CN103834605A - 一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用。具体地，对野生型的阿维菌素产生菌中的aveD基因进行失活，可以获得消除A组分，只产生B组分的菌株；对aveD基因和aveC基因同时失活，并在此基础上回补aveC的同源基因（优选梅岭霉素生物合成基因簇中的meiC基因），获得的突变体发酵产物中95wt%以上都为阿维菌素B2a。将产物阿维菌素B2a作为前体，可以直接用于大量合成高纯度的阿维菌素B1a和伊维菌素。

Description

一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用。
背景技术
阿维菌素(Avermectin)是一种由革兰氏阳性菌除虫链霉菌(Streptomycesavermectinius)产生的一类十六元大环内酯类抗生素。阿维菌素是一种高效，无公害的生物农药，具有广谱的杀虫抗螨活性，并且阿维菌素对人畜毒副作用低，体内残留低，这些特点使得阿维菌素在家畜寄生虫感染的治疗和农业病虫害防治方面均有广泛的应用，是生产绿色食品的最佳用药。
通常，在阿维菌素发酵过程中，产生Ａ组分（Ａ1a和Ａ2a等）和Ｂ组分（B1a和B2a等）(见图1)，以B1a组分为最有效成份，而B2a组份通常用作合成另外一种生物农药伊维菌素的前体。以阿维菌素为前体半合成的衍生物依维菌素（Ivermectin）和多拉菌素(Doramectin)具有更高的应用价值，前者将B1a的22为和23位双键换为单键，后者则将B1a的25位的侧链基团换为环己基。
目前阿维菌素和伊维菌素生产上需要从天然发酵产物中加以提纯，处理过程非常复杂，得率低，还需要使用甲苯等有毒溶剂。此外，尚没有发酵产物只有B2a组分的菌株。
因此本领域迫切需要开发高产的发酵组份明确单一的阿维菌素产生菌。
发明内容
本发明的目的就是提供一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用。
在本发明的第一方面，提供了一种阿维菌素产生菌，所述的产生菌的发酵产物中，阿维菌素B2a组分的相对含量满足式I：
B/A≥35%
式I
其中，
B为发酵产物中阿维菌素B2a组分的质量；
A为发酵产物中所有阿维菌素组分总的质量。
在另一优选例中，B/A≥40%，更佳地≥50%，更佳地≥60%，更佳地≥70%，更佳地≥80%，更佳地≥90%，更佳地≥95%，最佳地≥99%。
在另一优选例中，所述的阿维菌素产生菌为链霉菌属。
在另一优选例中，所述的阿维菌素产生菌为除虫链霉菌(Streptomycesavermectinius)。
在另一优选例中，所述产生菌的基因组中的aveD基因被失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因、或不表达AveD蛋白、或表达的AveD蛋白无功能。
在另一优选例中，所述AveD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在另一优选例中，所述产生菌的基因组中aveC基因被失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失；或不表达aveC基因、或不表达AveC蛋白、或AveC蛋白无功能；并且，所述产生菌的基因组中含有或表达aveC的同源基因；或所述产生菌中表达AveC蛋白的同源蛋白。
在另一优选例中，所述AveC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在另一优选例中，所述aveC的同源基因选自下组：美贝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克马丁（nemadectin）生物合成基因nemC，梅岭霉素（meilingmycin）生物合成基因meiC。
在另一优选例中，所述的aveC的同源基因为梅岭霉素（meilingmycin）生物合成基因meiC。
在另一优选例中，所述的milC基因来源于冰城链霉菌(Streptomycesbingchenggensis)。
在另一优选例中，所述的nemC基因来源于蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseus)。
在另一优选例中，所述的meiC基因来源于南昌链霉菌Streptomycesnanchangensis。
在另一优选例中，梅岭霉素（meilingmycin）生物合成基因meiC编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：3所示。
在另一优选例中，所述的阿维菌素产生菌是除虫链霉菌（Streptomycesavermectinius）mVL1003，保藏编号为GCMCC No.6678。
在本发明的第二方面，提供了第一方面所述的阿维菌素产生菌的用途它被用做发酵生产阿维菌素B2a组分的工程菌。
在本发明的第三方面，提供了一种制备阿维菌素B2a组分的方法，包括步骤：
(a)培养第一方面所述的阿维菌素产生菌，从而获得含有阿维菌素B2a的发酵产物；和
(b)从发酵产物中分离出所述的阿维菌素B2a组分。
在本发明的第四方面，提供了一种生产阿维菌素B1a组分的方法，包括步骤：
(a)培养第一方面所述的阿维菌素产生菌，从而获得含有阿维菌素B2a组分的发酵产物；
(b)从发酵产物中分离出所述的阿维菌素B2a组分；和
(c)将分离的阿维菌素B2a转化为阿维菌素B1a组分。
在另一优选例中，步骤(c)所述转化是将B2a组分高温水解，从而获得B1a组分。
在本发明的第五方面，提供了一种生产伊维菌素的方法，包括步骤：
(a)培养第一方面所述的阿维菌素产生菌，从而获得含有阿维菌素B2a组分的发酵产物；
(b)从发酵产物中分离出所述的阿维菌素B2a组分；和
(c)将分离的阿维菌素B2a组分转化为伊维菌素。
在另一优选例中，步骤(c)所述转化是用三-正-丁基氢化锡对阿维菌素B2a进行还原和脱保护，获得伊维菌素。
在本发明的第六方面，提供了一种制备阿维菌素产生菌的方法，包括步骤：
(1)对生产伊维菌素的出发菌进行aveD基因和或AveD蛋白的遗传改造，从而获得基因组中aveD基因失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因、或不表达AveD蛋白、或表达的AveD蛋白无功能的阿维菌素产生菌；
并且，在所述生产伊维菌素的出发菌的发酵产物中，阿维菌素B2a组分的相对含量满足式II：
B/A＜35%
式II
其中，
B为发酵产物中阿维菌素B2a组分的质量；
A为发酵产物中所有阿维菌素组分总的质量。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
(2)对步骤(1)获得的菌株，对aveC基因和或AveC蛋白进行进一步的遗传改造，从而获得基因组中aveC基因失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失、或不表达aveC基因、或不表达AveC蛋白、或表达的AveC蛋白无功能的阿维菌素产生菌；以及
(3)对步骤(2)获得的菌株，回补aveC的同源基因或AveC同源蛋白。
在本发明的第七方面，提供了一种基因组合，所述的基因组合与出发（或原始）的生产伊维菌素的基因组合相比，具有选自下组的一个或多个特征：
(1)所述基因组合中，aveD基因被失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因；或
(2)所述基因组合中，aveC基因被失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失；或不表达aveC基因；并且，含有或表达aveC的同源基因。
在本发明的第七方面，提供了一种载体，所述的载体上整合有第六方面所述的基因组合。
在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有第七方面所述的载体，或所述的宿主细胞整合有第六方面所述的基因组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了阿维菌素8个组分的化学结构。
图2显示了不同菌株发酵产物HPLC分析结果；I为出发菌株发酵产物HPLC分析结果；II为aveD失活的突变株mVL1001发酵产物HPLC分析结果，只产生阿维菌素B组分；III显示，在mVL1001进行aveC失活后突变株mVL1002的发酵产物HPLC分析结果，完全不产阿维B1a组分，仅产生微量的B2a组分；IV显示，在mVL1002中异源回补meiC得到的突变株mVL1003发酵产物HPLC分析结果，只产生阿维菌素B2a单一组分。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次提供了一种高产阿维菌素B2a组分的阿维菌素产生菌及其制备和应用。具体地，对野生型的阿维菌素产生菌中的aveD基因进行失活，可以获得消除A组分，只产生B组分的菌株，从而大幅度提高发酵产物中B2a组分的含量；aveD基因和aveC基因同时失活，并在此基础上回补aveC的同源基因（梅岭霉素生物合成基因簇中的meiC基因），突变体发酵产物中95wt%以上都为阿维菌素B2a。将产物阿维菌素B2a作为合成前体，可以直接用于高纯度阿维菌素B1a和伊维菌素的合成。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如，“90%以上“指≥90%，“0.2%以下”指≤0.2%。
术语“不含/不产生阿维菌素A或B1a组分”或“基本上不含/不产生阿维菌素A或B1a组分”可互换使用，指发酵产物中阿维菌素A或B1a组分的含量≤0.1wt%，较佳地≤0.01wt%，更佳地≤0.005wt%(如0wt%)。
菌株
如本文所用，术语“本发明出发菌株”、“本发明野生菌株”或“本发明出发微生物”可以互换使用，都是指除虫链霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267。
本发明的出发菌株来自于美国模式培养物集存库(American type culturecollection，ATCC)，编号为ATCC31267。
用于本发明的出发菌株不仅包括除虫链霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267，还包括其衍生菌株及其他生产阿维菌素的菌株。
菌种保藏
本发明的除虫链霉菌（Streptomyces avermectinius）mVL1003，于2012年10月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.6678。
引物
如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。
引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
构建重组质粒
根据本文所述的基因簇及其外部两端的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的同源重组序列。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。
所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
本发明还提供了一种穿梭质粒载体。在本发明的一个优选例中，穿梭质粒载体可以为用作基因敲除的pKC1139和用作表达的pSET152质粒。根据已知载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组载体。
转化
将含有所述编码序列的载体导入宿主细胞，可采用本领域的多种已知技术，包括但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，复制本发明的基因序列。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
本发明还提供了一种宿主细胞，其中含有本发明的编码序列。所述的宿主细胞优选的是原核细胞，一个适用于本发明的宿主细胞为宿主甲基化修饰缺失的大肠杆菌E.coli ET12567。
同源重组
同源重组(Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体(non-sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构(Holiday JunctureStructure)。同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性。
同源重组可以用于基因敲除。基因敲除的技术路线如下：
(1)构建重组基因载体﹔
(2)将重组DNA转入受体细胞核内﹔
(3)用选择培养基筛选已发生重组的细胞。
在哺乳动物中，还包括步骤(4)：将已发生重组的细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，还可以对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。
制备本发明的阿维菌素产生菌
本发明提供了一种制备阿维菌素产生菌的方法，包括步骤：
(1)对生产伊维菌素的出发菌进行aveD基因和或AveD蛋白的遗传改造，从而获得基因组中aveD基因失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因、或不表达AveD蛋白、或表达的AveD蛋白无功能的阿维菌素产生菌；并且，在所述生产伊维菌素的出发菌的发酵产物中，阿维菌素B2a组分的相对含量满足式II：
B/A＜35%
式II
其中，
B为发酵产物中阿维菌素B2a组分的质量；
A为发酵产物中所有阿维菌素组分总的质量。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
(2)对步骤(1)获得的菌株，对aveC基因和或AveC蛋白进行进一步的遗传改造，从而获得基因组中aveC基因失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失、或不表达aveC基因、或不表达AveC蛋白、或表达的AveC蛋白无功能的阿维菌素产生菌；以及
(3)对步骤(2)获得的菌株，回补aveC的同源基因或AveC同源蛋白。
在本发明的一个优选例中，具体地，所述方法包括步骤：
(1)构建用于同源重组的载体，所述载体依次含有通过0-2000bp碱基相互连接的、分别含有位于aveD上游和下游的同源臂序列；
(2)将步骤(1)的所述载体导入作为出发菌株，获得导入载体的菌株，其中所述的出发菌株可发酵主要产生阿维菌素A1a，A2a，B1a，B2a组分；
(3)从步骤(2)获得的菌株中，筛选所述上游同源臂序列和下游同源臂序列与出发菌株的基因组发生了二次同源重组的菌株，从而获得只产生B1a和B2a组分的阿维菌素产生菌；
(4)构建用于同源重组的载体，所述载体依次含有通过0-2000bp碱基相互连接的、分别含有位于aveC上游和下游的同源臂序列；
(5)将步骤(4)的所述载体导入步骤（3）获得的菌株，其中所述的步骤（3）获得的菌株可发酵产生阿维菌素B1a，B2a组分；
(6)从步骤(5)获得的菌株中，筛选所述上游同源臂序列和下游同源臂序列与出发菌株的基因组发生了二次同源重组的菌株；
(7)构建用于表达aveC同源基因的载体，所述载体依次含有红霉素启动子、完整的aveC同源基因片段；
(8)将步骤(7)的所述载体导入步骤（6）获得的菌株；获得只产生B2a组分的阿维菌素产生菌。
在另一优选例中，步骤(7)所述aveC同源基因选自：美贝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克马丁（nemadectin）生物合成基因nemC，梅岭霉素（meilingmycin）生物合成基因meiC。
在另一优选例中，步骤(3)之后还包括步骤：验证阿维菌素产生菌aveD基因是否发生点突变。
在另一优选例中，步骤(6)之后还包括步骤：验证阿维菌素产生菌aveC基因是否缺失。
在另一优选例中，步骤(1)、(4)所述同源臂序列是用PCR扩增的方法获得的。
在另一优选例中，步骤(7)所述完整的aveC同源基因片段是用PCR扩增的方法获得的。
在另一优选例中，步骤(1)、(4)所述同源臂序列的长度没有特别限制，较佳地≥15000bp。
在另一优选例中，步骤(1)、(4)、(7)所述载体为穿梭质粒，较佳地为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒。
在另一优选例中，步骤(1)、(4)、(7)所述载体还含有抗生素抗性基因，较佳地为阿伯拉霉素抗性基因。
在另一优选例中，步骤(2)、(5)、(8)所述的导入方法链霉菌DNA导入法，较佳的为接合转移导入法。
在另一优选例中，步骤(2)所述的出发菌株为链霉菌属，较佳地为除虫链霉菌。
基因组合
本发明还提供了一种基因组合，所述的基因组合与出发（或原始）的生产伊维菌素的基因组合相比，具有选自下组的一个或多个特征：
(1)所述基因组合中，aveD基因被失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因；或
(2)所述基因组合中，aveC基因被失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失；或不表达aveC基因；并且，含有或表达aveC的同源基因。
本发明还提供了一种载体，所述的载体上整合有上述的基因组合。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有上述载体，或所述的宿主细胞整合有上述基因组合。
在另一优选例中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌或链霉菌，较佳地为链霉菌，最佳的为除虫链霉菌。
发酵生产阿维菌素B2a
本发明的菌株可用于通过生物法制备阿维菌素B2a或其盐或其衍生物。其中，所述的盐包括(但并不限于)：盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐、醋酸盐，柠檬酸盐、其他有机羧酸盐等。
所述的阿维菌素B2a衍生物包括(但并不限于)：伊维菌素、多拉菌素等。
本发明的发酵生产阿维菌素B2a生产方法，除了生产菌不同之外，其他条件与现有技术中发酵生产的方法基本相同，例如对阿维菌素B粗品的纯化工艺。本发明菌株的发酵条件与一般的链霉菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培养基中，在pH5.0-9.0(较佳地pH7.0-7.5)和20-45℃(较佳地25-40℃)发酵。在本发明中，“菌丝体”、“发酵液”或“培养液”可通过在适合生长的条件下培养本发明菌株，使其生长至一定的菌丝体浓度来获得。用于培养本发明菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其他营养源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、黄豆饼粉、肉膏、蛋白粉、麦皮、米糖、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其他有机物或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐(如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等)、硫酸锰、硫酸铵、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等对本菌株进行斜面固体培养并4℃环境下进行初步保藏。在一个具体实施方案中，用于培养本发明菌株的培养基具有以下组成(%表示质量/体积)：黄豆饼粉2%，D-甘露醇2%，琼脂2%。
然而，本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于本文中列举的这些具体培养基配方。
培养本发明中的菌株的温度、pH、气液比、罐压、转速等条件没有特别严格的限制，只要该条件适合该菌的生长即可。在一些较佳的实施方案中，pH宜控制在6.5～8.0之间，培养温度宜在25～40℃之间。应理解，本发明的发酵可以是连续发酵，也可以是间歇式发酵。在本发明的一个较佳的实施方案中，通过以下方法培养得到发酵液和菌丝体：MS固体培养基（黄豆饼粉2%，D-甘露醇2%，琼脂2%）上30℃培养7天。切下约1cm2的含孢子和菌丝的琼脂块接入一级发酵培养基（玉米淀粉3%、豆粕粉0.8%、花生饼粉1%、酵母浸提物0.4%、淀粉酶4μ/g淀粉），30℃、200rpm培养48小时。按10%体积的接种量将种子培养液接入发酵培养基(玉米淀粉14%，豆粕粉2%，酵母粉1%，钼酸钠0.22%，硫酸铵0.5%)，30℃、200rpm，培养8天。
本发明的主要优点包括：
(1)用本发明方法进行遗传改造的菌株性能重现性好，经改造的阿维菌素产生菌遗传稳定，不易突变，发酵产物中不再产生阿维菌素A和B1a组分，95wt%以上产物为阿维菌素B2a；
(2)将产物阿维菌素B2a作为前体，可以合成高纯度阿维菌素B1a和伊维菌素，极大地简化了伊维菌素的生产工艺，提高了生产效率，显著降低了生产成本；
(3)本发明经基因工程修饰后的基因工程菌发酵组份明确单一，后提取工艺中不再利用甲苯等有毒溶剂，极大地改善了劳动条件和生产的安全性；减少了其他组份作为废弃物被放弃导致的生物量的浪费和由此导致的环境污染；
(4)由于阿维菌素组份的纯化，由此生产出来的生物农药含有低效结构类似杂质物的减少，施药过程中能极大地延缓昆虫耐药性的产生。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
阿维菌素生物合成基因aveD失活（aveD点突变）菌株的构建
1.构建用于aveD点突变的重组质粒
PCR克隆阿维菌素生物合成基因簇中aveD基因上游DNA片段的引物序列如下：
引物1：5’-TAT GAA TTC CCT CGT CGA GGT GGC CGA G-3’(下划线为EcoRI位点)(SEQ ID NO：4)
引物2：5’-TTA AAG CTT ACC GCA GCC GAC GTC CAG G-3’(下划线为HindIII)(SEQ ID NO：5)
PCR克隆阿维菌素生物合成基因簇中aveD基因下游DNA片段的引物序列如下：
引物3：5’-TTA AAG CTT AAG CCG GCG GTG CGG CTC G-3’(下划线为HindIII)(SEQ ID NO：6)
引物4：5’-TTA TCT AGA TCC TCA CCC TTT CCC CCG GC-3’(下划线为XbaI)(SEQ ID NO：7)
以抽提的阿维菌素产生菌除虫链霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267的总DNA为模板，分别用上述两组特异性引物对阿维菌素生物合成基因aveD的上下游序列进行PCR扩增，获得基因簇上游的2.0kb的扩增片段与下游的1.8kb的扩增片段。将这两个片段分别进行EcoRI-HindIII和HindIII-XbaI酶切后，连入市售的pKC1139(一种温度敏感的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，US5，955，319)的EcoRI-XbaI位点，从而获得aveD点突变的重组质粒pVL1001。将aveD保守DxGxGxG区域中的第79位甘氨酸（Gly）突变为亮氨酸（Leu），同时将第78位的丝氨酸（Ser）突变为赖氨酸（Lys），从而形成HindIII位点。
将重组质粒pVL1001转化常规的大肠杆菌E.coli DH5α，挑取单克隆菌落于LB培养液(含有阿伯拉霉素抗生素100μg/ml)中培养过夜，至菌液较浓。提取重组质粒，经酶切验证后，进行商业测序，结果证明，重组穿梭质粒构建正确。
2.aveD点突变突变株mVL1001的构建和筛选
将验证正确的质粒pVL1001转化入常规的甲基化修饰缺失的大肠杆菌E.coli E T12567(参见US7，326，782和US7，105，491)，通过接合转移的方法，将质粒pVL1001导入阿维菌素产生菌Streptomyces avermectiniusATCC31267中。
选出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，将接合子置于37℃生长，使质粒pVL1001中的aveD基因上游或下游片段与染色体上的同源片段发生一次同源重组，然后将37℃生长良好的结合子接入不含任何抗生素的TSB液体培养基(培养基购自Sigma-Aldrich公司)中，在30℃下培养两天后取少量菌液重新接种入无抗生素的TSB液体培养基中，如此重复2轮之后，将菌液在MS固体培养基上划线，挑选丧失阿伯拉霉素抗性的单菌落。
由于在无抗生素条件下培养，导入链霉菌的质粒中约3-5%会与基因组发生二次同源重组，从而丧失阿伯拉霉素抗性。对于选出的丧失阿伯拉霉素抗性的单菌落，抽提DNA，用PCR产物进行酶切的方法确定基因型。
使用的引物为：
引物5：5’-CCC CGC CGT CCA TCC TCT G-3’(SEQ ID NO：8)；
引物6：5’-TAC CGC GGC CGC ACT CAC G-3’(SEQ ID NO：9)；
野生型的2.01kb PCR产物不能被HindIII酶切，而正确的aveD点突变突变株的2.01kb PCR产物能被HindIII酶切成0.59kb和1.42kb，经PCR产物酶切和测序鉴定，发明人成功构建了正确aveD基因点突变的基因工程改造菌株，命名为mVL1001。
实施例2
阿维菌素生物合成基因aveC aveD双突变菌株的构建
1.构建aveC同框敲除的质粒
PCR克隆阿维菌素生物合成基因簇中aveC基因上游DNA片段的引物序列如下：
引物7：5’-TTA GAA TTC CAT CAC GCT GCT GGA CTT CG-3’(下划线为EcoRI位点)(SEQ ID NO：10)
引物8：5’-ACG CCT GCA GGG CCA GAA ACA G-3’(下划线为PstI)(SEQ ID NO：11)
PCR克隆阿维菌素生物合成基因簇中aveC基因下游DNA片段的引物序列如下：
引物9：5’-TAT CTG CAG GTG AAT GCC GTG ATG TTC CTC-3’(下划线为PstI)(SEQ ID NO：12)
引物10：5’-TAT TCT AGA TGC TCT CCT CCA CCA CAT CCT C-3’(下划线为XbaI)(SEQ ID NO：13)
以抽提的阿维菌素产生菌除虫链霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267的总DNA为模板，分别用上述两组特异性引物对阿维菌素生物合成基因aveC的上下游序列进行PCR扩增，获得基因簇上游的1.87kb的扩增片段与下游的1.9kb的扩增片段。将这两个片段分别进行EcoRI-PstI和PstI-XbaI酶切后，连入pKC1139(一种温度敏感的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，US5，955，319)的EcoRI-XbaI位点，从而获得aveC同框敲除的重组质粒pVL1002。其中aveC同框缺失756bp。
将重组质粒pVL1002转化常规的大肠杆菌E.coli DH5α，挑取单克隆菌落于LB培养液(含有阿伯拉霉素抗生素100μg/ml)中培养过夜，至菌液较浓。提取重组质粒，经酶切验证后，进行商业测序，结果证明，重组穿梭质粒构建正确。
2.aveC同框敲除突变株mVL1002的构建和筛选
将验证正确的质粒pVL1002转化入常规的甲基化修饰缺失的大肠杆菌E.coli ET12567(可参见US7，326，782和US7，105，491)，通过接合转移的方法，将质粒pVL1002导入按照实施例1构建的aveD点突变的菌株mVL1001中。选出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，将接合子置于37℃生长，使质粒pVL1002中的aveC基因上游或下游片段与染色体上的同源片段发生一次同源重组，然后将37℃生长良好的结合子接入不含任何抗生素的TSB液体培养基(购自Sigma-Aldrich公司)中，在30℃下培养两天后取少量菌液重新接种入无抗生素的TSB液体培养基中，如此重复2轮之后，将菌液在MS固体培养基上划线，挑选丧失阿伯拉霉素抗性的单菌落。
由于在无抗生素条件下培养，导入链霉菌的质粒中约3-5%会与基因组发生二次同源重组，从而丧失阿伯拉霉素抗性。对于选出的丧失阿伯拉霉素抗性的单菌落，抽提DNA，用PCR的方法确定基因型。
引物11：5’-CCC CGC CGT CCA TCC TCT G-3’(SEQ ID NO：14)；
引物12：5’-TAC CGC GGC CGC ACT CAC G-3’(SEQ ID NO：15)；
出发菌株aveD点突变的突变株得到1.19kb PCR产物，而正确的aveCaveD双突变菌株得到0.43kb PCR产物。PCR产物经测序鉴定，发明人成功构建了正确aveCaveD基因双突变的基因工程改造菌株，命名为mVL1002。
实施例3
meiC异源回补菌株的构建
1.构建meiC异源回补的质粒
PCR克隆梅岭霉素生物合成基因meiC的引物序列如下：
引物13：5’-TAT GGA TCC CTG CGC AAT AGG CTC ACC AC-3’(下划线为BamHI位点)(SEQ ID NO：16)
引物14：5’-TAT TCT AGA CGG GAG GTG TCT ACA AGT GC-3’(下划线为XbaI位点)(SEQ ID NO：17)
以抽提的梅岭霉素产生菌南昌链霉菌Streptomyces nanchangensis的总DNA为模板，用上述一对特异性引物对梅岭霉素生物合成基因meiC的进行PCR扩增，获得1.7kb包含完整meiC基因片段的PCR产物。将PCR产物进行BamH-XbaI酶切后，连入常规市售的含有红霉素启动的pSET152(一种整合型的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，可参见US1，171，583)的BamH-XbaI位点，从而获得用于meiC异源回补的重组质粒pVL1003。
将重组质粒pVL1003转化常规的大肠杆菌E.coli DH5α，挑取单克隆菌落于LB培养液(含有阿伯拉霉素抗生素100μg/ml)中培养过夜，至菌液较浓。提取重组质粒，经酶切验证后，测序结果证明，重组穿梭质粒构建正确。
2.meiC异源回补菌株mVL1003的构建和筛选
将验证正确的质粒pVL1003转化入常规的甲基化修饰缺失的大肠杆菌E.coli ET12567(参见US7，326，782和US7，105，491)，通过接合转移的方法，将质粒pVL1003导入按照实施例2构建的aveCaveD双突变的菌株mVL1001中。选出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，将接合子置于30℃生长，即获得meiC异源回补的基因工程菌株，命名为mVL1003。
除虫链霉菌（Streptomyces avermectinius）mVL1003，于2012年10月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国北京市)，保藏号为CGMCC No.6678。
实施例4
重组菌株的发酵及检测
1.种子活化及培养
将-80℃保存的重组菌株mVL1001、mVL1002和mVL1003的孢子涂布在MS固体培养基（黄豆饼粉2%，D-甘露醇2%，琼脂2%）上，30℃培养7天。切下约1cm2的含孢子和菌丝的琼脂块接入一级发酵培养基(玉米淀粉3%、豆粕粉0.8%、花生饼粉1%、酵母浸提物0.4%、淀粉酶4μ/g淀粉)，30℃、200rpm培养48小时，获得用于下一步实验的种子培养液。
2.扩大培养
按10%体积的接种量将种子培养液接入发酵培养基(玉米淀粉14%，豆粕粉2%，酵母粉1%，钼酸钠0.22%，硫酸铵0.5%)，30℃、200rpm，培养8天。收获发酵液，得到含有阿维菌素B2a的粗产物。低温保存，用于产量检测。
3.发酵产物检测
检测产物准备：发酵液加入4倍体积的甲醇浸泡，超声15分钟，离心取上清，将甲醇稀释3倍以后用于HPLC和LC-MS检测。
HPLC和LC-MS分析检测条件：
仪器：Agilent 1100HPLC系统；
柱子：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6x250mm)；
检测波长：UV=245nm；
流速：1ml/min；
流动相：A=H2O；B=甲醇；
采用85%B/15％A恒梯度洗脱条件为，洗脱时间为20min。
结果：不同菌株发酵产物HPLC分析结果如图2所示。
I为出发菌株发酵产物HPLC分析结果，产生阿维菌素8个组分，其中B2a组分约占总组分的30%。
II为aveD点突变的突变株mVL1001发酵产物HPLC分析结果，只产生阿维菌素B组分，其中B2a组分约占总组分的42%。
III为在mVL1001进行aveC敲除后突变株mVL1002的发酵产物HPLC分析结果，完全不产阿维B1a组分，仅产生微量的B2a组分。
IV为在mVL1002中异源回补meiC得到的突变株mVL1003发酵产物HPLC分析结果，只产生阿维菌素B2a单一组分，其中B2a组分约占总组分的95%以上。
结果表明，发明人通过对野生型除虫链霉菌进行基因工程改造，获得菌种的发酵产物95wt%以上为阿维菌素B2a组份，不再产生阿维菌素A组分和B1a组分。
实施例5
阿维菌素B2a组份活性检测
测试方法：对棉蚜杀虫活性实验：取干净新鲜的瓜叶1小片，用小号毛笔将大小、体色一致的棉蚜虫(Aphis gossypii Glover)挑选30条于其上，将叶片连试虫一起浸入药液中2s后取出，立即用吸水纸将棉蚜虫周围多余的药液吸净，将叶片放入50ml的塑料杯中，杯口用纱布以橡皮筋套紧以防蚜虫逃逸，将试虫放入(27±1)℃相对湿度85%的恢复室中，16h后检查结果。死亡标准为，以小号毛笔轻轻触动虫体，试虫不动且无任何反应者视为死亡，以死虫数占总虫数的百分数为死亡率。同时设清水对照，以清水对照按Abbott公式计算校正死亡率。每药剂设0.50、1.50和2.50mg/L三个质量浓度，各质量浓度下重复2～3次。
结果表明：本发明制备的阿维菌素B2a具有良好的生物活性。
实施例6
阿维菌素B2a组份作为前体转化为其他的化合物的实验
阿维菌素B2a组分合成活性更优的B1a组分的方法：通过叔丁基二甲基甲硅烷氧基乙酰氯对B2a 4”和5位-OH基进行选择性的烷基化保护，用0-4-甲基苯基氯甲酸酯对23位-OH基进行烷基化，将得到的烷基化产物在1，2，4-三氯苯中200℃水解1小时，得到C22-C23位成双键的化合物。用p-甲苯磺酸处理后得到4”和5位双羟基乙酰基修饰的衍生物，最后甲醇钠-甲醇（0.2M，60分钟，18℃）处理得到活性更优的B1a组分。
阿维菌素B2a组分合成伊维菌素的方法：通过叔丁基二甲基甲硅烷氧基乙酰氯对B2a 4”和5位-OH基进行选择性的烷基化保护，用0-4-甲基苯基氯甲酸酯对23位-OH基进行烷基化，将得到中间体以甲苯为溶剂，偶氮二异丁腈作为催化剂进行1小时回流反应，得到C23位脱氧的产物，通过薄层色谱分离后立即在甲醇中用P-TSOH x H20处理得到4”和5位双羟基乙酸酯修饰的C23位脱氧衍生物，最后用甲醇钠-甲醇（0.2M，60分钟，18℃）处理得到伊维菌素。
结果表明：本发明制备的阿维菌素B2a可以成功进行后续的转化合成。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (11)

1.一种阿维菌素产生菌，其特征在于，所述的产生菌的发酵产物中，阿维菌素B2a组分的相对含量满足式I：
B/A≥35%
式I
其中，
B为发酵产物中阿维菌素B2a组分的质量；
A为发酵产物中所有阿维菌素组分总的质量。
2.如权利要求1所述的阿维菌素产生菌，其特征在于，所述产生菌的基因组中的aveD基因被失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因、或不表达AveD蛋白、或表达的AveD蛋白无功能。
3.如权利要求2所述的阿维菌素产生菌，其特征在于，所述产生菌的基因组中aveC基因被失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失；或不表达aveC基因、或不表达AveC蛋白、或AveC蛋白无功能；并且，
所述产生菌的基因组中含有或表达aveC的同源基因；或所述产生菌中表达AveC蛋白的同源蛋白。
4.如权利要求3所述的阿维菌素产生菌，其特征在于，所述aveC的同源基因选自下组：美贝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克马丁（nemadectin）生物合成基因nemC，梅岭霉素（meilingmycin）生物合成基因meiC。
5.如权利要求1所述的阿维菌素产生菌，其特征在于，它是除虫链霉菌（Streptomyces avermectinius）mVL1003，保藏编号为CGMCC No.6678。
6.权利要求1中所述的阿维菌素产生菌的用途，其特征在于，它被用做发酵生产阿维菌素B2a组分的工程菌。
7.一种制备阿维菌素B2a组分的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)培养权利要求1所述的阿维菌素产生菌，从而获得含有阿维菌素B2a的发酵产物；和
(b)从发酵产物中分离出所述的阿维菌素B2a组分。
8.一种生产阿维菌素B1a组分的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)培养权利要求1所述的阿维菌素产生菌，从而获得含有阿维菌素B2a组分的发酵产物；
(b)从发酵产物中分离出所述的阿维菌素B2a组分；和
(c)将分离的阿维菌素B2a转化为阿维菌素B1a组分。
9.一种生产伊维菌素的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)培养权利要求1所述的阿维菌素产生菌，从而获得含有阿维菌素B2a组分的发酵产物；
(b)从发酵产物中分离出所述的阿维菌素B2a组分；和
(c)将分离的阿维菌素B2a组分转化为伊维菌素。
10.一种制备阿维菌素产生菌的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)对生产伊维菌素的出发菌进行aveD基因和或AveD蛋白的遗传改造，从而获得基因组中aveD基因失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因、或不表达AveD蛋白、或表达的AveD蛋白无功能的阿维菌素产生菌；
并且，在所述生产伊维菌素的出发菌的发酵产物中，阿维菌素B2a组分的相对含量满足式II：
B/A＜35%
式II
其中，
B为发酵产物中阿维菌素B2a组分的质量；
A为发酵产物中所有阿维菌素组分总的质量。
11.一种基因组合，其特征在于，所述的基因组合与出发（或原始）的生产伊维菌素的基因组合相比，具有选自下组的一个或多个特征：
(1)所述基因组合中，aveD基因被失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因；或
(2)所述基因组合中，aveC基因被失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失；或不表达aveC基因；并且，含有或表达aveC的同源基因。
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