CN110964733B

CN110964733B - 一种水稻半显性脆秆控制基因、分子标记及应用

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Publication number: CN110964733B
Application number: CN202010005986.7A
Authority: CN
Inventors: 叶亚峰; 刘斌美; 吴跃进; 陶亮之
Original assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2020-01-03
Filing date: 2020-01-03
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2040-01-03
Also published as: CN110964733A

Abstract

本发明公开一种水稻半显性脆秆控制基因，涉及涉及生物技术领域，该基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，本发明还公开编码该基因的编码蛋白，该蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，本发明还公开含有上述基因的表达载体、宿主细胞，本发明还公开半显性脆秆水稻的分子标记方法，本发明还公开一种培育植物茎秆变脆的方法，包括以下步骤：将表达载体pSdbc1F转化植物细胞，将转化的植物细胞培育成植株。本发明的有益效果在于：本发明提供了一个水稻半显性脆秆基因Sdbc1的核苷酸序列及其蛋白序列，为水稻茎秆机械强度研究提供了理论依据以及基因资源，同时为水稻转基因研究提供了有力的工具。

Description

一种水稻半显性脆秆控制基因、分子标记及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种水稻半显性脆秆控制基因、分子标记及应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上十分重要的粮食作物，其总产量占世界粮食总产量的1/4，全球一半以上的人口以水稻为主食。水稻的茎秆机械强度是其重要的农艺性状之一，直接关系到水稻植株的抗倒伏能力，从而最终影响水稻的产量。而另一方面，水稻每年还生产大量的秸秆，由于生物质的抗降解屏障导致秸秆难降解，因此秸秆处理一直是育种家面临的难题，不利于直接还田。所以寻找一个不影响水稻的抗倒伏的前提下，秸秆易还田的材料是重要的目标之一。

水稻茎秆的机械强度以及其生物质抗降解屏障都是由次生细胞壁所决定的，次生细胞壁是特定细胞在停止生长后，在初生细胞壁内侧继续积累的细胞壁层。次生细胞壁主要有纤维素，半纤维素和木质素组成。每一个成分的改变都会影响次生细胞壁的合成，从而影响植株的机械强度。在水稻中，脆秆突变体是研究水稻次生细胞壁的重要材料，在已报道的脆秆突变体中，大部分都是由于纤维素含量的降低最终影响到次生细胞壁的加厚。近些年来，通过GWAS，QTL分析以及图位克隆的方法已经鉴定和解析了多个控制水稻次生细胞壁合成的关键基因。例如OsCESA4，OsCESA7，OsCESA9这3个基因是编码水稻次生细胞壁纤维素合成酶催化亚基，他们的突变都会导致茎秆机械强度改变，表现出脆秆表型。影响纤维素组装与排列的基因BC1和BC12；影响纤维素合成酶囊泡运输的基因BC3；影响半纤维素合成基因BC10；以及调控水稻次生细胞壁合成基因CEF1/MYB103L。这些基因的研究不仅为水稻次生细胞壁的合成提供新的理论，而且这些突变体材料也为水稻秸秆高效利用提供了新的资源。其中cef1突变体不影响植株的正常生长情况下，纤维素含量降低，茎秆易粉碎，使其具有秸秆直接还田的应用前景。杂交稻不仅是水稻产量提升的一大飞跃，而且其生物量也比常规稻更大，因此杂交稻的秸秆处理问题更加棘手。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种水稻半显性脆秆控制基因。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种水稻半显性脆秆控制基因SDBC1，所述SDBC1基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

有益效果：利用重离子辐照中国粳稻品种武运粳7号(WYJ7)获得一个半显性脆秆突变体，之后利用图位克隆的方法分离鉴定出一个控制水稻茎秆机械强度的基因SDBC1(semi-dominant brittle culm 1)，通过对一对材料的表型分析及遗传互补实验，证明了该基因在水稻茎秆机械强度以及纤维素含量控制方面的功能。

可为今后从分子水平阐明水稻次生细胞壁合成调控遗传基础，以及为水稻基于分子设计的环境友好型新品种育种提供理论依据及材料支持。

优选的，所述SDBC1基因的突变位点位于LOC_Os09g25490基因序列的第1629位置碱基处，所述突变位点由G突变为A。

有益效果：基于sdbc1突变的半显性效应，该突变位点可以应用于解决杂交水稻的秸秆处理的问题(直接粉碎还田或应用于生物质能源的生产)。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种水稻半显性脆秆控制基因编码蛋白。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种水稻半显性脆秆控制基因SDBC1编码蛋白，所述SDBC1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

有益效果：SDBC1蛋白属于次生细胞壁纤维素合成酶复合体中一员OsCESA9，包含N端的锌指结构域，8个跨膜结构域，以及第二和第三跨膜结构域之间的胞内催化活性区，该区含有几个保守的天冬氨酸残基(D)，在结合底物和催化糖基转移过程中发挥关键作用。本发明涉及sdbc1蛋白与SDBC1/OsCESA9蛋白相比，胞内催化活性区第一个保守的天冬氨酸突变为天冬酰胺(N)，而该突变位点不影响其表达模式以及蛋白亚细胞定位，但是能够竞争与野生型SDBC1蛋白与其他复合体成员(如OsCESA4和OsCESA7)的蛋白互作，最终形成功能缺失或只有部分功能的纤维素合成酶复合体，因而该位点突变表现出半显性效应。

优选的，所述SDBC1基因编码蛋白的突变位点位于LOC_Os09g25490基因序列编码蛋白在387位氨基酸处，所述突变位点由天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)。

本发明所要解决的技术问题之三在于提供一种水稻半显性脆秆控制基因的表达载体。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种水稻半显性脆秆控制基因SDBC1的表达载体。

优选的，所述表达载体为pSdbc1F。

有益效果：构建了sdbc1突变体基因重组植物表达载体pSdbc1F，并将其转化WYJ7野生型水稻中，性状观察显示转基因植株均表现出茎秆变脆的表型，从而确定了SDBC1基因为半显性脆秆的控制基因。

本发明所要解决的技术问题之四在于提供一种水稻半显性脆秆控制基因表达载体的宿主细胞。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种水稻半显性脆秆控制基因SDBC1表达载体的宿主细胞。

优选的，所述宿主细胞为植物细胞。

本发明所要解决的技术问题之五在于提供一种半显性脆秆水稻的分子标记方法。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种鉴别水稻半显性脆秆基因SDBC1突变位点的分子标记方法，包括以下步骤：

(1)利用正向引物sdbc1-jd-F和反向引物sdbc1-jd-R，进行PCR扩增，所述正向引物sdbc1-jd-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物sdbc1-jd-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

(2)扩增产物利用AhdI酶切，若酶切结果只有一条带，则该突变位点为纯合型，若有两条带，则突变位点为杂合型。

有益效果：该突变位点可以应用于解决杂交水稻的秸秆处理的问题(直接粉碎还田或应用于生物质能源的生产)。

本发明所要解决的技术问题之六在于提供一种培育植物茎秆变脆的方法。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种培育植物茎秆变脆的方法，包括以下步骤：将表达载体pSdbc1F转化植物细胞，将转化的植物细胞培育成植株。

有益效果：本发明构建了sdbc1突变体基因重组植物表达载体pSdbc1F，并将其转化WYJ7野生型水稻中，性状观察显示转基因植株均表现出茎秆变脆的表型，从而确定了SDBC1基因为半显性脆秆的控制基因。

优选的，所述植物为水稻。

本发明的优点在于：

(1)本发明利用重离子辐照中国粳稻品种武运粳7号(WYJ7)获得一个半显性脆秆突变体，之后利用图位克隆的方法分离鉴定出一个控制水稻茎秆机械强度的基因SDBC1(semi-dominant brittle culm 1)，通过对一对材料的表型分析及遗传互补实验，证明了该基因在水稻茎秆机械强度以及纤维素含量控制方面的功能；

(2)本发明的sdbc1蛋白与SDBC1/OsCESA9蛋白相比，胞内催化活性区第一个保守的天冬氨酸突变为天冬酰胺(N)，而该突变位点不影响其表达模式以及蛋白亚细胞定位，但是能够竞争与野生型SDBC1蛋白与其他复合体成员(如OsCESA4和OsCESA7)的蛋白互作，最终形成功能缺失或只有部分功能的纤维素合成酶复合体，因而该位点突变表现出半显性效应；

(3)本发明构建了sdbc1突变体基因重组植物表达载体pSdbc1F，并将其转化WYJ7野生型水稻中，性状观察显示转基因植株均表现出茎秆变脆的表型，从而确定了SDBC1基因为半显性脆秆的控制基因；

(4)本发明提供了一个水稻半显性脆秆基因SDBC1的核苷酸序列及其蛋白序列，为水稻茎秆机械强度研究提供了理论依据以及基因资源，同时为水稻转基因研究提供了有力的工具，可促进提高水稻秸秆高效利用的品种培育；

(5)与现有技术相比，SDBC1是一个半显性脆秆基因，不仅可以应用于常规稻秸秆还田品种培育，而且还可以应用于杂交稻的秸秆还田品种的培育。

附图说明

图1为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的株型比较图；

图2为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的茎秆折断比较图；

图3为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的叶片折断比较图；

图4为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的茎秆抗折力测定结果图；

图5为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的叶片抗折力测定结果图；

图6为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的株高测定结果图；

图7为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的分蘖数测定结果图；

图8为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的穗粒数测定结果图；

图9为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的穗长测定结果图；

图10为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的结实率测定结果图；

图11为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的千粒重测定结果图；

图12为本发明实施例1中野生型WT的倒二茎秆横切面的电镜图；

图13为图12中标注的方形框内的放大电镜图；

图14为本发明实施例1中sdbc1突变体的倒二茎秆横切面的电镜图；

图15为图14中标注的方形框内的放大电镜图；

图16为本发明实施例1中野生型与sdbc1突变体杂交的F1代的倒二茎秆横切面的电镜图；

图17为图16中标注的方形框内的放大电镜图；

图18为本发明实施例1中sdbc1突变体、野生型WT、F1代的糖化效率分析结果图；

图19为本发明实施例2中SDBC1基因的精细定位图；

图20为本发明实施例2中SDBC1的候选基因；

图21为本发明实施例2中SDBC1蛋白的结构图；

图22为本发明实施例2中sdbc1同源蛋白保守位点分析；

图23为本发明实施例2中pSdbc1F表达载体的结构图；

图24为本发明实施例2中遗传互补植株的表型；

图25为本发明实施例2中dCAPs分子标记；

图26为本发明实施例3中OsCESA9基因的表达模式；

图27为本发明实施例3中OsCESA9与sdbc1蛋白的亚细胞定位；

图28为本发明实施例4中野生型田间收割现场；

图29为本发明实施例4中sdbc1突变体田间收割现场；

图30为本发明实施例4中野生型收割后的茎秆；

图31为本发明实施例4中sdbc1突变体收割后的茎秆；

图32为本发明实施例4中野生型收割后的茎秆长度分布图；

图33为本发明实施例4中sdbc1突变体收割后的茎秆长度分布图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例1

sdbc1突变体的表型分析

采用重离子¹²C⁶⁺诱变(能量80MeV，剂量120Gy)粳稻品种武运粳7号(WYJ7)获得sdbc1突变体，通过sdbc1突变体与野生型WYJ7杂交获得F1代植株，F1代自交，获得F2代群体，如表1所示，在F2代分离中，野生型：微脆：特脆的分离比为1：2：1，因此可以判定该突变体为一个半显性脆秆突变体。

表1为sdbc1突变体的遗传分析表

2.农艺性状测定

对sdbc1突变体、野生型WT、F1代的农艺性状进行测定，如图1-图11所示，该突变体与野生型相比，株高无明显差异，但茎秆和叶片非常容易折断，其他农艺性状如分蘖数、穗粒数、穗长、结实率、千粒重无明显差异。

通过遗传分析表明，sdbc1突变体与野生型WYJ7杂交的F1代植株茎秆呈现微脆表型，如图1-图11所示，其杂合形式F1除茎秆表现出微脆外，其他农艺性状如分蘖数、穗粒数、穗长、结实率、千粒重无明显差异。

3.茎秆横切面电镜观察

通过扫描电镜对野生型，sdbc1突变体以及F1的倒二节的茎秆的横切面进行观察发现，sdbc1突变体的厚壁组织的细胞壁(图16，图17为图16的局部放大)明显比野生型(图12，图13为图12的局部放大)要薄，而F1(图14，图15为图14的局部放大)则介于野生型与sdbc1突变体之间。

4.细胞壁成分分析

采用Xiong,G.,Li,R.,Qian,Q.,Song,X.,Liu,X.,Yu,Y.,Zeng,D.,Wan,J.,Li,J.,and Zhou,Y.(2010).The rice dynamin-related protein DRP2B mediates membranetrafficking,and thereby plays a critical role in secondary cell wallcellulose biosynthesis.Plant J 64,56-70.中公开的方法对野生型，sdbc1突变体以及F1的细胞壁成分进行测定；

采用Gao,Y.,He,C.,Zhang,D.,Liu,X.,Xu,Z.,Tian,Y.,Liu,X.H.,Zang,S.,Pauly,M.,Zhou,Y.,et al.(2017).Two Trichome Birefringence-Like ProteinsMediate Xylan Acetylation,Which Is Essential for Leaf Blight Resistance inRice.Plant Physiol 173,470-481.中公开的方法对野生型，sdbc1突变体以及F1秸秆的糖化效率进行测定。

结果如表2和表3所示，与野生型相比，sdbc1突变体的纤维素含量明显降低，F1的纤维素含量介于两者之间，也呈现出半显性效应。

如图18所示，与野生型相比，sdbc1突变体以及F1具有更高的糖化效率，在处理5小时的sdbc1和F1释放的可溶性糖含量与处理20小时的野生型释放的可溶性糖含量一致，而在处理20小时的sdbc1和F1释放的可溶性糖含量也明显高于同时间的野生型含量。糖化效率直接决定茎秆生物质转化为生物能源的利用效率，因此sdbc1突变体以及F1的秸秆在生物能源方面具有更高的利用效率。

表2为细胞壁成分分析表

表3为细胞壁成分分析表

实施例2

SDBC1基因的精细定位于图位克隆

1.定位群体构建

利用sdbc1突变体与籼稻品种93-11进行杂交，F1代均为微脆表型，F1代自交，选取F2代分离群体中的特脆单株和正常单株分别作为定位群体。每个单株取100mg左右的叶片，用来提取DNA。

2.简单重复序列(SSR，Simple Sequence Repeat)多态性筛选

利用已报道的均匀分布水稻12条染色体上的SSR引物对sdbc1突变体和93-11进行多态性筛选，获得具有多态性的SSR引物进行下一步试验。

3.SDBC1基因的初步定位

对由50个F2群体中的特脆单株组成的定位群体，选用筛选获得的SSR引物进行连锁分析。结果表型第九号染色体长臂端上的分子标记ISR10，ISR14，ISR15，ISR17，ISR19与突变基因有明显的连锁，如图19所示，图中Recombinants表示重组子，进一步分析表明SDBC1基因位于ISR14与ISR15之间，该区间大约1.7Mb范围。

4.SDBC1基因的精细定位

在ISR14与ISR15分子标记之间寻找更多的具有多态性的引物，SDBC1基因定位所用引物序列如表4所示，对更大的定位群体进行连锁分析，如图20所示，图中Recombinants表示重组子，最终将SDBC1基因精细定位在Indel标记A7和A8之间，大约45Kb的范围。

5.候选基因分析与SDBC1基因的克隆

对精细定位的45Kb区段内的候选开放阅读框(ORF)进行了详细地调查，发现该范围内共含有6个ORF。为确定SDBC1基因，对野生型和突变体的6个ORF进行了测序分析，如图21所示，结果表明ORF3的1629bp处存在从鸟嘌呤核苷酸(G)到腺嘌呤核苷酸(A)的点突变，该突变可导致ORF3编码的第387位天冬氨酸(Asp，D)突变为天冬酰胺(Asn，N)，且该突变位点位于OsCESA高度保守的催化区。因此推测ORF3(LOC_Os09g25490)是SDBC1的候选基因。

通过对SDBC1候选基因的进行进一步分析，发现该基因编码一个纤维素合成酶催化亚基，包含N端的锌指结构域，8个跨膜结构域，以及第二和第三跨膜结构域之间的胞内催化活性区，该区含有几个保守的天冬氨酸残基(D)，在结合底物和催化糖基转移过程中发挥关键作用。如图20和图22所示，该突变位点正位于第一个保守的天冬氨酸位置。

6.SDBC1的功能互补验证

为了验证LOC_Os09g25490就是SDBC1基因，基于上述所示sdbc1是一个半显性脆秆突变体，所以以sdbc1突变体的倒二节茎秆为材料，提取RNA并反转录扩增获得sdbc1全长cDNA。构建SDBC1自身启动子(ATG上游2500bp片段)驱动的sdbc1表达载体pSdbc1F，pSdbc1F表达载体的结构图如图23所示，将pSdbc1F表达载体转入野生型WYJ7中，获得转基因T0代植株全部表现为微脆表型，如图24所示。这一结果证明LOC_Os09g25490基因就是SDBC1基因，并且该位点的突变的确能具有半显性效应，SDBC1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示。

构建表达载体pSdbc1F所用的引物如下：

pSdbc1-F：5’-cggaattcCTATTATGATCTAACGGTCT-3’

pSdbc1-R：5’-ggggtaccGGCCGCGCAACAACGGCCGG-3’

sdbc1-CDS-F：5’-ggggtaccATGGAGGCGAGCGCCGGGCT-3’

sdbc1-CDS-R：5’-cgggatccTCAGCAGTTGATGCCGCACT-3’

表达载体pSdbc1F的构建方法包括以下步骤：

(1)利用pSdbc1-F和pSdbc1-R引物，以sdbc1突变体的DNA为模板，扩增获得的PCR产物，通过EcoRI和KpnI限制性内切酶双酶切，同时利用该酶对pCAMBIA2300骨架进行双酶切，进而利用T4连接酶将扩增出的pSdbc1的片段插入pCAMBIA2300载体中，获得中间载体pCAMBIA2300-pSdbc1。

(2)利用sdbc1-CDS-F和sdbc1-CDS-R引物，以sdbc1突变体的cDNA为模板，扩增获得的PCR产物，通过KpnI和BamHI限制性内切酶双酶切，同时利用该酶对步骤(1)中获得的中间载体pCAMBIA2300-pSdbc1进行双酶切，进而利用T4连接酶将扩增出的sdbc1-CDS片段插入pCAMBIA2300-pSdbc1载体中，获得最终载体pCAMBIA2300-pSdbc1-sdbc1，将该载体成为pSdbc1F。

从图25可以看出，利用sdbc1-jd-F和sdbc1-jd-R引物对野生型，sdbc1突变体，以及杂合形式F1和pSdbc1F转基因植株的DNA进行PCR扩增，扩增产物再利用AhdI内切酶进行酶切，酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示野生型和纯合的sdbc1都显示一条带，而杂合形式的F1以及pSdbc1F转基因都呈现出两条电泳条带，说明sdbc1-jd-F和sdbc1-jd-R一对引物可以用来作为鉴定sdbc1突变位点的分子标记。

实施例3

sdbc1突变不影响其表达模式与亚细胞定位

1.sdbc1突变不影响其表达模式

一个基因的表达模式决定该基因的功能。利用qRT-PCR分析野生型，sdbc1突变体和F1不同组织中SDBC1基因表达水平，结果如图26所示，该基因在三个材料中表达水平一致，表明sdbc1突变并不影响其表达模式。以上qRT-PCR分析用到的引物如下：

qSDBC1-F：5’-GAGCGCTTCTCCTACATCAACACC-3’

qSDBC1-R：5’-AACTCGCAAACGTGCTAATCGG-3’

2.sdbc1突变不改变其亚细胞定位

一个蛋白的亚细胞定位决定该蛋白的功能。利用野生型和sdbc1突变体的cDNA，以及如下引物扩增获得相关片段插入pCAMBIA1300中，最终获得SDBC1-GFP和sdbc1-GFP融合表达载体，进而分别转入农杆菌GV3101，注射烟草，培养48小时，通过激光共聚焦显微镜观察SDBC1与sdbc1的亚细胞定位。结果如图27所示，sdbc1与SDBC1定位一致。表明sdbc1突变并没有改变其亚细胞定位。

SDBC1-GFP-F:5’-gcggatccATGGAGGCGAGCGCCGGGCT-3’；

SDBC1-GFP-R:5’-ggctgcagGCAGTTGATGCCGCACTGCC-3’。

实施例4

培育水稻茎秆变脆的方法

通过杂交的方式(sdbc1突变体与正常水稻品种杂交，后代不断与正常品种回交，每一代利用分子标记追踪鉴定)，最终将sdbc1突变位点导入正常水稻品种中，这样正常品种的茎秆将会变脆，可以培育茎秆变脆的水稻品种；还可以通过转基因方法，将pSdbc1F载体转入正常水稻品种中，使正常水稻品种的茎秆也会变脆，其中转基因方法为现有技术。

实施例5

sdbc1突变体具有秸秆直接还田的应用前景

大面积种植野生型(WT)WYJ7和sdbc1突变体材料，其中WT为野生型英文的缩写，收获期通过联合收割机进行田间收割，收割现场分别如图28和图29所示，图28为野生型，图29为sdbc1突变体，sdbc1突变体的茎秆与叶片都均匀分布于田间，而野生型则成堆分布在田间，收割后的茎秆如图30和图31所示，图31为野生型，图32为sdbc1突变体，野生型和sdbc1突变体收割后的茎秆长度分布分别如图32和图33所示，可以看出sdbc1突变体收割后的小于5cm的茎秆长度分布超过60％，表明sdbc1突变体可以直接应用于秸秆还田，利于秸秆的降解。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院合肥物质科学研究院

<120> 一种水稻半显性脆杆控制基因、分子标记及应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3168

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

atggaggcga gcgccgggct ggtggccggg tcgcacaacc ggaacgagct ggtgctgatc 60

cgggggcacg aggagcccaa gccgctgcgg gcgctgagcg ggcaggtgtg cgagatatgc 120

ggcgacgagg tcggccgcac cgtcgacggc gacctcttcg tcgcctgcaa cgagtgcggc 180

ttcccggtgt gccgcccctg ctacgagtac gagcgccgcg agggcaccca gaactgcccc 240

cagtgcaaga cccgctacaa gcgcctcaag gggagcccga gggtgcccgg ggacgaggac 300

gaggaggaca ttgacgacct ggagcacgag ttcaacatcg acgacgagaa gcagaagcag 360

ctgcagcagg atcaggatgg catgcagaac agccacatca ccgaggcgat gctgcacggc 420

aagatgagct acgggagggg ccccgacgac ggcgacggca acagcacccc gctcccgccg 480

atcatcaccg gcgctcgctc cgtcccggtg agcggggagt tcccgatatc gaacagccat 540

ggccatggcg agttctcctc ttccctgcac aagcgcatcc acccctaccc ggtgtctgag 600

ccagggagtg caaagtggga cgagaagaaa gaggtgagct ggaaggagag gatggacgac 660

tggaaatcca agcagggcat cgtcgccggc ggcgcccccg atcccgacga ctacgacgcc 720

gacgtcccac tgaacgacga ggcgaggcag ccgctgtcga ggaaggtgtc gatcgcgtcg 780

agcaaggtga acccgtaccg gatggtgatc atcctccgtc tcgtggtgct cggcttcttc 840

ctccggtacc gcatcctcca cccggtgccc gacgccatcc cgctgtggct cacctccatc 900

atctgcgaga tctggttcgc cgtgtcgtgg atcctcgacc agttccccaa gtggtacccg 960

atcgacaggg agacctacct cgaccgcctc tccctccgct acgagcgcga gggggagccg 1020

tcgctgctgt cggcggtgga cctgttcgtc agcacggtgg atccgctcaa ggagccgccg 1080

ctggtcacgg ccaacaccgt gctgtccatc ctcgccgtcg actaccccgt cgacaaggtg 1140

tcctgctacg tctccgacaa cggcgcgtcc atgctcacgt tcgagtcgct gtcggagacg 1200

gcggagttcg cccgcaagtg ggtgccattc tgcaagaagt tcagcatcga gccccgcgcc 1260

ccggagttct acttctccca gaaggtcgac tacctcaagg acaaggtcca tcccaacttc 1320

gtccaggagc gccgcgccat gaagagagag tacgaggagt tcaaggtgag gatcaacgcg 1380

ctggtggcga aggcgcagaa ggtgccggcg gaagggtgga tcatgaagga cgggacgcca 1440

tggccgggga acaacacccg cgaccacccg ggcatgatcc aggtgttcct cggccacagc 1500

ggcggccacg acaccgaggg caacgagctc ccccgcctcg tctacgtctc ccgtgagaag 1560

cgccccggct tccagcacca caagaaggcc ggcgccatga acgccctcat tcgtgtgtcg 1620

gccgtgctga cgaacgcgcc gttcatgctc aacttggatt gcgatcacta catcaacaac 1680

agcaaggcca tcagggaggc gatgtgcttc ctcatggatc cgcaggtcgg acggaaggtt 1740

tgctacgtgc agttcccgca gaggttcgac ggcatcgacg tccacgaccg atacgccaac 1800

cgcaacaccg tcttcttcga catcaacatg aaggggcttg atgggatcca gggcccggtg 1860

tacgtcggga cagggtgcgt gttcaggcgg caggcgctgt acggatacaa cccacccaag 1920

ggacccaaga ggcccaagat ggtgacctgc gactgctgcc cttgcttcgg gaggaagaag 1980

cggaagcacg gcaaggacgg cctcccggag gccgtcgccg ccgacggcgg gatggacagc 2040

gacaaggaga tgctcatgtc gcagatgaac ttcgagaagc ggttcgggca gtcggcggcg 2100

ttcgtgacgt cgacgctgat ggaggaaggc ggcgtcccgc cgtcgtccag ccccgccgcg 2160

ctcctcaagg aggccatcca tgtcatcagc tgcggctacg aggacaagac cgactggggt 2220

ctcgagctgg ggtggatcta cgggtcgatc acggaggaca tcctaacggg gttcaagatg 2280

cactgccgcg ggtggaggtc ggtgtactgc atgccgaaga gggcggcgtt caaggggtca 2340

gcgccgatca acctatctga ccgtctcaac caggtgctcc ggtgggcgct cggctccgtc 2400

gagatcttct tcagccggca cagcccgctc ctctacggct acaagaacgg caacctcaag 2460

tggctcgagc gcttctccta catcaacacc accatctacc ccttcacttc tctccccctc 2520

ctcgcctact gcaccctacc cgccgtctgc ctcctcaccg gcaagttcat catgcctccg 2580

attagcacgt ttgcgagttt gttcttcatc gcgctcttca tctccatctt cgcgacgggc 2640

atcctggaga tgaggtggag cggggtgagc atcgaggagt ggtggaggaa cgagcagttc 2700

tgggtcatcg gcggcgtgtc ggcgcacctg ttcgcggtgg tgcagggcct gctcaaggtg 2760

ctggccggga tcgacaccaa cttcaccgtc acgtccaagg ccaccggaga cgaggacgac 2820

gagttcgcgg agctctacgc cttcaagtgg accaccctcc tcatcccgcc caccacgctg 2880

ctcatcctca acatcatcgg cgtcgtcgcc ggcgtctccg acgccatcaa caacggctcc 2940

gaggcgtggg gcccgctctt cgggaagctc ttcttcgcct tctgggtcat cgtccacctc 3000

taccccttcc tcaaggggct catggggagg cagaaccgga cgcccaccat tgttgtcatc 3060

tggtccgtgc tgctcgcctc catcttttcc ttgctctggg tcaggattga tcccttcacc 3120

atcaaggcca ggggccctga cgtcaggcag tgcggcatca actgctga 3168

<210> 2

<211> 1055

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 2

Met Glu Ala Ser Ala Gly Leu Val Ala Gly Ser His Asn Arg Asn Glu

1 5 10 15

Leu Val Leu Ile Arg Gly His Glu Glu Pro Lys Pro Leu Arg Ala Leu

20 25 30

Ser Gly Gln Val Cys Glu Ile Cys Gly Asp Glu Val Gly Arg Thr Val

35 40 45

Asp Gly Asp Leu Phe Val Ala Cys Asn Glu Cys Gly Phe Pro Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Tyr Glu Tyr Glu Arg Arg Glu Gly Thr Gln Asn Cys Pro

65 70 75 80

Gln Cys Lys Thr Arg Tyr Lys Arg Leu Lys Gly Ser Pro Arg Val Pro

85 90 95

Gly Asp Glu Asp Glu Glu Asp Ile Asp Asp Leu Glu His Glu Phe Asn

100 105 110

Ile Asp Asp Glu Lys Gln Lys Gln Leu Gln Gln Asp Gln Asp Gly Met

115 120 125

Gln Asn Ser His Ile Thr Glu Ala Met Leu His Gly Lys Met Ser Tyr

130 135 140

Gly Arg Gly Pro Asp Asp Gly Asp Gly Asn Ser Thr Pro Leu Pro Pro

145 150 155 160

Ile Ile Thr Gly Ala Arg Ser Val Pro Val Ser Gly Glu Phe Pro Ile

165 170 175

Ser Asn Ser His Gly His Gly Glu Phe Ser Ser Ser Leu His Lys Arg

180 185 190

Ile His Pro Tyr Pro Val Ser Glu Pro Gly Ser Ala Lys Trp Asp Glu

195 200 205

Lys Lys Glu Val Ser Trp Lys Glu Arg Met Asp Asp Trp Lys Ser Lys

210 215 220

Gln Gly Ile Val Ala Gly Gly Ala Pro Asp Pro Asp Asp Tyr Asp Ala

225 230 235 240

Asp Val Pro Leu Asn Asp Glu Ala Arg Gln Pro Leu Ser Arg Lys Val

245 250 255

Ser Ile Ala Ser Ser Lys Val Asn Pro Tyr Arg Met Val Ile Ile Leu

260 265 270

Arg Leu Val Val Leu Gly Phe Phe Leu Arg Tyr Arg Ile Leu His Pro

275 280 285

Val Pro Asp Ala Ile Pro Leu Trp Leu Thr Ser Ile Ile Cys Glu Ile

290 295 300

Trp Phe Ala Val Ser Trp Ile Leu Asp Gln Phe Pro Lys Trp Tyr Pro

305 310 315 320

Ile Asp Arg Glu Thr Tyr Leu Asp Arg Leu Ser Leu Arg Tyr Glu Arg

325 330 335

Glu Gly Glu Pro Ser Leu Leu Ser Ala Val Asp Leu Phe Val Ser Thr

340 345 350

Val Asp Pro Leu Lys Glu Pro Pro Leu Val Thr Ala Asn Thr Val Leu

355 360 365

Ser Ile Leu Ala Val Asp Tyr Pro Val Asp Lys Val Ser Cys Tyr Val

370 375 380

Ser Asp Asn Gly Ala Ser Met Leu Thr Phe Glu Ser Leu Ser Glu Thr

385 390 395 400

Ala Glu Phe Ala Arg Lys Trp Val Pro Phe Cys Lys Lys Phe Ser Ile

405 410 415

Glu Pro Arg Ala Pro Glu Phe Tyr Phe Ser Gln Lys Val Asp Tyr Leu

420 425 430

Lys Asp Lys Val His Pro Asn Phe Val Gln Glu Arg Arg Ala Met Lys

435 440 445

Arg Glu Tyr Glu Glu Phe Lys Val Arg Ile Asn Ala Leu Val Ala Lys

450 455 460

Ala Gln Lys Val Pro Ala Glu Gly Trp Ile Met Lys Asp Gly Thr Pro

465 470 475 480

Trp Pro Gly Asn Asn Thr Arg Asp His Pro Gly Met Ile Gln Val Phe

485 490 495

Leu Gly His Ser Gly Gly His Asp Thr Glu Gly Asn Glu Leu Pro Arg

500 505 510

Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro Gly Phe Gln His His Lys

515 520 525

Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Ile Arg Val Ser Ala Val Leu Thr

530 535 540

Asn Ala Pro Phe Met Leu Asn Leu Asp Cys Asp His Tyr Ile Asn Asn

545 550 555 560

Ser Lys Ala Ile Arg Glu Ala Met Cys Phe Leu Met Asp Pro Gln Val

565 570 575

Gly Arg Lys Val Cys Tyr Val Gln Phe Pro Gln Arg Phe Asp Gly Ile

580 585 590

Asp Val His Asp Arg Tyr Ala Asn Arg Asn Thr Val Phe Phe Asp Ile

595 600 605

Asn Met Lys Gly Leu Asp Gly Ile Gln Gly Pro Val Tyr Val Gly Thr

610 615 620

Gly Cys Val Phe Arg Arg Gln Ala Leu Tyr Gly Tyr Asn Pro Pro Lys

625 630 635 640

Gly Pro Lys Arg Pro Lys Met Val Thr Cys Asp Cys Cys Pro Cys Phe

645 650 655

Gly Arg Lys Lys Arg Lys His Gly Lys Asp Gly Leu Pro Glu Ala Val

660 665 670

Ala Ala Asp Gly Gly Met Asp Ser Asp Lys Glu Met Leu Met Ser Gln

675 680 685

Met Asn Phe Glu Lys Arg Phe Gly Gln Ser Ala Ala Phe Val Thr Ser

690 695 700

Thr Leu Met Glu Glu Gly Gly Val Pro Pro Ser Ser Ser Pro Ala Ala

705 710 715 720

Leu Leu Lys Glu Ala Ile His Val Ile Ser Cys Gly Tyr Glu Asp Lys

725 730 735

Thr Asp Trp Gly Leu Glu Leu Gly Trp Ile Tyr Gly Ser Ile Thr Glu

740 745 750

Asp Ile Leu Thr Gly Phe Lys Met His Cys Arg Gly Trp Arg Ser Val

755 760 765

Tyr Cys Met Pro Lys Arg Ala Ala Phe Lys Gly Ser Ala Pro Ile Asn

770 775 780

Leu Ser Asp Arg Leu Asn Gln Val Leu Arg Trp Ala Leu Gly Ser Val

785 790 795 800

Glu Ile Phe Phe Ser Arg His Ser Pro Leu Leu Tyr Gly Tyr Lys Asn

805 810 815

Gly Asn Leu Lys Trp Leu Glu Arg Phe Ser Tyr Ile Asn Thr Thr Ile

820 825 830

Tyr Pro Phe Thr Ser Leu Pro Leu Leu Ala Tyr Cys Thr Leu Pro Ala

835 840 845

Val Cys Leu Leu Thr Gly Lys Phe Ile Met Pro Pro Ile Ser Thr Phe

850 855 860

Ala Ser Leu Phe Phe Ile Ala Leu Phe Ile Ser Ile Phe Ala Thr Gly

865 870 875 880

Ile Leu Glu Met Arg Trp Ser Gly Val Ser Ile Glu Glu Trp Trp Arg

885 890 895

Asn Glu Gln Phe Trp Val Ile Gly Gly Val Ser Ala His Leu Phe Ala

900 905 910

Val Val Gln Gly Leu Leu Lys Val Leu Ala Gly Ile Asp Thr Asn Phe

915 920 925

Thr Val Thr Ser Lys Ala Thr Gly Asp Glu Asp Asp Glu Phe Ala Glu

930 935 940

Leu Tyr Ala Phe Lys Trp Thr Thr Leu Leu Ile Pro Pro Thr Thr Leu

945 950 955 960

Leu Ile Leu Asn Ile Ile Gly Val Val Ala Gly Val Ser Asp Ala Ile

965 970 975

Asn Asn Gly Ser Glu Ala Trp Gly Pro Leu Phe Gly Lys Leu Phe Phe

980 985 990

Ala Phe Trp Val Ile Val His Leu Tyr Pro Phe Leu Lys Gly Leu Met

995 1000 1005

Gly Arg Gln Asn Arg Thr Pro Thr Ile Val Val Ile Trp Ser Val

1010 1015 1020

Leu Leu Ala Ser Ile Phe Ser Leu Leu Trp Val Arg Ile Asp Pro

1025 1030 1035

Phe Thr Ile Lys Ala Arg Gly Pro Asp Val Arg Gln Cys Gly Ile

1040 1045 1050

Asn Cys

1055

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcgactacc ccgtcgacaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcgaccttc tgggagaagt 20

Claims

1.一种水稻半显性脆秆控制基因SDBC1，其特征在于：所述SDBC1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种水稻半显性脆秆控制基因SDBC1编码蛋白，其特征在于：所述SDBC1基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的水稻半显性脆秆控制基因SDBC1编码蛋白，其特征在于：所述SDBC1基因编码蛋白的突变位点位于LOC_Os09g25490基因序列编码蛋白在387位氨基酸处，所述突变位点由天冬氨酸突变为天冬酰胺。

4.一种含有如权利要求1所述的水稻半显性脆秆控制基因SDBC1的表达载体。

5.根据权利要求4所述的水稻半显性脆秆控制基因SDBC1的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pSdbc1F。

6.一种鉴别如权利要求1所述的水稻半显性脆秆基因SDBC1的突变位点的分子标记方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）利用正向引物sdbc1-jd-F和反向引物sdbc1-jd-R，进行PCR扩增，所述正向引物sdbc1-jd-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述反向引物sdbc1-jd-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

（2）扩增产物利用AhdI酶切，若酶切结果只有一条带，则该突变位点为纯合型，若有两条带，则突变位点为杂合型。

7.一种培育水稻茎秆变脆的方法，包括以下步骤：将含有权利要求1所述的SDBC1基因的表达载体pSdbc1F转化水稻细胞，将转化的水稻细胞培育成植株。