阿维链霉菌中麦芽糖转运蛋白MalEFG的基因malEFG及其自身启动子，构建malEFG基因的多拷贝或整合型表达载体，并将构建好的重组载体转化产阿维菌素和/或伊维菌素菌株，筛选获得阳性重组菌。在本发明实施例中，分别获得了过表达MalEFG的阿维链霉菌野生菌、仅产阿维菌素B组分的阿维链霉菌以及对阿维菌素聚酮合酶进行改造的产伊维菌素的基因工程菌。

前述的方法，其中构建malEFG基因表达载体的出发载体可以是任意一种大肠杆菌-链霉菌穿梭载体。优选多拷贝质粒载体如pKC1139、pKC505、pIJ653、pIJ8154，或整合型质粒载体如pSET152、pIJ8600、pIJ8660。

在本发明实施例中，以pKC1139为出发载体构建了malEFG基因表达载体pME16；以及以pET152为出发载体构建了malEFG基因表达载体pME17。

前述的方法，其中所述将malEFG基因表达载体引入产阿维菌素和/或伊维菌素的菌种中，可以采用生物工程领域中常用的方法，例如PEG介导的原生质体转化法、电转化法、接合转移法等，优选PEG介导的原生质体转化法。

前述的方法，为提高转化效率，可先将malEFG基因表达载体转化到限制修饰作用缺陷的大肠杆菌ET12567中，从中提取质粒再转化到产阿维菌素和/或伊维菌素的菌种中。

本发明提供一种提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法，其利用过表达麦芽糖转运蛋白MalEFG的产阿维菌素和/或伊维菌素的基因工程菌来生产高阿维菌素和/或伊维菌素。

借由上述技术方案，本发明是将阿维链霉菌中编码麦芽糖转运蛋白的malEFG基因通过表达载体引入阿维链霉菌中获得麦芽糖转运蛋白过表达的重组菌，通过该重组菌过量表达麦芽糖转运系统基因来提高麦芽糖的利用效率，以提高阿维菌素和/或伊维菌素的产量，同时可缩短发酵周期，从而降低生产成本。

附图说明

图1A为malEFG基因多拷贝表达载体pME16的质粒图谱；

图1B为malEFG基因整合型表达载体pME17的质粒图谱；

图2A显示的是阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267及其不同转化子的阿维菌素(avermectin)发酵单位；

图2B显示的是阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267及其不同转化子的菌体干重；

图2C显示的是阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267及其不同转化子的发酵液还原糖浓度；

图3显示的是不同淀粉浓度发酵培养基中，阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267及其转化子pME16/31267的阿维菌素发酵单位；

图4A显示的是阿维链霉菌仅产阿维菌素B组分高产菌株GB165及其不同转化子的阿维菌素发酵单位；

图4B显示的是阿维链霉菌仅产阿维菌素B组分高产菌株GB165及其不同转化子的菌体干重；

图5显示的是产伊维菌素基因工程菌OI-31及其不同转化子的伊维菌素产量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 malEFG基因表达载体的构建

一、阿维链霉菌malEFG基因的克隆

根据Genebank公布的阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267中malEFG基因[NC_003155.4(7195314..7198638)]的序列设计合成PCR所需引物：

Primer mal5：5′-AGATCTCGGATGATTCCCGCAACGAAA-3′

Primer mal6：5′-AATTCGAAGAACACGGAGACGGGTA-3′

引物两端分别引入BglII、EcoRI酶切位点(划线部分)，以ATCC31267基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃，5min；(95℃，1min；58℃，1min；72℃，4min)×25个循环；72℃，10min。将PCR产物电泳检测，在3.6kb处有特异性的扩增条带。

二、malEFG表达载体的构建

电泳回收上述3.6kb片段，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，连接于pMD18-T载体(TaKaRa公司)得质粒pME14。测序表明所扩增的片段确实为malEFG基因，且与所公布的序列一致。将质粒pME14用BglII和EcoRI进行酶切，得到3.6kb目的片段，电泳回收该片段，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与经BamHI和EcoRI双酶切的载体pSET152(Bierman M，Logan R，O’Brien K，等.用于从大肠杆菌到链霉菌DNA接合转移的质粒克隆载体.基因，1992，116：43-49)相连接，得到整合型表达载体pME17。同时将上述所得质粒pME14经BglII和EcoRI酶切，电泳回收3.6kb目的片段，与经BamHI和EcoRI双酶切的载体pKC1139(参考文献同pSET152)相连接，得到多拷贝表达载体pME16。pME16和pME17的质粒图谱请参阅图1A和图1B所示。

实施例2重组质粒的转化

通过实施例1一共构建了两种malEFG基因的表达质粒载体，分别为pME16和pME17，作为对照的原始质粒分别为pKC1139和pSET152。

由于阿维链霉菌中存在很强的限制修饰作用，用提自E.coliDH5α的质粒直接转化阿维链霉菌，转化效率极低，有时甚至得不到转化子。而用来自没有限制修饰作用的受体菌E.coli ET12567的质粒，其转化效率明显提高。因此，将构建好的重组质粒以及对照质粒先分别转化到E.coli ET12567(Kieser T，Bibb M J，Buttner M J，等.实用链霉菌遗传手册，2000，Norwich：约翰英纳斯基金会)中以获得非甲基化的DNA，然后再用非甲基化的质粒DNA转化阿维链霉菌的原生质体。

本实施例选用了三种不同的阿维链霉菌菌株做出发菌株：ATCC31267、GB-165和OI-31。ATCC31267是阿维链霉菌野生型菌株，产灰色孢子；GB-165(蔡玉娟.产绿孢子阿维链霉菌遗传改造和发酵条件的研究.硕士学位论文，2006，北京：中国农业大学)是经诱变和基因工程手段得到的仅产阿维菌素B组分的阿维链霉菌菌株，产绿色孢子；OI-31(Li M，Chen Z，Lin X P，等.提高阿维链霉菌中伊维菌素产量的阿维菌素生物合成基因技术.生物有机与药物化学快报，2008，18：5359-63)是利用组合生物合成技术对阿维菌素聚酮合酶进行改造，所构建的产伊维菌素基因工程菌。制备这三种阿维链霉菌菌株的原生质体，用从E.coli ET12567中提取的质粒转化原生质体，涂于已吹干的不加抗生素的RM14平板上，28℃培养12-28h后，在平板上涂1mL含1000-1500μg安普霉素的水溶液，在28℃继续培养7-12天，长出的菌落即为转化子。由于阿维链霉菌的转化子在RM14再生培养基上不产孢，故各挑取三个转化子，接种于含10-15μg/mL安普霉素的YMS平板上，28℃培养7-10天恢复产孢。转化子经质粒提取及PCR验证正确后，进行下一步的发酵研究。

本实施例中大肠杆菌的转化、阿维链霉菌原生质体的制备及转化方法、RM14及YMS培养基的配制参见蔡玉娟的硕士论文(蔡玉娟.产绿孢子阿维链霉菌遗传改造和发酵条件的研究.硕士学位论文，2006，北京：中国农业大学)。

实施例3阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267及其转化子的发酵研究

一、阿维链霉菌的摇瓶发酵

种子培养基：可溶性淀粉30g，麦芽膏2g，大豆蛋白胨2g，CoCl₂·6H₂O 5mg，加蒸馏水至1L，调pH至7.0-7.2。

发酵培养基：可溶性淀粉50g，酵母粉12g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，KCl 4g；CaCO₃2g，CoCl₂·6H₂O 5mg，加蒸馏水至1L，调pH至7.0-7.2。

二、发酵产物的HPLC分析

1.样品处理：取1.0mL发酵液，加入4.0mL甲醇，浸泡30分钟以上，每隔10分钟振荡一次，4000rpm离心10分钟，取上清液进样分析；

2.HPLC分析条件：C₁₈反相柱，柱长150mm，柱内径4.6mm，柱温40℃，流动相为甲醇∶水(85∶15)，流速1.0mL/min，进样体积10μL，波长为246nm。

三、菌体干重的测定

将50ml发酵液过滤，菌体以蒸馏水洗净，烘干至恒重，称菌体干重。

四、ATCC31267及其不同转化子的发酵结果

阿维链霉菌野生型菌株ATCC31267及其转化子在YMS培养基上长出丰富的孢子后接种于种子培养基(装量为100mL/500mL三角瓶)中，28℃摇床培养24小时(转速180rpm，偏心距2.5cm)。按5％接种量接种于发酵培养基(装量为50mL/300mL三角瓶)中，28℃培养10天(转速250rpm，偏心距2.5cm)，放瓶，用甲醇提取-HPLC法测定阿维菌素的发酵单位，结果请参阅图2A所示，将菌体烘干称取菌体干重，结果请参阅图2B所示，用3，5-二硝基水杨酸法测定发酵液中还原糖的含量，结果请参阅图2C所示。

图2A、图2B和图2C的发酵结果显示，malEFG过量表达的转化子与出发菌株相比，菌体干重都没有明显变化。对照质粒pKC1139和pSET152的转化对阿维菌素的产量影响不大，而含有malEFG表达载体的ATCC31267转化子的阿维菌素发酵单位与出发菌株相比均明显增加，含多拷贝表达载体的转化子pME16/31267阿维菌素的产量提高了3.2倍，含整合型表达载体的转化子pME17/31267阿维菌素的产量提高了3倍。可见，多拷贝的malEFG基因对阿维菌素合成的促进作用更加显著。同时malEFG过量表达的转化子发酵液中还原糖含量较出发菌株有明显下降，其中转化子pME16/31267发酵液中还原糖的浓度降低了28％，转化子pME17/31267发酵液中还原糖的浓度降低了26％。

以上结果表明，malEFG过表达菌株中阿维菌素产量的提高并不是由于菌体生物量的提高导致的，而是由于malEFG基因的过表达提高了菌体对培养基中糖的利用能力，从而为阿维菌素的合成提供更多的前体。

五、ATCC31267及其转化子pME16/31267在不同淀粉浓度的发酵培养基中的发酵结果

分别在淀粉浓度为70g/L、90g/L、110g/L、130g/L的发酵培养基中，对pME16/31267和出发菌株ATCC31267进行培养，每天取样测定发酵液中阿维菌素的产量，结果如图3所示。转化子与出发菌株相比，在不同淀粉浓度下阿维菌素的产量均有所提高，发酵9天后，在淀粉浓度为70g/L和90g/L的条件下阿维菌素产量提高了70％，110g/L条件下产量提高了1倍，130g/L条件下产量提高了90％。同时发现，在110g/L和130g/L的高浓度淀粉条件下，转化子中阿维菌素的产生时间提前，于发酵第2天便产生阿维菌素，可缩短发酵周期。

实施例4阿维链霉菌GB165及其转化子的发酵研究

摇瓶发酵及HPLC分析方法同实施例1，不同之处在于所用的发酵培养基为发酵培养基G：可溶性淀粉95g，花生蛋白粉25g，棉籽蛋白7g，麦芽糖3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CoCl₂·6H₂O 7.5mg，(NH₄)₂SO₄ 0.1g，CaCO₃ 1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.3g，ZnSO₄·7H₂O 2mg，加蒸馏水至1L，调pH至7.0-7.2。

从图4A和图4B的发酵结果可以看出，malEFG的过量表达对阿维菌素高产菌株GB165的菌体干重也没有影响。malEFG基因在GB-165中的过量表达同样可以促进阿维菌素的合成，转化子pME16/GB165中阿维菌素的产量提高了60％，pME17/GB165中阿维菌素的产量提高了40％，但提高的幅度都没有野生型菌株高。推测可能由于GB165是经长期诱变得到的高产菌株，其基因组内发生了许多突变，对麦芽糖的利用效率已经有所提高，因此额外的malEFG并不能引起阿维菌素合成的大幅度提高。

实施例5产伊维菌素基因工程菌OI-31及其转化子的发酵研究

摇瓶发酵及HPLC分析方法同实施例1，图5的发酵结果表明，malEFG过表达也可显著促进工程菌中伊维菌素的合成，与出发菌株相比，转化子pME16/OI-31伊维菌素的产量提高了3.3倍，转化子pME17/OI-31伊维菌素的产量提高了2.5倍。同样是多拷贝的malEFG基因对伊维菌素合成的促进作用优于低拷贝的malEFG基因。

实施例6工程菌株的稳定性考察

将所构建的malEFG基因过表达的工程菌株分别在YMS斜面上连续转接五次，发现所得菌株与出发菌株在形态特征和培养特征上相同，生长状态良好，性状稳定。经转接五次后的各个工程菌株再进行摇瓶发酵，HPLC检验阿维菌素或伊维菌素产量均未发生明显变化，说明所构建的工程菌是稳定的。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

                  序列表

<110>中国农业大学

<120>提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法及生产菌株

<130>KHP09112773.0

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

agatctcgga tgattcccgc aacgaaa    27

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aattcgaaga acacggagac gggta      25

Claims (7)

1.malEFG基因在提高阿维链霉菌的阿维菌素和/或伊维菌素表达量中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于通过在阿维链霉菌中过表达麦芽糖转运蛋白MalEFG，以提高阿维菌素和/或伊维菌素表达量。

3.一种过表达麦芽糖转运蛋白MalEFG的产阿维菌素和/或伊维菌素的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的制备方法为：构建malEFG基因的表达载体，并将该表达载体引入产阿维菌素和/或伊维菌素的阿维链霉菌中获得MalEFG过表达的重组菌。

4.一种制备权利要求3所述基因工程菌的方法，其包括如下步骤：构建malEFG基因的表达载体，并将该表达载体引入产阿维菌素和/或伊维菌素的阿维链霉菌中获得MalEFG过表达的重组菌。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于构建malEFG基因表达载体的出发载体为任意一种大肠杆菌-链霉菌穿梭载体。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述穿梭载体为：多拷贝质粒载体pKC1139、pKC505、pIJ653、pIJ8154，或整合型质粒载体pSET152、pIJ8600、pIJ8660。

7.一种提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法，其利用权利要求3所述的基因工程菌来生产阿维菌素和/或伊维菌素。

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