CN107058328A

CN107058328A - 一种提高植物直链淀粉含量的方法及应用

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Publication number: CN107058328A
Application number: CN201710482844.8A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 吴银亮; 周文智
Original assignee: Jiangsu Three Millet Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Three Millet Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-06-22
Filing date: 2017-06-22
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明涉及生物技术和植物转基因技术领域，具体涉及一种提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，它采用如下的方法步骤：步骤一：利用CRISPR/Cas9多元系统编辑薯类植物SBEI或者SBEII基因；步骤二：步骤一中所述的CRISPR/Cas9多元系统包括：系统中含有一个及一个以上的sgRNA序列的CRISPR/Cas9系统；它利用多元sgRNA介导的CRISPR/Cas9技术定向编辑木薯基因组中SBEI或者SBEII基因序列，可以显著改变薯类植物的淀粉组成和性状，具有能提高薯类植物淀粉中直链淀粉含量；降低薯类植物淀粉中支链淀粉；以及调节薯类植物储藏根重量、直径或数目；并且通过杂交或者自交可获得不含外源基因片段的新品系，在植物品质的遗传改良上具有良好的应用前景。

Description

一种提高植物直链淀粉含量的方法及应用

【技术领域】

本发明涉及生物技术和植物转基因技术领域，具体涉及一种提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用。

【背景技术】

薯类植物主要指具有可供食用块根或地下茎的一类陆生作物。有块根、块茎类，如番薯(红薯、甘薯)、木薯、马铃薯、薯蓣(山药)、脚板薯等，多行无性繁殖，只留薯块作种，并可以用藤本进行繁殖。这类植物一般耐寒力较弱，多在无霜季节栽培，低温会抑制薯类作物的生长，造成块根或块茎的减产，因此种植薯类作物尽量避免长时间的低温期；此外，疏松、肥沃、深厚的土壤和多量钾肥有利于提高薯类作物产量及品质。

淀粉作为重要的粮食和工业原材料在国民生产中具有重要的意义。淀粉的组成包含直链淀粉和支链淀粉两大部分。直链淀粉是D-葡萄糖基以α-(1,4)糖苷键连接的多糖链，分子中有200个左右葡萄糖基，分子量1～2×105，聚合度990，空间构象卷曲成螺旋形，每一回转为6个葡萄糖基。支链淀粉分子中除有α-(1，4)糖苷键的糖链外，还有α-(1，6)糖苷键连接的分支，分子中含300～400个葡萄糖基，分子量>2×107，聚合度7200，各分支也都是卷曲成螺旋形。不同直链淀粉含量的淀粉在工业运用和食品加工中具有极大地差异。

因此，研究薯类植物淀粉的组成和性质，找到调节储藏根性状的关键性因素，是本领域研究的重点。

【发明内容】

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用。

本发明所述的提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，它采用如下的方法步骤：

步骤一：利用CRISPR/Cas9多元系统编辑薯类植物SBEI或者SBEII基因；

步骤二：步骤一中所述的CRISPR/Cas9多元系统包括：系统中含有一个、两个及两个以上的sgRNA序列的CRISPR/Cas9系统；

步骤三：步骤二中的所述的CRISPR/Cas9多元系统的sgRNA核苷酸序列选自下组：

(a)如SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3核苷酸序列中的核酸序列；

(b)将SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3核苷酸序序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)核苷酸功能的由(a)衍生的核酸序列；

(c)或者与(a)限定的核酸序列有70％以上同源性且具有(a)核酸功能的由(a)衍生的多核酸序列；

步骤四：步骤一中所述的对SBEI或者SBEII基因的编辑包括如下方面：

(a)对SBEI或者SBEII基因所在基因组区域的编辑或对包含SBEI或者SBEII基因所在基因组区域的编辑

(b)对(a)中所述编辑包括：单个或多个核酸位点的取代、缺失或添加；

步骤五：终止植物中SBEI或者SBEII多肽的表达或终止有生物功能的SBEI或者SBEII多肽的形成，从而提高薯类植物储藏根中直链淀粉含量，降低支链淀粉的含量；以及调节薯类植物储藏根重量、直径或数目；

步骤六：从终止SBEI或者SBEII多肽的表达或终止有生物功能的SBEI或者SBEII多肽的形成后的植物中选择出相较调节前植物而言性状获得变化的植物，包括：直接产生的较调节前而言性状获得变化的植物；杂交或者自交产生的有外源基因的相较调节前植物而言性状获得变化的植物；杂交或者自交产生的无外源基因的相较调节前植物而言性状获得变化的植物；

进一步地，所述薯类植物包括：木薯，甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜或雪莲果。

进一步地，编辑所述SBEI或者SBEII核苷酸序列的sgRNA靶向SBEI或者SBEII基因组核苷酸序列；较佳地，靶向SBEI基因组的第1939-1958位和2948-2967位；或者SBEII基因组序列的1-20位和1193-1212位。

采用上述结构后，本发明有益效果为：本发明所述的提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，它利用多元sgRNA介导的CRISPR/Cas9技术定向编辑木薯基因组中SBEI或者SBEII基因序列，可以显著改变薯类植物的淀粉组成和性状，具有能提高薯类植物淀粉中直链淀粉含量；降低薯类植物淀粉中支链淀粉；以及调节薯类植物储藏根重量、直径或数目；并且通过杂交或者自交可获得不含外源基因片段的新品系，在植物品质的遗传改良上具有良好的应用前景。

【附图说明】

此处所说明的附图是用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，但并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1是sgRNA在SBEI或者SBEII基因组序列中位置示意图。

图2是CRISPR/Cas9系统多元载体示意图。

图3是转基因植株Southern blot鉴定。

图4是CRISPR/Cas9转基因植株PCR检测结果。

图5是双元CRISR/Cas9基因编辑效果检测。

图6是用多元sgRNA介导的CRISR-Cas9技术改造木薯后直链淀粉含量。

【具体实施方式】

下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，其中的示意性实施例以及说明仅用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本发明中，对各附图进行具体陈述，如下：

图1是sgRNA在SBEI或者SBEII基因组序列中位置示意图。灰色方框区为外显子区，黑色线区是内含子区。

图2是CRISPR/Cas9系统多元载体示意图。其中sgRNA-cas9是中间过渡载体；pCAMBIA 1301S为终表达载体。sgRNA1、sgRNA2利用拟南芥U6启动子启动；Cas9基因由拟南芥uBQ启动子启动，带有flag标签。终载体中带有潮霉素抗性基因：hyg II，以CaMV35S启动子启动。

图3是转基因植株Southern blot鉴定。Mark：λ-HindIII Marker，基因组DNA通过HindIII酶切，琼脂糖胶分离、转膜后用潮霉素探针杂交，红色字体为单拷贝植株。DNA提取材料为温室盆栽苗叶片。SBEI-Cas9是SBEI转基因植株结果；SBEII-Cas9是SBEII转基因植株结果

图4是CRISPR/Cas9转基因植株PCR检测结果。M:DL2000plus marker；WT:野生型对照组；L系列：转基因系列株系。DNA提取材料为温室盆栽苗叶片，PCR扩增后琼脂糖胶凝胶电泳分离，为待选株系。

图5是双元CRISR/Cas9基因编辑效果检测。DNA提取材料为温室盆栽苗叶片，PCR扩增后琼脂糖胶凝胶电泳分离，测序；

A:MeGBSSISBEI-sg-1表示PCR产物中大片段测序结果中MeGBSSISBEI-cas9双元体系中sgRNA1位点的基因编辑结果；MeGBSSISBEI-sg-2表示MeGBSSISBEI-cas9双元体系中sgRNA2位点的基因编辑结果。MeSBEI-sg-out或者SBEII-sg-out表示PCR中小片段的测序结果，即敲除目的基因后测序结果。“--”表示核酸被删除；灰色为原始序列。MeSBEII与MeSBEI相同；

图6、用多元sgRNA介导的CRISR-Cas9技术改造木薯后直链淀粉含量。取种植室外大田生长六个月的野生型和转基因植株，提取淀粉，测定直链淀粉和支链淀粉含量。WT:野生型木薯淀粉；MeSI系列：多元sgRNA介导的CRISR-Cas9系统编辑MeSBEI后的转基因植株。MeSII系列:多元sgRNA介导的CRISR-Cas9系统编辑MeSBEII后的转基因植株。

如图1-图6所示，本具体实施方式所述的提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，它采用如下的方法步骤：

(a)如SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3核苷酸序列中的核酸序列；

作为本发明的一种优选，所述薯类植物包括：木薯，甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜或雪莲果。

作为本发明的一种优选，编辑所述SBEI或者SBEII核苷酸序列的sgRNA靶向SBEI或者SBEII基因组核苷酸序列；较佳地，靶向SBEI基因组的第1939-1958位和2948-2967位；或者SBEII基因组序具列的1-20位和1193-1212位。

本设计中，经过深入的研究，发现通过CRISPR/Cas9多元系统编辑薯类植物基因组中SBEI或者SBEII基因，调节SBEI或者SBEII多肽在薯类植物中的表达，可以显著调节薯类植物的储藏根的发育性状可以显著调节薯类植物的直链淀粉含量，在植物淀粉品质的遗传改良上具有良好的应用前景。

本发明各术语陈述如下：

本设计中的“薯类植物”也称为“薯类作物”，主要指具有可供食用块根或地下茎的一类的陆生作物。包括但不限于：大戟科的块根植物如木薯、旋花科的块根植物如甘薯，茄科的块茎植物如马铃薯，薯蓣科的块根植物如山药，天南星科的块茎植物如芋头、魔芋，豆科块根植物如葛根，菊科块茎植物如洋姜，雪莲果等。

本发明包括CRISPR/Cas9多元载体系统。如本文所用，术语“多元”是指带有一个、两个或多于两个基本上保持本发明中SBEI或者SBEII核苷酸序列中的sgRNA序列相同的生物学功能或活性的核苷酸序列。多元可以是(i)一个、两个或两个以上的sgRNA均来自于SEQID NO:1或者SEQ ID NO:3所在区域，或(ii)一个、两个或两个以上的sgRNA至少有一个来自于SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3所在区域，或(iii)一个、两个或两个以上的sgRNA均来自SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3所在区域以外，但敲除或编辑区域包含SEQ ID NO:1SEQ IDNO:3。

任何一种SBEI或者SBEII基因组来源的sgRNA的生物活性核苷酸片段都可以应用到本发明中。在这里，sgRNA的生物活性片段的含义是指作为一种核苷酸序列，其仍然能保持正常的sgRNA的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的正常的sgRNA的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长SBEI或者SBEII多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明的sgRNA序列可以是(i)SBEI或者SBEII基因组中内含子区域中的核苷酸序列或者有一个或多个核苷酸被取代的但仍具有本发明中sgRNA功能的核苷酸序列或(ii)SBEI或者SBEII基因组中外显子区域中的核苷酸序列或者有一个或多个核苷酸被取代的但仍具有本发明中sgRNA功能的核苷酸序列或(iii)突变或者敲除区域包含本发明中SBEI或者SBEII基因组整个或者部分区域的核苷酸序列或者有一个或多个核苷酸被取代的但仍具有本发明中sgRNA功能的核苷酸序列。根据本文的定义这些多元、sgRNA属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“SBEI或者SBEII基因组”指具有生物活性的SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3序列的多核苷酸。该术语还包括具有与SBEI或者SBEII核苷酸相同功能的SEQID NO:1或者SEQ ID NO:3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-150个，较佳地1-90个，更佳地1-60个，最佳地1-30个，还更佳如1-24个、1-15个)核苷酸的缺失、插入和/或取代。例如，在本领域中，不同品种来源的木薯SBEI或者SBEII基因组序列存在多态性，通常不会改变核苷酸序列的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个标签序列通常也不会改变核算序列的功能。

SBEI或者SBEII核苷酸序列的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SBEI或者SBEII核酸序列杂交的DNA序列。

任何与所述的SBEI或者SBEII基因序列同源性高(比如与SEQ ID NO:1或者SEQ IDNO:3所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有SBEI或者SBEII基因序列相同功能的核酸序列也包括在本发明内。

应理解，虽然本发明的SBEI或者SBEII基因序列优选获自木薯，但是获自其它植物的与木薯SBEI或者SBEII基因序列高度同源(如具有70％以上，如80％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它多核苷酸也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明还涉及编码本发明SBEI或者SBEII多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:4的蛋白质，但与SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:4的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。

本发明的SBEI或者SBEII基因序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或SBEI或者SBEII基因序列经基因工程产生的宿主细胞。

本发明还提供了一种调节薯类植物的淀粉组成和性质的方法，其方法包括调节所述薯类植物中SBEI或者SBEII多肽的表达。

更优选地，所述的方法包括：编辑所述薯类植物中SBEI或者SBEII基因组核苷酸序列，调节SBEI或者SBEII多肽的表达(包括使终止SBEI或者SBEII多肽的表达或终止有生物学功能的SBEI或者SBEII多肽的形成)，从而调节薯类植物淀粉的直链淀粉和支链淀粉的含量，包括：提高薯类植物淀粉中直链淀粉含量；降低薯类植物淀粉中支链淀粉的含量；调节薯类植物储藏根重量、直径或数目。

可以采用本发明中涉及的基因编辑系统来终止SBEI或者SBEII多肽的表达或终止有生物学功能的SBEI或者SBEII多肽的形成。

作为本发明的一种实施方式，提供了一种通过CRISPR/Cas9多元系统编辑薯类植物基因组中SBEI或者SBEII基因，调节SBEI或者SBEII多肽在薯类植物中的表达，从而提高薯类植物直链淀粉含量同时降低支链淀粉含量的方法。所述的方法包括：

(1)将携带SBEI或者SBEII基因组sgRNA的多元CRISPR/Cas9载体分子转入植物组织、器官或种子，获得转化入所述编辑功能的植物组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了所述携带SBEI或者SBEII基因组sgRNA的多元CRISPR/Cas9载体分子的植物组织、器官或种子再生成植物。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带可编辑SBEI或者SBEII基因组的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：

(a)含有启动的sgRNA和Cas9多肽的编码基因或基因片段的载体；

(b)含有可在植物体内编辑SBEI或者SBEII基因组和甘薯序列的载体；

(ii)将植物的组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物组织或器官。

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织或器官再生成植物。

基于SBEI或者SBEII基因的核苷酸序列，可以设计出在导入植物体后可特性性识别SBEI或者SBEII靶点的多核苷酸。设计时要考虑到特异性以及编辑的效率。本发明对sgRNA序列的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了CRISPR/Cas9多元系统的组成、sgRNA序列与植物性状的相关性以后，可以以各种途径制备出所述的表达系统，从而用于调节植物性状。所述的多元系统可通过转基因技术被输送到植物体内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到植物体内。

作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果优异的sgRNA分子，所述的分子可特异性的编辑SBEI或者SBEII基因组序列；并且经验证，其具有良好的调节SBEI或者SBEII多肽生物学功能的效果。所述的sgRNA分子是含有SEQ ID NO:1中第1939-1958位和2948-2967位或者SEQ ID NO:3中第1-20位和1193-1212位。

所示的核苷酸序列的分子，构成双元系统。所述双元系统含有两个sgRNA序列，可以在基因组中定向敲除大片段序列。所述的双元系统在导入到植物体内后，可在基因组中两个特异的靶点同时编辑基因组，编辑后在造成两个靶点突变的同时还可以将两个靶点间的核苷酸序列片段敲除。通常，所述的双元系统位于表达载体上。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括但不限于从终止SBEI或者SBEII多肽的表达或终止有生物功能的SBEI或者SBEII多肽的形成后的植物中选择出相较调节前植物而言性状获得变化的植物，例如：直接产生的较调节前而言性状获得变化的植物；杂交或者自交产生的有外源基因的相较调节前植物而言性状获得变化的植物；杂交或者自交产生的无外源基因的相较调节前植物而言性状获得变化的植物。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

具体实施例一，木薯MeSBEI和MeSBEII基因sgRNA的选择和合成：为获得木薯MeSBEI和MeSBEII基因sgRNA序列，本发明人利用NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)找到了木薯的MeSBEI和MeSBEII基因组核苷酸序列。MeSBEI全长2559bp；MeSBEII全长2514bp。将此两个基因序列通过Blastp及Blastn在RIKEN cassavacDNA数据库(http://www.brc.riken.jp/inf/en/index.shtml)中搜索找到其基因组序列，MeSBEI全长7232bp；包含14个外显子，编码852个氨基酸。从基因组序列中筛选出特异的sgRNA序列MeSBEI-sgRNA1:5’-GGATGGTTCCAACCATAGGA-3’；MeSBEI-sgRNA2：5’-CCATCATCATGGGATCAACA-3’，合成sgRNA序列:

sgRNA1：

LP:5’-GATTGGGATGGTTCCAACCATAGGA-3’；

RP:5’-AAACTCCTATGGTTGGAACCATCCC-3’；

sgRNA2:

LP:5’-GATTGCCATCATCATGGGATCAACA-3’

RP:5’AAACTGTTGATCCCATGATGATGGC-3’

MeSBEII全长13138bp，包含22个外显子，编码837个氨基酸。从基因组序列中筛选出特异的sgRNA序列MeSBEII-sgRNA1:5’-ATGGGACACTACACCATATC-3’；MeSBEII-sgRNA2：5’-AAAGAGTCCTTCCTGATGGT-3’，合成sgRNA序列:

sgRNA1：

LP:5’-GATTGATGGGACACTACACCATATC-3’；

RP:5’-AAACGATATGGTGTAGTGTCCCATC-3’；

sgRNA2:

LP:5’-GATTGAAAGAGTCCTTCCTGATGGT-3’

RP:5’-AAACACCATCAGGAAGGACTCTTTC-3’

具体实施例二，木薯MeSBEI和MeSBEII基因CRISPR/Cas9双元载体的构建及转基因木薯的获得：本设计中，首先通过BbsI酶切方法分别将两个sgRNA片段导入到两个sgRNA-cas9中间载体中，然后在利用KpnI和XbaI双酶切将任意一sgRNA导入sgRNA-cas9中间载体形成双元中间过渡载体：sgRNA1-cas9-sgRNA2。再将构建好的双元中间过渡载体转入表达载体pCAMBIA 1301S中。然后将sgRNA1-cas9-sgRNA2-P1301s转入农杆菌LBA4404，再通过农杆菌侵染木薯脆性悬浮愈伤，侵染后的愈伤组织通过再生、筛选等过程得到阳性植株，分别将sgRNA1-cas9-sgRNA2-P1301s转基因木薯记作MeGBSSISBEI和MeSBEII-cas9，分别缩写为MeGIMeSI和MeSII。如图1、图2所示。

具体实施例三，MeSBEI-Cas9和MeSBEII-Cas9转基因木薯的分子鉴定：通过农杆菌介导的木薯悬浮愈伤转化，获得转基因植株。通过Southern blot筛选最后获得单拷贝转基因植株，MeSBEI-Cas9和MeSBEII-Cas9各选择4个株系。

具体实施例四，MeSBEI或者MeSBEII-Cas9转基因木薯的基因编辑检测：为了验证CRISPR/Cas9的基因编辑效果，本发明人分别提取了转基因木薯的基因组，设计扩增引物。MeSBEI-FP:5’-AATTTGGATTTAATAGAGAAGCA-3’；MeSBEI-RP:5’-CTGTGATTGCTGAAGATGTTTC-3’通过PCR扩增单拷贝植株中MeSBEI的目的编辑片段。结果显示，在MeSBEI-Cas9系列转基因株系中，L1/L2/L3/L4中有小片段出现(图3)，测序结果显示小片段为理论敲除后的序列，切在sgRNA1和sgRNA2的靶点出存在插入突变(图4)；对大片段测序结果显示，在sgRNA1和sgRNA2编辑位点也存在突变现象其中包括插入突变、删除突变、替换(图4)。说明我们的双元系统具有很高的基因敲除效率和编辑效率。

对于MeSBEII基因设计引物：MeSBEII-FP:5’-CTTTCTTTGCTAGAAAATCTTT-3’；MeSBEII-RP:5’-ATATTTAAGTTTAGAGTTTGAG-3’通过PCR扩增单拷贝植株中MeSBEII的目的编辑片段。结果显示，在MeSBEII-Cas9系列转基因株系中，L4/L7/L4/L15中有小片段出现(图3)，测序结果显示小片段为理论敲除后的序列，切在sgRNA1和sgRNA2的靶点出存在插入突变(图4)；对大片段测序结果显示，在sgRNA1和sgRNA2编辑位点也存在突变现象其中包括插入突变、删除突变、替换(图4)。说明我们的双元系统具有很高的基因敲除效率和编辑效率。

具体实施例四，MeSBEI-Cas9和MeSBEII-Cas9转基因木薯对淀粉组成成分的影响：在大田中，观察野生型木薯以及MeSBEI-Cas9和MeSBEII-Cas9转基因木薯的生长、发育以及产量性状。于四月中旬从三亚种苗库中收获MeSBEI-Cas9和MeSBEII-Cas9转基因木薯的种茎，在上海五厍中试试验田中起垄，垄高50cm，垄间距为100cm，将种茎扦插于垄上，随后铺上地膜，在前三个月平均每周浇一次水，保持土壤潮湿，三个月以后，20天左右浇一次水，保持土壤不旱即可，并于第五个月施加一次复合肥，直至收获。提取野生型及转基因木薯成熟储藏根中的淀粉，测定其直链淀粉含量。结果显示野生型木薯直链淀粉含量为26％，在MeSBEI-Cas9-Cas9直链淀粉含量显著提高，介于39％-75％之间；MeSBEII-Cas9-Cas9中直链淀粉含量介于37％-64％之间。

以上所述仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均包括于本发明专利申请范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏三黍生物科技有限公司

<120> 一种提高植物直链淀粉含量的方法及应用

<130> 20170607

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7035

<212> DNA

<213> Manihot esculenta

<400> 1

atgttaggtt ctttgggtct gtttccggcg cctgattttg ggtctttatc accttcttta 60

gccaagaact ccaaaagggt aactttattt tttcacattt taaaataaat ttgatttttt 120

tgaggttttt ctttctgtta ttccaagtgg gtaattttat tttttcacat tgtaatggcc 180

tgctggtttt cttattcttg ttctggtcgg tttgctgcac atcctattct ctagaggttg 240

tttctcaatt tgcatttgct cagttagttt gcttttatgc agtgatgtgt attttgattg 300

attgattgct tgcttgatta caaggaagga ttcttctggt ttcaaaatga agtttatttc 360

tttgcctact gctctatatt aactaaaatc gtaactctga tgataaatca gagcatgatt 420

agctcaaaga aacaaataat taatgtgtac gtgcatgatt gttcatagca ttattagttg 480

agaggactca tcaatttgac cagcctattt gaacgaatct ctgtttcatt tgtaaagttc 540

agtgtgtccc agtgtatata tagataaaaa gtgcatggca actgatgaaa caccattctt 600

gtgattatat tcaggatgtt ttcaagtctc cggagtatga tgtacttgca agttgttatt 660

ttctggatgt ttcttgcatc aaatactgct tgatttcttg tctggtatct ttgacaggct 720

gtggaaagaa actgtcaaat tgtcaaacaa aaacagattg aactgactgg atgtcgaaaa 780

ttgcctggtt gttctagatt cctttttcta ccaagaatct caatagataa gagggtatgt 840

ttaacaattt ttgcatggac tattcagtca aggatttctc ctaccatata tagttccagt 900

tattgttcaa atatatgtgg agtcgaagca tgaatgtcaa ttggcttgtt tgacttttgt 960

tggcgatgat gttagagaaa caaatatata tggttaaaat agttcagaaa caagtatcta 1020

agtcgcagat caaacatgaa cctaattctt atatcaatgc ttctttcctt tataaatatc 1080

acaaagcact ggtgaaaatt ttaacttgtc atacaggagc attcagttgg cttatcttct 1140

taatctgcaa aatttttatg aaaactttaa tcttcaacta tcttatttac aaataaactt 1200

ttacatgatg catgatcatt gctaggtgaa gcaaggtctt gcaatctcag cagctgtggc 1260

agatgagaag aaaacgataa caagctttga ggaagacatg gaaattactg gtcttttgag 1320

cattgatcct gggttagaat catttaaaga tcatttcaga tatagaatgc aaagatttac 1380

aaatcagaaa caactcattg aaaaatatga aggtggtctt gaggaatttt caaaaggtgc 1440

tttcagtagt ataccagttt aatcttccct ttttatttcc ttttcaataa atattcataa 1500

ctagctactt aaacagtact tgagacagtt ttttaatgtt tgaatttccc ttgctttaac 1560

atgtaatttt gtttagaagt catgtaactg tgtccagtta cttaaaatct tggtgttctg 1620

attgacctct taattggatc ttgagtgtcc cttgtgttcc cagtatagca gccttttttt 1680

tccttttttt cttttagtgg tagttatatt tttgcacgtt aaaaccctct gcttctatca 1740

ttttgtaggt tacctgaaat ttggatttaa tagagaagca ggtggaattg tctatcgtga 1800

gtgggcccct gcagctcagt atgttgtttg ctttcagaat caaaatacaa ctttgcaaac 1860

tttgttatca ttgtccaaat aaaagatacg ttctttgtaa tgtagggaag cacaagttat 1920

tggggacttt aatggttggg atggttccaa ccataggatg gaaaagaatg aatttggtgt 1980

ttggagtatc aacatacctg attctggcgg aaatccagcc attcatcaca attcaagggt 2040

caaattcaga ttcaagcatg gtgatggagt ttgggttgat cgaattccag cttggattag 2100

atatgccact gtggacccca caaaatttgg agcaccatat gatggtgtct actgggatcc 2160

tccacctcca gaaaggtgac agcacattta catattgtga aatctggact ataaccataa 2220

tcaagttaat gaaggaccaa ttccataaag atcccacata tgaagatggt tttttatgct 2280

tgtattgtcg ctcattttca tcccaaaagt atgatctgtt tattttccta gacaaggaag 2340

acttggtcat atggaaaaag gtcttttgct gatccactct ttcattgata tgcaggtacc 2400

aattcaagta tccccggcct ccaaaagccc aggcccctcg catatatgag gctcatgtgg 2460

gaatgagtag ctcagaacct cgcattaata catacagaga gtttgctgat gatgttctgc 2520

ctcgtatacg ggcaaacaac tataatacgg ttcagttaat ggctgttatg gagcattcat 2580

attatgggtc gtttgggtac catgttacaa acttttttgc tgtaagcagt agatctggaa 2640

ctcctgagga tcttaaatat ttaattgata aagctcatag cttgggttta agtgttctga 2700

tggatgttgt tcacagtcac gcaagtaaca atatcactga tggacttaat ggctttgatg 2760

ttggccaaag cactcaagat tcctactttc acactggaga tcgaggctac cataagctat 2820

gggatagcag actctttaac tatgctaatt gggaagttat tcgcttcctt ctgtccaact 2880

taagatggtg gcttgaggag tacaaatttg atggattccg atttgacgga gtaacatcaa 2940

tgttgtacca tcatcatggg atcaacatgg catttacagg ggattataat gagtatttca 3000

gtgaggcaac tgatattgat gccgttgttt atctgatgct ggccaattct ctgattcaca 3060

acatcttgcc tgatgctact gtgattgctg aagatgtttc tggcatgcct gggcttggcc 3120

gttctgtctc tgagggggga ataggttttg actatcgcct agcaatggcc atccctgaca 3180

aatggatcga ttacttgaaa aacaagagtg atgaagagtg gtcaatgaag gaaatctcat 3240

ggagcttaac taataggaga tacactgaga aatgtgttgc ttatgctgag agtcatgacc 3300

aagtaagaga actggaattt cttgtttgtt cattttcaca attacttttg ttggtggttg 3360

tgttcattgc tccatggtag tgttgcatat aacttgataa gataatgaaa agacaagaag 3420

gaagttactt ggtaaggtaa agaaagataa agacaagatg atgtagaacc aataggacaa 3480

aaggggaaca agggatgaga aactcttaag gtagataaat aaattctcaa tagagagaga 3540

gagagagaga gatagagaaa ttcttcctaa tttcacaatt aatcaacata attcctaaat 3600

tgaatcttcc ttcactgcat cacttgaagc aggaataatt tatacaaaga atagctgctt 3660

tcatcctgga aagagaactt gctcatgttt aacttccttt tttcatttct ttcttatgaa 3720

tatggtatct tttgtttcca caggccattg taggtgacaa gatagttgcc tttttattaa 3780

tggataaaga gaacttgatc atgtttaact tcttttttca tttctttctt gtgaatatgg 3840

tatcttttgt ttccacaggc cattgtaggt gacaagacgg ttgccttttt attaatggat 3900

aaagaaatgt attatggaat gtcttgtttg acagatgctt cacctatggt tgatcgaggg 3960

gtagcgcttc ataaggtttg atttacacaa tctcatgagc actttcctca cttcactgtg 4020

gttttcaacc acaaccattg tttctgaatc ctattttatt gtaattttat attgattccc 4080

atccatcagg ttttgcaaac agctgtcccc tttgttctga ttgatgtaat tctattctgc 4140

agatggttca tcttttaact atggctttag gaggtgaggg ctaccttaat tttatgggaa 4200

atgaggtaac cacactagcc caactctagt ctaacaagct ctcattgcta ctaaactgcc 4260

acatctatat atttctcatg atatcttaga cttcatttgt ttcacagtaa atatttttca 4320

ttttttctaa ttgttatggc actcagaaaa attggtaagg aaaaataaat cacttttaag 4380

gaaaatgttt tcctctttca aaaggaagtc attttctaga ctttaagaat cttattaaca 4440

ccagttttct atacatggac gttattactt ctcttagttt tttaacatta taatcaaata 4500

atagaaaatg agttgtcttc ttggaaaaca atttccagaa agacattttc cacatacaag 4560

ttattttccg ccaaaataaa tggagcctta atctgcttgc ttgtcaaaag tttaaattca 4620

tgaaatggaa tatgttttgg tttatccttg gttgatccgt atgtttctca agcatcgctc 4680

tgaaataaat tgaggaaatg aaatggtcaa aacatgaggc caaccagtaa cttctaatct 4740

gatctgatac tcttatttta tggagcctgt tgattctaag catgagacaa tgagagcaac 4800

aagttgactt ggagaaacac ttctttctct gagggaaaat aaggaatagg atatgcatgc 4860

atgttttgtt gattagtctc tgaattagtt gtgatgaata tttcttatag tttggccatc 4920

ctgagtggat tgacttccca agagaaggca atgggtggag ttatgacaag tgcagacgcc 4980

aatggaacct agttgacact gaacacttga gatacagggt ttgtgaactc atttgcattt 5040

tgagctgctg cttcatattg tctgcttatc tagtaaattg tctttaatca accattttgc 5100

tttgtacaaa atagagcatc ctaacaaaca tttttttcat ttcattttct tttccttctt 5160

cagttcatga atgcatttga caaggctatg aacttgcttg atgaaaagta ttcatttcta 5220

gcatcaacaa agcagattgt gagcagcaca aatgaagagg ataaggtaca gatgccccga 5280

gtaaatcctt gctggatatg gtcaggaagt gttgtaataa tccactaaca aggatgtcac 5340

ttttcaagtt gacattttag tcatctttca gtcctatagc acttattagt cacttcacat 5400

tacaggttat cgtctttgag cgtggggacc tggtttttgt attcaatttt catccagaga 5460

atacatatga tgggtatgtg ttttttgttt ttcccccatg aagtaagaca tctaagttgt 5520

tttagtgtat atggactgta gaccaattat aatgttaaat ttaggccagg cctaactcac 5580

cctaaaagct agctcaaggg cagaagtgcc tatggtctat ataaggggca ctttacccct 5640

tttcacaacc aatgtgggat tcaacataca ccctcacgcc cagaactttt actggtatgt 5700

gacatattta tgagaagtcc aacatcggat gagaggctct gataggctct gatactatat 5760

taaatttgga tcagacctaa ctcaccccaa aagctaggtt aagggggaag agtgtctatg 5820

gccaaataag gggcacatta ccccttttca caaccgacgt agaattcaac acatagtaag 5880

gtgaatgtta gcaggccaca cattgctgag atcaaacagt taggatagga cttgcattct 5940

gacgattaat tatttatgta ggcttccagt aaccctttgt gtttcaatct gaatcattca 6000

ggtacaaggt tggttgcgac ttgcccggaa agtatcgagt tgcattggat agtgatgctt 6060

gggagtttgg tggacgtgga agagtaagaa atcctctgca aaatttttcc gtacttccat 6120

gaaaaatagt agaggataga agaaaactga tggtgaactt gttatactta acaatgtgat 6180

gtaaaactca tgcacctagg tacaaaagaa gttatgccaa tgcttatatt tcttagacat 6240

agaatgttga tggaatggag ccctgagttc aggagtttga cctagttctt aatgaaagct 6300

gtagtgagag agaaaagatg ccagctgagg catggaaaga atttattttt gaacatatcc 6360

ccttcatcaa ttgttcagtt ctaatgtgaa attttattaa ttaatctggc aggtgggcca 6420

tgatgtggac cattttacat ctcctgaagg gatacctgga gtgcccgaaa caaatttcaa 6480

caatcgtcca aactccttca aaatactctc tgcagctcgc acttgtgtgg tgagttccat 6540

ccttatttat gtttaccatt taaagttact tctgatgatt gatttttatc atttcaccct 6600

agaaagatgt tgcaagtgct gagtatggcg gttttgagac attagtttaa tagattatag 6660

acctttatca gcattataaa cacaacatct ctagcatgta actattcttt ttgctgctgt 6720

ctgaacgagc tctaagcata tttgatttct ttctttttaa cttttttcaa atgcaaattt 6780

gtctaggttt actatagagt tgaagaaaaa gaaggaaatc acaacagtag tgatattggt 6840

gctgcaaatg agacattgac agacattgca aagctgggag attttgaagg tatcaacgag 6900

acatcaccag cagatgctgt ggcaaagcag gaggatctta aggcagcaca accttctttg 6960

attgccgatg atattgcaac aaaggcaaac acagaaacag aagagattga ggaagagaca 7020

tcggatgaca aatga 7035

<210> 2

<211> 852

<212> PRT

<213> Manihot esculenta

<400> 2

Met Leu Gly Ser Leu Gly Leu Phe Pro Ala Pro Asp Phe Gly Ser Leu

1 5 10 15

Ser Pro Ser Leu Ala Lys Asn Ser Lys Arg Ala Val Glu Arg Asn Cys

20 25 30

Gln Ile Val Lys Gln Lys Gln Ile Glu Leu Thr Gly Cys Arg Lys Leu

35 40 45

Pro Gly Cys Ser Arg Phe Leu Phe Leu Pro Arg Ile Ser Ile Asp Lys

50 55 60

Arg Val Lys Gln Gly Leu Ala Ile Ser Ala Ala Val Ala Asp Glu Lys

65 70 75 80

Lys Thr Ile Thr Ser Phe Glu Glu Asp Met Glu Ile Thr Gly Leu Leu

85 90 95

Ser Ile Asp Pro Gly Leu Glu Ser Phe Lys Asp His Phe Arg Tyr Arg

100 105 110

Met Gln Arg Phe Thr Asn Gln Lys Gln Leu Ile Glu Lys Tyr Glu Gly

115 120 125

Gly Leu Glu Glu Phe Ser Lys Gly Tyr Leu Lys Phe Gly Phe Asn Arg

130 135 140

Glu Ala Gly Gly Ile Val Tyr Arg Glu Trp Ala Pro Ala Ala Gln Glu

145 150 155 160

Ala Gln Val Ile Gly Asp Phe Asn Gly Trp Asp Gly Ser Asn His Arg

165 170 175

Met Glu Lys Asn Glu Phe Gly Val Trp Ser Ile Asn Ile Pro Asp Ser

180 185 190

Gly Gly Asn Pro Ala Ile His His Asn Ser Arg Val Lys Phe Arg Phe

195 200 205

Lys His Gly Asp Gly Val Trp Val Asp Arg Ile Pro Ala Trp Ile Arg

210 215 220

Tyr Ala Thr Val Asp Pro Thr Lys Phe Gly Ala Pro Tyr Asp Gly Val

225 230 235 240

Tyr Trp Asp Pro Pro Pro Pro Glu Arg Tyr Gln Phe Lys Tyr Pro Arg

245 250 255

Pro Pro Lys Ala Gln Ala Pro Arg Ile Tyr Glu Ala His Val Gly Met

260 265 270

Ser Ser Ser Glu Pro Arg Ile Asn Thr Tyr Arg Glu Phe Ala Asp Asp

275 280 285

Val Leu Pro Arg Ile Arg Ala Asn Asn Tyr Asn Thr Val Gln Leu Met

290 295 300

Ala Val Met Glu His Ser Tyr Tyr Gly Ser Phe Gly Tyr His Val Thr

305 310 315 320

Asn Phe Phe Ala Val Ser Ser Arg Ser Gly Thr Pro Glu Asp Leu Lys

325 330 335

Tyr Leu Ile Asp Lys Ala His Ser Leu Gly Leu Ser Val Leu Met Asp

340 345 350

Val Val His Ser His Ala Ser Asn Asn Ile Thr Asp Gly Leu Asn Gly

355 360 365

Phe Asp Val Gly Gln Ser Thr Gln Asp Ser Tyr Phe His Thr Gly Asp

370 375 380

Arg Gly Tyr His Lys Leu Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Ala Asn

385 390 395 400

Trp Glu Val Ile Arg Phe Leu Leu Ser Asn Leu Arg Trp Trp Leu Glu

405 410 415

Glu Tyr Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Leu

420 425 430

Tyr His His His Gly Ile Asn Met Ala Phe Thr Gly Asp Tyr Asn Glu

435 440 445

Tyr Phe Ser Glu Ala Thr Asp Ile Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu

450 455 460

Ala Asn Ser Leu Ile His Asn Ile Leu Pro Asp Ala Thr Val Ile Ala

465 470 475 480

Glu Asp Val Ser Gly Met Pro Gly Leu Gly Arg Ser Val Ser Glu Gly

485 490 495

Gly Ile Gly Phe Asp Tyr Arg Leu Ala Met Ala Ile Pro Asp Lys Trp

500 505 510

Ile Asp Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Asp Glu Glu Trp Ser Met Lys Glu

515 520 525

Ile Ser Trp Ser Leu Thr Asn Arg Arg Tyr Thr Glu Lys Cys Val Ala

530 535 540

Tyr Ala Glu Ser His Asp Gln Ala Ile Val Gly Asp Lys Thr Val Ala

545 550 555 560

Phe Leu Leu Met Asp Lys Glu Met Tyr Tyr Gly Met Ser Cys Leu Thr

565 570 575

Asp Ala Ser Pro Met Val Asp Arg Gly Val Ala Leu His Lys Met Val

580 585 590

His Leu Leu Thr Met Ala Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met

595 600 605

Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Glu Gly

610 615 620

Asn Gly Trp Ser Tyr Asp Lys Cys Arg Arg Gln Trp Asn Leu Val Asp

625 630 635 640

Thr Glu His Leu Arg Tyr Arg Phe Met Asn Ala Phe Asp Lys Ala Met

645 650 655

Asn Leu Leu Asp Glu Lys Tyr Ser Phe Leu Ala Ser Thr Lys Gln Ile

660 665 670

Val Ser Ser Thr Asn Glu Glu Asp Lys Val Ile Val Phe Glu Arg Gly

675 680 685

Asp Leu Val Phe Val Phe Asn Phe His Pro Glu Asn Thr Tyr Asp Gly

690 695 700

Tyr Lys Val Gly Cys Asp Leu Pro Gly Lys Tyr Arg Val Ala Leu Asp

705 710 715 720

Ser Asp Ala Trp Glu Phe Gly Gly Arg Gly Arg Val Gly His Asp Val

725 730 735

Asp His Phe Thr Ser Pro Glu Gly Ile Pro Gly Val Pro Glu Thr Asn

740 745 750

Phe Asn Asn Arg Pro Asn Ser Phe Lys Ile Leu Ser Ala Ala Arg Thr

755 760 765

Cys Val Val Tyr Tyr Arg Val Glu Glu Lys Glu Gly Asn His Asn Ser

770 775 780

Ser Asp Ile Gly Ala Ala Asn Glu Thr Leu Thr Asp Ile Ala Lys Leu

785 790 795 800

Gly Asp Phe Glu Gly Ile Asn Glu Thr Ser Pro Ala Asp Ala Val Ala

805 810 815

Lys Gln Glu Asp Leu Lys Ala Ala Gln Pro Ser Leu Ile Ala Asp Asp

820 825 830

Ile Ala Thr Lys Ala Asn Thr Glu Thr Glu Glu Ile Glu Glu Glu Thr

835 840 845

Ser Asp Asp Lys

850

<210> 3

<211> 13280

<212> DNA

<213> Manihot esculenta

<400> 3

actttctttg ctagaaaatc tttctccaat tccctgcctc gcgcgtttct cgcgaccgct 60

ttcgatctct cttcccttta aaacaagttg aacatgcaat tagttgcgtc agttctcaca 120

ctctctctaa cttctcagcg aaatgggaca ctacaccata tcaggaatac gttttccttg 180

tgctccacta tgcaaatctc aatctaccgg cttccatggc gatcggagga cctcctcttg 240

cctttccttc aacttcaaga aggaggcgtt ttctagtact atttttctct ttctgtattt 300

tgttttcatc tgtggaattt tgtttgattg atttcgattc cgcatttgtt taatcgcgtt 360

tggatctttt tgattggtta ttgtcattac tatttttgga tgtagcagta gtatatcagt 420

tctgatcaaa gaaatggatc agtttttatt ttatttcagc tgtgatttta gcatagtaat 480

gcagttgcaa tttttgaagt tacagtagtg tttttcaatt gataatattt gttagtttta 540

ttcatgtctg ccgtgcctgc tgtctgctca gttgaatgtt cggtgatttg gtgatttaat 600

tgcgtaaaaa ctatttgttt aaaggcattg cagttggatt gctgatcttt agcattttat 660

ttgaattttt ctcttgtaag ggggagcatt ttgtatttct ttggtactaa gcttgagagt 720

tcttatagta atgctctctc atggagcttt tatactactg gaatttgcag ccttatacct 780

ttggaagaat ctatgaatat tttgctgcag agatctgctg tcttgccttt aagttattag 840

catatatctg gggaaactgg agtttgatat attccatcta cggggtttgg gtgctgtgaa 900

ttgttttttt cagtcccatc tctgccattt tctggaacaa atatatatga ctttatatga 960

gatacgtcag tatttgaatg gttacgggga tctccttgac aagatatcca ttggaatatt 1020

ctgaatttta ttttcagtcg tagctcattg ataagttggt ttgtttcaat tcctagttgg 1080

tgtgtatgtt tatatcttcc tactactaca aacaaaaatt agtatatatt attaactgtt 1140

atatctaagt atctttagaa ttttctaatg gtcaatcctc ttcttatgcc tgttatatat 1200

ataaagaagc tggtaggtat aaaagaagat atatataaat gtaaaaataa tatgtttctt 1260

gtttgtaggg agggtcttct ctggaaagtc atctcatgaa tctgactcct caaatgtaat 1320

ggtcactgcg tctaaaagag tccttcctga tggtcggatt gaatgctatt cttcttcaac 1380

agatcaattg gaagcccctg gcacagtttc agaagaatcc caggtttgta tattgtgtgc 1440

atgtctagat gtatatgata cattttttgt ttaaatgata tttaagttta gagtttgaga 1500

ttcatgggtg gcaataggag gagaacttta tagataaatg caattatggg aagaaaggca 1560

gattcaactg tgggagaaga ggaaaaatag gggagagttt gttgacatgg ttttttcatg 1620

ttcattgaag gcccctggct agtattatga atccatgctt cagtttaaag tggtttggac 1680

ttgaagggtg tggaatgagg ttttgaaagg accattcttg tttccagttt tggtataata 1740

tatggctcaa actaggagtg tgaatcaaaa taacgaaaag gcaagtaata aaatcatgag 1800

acttaagcga atcaatttat aaggaaaacc aaatcttacc aaaccaacta attttggttc 1860

ggttcattgg ttctcaacac caagaagatg acattacaat gcaagactct caattatatc 1920

attgaatcac atccaaataa aaataataat aaaaaaaact atggatcaaa taggagtaaa 1980

gaacacaata cagcatcaag ctacaaatca acaatcaatg atctcataga tgacggatta 2040

caagcaattg caaattgcta tatttaaaat ctcaaatggg ttaaaacgaa ccaatccaaa 2100

accaaattgc catatttaaa atctcaaatg ggttaaaact aaccaataca aaaccaaata 2160

taaaccttca agaaatggga acccgtagat aaatagagaa ctcagttccg gagatgagaa 2220

ttgagtattg agaccttgag gccgattttg ggagccaatg taggagtgac caactcttgc 2280

atgtgtttgt agcctttaac tctaatggtc tcggacttgg ctctatgtca caacctcacc 2340

aaggacacaa ataaggatga caacatcaat gaggccgcaa ttggagatgg caacatcaca 2400

tagagcatga gagagatgca attgcaaaag gggcatgcta gtgtgattgt gcaacaaggg 2460

aatggtttga gatgagatgt tgtgataaac aaggtagaag aaggtgcagc aaggggctag 2520

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gggtcaggtg atgaggatga gggcgagggc gagggcaaaa taaagtttaa ctagatagga 2700

ttttggttgg ggtaaaatgg tgtagtacaa gagtgaattg gttcggtagt ttcggttttc 2760

tgaccttaat gttgaacaga aaaactgatt ttttttcttt taataattga aactgatctg 2820

atgtacttag aacccaactg aaaaactaaa tcagtttggt ttggttgttt ggttaaacca 2880

atgagcgctc agccccagcc taatccagaa cttgtagaat cacattctat caagaaatgt 2940

caagttgtgc taaggtatag gctttattgc cttctatgga agtttactcc aatttataga 3000

actggaaatc ccctcatttt ccttaattgt gcaatggggt cgataccatg cctcaacaag 3060

aagaagggtg cggcaagggg cttggtggtt aggtgagatg gattgaagga ggaggaggag 3120

ggagggcaaa aaatggctta aatagctagg gtttgggttg gggtaaaatt gtgttctcta 3180

agagtaaaat tgattgagta ggaggaggct tctactaagt tctttattga tccttttcca 3240

tgtccttttc tcctcgtata taatatgtgc tatctaatga ttctttaagg agcaatatca 3300

aaaagctttg tggtttaatt ttatcaattg tgttaatagt ttgagtattt tgacactatc 3360

ctatatttat acactcccaa tttgttgaca catgtatttc tatggcatgc agtgtgttca 3420

taattctgat ccttttgctt gttgcatttg cttgtgttat aaatgaattt attaattttt 3480

ctccaacttg aagcagcata catcgtccaa tgcggcacct agatattatg cagatcttct 3540

gccttaattc tgcaacttga aaggtggaaa aagttaggaa agacagtgag ggggaatgca 3600

aggaatcttt tgtttaagat aagggcaaaa aatgagaggg aaaatagggt actaaatagt 3660

atcttggtca taggtgtcat ggcatatttc ctcttcatat tatttgtcct acctcttaaa 3720

tttgtcttac aaatatgtag agggtatcat tgtaatttca tcattcacat tttatttacc 3780

ccaatttact tttgctttca gaacaaggtt aaattaactt ctctacatct tatttcctcc 3840

acttattttc ccccaattat ccctagcagt ataataattt ttgtttgatt gaatcttgtg 3900

atatttaaat gtccaaaatg tctttccaca aaaaactttc gttcatggca aactcagaca 3960

ttgccataaa agagctgaaa gatggtgtct aaagcagttg gacttagtaa gaaccatgtg 4020

gaaaaatgat cttattttga acagctgaaa ttttggaaat gtgctgcata gcccctattg 4080

gaatgatcat aatcataggc caaagtgaat gcttcttgga tgatagaaga gttcttctga 4140

cagaattatg ctggacttat gaagacttaa agtcatgtgc aatcaaagct cttatgtact 4200

tttactgcta attagcatgt ttttctaaga gtagtcattt ttttttatat tttgcatgtc 4260

ctttatctct tgatgccttt tcaagtaaat gatcatgaca agatcatttt ccacggcatg 4320

aaatttctga caacttatta attaaacatg cttttatgat gcttgtgtta ggtgcttact 4380

gatgttgaga gtctcattat ggatgataag attgttgaag atgaagtaaa taaagaatct 4440

gttccaatgc gggagacagt tagcatcaga aaaattggat ctaaaccaag gtccattcct 4500

ccacccggca gagggcaaag aatatatgac atagatccaa gcttgacagg ctttcgtcaa 4560

cacctagatt accggtgaga tgatgctcct actaagtgtt ttattgatcc ttttcgtgtc 4620

cttttctcct aatttataat atatgatata taatgattat ttagggagca ataccaaaaa 4680

actttgtggt ttaattttat caattatgtt aatattttga gtattttatc actatcctag 4740

agttatactc tctccatttg ttagcacatg caaaattgta attgtacgtc tatggcatgc 4800

tgtgtgctca tatcttttat cctttttact tgttgcattt gcttgcatta tgatcaaagt 4860

tattaatttt tctccatctt gaagtagcat aaatgagtaa acagatgtta acatatcaat 4920

cacaaaagaa agccttcaac tccattccat tttgttctct aaaaacaatt tataccaagt 4980

attttaatta aaggtataat cattgatcaa aatcaccaaa atgcccactt ggaaacccaa 5040

ggaaattaac tctttttcct tgaaagagag ctgaaatata atttccaatt ccacttgtcg 5100

ttttattctt gtgattaagt ggattttctg gtagcactgt ataattttta aggttgagac 5160

ttgagatatt gttttcatta tgcagaagca ttagaattct ttatgggatt gggattttaa 5220

tgctgcaata cttctctgct atcctgttat tagaataact cttgtgttaa tttttgtctt 5280

ttcatttagt attcctgctt cttgctgtgt gtgtgtgttt ttttttcaac cccagcagtt 5340

tagagacttt agcattatga aaagttgagc atattaaagt tgcagaaaag aaaagttgac 5400

agaggagacc taggatgata tgaagcagtg aaaaagggaa aaacatcttt aaactctagg 5460

atatattggc tctatcttct gaagatgtag ccctaaatgg gaggaaaaaa gggaaagcat 5520

ctttgatgtt gactattttt ggactaaggc taatttaatc tattattttt caaatactta 5580

aatctattgt attttctttg atcttttgtc caattatagg tattcacagt acaaaagact 5640

ccgagaagaa attgacaagt atgaaggtgg tctggatgca ttttctcgtg gctatgaaaa 5700

gtttggtttc tcacgcaggt actatcgctg ttttgatcca tgcatgttga tcatgttgct 5760

ttcctatctt ctgttgcatt atgattgtgg cttctttaca tggacatctc tgcatctttt 5820

gtttaatgaa tcttttcttt gctcatatcc tagttttcat cacagtgaac tctaactgaa 5880

aaataatgga caatctttga tgtgaaatgt ggaggaggta ttacaataaa ttgtggaata 5940

tactcgcact attattatct tcagataaag tatttgcaac attagcatca ttatctagat 6000

ggtaccatgg ttcttgagtc agttggtttt tgtccattgc agtttgttat ttatgtatta 6060

taatagttag gaagttcttt tgagacaggt tgacttttta tgttttattt ctaggctttt 6120

ggaagagact tatccttgtg cttagaaatg gcaataagaa gttgggatca gataagttag 6180

tgtggacctt gtaacttcac ctatagattg tttcaaataa tttacttttg taactgaggt 6240

ggcaaattga aagctatgat attggcctat gaatttgaat acttctgttg acttctttgt 6300

gcacttattt atgcttttgg cttctctcat cttcagatgc atgccttttt aaactaacaa 6360

taagtaagaa ataattttgc agttctggag cgaaattttt ttcccttatc aatcaatctt 6420

agtttcttga aataattctt catttttgca tattataatt tctactggat ttcagtgaaa 6480

caggaataac ttatagagag tgggcaccag gagctacggt tagttctgtc ccatttcttt 6540

attatgtgtt ttgaatatcc atttggcata tgtgctctac taaacatgat atttgtgtta 6600

tatactctca aatatggcga cagtcagttg tggtttcatc ttgaatatcc actgcttggt 6660

tgtagtactt gtattacaaa acaagtttgt gggcataatt ttctggtgat gcatcagctc 6720

tctgcttgta taaatatcca ttcatttata caaggggctg cttctttgtg gtctgtcaat 6780

tgaaccacta ggataatgtt ctttttggct gatactgaga actaattgac tgttcaaaaa 6840

gcggcttttg ttttcatttc ttgtcaagta tattaatata tttatgttgt tttcagtggg 6900

ctgcattgat tggagatttc aataactgga atcctaatgc agatgtcatg actcaggtat 6960

gctatttttg catcggtttg ttgattgttc aatccagcca tgaacttttc tcttcaattg 7020

atctgatatc atgaatatat atttatataa ttccttttta aaagatattc gtggtagtgg 7080

tattattgcc actggtgtag tatgatattt aaggttcaat tcagtccaac atctcgccat 7140

ttccaaaaca tctattaaac accatgatta ttacatttat tgatcgtaga tatatattct 7200

ggccattcat tggttgaatg aggatactca tctgaaagaa ttctccatgt tcttatatta 7260

cattatgcaa ttggtacttt tttttctttg tcaaaacaat tgatactgtt tgcttggctg 7320

aaagttgaca attttgctta tttagagttt ggaatagtat ccaaagacta tgaaaaattg 7380

aacatttaga gttctcatct ccttaaaaac tggaatcctc atatgtagtt gcattggggt 7440

tgttcttgga tcatctttat tggccttgag catgggaaag gggcagttat aactttgttt 7500

gaggtagtgg ggtggttctt tgtgttaatt tttttttggg agggggggaa gtaggcagga 7560

actctggaga aagtcgatat ctgcaaaggt ttactatttg cttgcagtat tggattattc 7620

cttctgtatt agatttctta tggtgctaat tgactcacct tcctgtgcag aatgagtgtg 7680

gcgtctggga gatctttttg ccgaataatg cagatggttc accaccaatt ccccatggtt 7740

ctcgagtaaa ggtaatcttt ctagagaatg aaattcggaa tcatatcctt ctgtcctttc 7800

tttttttcat caagtacaca aaatgtgttt gtttcctttt aatttcattt ctagatattt 7860

attcacatga aaagtctaaa taaaagcttc taggaatttt ttgcatttct agttgttttg 7920

ctgaaggggt ggctttttta tactagctag tgaatatcac atcaaatgaa gcaacttctg 7980

tacaaacaga agcagagagc atgtagtttt gtcattttat ctgaactata taaaataata 8040

aggaaaatga ttgtaatctg tatttgcaaa aggatatttt gtttcttatt ggacagtaga 8100

caaatgtaaa tctggcaact gaagatgatc tgttcttttc ttgtaaaaat gaggactgaa 8160

agctcagcac gtgtgaaaat aacatggtgg ctgctttgtt ctgtgtttag ttgccaaaag 8220

gacatgacaa tctgatattt tttttgtaaa aatgaaaagg gggtgagacc gtgagagttc 8280

agcaagcttg aaactaacac gatggcttct ttgctctgtg acaaaattat ctttaagctt 8340

tctgtgccat agaacttctt cctgtaattt gagcataatt actaattaat tatccaagcc 8400

ttgggcacag tggttaagca cattctgaat ttgaaggttt tatctttttc tcattataga 8460

tgatgaaatt tctagaagat ggaacaagtg aagctctttt ttatttctgg attgtacaag 8520

agagacttct ttagtagccc ctatattcct cagcaactga aattaaatct atttgattct 8580

taaaagcctt gtccacctcc ccagacaagt acttcaagtt actcaaaata tggcacatta 8640

ccattttatt tatgcttctt tttcctttac gaaaaatact ttcatgaggt gtctgtatat 8700

gtggatgcgt gaggtttagc actttagctt ctgccattta ccttccatgc tttctaagaa 8760

gacagaagac taatatctga atgggcttcc agttatagtt gtttggatta attatggttt 8820

agtaagatgg taaatcttat ttaaggtctt taaaactatg ccatgtcaga attgctggtc 8880

tttgaaattt gaaaatctaa aatgtcgtta acctaagact ctaagtcgcg agccctaact 8940

caaccatgtg tatgtagata cgcatggata ctccatctgg caacaaagat tctattcctg 9000

cttggatcaa gttctcagtt caagcaccag gtgaactccc atataatggc atatactatg 9060

atcctcccga ggaggtatgt ttgtcccttt ttcttctttc ttagtttttt tttccttaac 9120

agtaagagaa gttactgaac tgctgataat aatatggaat ttaagtcaat aaaaagtagc 9180

agaaaatgtt aaaaattggt agtaatatta ctaaaaccag gttttgtgaa tgcttaaaaa 9240

atatgtcacc tgttgttggc cccaccagtt ttccattgtc cttggaaaga agtcagaaaa 9300

taatacccat ggttgggagt tgggcatttt atatgctgca aaagagaatg gtttgttagg 9360

tttacaaagc atcatcataa tgaacaaatg tatttgactg gccacaatac tcaatatagc 9420

cttacttgta cctatgtagg acttttggct tttgtggaga gatgcatttg attctataaa 9480

atgcttgcaa ttgcaaaatc agttgaaatt ttcttgtact ttaaaaaaaa aaattcattg 9540

gcattgatgg tgttacttgt tttttcgcag gagaagcatg tgttcaaaaa tcctcagcca 9600

aagagaccaa aatcacttcg gatttatgag tcgcacgttg gaatgagtag tacggtgtga 9660

ttttttcccc attgtctcat gtaaaattat ttgttaatta ttttcaaaaa catggtaata 9720

tatataggta acacgctcac acacatatat atacacattt atcttgaaga actctaggat 9780

attattagag ttgagtcctt gttaggcaca atttagtttg tcgatttaca accttattat 9840

ggttctggtt tccattgaac ctgaaggatt ggcatgcttt gtatataaaa catgtcaact 9900

ttgaattgca ggagccagta attaacacat atgccaactt tagagatgat gtgcttcctc 9960

gcatcaaaaa gcttggctac aatgctgttc agctcatggc tattcaagag cattcatatt 10020

atgctagttt tgggtttggt tctttggcat tagctccatg tttattgttt atcaacagtt 10080

ggtgcttgtg ttggagtgcc tcttccttgt ctcctcataa acttgcaagt tccctttggt 10140

ccaatgcagg tatcacgtca caaactttta tgcagctagc agccgatttg gaactcctga 10200

tgatttaaag tctctaatag ataaagctca cgagttagat cttcttgttc tcatggatat 10260

tgttcatagg tactattgct acaaacgtta gatactgtca aatgtcaata tttgtaataa 10320

ttgctaagct ctttttagcg ttggggttag ggggctattt ggctgaatta agaaattaaa 10380

tggttttctg gcttattcat tctatttttt ttaaaatttg ctttgtttgc tgccattgac 10440

attgagctcg atcccgttat gttgaaatat tcaattttgc acctattata attttattct 10500

tttgtatatt actaagctgt tgaaaaagat tgtaggaaac agacatgttg tggagtgatc 10560

tagaagttag tatgcttagt cagatttagt tgaaattaca ttaagaacta tctcaacatt 10620

tattaggatt gacaacttgt aaaaagtagc aacctgagct taggttttgc taagcgtctc 10680

aggtttgttg ttcaaatatt cagctgactc acattgttac tgcatctgac agaagcatgt 10740

taatattaat atgatttcaa cttcatctga tgtatggaca gaattctctt tcttagattg 10800

gttgcaaatg tcctctcttg catatttgtt tagtgaactt gttttagcat ctttgtgatc 10860

attaatgtga tgatgcgatt ctctcatatt ttctgttacc taggatacta gtggaatcat 10920

ttgccacaaa tctcggtcaa attttacctc ttattcattt ggtccactaa tatttttgtc 10980

ttgttcaatg aaatttatca aacaaatatc tagccatgca tcaactaata cgttggatgg 11040

gctgaatatg tttgatggta cggatggtca ctactttcac tctggaccac ggggtcatca 11100

ttggatgtgg gactctcgcc ttttcaacta tgggagctgg gaggtatata attttttgaa 11160

atttgtgaaa tagtttactg tactgagttt tccagtgtgc tttcccttta tcctgtcatt 11220

ggtcaagact aattcttgct gattgattca ggttctaagg tttcttcttt caaatgcaag 11280

gtggtggttg gatgagtaca agtttgatgg gttcagattt gatggggtga cttcaatgat 11340

gtacacccat catggattgc aggtaccatt taagtggcta ggaaatttat tgtttttcat 11400

tctgaagcac aatgatttgg ttaattgttc aatagctttt tatcaaggca tcaatatgcc 11460

taatttactc gattggatgg gctaacttga ttcctacttt aagttaacca aacatcattc 11520

tgactggtaa tgatgagttt catgttctca ttttggcatt tagcctatct ggggaaatta 11580

ataatgcaac ttatcttttt cttaaaactt ctttgttgat ggtaaatgtt ccctcctaca 11640

ctcacaattt tgcatgcttg atgtaggtag attttaccgg caactacaat gaatactttg 11700

gatatgcaac tgatgtagat gctgtggttt atttgatgct gttgaatgat atgattcatg 11760

gtctcttccc agaggctgtc accattggtg aagatgtatg ttaattccat cattgcagaa 11820

accatcacct agactcttag atctaataat cttctcatgc tctttcctga cttttctgtt 11880

taaaatgata atttcactct ttacaggtta gtggaatgcc aacagtttgc attccggttg 11940

aagatggtgg tgttggcttt gattatcgtc tccacatggc tgttgctgat aaatgggttg 12000

agattattca gtatgcttct ttaaaaacct ttaccacttc atttttacta gctggaatct 12060

atcatctctg agttgatgtt agttttgagt tgtaaggtca aatctatcct atatttttct 12120

ttgtactgat actggatgta ggaagagaga tgaagattgg aaaatgggtg acattgtaca 12180

tatgctgacc aacaggcggt ggttggaaaa gtgtgtttct tatgctgaaa gtcatgacca 12240

ggcccttgtt ggtgacaaaa ctattgcatt ttggctgatg gacaaggtca gagaattttt 12300

ctcctattga tttgtgcaca tcactctacc ctgcacacaa tccaaagtta gaatgtccaa 12360

gctttatggt tctaaggatg ggcttggata gacatcacat attttgtgac accttgatac 12420

agcaattctt tgaaaagcat aagtgaatta attctgctgt ttaatcttga ctggtcaacc 12480

ttcttgaggt catcttaact tgatggagaa tttttttttc accacaataa aactagaggg 12540

ataaattacc tgtatgatct tttaaaggga ctgatcttgg aaactactat accagaatca 12600

atttggtgtc ccttgcttct ctaactctat gataaaccaa agttatagtt tacacaagca 12660

ttggaaactc cattatgtgc atacaagatg ggaaattttg ctctttactt ttagaacata 12720

agcaattaat caattcttta tgaacatctt tttagataga tgccctctta tgaaacaatg 12780

ttgatatgca tcgggtaaag catgacttta aaaaagaggg catggtaaaa gagtaatttt 12840

atcaactggg cttgttagtt gctaaataat tgcggttggg cctggaacca ttcaacagtt 12900

caagtgccca gaccgaaacc agagccccag gggtcagaga tcaattttgc ctccccaacc 12960

ctcaaacctg actggagtct aagattcaac ctgctttttt tttcctaaga aaattgaaaa 13020

aaaaaattgg ccatgattgc ttcaaaccca gtgctgaact gggactggac ctatgtagtc 13080

tggtttaggg gcttccagcg atgattggaa ctgccagttc caacctggaa ccagcccggt 13140

gccgggatta catggtacct acttatttca tgctcttaca atattttatt gtgtagaatt 13200

tactaggagc caccagtgct tgtatattta tataaaagtt attttacttg ccatttgcaa 13260

acatatatta agaaaatgat 13280

<210> 4

<211> 837

<212> PRT

<213> Manihot esculenta

<400> 4

Met Gly His Tyr Thr Ile Ser Gly Ile Arg Phe Pro Cys Ala Pro Leu

1 5 10 15

Cys Lys Ser Gln Ser Thr Gly Phe Tyr Gly Asp Arg Arg Thr Ser Ser

20 25 30

Cys Leu Ser Phe Asn Phe Lys Lys Glu Ala Phe Ser Arg Arg Val Phe

35 40 45

Ser Gly Lys Ser Ser His Glu Ser Asp Ser Ser Asn Val Met Val Thr

50 55 60

Ala Ser Lys Arg Val Leu Pro Asp Gly Arg Ile Glu Cys Tyr Ser Ser

65 70 75 80

Ser Thr Asp Gln Leu Glu Ala Pro Gly Thr Val Ser Glu Glu Ser Gln

85 90 95

Val Leu Thr Asp Val Glu Ser Leu Ile Met Asp Asp Lys Ile Val Glu

100 105 110

Asp Glu Val Asn Lys Glu Ser Val Pro Met Arg Glu Thr Val Ser Ile

115 120 125

Arg Lys Ile Gly Ser Lys Pro Arg Ser Ile Pro Pro Pro Gly Arg Gly

130 135 140

Gln Arg Ile Tyr Asp Ile Asp Pro Ser Leu Thr Gly Phe Arg Gln His

145 150 155 160

Leu Asp Tyr Arg Tyr Ser Gln Tyr Lys Arg Leu Arg Glu Glu Ile Asp

165 170 175

Lys Tyr Glu Gly Gly Leu Asp Ala Phe Ser Arg Gly Tyr Glu Arg Phe

180 185 190

Gly Phe Ser Arg Ser Glu Thr Gly Ile Thr Tyr Arg Glu Trp Ala Pro

195 200 205

Gly Ala Thr Trp Ala Ala Leu Ile Gly Asp Phe Asn Asn Trp Asn Pro

210 215 220

Asn Ala Asp Val Met Thr Gln Asn Glu Cys Gly Val Trp Glu Ile Phe

225 230 235 240

Leu Pro Asn Asn Ala Asp Gly Ser Pro Pro Ile Pro His Gly Ser Arg

245 250 255

Val Lys Ile Arg Met Asp Thr Pro Ser Gly Asn Lys Asp Ser Ile Pro

260 265 270

Ala Trp Ile Lys Phe Ser Val Gln Ala Pro Gly Glu Leu Pro Tyr Asn

275 280 285

Gly Ile Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Lys Tyr Val Phe Lys Asn

290 295 300

Pro Gln Pro Lys Arg Pro Lys Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Ser His Val

305 310 315 320

Gly Met Ser Ser Thr Glu Pro Val Ile Asn Thr Tyr Ala Asn Phe Arg

325 330 335

Asp Asp Val Leu Pro Arg Ile Lys Lys Leu Gly Tyr Asn Ala Val Gln

340 345 350

Leu Met Ala Ile Gln Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr His

355 360 365

Val Thr Asn Phe Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro Asp Asp

370 375 380

Leu Lys Ser Leu Ile Asp Lys Ala His Glu Leu Gly Leu Leu Val Leu

385 390 395 400

Met Asp Ile Val His Ser His Ala Ser Thr Asn Thr Leu Asp Gly Leu

405 410 415

Asn Met Phe Asp Gly Thr Asp Gly His Tyr Phe His Ser Gly Pro Arg

420 425 430

Gly His His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Ser Trp

435 440 445

Glu Val Leu Arg Phe Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu Asp Glu

450 455 460

Tyr Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Met Tyr

465 470 475 480

Thr His His Gly Leu Gln Val Asp Phe Thr Gly Asn Tyr Asn Glu Tyr

485 490 495

Phe Gly Tyr Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Leu

500 505 510

Asn Asp Met Ile His Gly Leu Phe Pro Glu Ala Val Thr Ile Gly Glu

515 520 525

Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Val Cys Ile Pro Val Glu Asp Gly Gly

530 535 540

Val Gly Phe Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Val Ala Asp Lys Trp Val

545 550 555 560

Glu Ile Ile Gln Lys Arg Asp Glu Asp Trp Lys Met Gly Asp Ile Val

565 570 575

His Met Leu Thr Asn Arg Arg Trp Leu Glu Lys Cys Val Ser Tyr Ala

580 585 590

Glu Ser His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe Trp

595 600 605

Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg Pro Ser

610 615 620

Thr Pro Leu Ile Asp Arg Gly Val Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu

625 630 635 640

Ile Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn

645 650 655

Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Gly Asp Leu His

660 665 670

Leu Pro Ser Gly Lys Phe Val Pro Gly Asn Asn Tyr Ser Tyr Asp Lys

675 680 685

Cys Arg Arg Arg Phe Asp Leu Gly Asn Ser Lys Arg Leu Arg Tyr His

690 695 700

Gly Met Gln Glu Phe Asp Gln Ala Ile Gln His Leu Glu Glu Ala Tyr

705 710 715 720

Gly Phe Met Thr Ser Glu His Gln Tyr Ile Ser Arg Lys Asp Glu Arg

725 730 735

Asp Arg Ile Ile Val Phe Glu Arg Gly Asn Leu Val Phe Val Phe Asn

740 745 750

Phe His Trp Thr Ser Ser Tyr Ser Asp Tyr Arg Val Gly Cys Leu Lys

755 760 765

Pro Gly Lys Tyr Lys Ile Val Leu Asp Ser Asp Asp Pro Leu Phe Gly

770 775 780

Gly Phe Gly Arg Leu Ser His Asp Ala Glu His Phe Ser Phe Glu Gly

785 790 795 800

Trp Tyr Asp Asn Arg Pro Arg Ser Phe Met Val Tyr Thr Pro Cys Arg

805 810 815

Thr Ala Val Val Tyr Ala Leu Val Glu Asp Glu Val Glu Asn Glu Val

820 825 830

Glu Pro Val Ala Gly

835

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEI-sgRNA1

<400> 5

ggatggttcc aaccatagga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEI-sgRNA2

<400> 6

ccatcatcat gggatcaaca 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBE1-sgRNA1-LP

<400> 7

gattgggatg gttccaacca tagga 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEI-sgRNA1-RP

<400> 8

aaactcctat ggttggaacc atccc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEI-sgRNA2-LP

<400> 9

gattgccatc atcatgggat caaca 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEI-sgRNA2-RP

<400> 10

aaactgttga tcccatgatg atggc 25

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEII-sgRNA1

<400> 11

atgggacact acaccatatc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEII-sgRNA2

<400> 12

aaagagtcct tcctgatggt 20

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEII-sgRNA1-LP

<400> 13

gattgatggg acactacacc atatc 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEII-sgRNA1-RP

<400> 14

aaacgatatg gtgtagtgtc ccatc 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEII-sgRNA2-LP

<400> 15

gattgaaaga gtccttcctg atggt 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEII-sgRNA2-RP

<400> 16

aaacaccatc aggaaggact ctttc 25

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEI-FP 引物序列

<400> 17

aatttggatt taatagagaa gca 23

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEI-RP 引物序列

<400> 18

ctgtgattgc tgaagatgtt tc 22

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEII-FP 引物序列

<400> 19

actttctttg ctagaaaatc ttt 23

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<223> SBEII-RP 引物序列

<400> 20

atatttaagt ttagagtttg ag 22

Claims

1.提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，其特征在于：它采用如下的方法步骤：

(a)如SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：3核苷酸序列中的核酸序列；

(a)对SBEI或者SBEII基因所在基因组区域的编辑或对包含SBEI或者SBEII基因所在基因组区域的编辑；

步骤六：从终止SBEI或者SBEII多肽的表达或终止有生物功能的SBEI或者SBEII多肽的形成后的植物中选择出相较调节前植物而言性状获得变化的植物，包括：直接产生的较调节前而言性状获得变化的植物；杂交或者自交产生的有外源基因的相较调节前植物而言性状获得变化的植物；杂交或者自交产生的无外源基因的相较调节前植物而言性状获得变化的植物。

2.根据权利要求1所述的提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，其特征在于：所述薯类植物包括：木薯，甘薯、马铃薯、山药、芋头、葛根、魔芋、洋姜或雪莲果。

3.根据权利要求1所述的提高植物直链淀粉含量和降低支链淀粉含量的方法及应用，其特征在于：编辑所述SBEI或者SBEII核苷酸序列的sgRNA靶向SBEI或者SBEII基因组核苷酸序列；较佳地，靶向SBEI基因组的第1939-1958位和2948-2967位；或者SBEII基因组序列的1-20位和1193-1212位。