CN108220216B - 一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用 - Google Patents

一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体公开了一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。所述耐铵固氮微生物为在类芽孢杆菌属菌株基因组的amyE位点整合来自多粘类芽孢杆菌的glnR基因，该耐铵固氮微生物在限铵和高铵条件下都能进行生物固氮，提高了类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下的固氮酶活性，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，在农业生产中具有广泛的应用前景。

Description

一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地说，涉及一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。
背景技术
氮素是植物生产中必需的最大元素。化学氮肥在保障我国粮食生产、蔬菜种植和果树栽培中起着十分重要的作用。但长期过量偏施化学氮肥，导致土壤酸化和盐渍化，土壤微生物活力下降，己成为农业可持续发展的一个重要制约因子。
固氮微生物在常温常压下，利用体内的固氮酶能将空气中的氮气还原成铵，供植物生长利用。但固氮效率受铵浓度的影响，即，在限铵或铵浓度低时固氮，铵浓度一般大于5mM以上抑制固氮。在贫瘠的土壤里，固氮微生物的固氮效率高，而在肥沃的土壤里，只生长但不固氮。因此，获得在高铵条件下固氮的微生物，在农业生产中具有重要的应用价值。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物，在微生物菌株基因组的amyE位点整合来自多粘类芽孢杆菌的 glnR基因，所述glnR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述微生物为固氮类芽孢杆菌属。
在本发明的具体实施方式中，采用多粘类芽孢杆菌作为代表，以说明本发明构建方法构建得到的突变株。
进一步地，本发明以多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) 为例，提供了所述耐铵固氮微生物的构建方法，包括如下步骤：
(1)利用引物glnR-amyE1和glnR-amyE2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1161bp的amyE位点上游同源臂；
利用引物glnR-amyE5和glnR-amyE6，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1017bp的amyE位点下游同源臂；
利用引物glnR-amyE3和glnR-amyE4，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长803bp的片段；
用Tiangen胶回收试剂盒切胶回收以上3个片段；
(2)用BamHI和SalI酶切温敏型质粒pRN5101，得到酶切片段；
(3)用Gibson assembly master mix(New England Biolabs)将回收纯化后的3个片段和酶切纯化后的pRN5101组装在一起，得到载体 pROglnR；
(4)将载体pROglnR通过电击转化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受态细胞中，39℃传代培养，先筛选得到具有红霉素抗性的单交换菌株，再继续传代，从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经PCR验证和测序确认得到同源双交换后的glnR过表达菌株 WT/glnR；
其中，所述引物glnR-amyE1、glnR-amyE2、glnR-amyE3、 glnR-amyE4、glnR-amyE5和glnR-amyE6的核苷酸序列如SEQ ID NO.2～7所示。
第二方面，本发明提供了SEQ ID NO.1所示的glnR基因在提高类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下固氮酶活性方面的应用，通过使所述微生物基因组DNA中的过表达glnR基因，提高类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下固氮酶活性。
所述类芽孢杆菌属微生物优选为多粘类芽孢杆菌。
本发明所述的高铵条件指微生物所处环境中NH4 +的浓度为 100～400mM。
本发明提供的过表达glnR基因的耐铵固氮微生物，在限铵和高铵下，均具有固氮酶活性。而野生型菌株只在0-10mM NH4 +范围内才有固氮酶活性。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
例如，本发明所述的BamHI/SalI限制性内切酶购自New England Biolabs。所述的载体质粒pRN5101购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。所述的Paenibacilluspolymyxa WLY78为本实验室筛选菌株，也可使用购自上海柯维化学技术有限公司的多粘类芽孢杆菌进行替代。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种耐铵固氮类芽孢杆菌，在限铵和高铵条件下都能进行生物固氮，提高了固氮酶活性，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，在农业生产中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为野生型菌株(WT)和WT/glnR菌株在低铵和高铵条件下固氮酶活性比较。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、glnR基因过表达的固氮类芽孢杆菌菌株构建
(1)引物与载体
glnR-amyE1：CGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCCGTT GTGGTAGGTGCATACG；
glnR-amyE2：ATGCTCTGGTCCAGTATTTATCCGCTTCCTGG；
glnR-amyE3：AGCGGATAAATACTGGACCAGAGCATCTAATTG；
glnR-amyE4：ATTTGAGCATTGCGGCAACCTTATACCAAGAG；
glnR-amyE5：GTATAAGGTTGCCGCAATGCTCAAATCAACTC；
glnR-amyE6：GACTGCGCAAAAGACATAATCGATAAGCTTATTCAT ACAAGCCGCTCC。
pRN5101：温敏型穿梭质粒，EmR，由中国农科院植物保护研究所彭琦教授赠送。
(2)利用引物glnR-amyE1和glnR-amyE2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1161bp的amyE位点上游同源臂；用引物glnR-amyE5和glnR-amyE6，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1017bp的amyE位点下游同源臂；用引物glnR-amyE3和glnR-amyE4，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长803bp的片段，其中包含glnR启动子区和glnR基因。
用Tiangen胶回收试剂盒切胶回收以上3个片段；用BamHI和 SalI酶切温敏型质粒pRN5101，37℃酶切3小时后过柱回收。
用Gibson assembly master mix(New England Biolabs)将纯化后的3个片段和酶切纯化后的pRN5101组装在一起，得到载体pROglnR。将载体pROglnR通过电击转化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受态细胞中，39℃传代培养，先筛选得到具有红霉素抗性的单交换菌株，再继续传代，从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经PCR验证和测序确认得到同源双交换后的glnR过表达菌株WT/glnR。
2、固氮酶活性测定
将glnR过表达菌株WT/glnR和野生型菌株(WT)分别培养在限铵培养基(-N)和高铵培养基(+N)中。限铵培养基(-N)是基本培养基中添加2mM谷氨酸，高铵培养基(+N)是在限铵培养基中添加100mM NH4Cl。培养10小时以上测定固氮酶活力(乙炔还原法)
固氮酶活(nmol C2H4/mg protein hr)的计算公式为：
Figure BDA0001533924710000051
实验结果如图1.野生型菌株(WT)在高铵条件下几乎没有固氮酶活性，而glnR过表达菌株WT/glnR菌株在高铵条件下固氮，该菌株的固氮酶活性能达到野生型在固氮条件下的1/4左右。
3、固氮类芽孢杆菌的培养
将固氮类芽孢杆菌WT/glnR培养在培养基(1000毫升水中含有：蔗糖36克/L，胰蛋白胨5克/L，酵母粉11克/L，MgSO4 0.51克/L， NaCl 3.5克/L，Na2MoO4克/L，FeSO4克/L)，在30℃振荡培养36-48 小时，活菌浓度达108个/克。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用
<141> 2017-12-29
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 803
<212> DNA
<213> Paenibacillus polymyxa
<400> 1
ggaccagagc atctaattgc ttttgtacag ggcattcagc gtgcggctgc cgtggatagc 60
catgtggtgc cggaaccgtg ggatatgccg ggttatgagc atccagttat catggctgca 120
ggtacgttca tacaaggggg aagtttggaa ctatccgcag atgctcctat tcgtgagcct 180
tatattggtt acatgcaagg ggggttaacc tactctcatg ttaaatttgg agtgcttatg 240
gcactgcaaa cgatgaaaga acgtaaatta ttgtgagttt ttctaacatg tcattgacac 300
tttgcatcag ctaaatgtac aataaggtgt ataatagatc actggaaggt tgatgacaaa 360
tgggcgacga aattcgcaga aatatggcct tatttccaat aggtattgtc atgaagctaa 420
cggacttgtc agcgcgtcag attcgttatt atgaacagca taacttgata gttcctgccc 480
gtacatcggg aaaccaacgt cttttttctt ttaatgacgt agagcgtctg cttgaaatta 540
aggcgttgat cgagaagggt gttaacattg cgggaattaa acaagtcatg aatccggtta 600
ccaaggaatc ggaggaagct acggttatta ctgcagatac ggaagttaaa cgccgtgaaa 660
tgtctgatac tcagcttcac cgcttgctga aacaacaact tgttgcaggc aaaaggccag 720
gacaggtatc cctgatccaa ggtgaattat cacggttctt caataagaga taatgtcttg 780
acttacctct tggtataagg ttg 803
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cggccacgat gcgtccggcg tagaggatcc gttgtggtag gtgcatacg 49
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgctctggt ccagtattta tccgcttcct gg 32
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agcggataaa tactggacca gagcatctaa ttg 33
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atttgagcat tgcggcaacc ttataccaag ag 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gtataaggtt gccgcaatgc tcaaatcaac tc 32
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gactgcgcaa aagacataat cgataagctt attcatacaa gccgctcc 48

Claims (3)

1.一种过表达glnR基因的耐铵固氮微生物，其特征在于，在多粘类芽孢杆菌基因组的amyE位点整合来自多粘类芽孢杆菌的glnR基因，所述glnR基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.权利要求1所述的耐铵固氮微生物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）利用引物glnR-amyE1和glnR-amyE2，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1161 bp的amyE位点上游同源臂；
利用引物glnR-amyE5和glnR-amyE6，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长1017bp的amyE位点下游同源臂；
利用引物glnR-amyE3和glnR-amyE4，以Paenibacillus polymyxa WLY78基因组为模板PCR扩增得到长803 bp的片段；
用Tiangen胶回收试剂盒切胶回收以上3个片段；
（2）用BamHI和SalI酶切温敏型质粒pRN5101，得到酶切片段；
（3）用New England Biolabs Gibson assembly master mix 将回收纯化后的3个片段和酶切纯化后的pRN5101组装在一起，得到载体pROglnR；
（4）将载体pROglnR通过电击转化到Paenibacillus polymyxa WLY78感受态细胞中，39℃传代培养，先筛选得到具有红霉素抗性的单交换菌株，再继续传代，从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经PCR验证和测序确认得到同源双交换后的glnR过表达菌株WT/glnR；
其中，所述引物glnR-amyE1、glnR-amyE2、glnR-amyE3、glnR-amyE4、glnR-amyE5和glnR-amyE6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2~7所示。
3.SEQ ID NO.1所示的glnR基因在提高多粘类芽孢杆菌在高铵条件下固氮酶活性方面的应用，其特征在于，通过在多粘类芽孢杆菌基因组的amyE位点整合来自多粘类芽孢杆菌的glnR基因，提高多粘类芽孢杆菌在高铵条件下固氮酶活性，所述高铵条件为多粘类芽孢杆菌所处环境中NH4 +的浓度为100mM。
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