CN112063626B - 玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途 - Google Patents

玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112063626B
CN112063626B CN201910496614.6A CN201910496614A CN112063626B CN 112063626 B CN112063626 B CN 112063626B CN 201910496614 A CN201910496614 A CN 201910496614A CN 112063626 B CN112063626 B CN 112063626B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
ala
pro
gly
arg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910496614.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112063626A (zh
Inventor
田丰
田金歌
王成龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201910496614.6A priority Critical patent/CN112063626B/zh
Priority to CA3142548A priority patent/CA3142548A1/en
Priority to PCT/CN2020/095099 priority patent/WO2020248971A1/en
Priority to BR112021024737A priority patent/BR112021024737A2/pt
Priority to US17/617,142 priority patent/US20230175000A1/en
Priority to ARP200101625A priority patent/AR122273A1/es
Publication of CN112063626A publication Critical patent/CN112063626A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112063626B publication Critical patent/CN112063626B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途。本发明通过精细定位将控制叶夹角表型功能位点定位至240bp，并且该区域的插入或缺失产生不同的夹角表型。本发明证实利用来自于大刍草的优良自然变异改良自交系能够在高种植密度下增加玉米产量，拓宽了植物育种中可用的优良等位基因的来源；本发明通过基因工程技术(RNAi)证实降低ZmRAVL1的表达能够影响株型例如减小叶夹角，为基因工程育种提供了优良基因资源；本发明通过基因编辑技术产生了更为优良的等位基因，大大缩短了优良等位基因的选择进程，为育种实践中获得可利用优良等位基因提供了新的思路；本发明结合分子辅助选择技术，能够快速、精准地改良或产生优良自交系，为优良等位基因的广泛应用提供了可能。

Description

玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途
技术领域
本发明属于植物基因图位克隆和分子育种领域，具体涉及玉米基因ZmRAVL1和相关功能位点以及相应的用途。
背景技术
玉米是世界第一大粮食作物，现在全世界玉米总产量已经超过10亿吨。中国同美国一样，玉米主要作为饲料。然而，中国玉米种植面积与美国相近，但单产和总产约为美国的60％。我国玉米种植面积的增长空间接近极限，更为严峻的是水资源短缺、极端气候频现等恶劣的自然环境已不可逆转。单纯依靠增加播种面积来提高我国玉米产量的空间已经非常有限，根本出路在于充分发掘玉米遗传资源的巨大潜力，大幅度提高玉米单位面积产量才是保证我国玉米总产持续增加的主要途径。
作物产量形成主要由三要素构成：亩穗数、穗粒数和千粒重。由于目前玉米生产品种基本为单穗，因此亩穗数主要决定于每亩的密度。美国著名玉米专家Donald N.Duvick研究了美国先锋公司20世纪30～90年代发放的35个玉米杂交种，认为美国70年间玉米品种的单株生产力没有明显变化，增产的主要原因是增加了耐密抗倒性和抗性(例如抗病虫害、耐旱、耐高温、抗冷等)(Duvick 2005)。近些年来，生产实践和研究结果均表明增加种植密度是玉米产量不断提升的主要贡献因子之一，而玉米株型决定了玉米的种植密度。
株型改良是培育耐密高产玉米品种的主要手段，紧凑合理株型是耐密高产玉米品种的重要外在形态指标。叶夹角是决定玉米株型紧凑程度的主要因子，直接影响玉米群体冠层中光照的合理分布，进而影响玉米冠层截光能力和群体光能利用率，最终影响群体产量。研究认为，上部叶片越上冲，截光能力就越低，群体透光率高，群体中下部叶片可处于较好的光照状态下，便于叶片充分高效利用光能，提高植株净光合速率，因而能够容纳更大密度的种植群体(Duncan and Hesketh 1968；Mock and Pearce 1975；王元东et al.2008)，最终提高玉米单位面积产量，这是选育紧凑型玉米的主要原因。
20世纪初至今，利用杂种优势选育新品种一直是世界各国玉米遗传改良的重要方向，随着玉米产量水平的不断提升和玉米生产机械化的推广普及，提高玉米种植密度已成为实现玉米超高产最重要的技术措施。目前美国玉米平均亩产在650公斤左右，平均种植密度为5500株/亩，与上世纪30年代的单产和种植密度水平相比，单产水平增加了8倍，种植密度提高了3倍，可见种植密度的增加在玉米的增产中发挥了重要作用。与美国相比，目前我国玉米平均亩产还不到400公斤，单产水平虽然比我国上世纪60年代提高了将近5倍，但仍然只有美国的60％左右。种植密度上，我国大部分地区玉米种植密度偏低，区域间差异较大。其中黄淮海夏玉米区密度最高，大部分在3500-4000株；东北春玉米区大部分密度为3000-3500株/亩；西南地区密度最低，大部分不足3000株/亩。因此，我国的玉米种植密度和产量提升潜力巨大。选育茎叶夹角小、叶片上冲的自交系，将株型改良与杂种优势利用相结合，培育耐密高产品种，已成为我国当前玉米品种改良的重要目标。
茎叶夹角是玉米植株紧凑程度的关键形态指标，直接影响玉米群体冠层中光照的合理分布，最终影响群体产量。叶环区是决定茎叶夹角大小的关键组织部位，包括叶舌和叶耳。通过突变体分析，目前已克隆了多个控制叶环区建成和发育的基因，包括LG1、LG2、LGN、Wab1、DRL1、DRL2等基因。20世纪60年代，美国育种家们就注意到LG1和LG2突变体叶片直立的表型，通过不断回交的办法，将lg1和lg2导入到当时的主栽品种中，并种植在不同的种植密度条件下，考察其产量表现。结果表明，在低密度条件下，导入了lg1和lg2的品种并没有表现出产量优势，而在高密度条件下，导入了lg1和lg2的品种的产量显著增加(Pendletonet al.1968；Lambert and Johnson 1978)。但具有叶片直立特性的lg1和lg2类型的玉米后来并没有得到广泛应用，主要是由于lg1和lg2类型的植株表型过于极端，叶片完全直立，在高密度种植条件下，极易产生秃尖的问题。另外，由于利用的是突变体，在回交渗入过程中同时也导入一些突变体不利的性状。玉米群体中存在极其广泛的自然变异，这些遗传变异已经经过长期的自然和人工选择，表型温和，能够直接用于选择育种，因此研究这些自然变异的遗传调控机理对耐密高产育种具有重要意义。
叶夹角是复杂的数量性状，研究者利用不同的定位群体，开展了大量的数量性状位点(quantitative trait locus，QTL)定位研究(Mickelson et al.2002；Ku etal.2010；Tian et al.2011；Ku et al.2012)。利用玉米巢式关联定位群体(NestedAssociation Mapping，NAM)对叶夹角进行了全基因组连锁和关联分析(Tian etal.2011)，共检测到30个叶夹角QTL和203个关联SNP(single nucleotide polymorphism)。研究发现，LG1和LG2分别控制第2和第3染色体上两个最大效应的叶夹角QTL，说明影响叶环区发育的liguleless基因是调控玉米叶夹角自然变异的重要调控因子。Ku等(Ku etal.2012)对不同研究定位到的叶夹角QTL进行了综合的元分析(meta-analysis)，鉴定出多个在不同群体中一致检测到的叶夹角QTL，该研究同时将拟南芥和水稻中与叶片发育相关的功能基因整合进QTL图谱中，这些信息为后续深入的功能分析奠定了重要基础。
综上所述，虽然目前对玉米叶夹角的遗传定位研究已取得了一定进展，并且在个别叶夹角基因克隆上取得了突破，但整个玉米叶夹角的研究还主要停留在初步定位的水平，玉米叶夹角建成的遗传与分子调控网络远未阐明。随着玉米生产对种植密度进一步提高的需求，培育耐密高产品种已成为我国当前玉米品种改良的重要目标。因此克隆更多玉米叶夹角相关基因，研究它们之间的相互调控关系，阐明玉米叶夹角的遗传与分子调控机理，同时挖掘玉米种质资源中优良的等位变异，开发可直接用于分子设计育种的分子标记，将为我国玉米耐密高产品种培育提供重要的理论指导和技术支撑。
发明内容
在一方面，本发明涉及多核苷酸序列在植物育种中的用途，其中所述多核苷酸序列包含选自以下的序列：
a)SEQ ID No：1的序列；
b)与SEQ ID No：1所示的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％或99.5％同一性的序列；
c)a)或b)中所示序列的互补序列；
d)a)或b)中所示序列的反向序列；
e)a)或b)中所示序列的反向互补序列；
f)由以上序列通过修饰如添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而获得的序列，
其中上述序列能够用于控制植物株型。
在本发明的一个实施方案中，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选所述植物为粮食作物，更优选所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、芸薹属植物(例如芸薹、甘蓝、油菜、芜菁、芥菜、擘蓝)、苜蓿、黑麦、大豆、向日葵、粟、烟草、马铃薯、花生、棉花、咖啡、可可、菠萝、茶、香蕉、芒果、橄榄、木瓜甜菜、甘蔗、燕麦、草莓、蓝莓、拟南芥中的一种或多种。
在又一个方面，本发明涉及控制植物株型例如叶夹角的方法，包括破坏植物中ZmRAVL1基因或其他植物中与ZmRAVL1基因同源的基因，其中优选所述植物为单子叶植物或双子叶植物，更优选所述植物为粮食作物，进一步更优选所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、芸薹属植物(例如芸薹、甘蓝、油菜、芜菁、芥菜、擘蓝)、苜蓿、黑麦、大豆、向日葵、粟、烟草、马铃薯、花生、棉花、咖啡、可可、菠萝、茶、香蕉、芒果、橄榄、木瓜甜菜、甘蔗、燕麦、草莓、蓝莓、拟南芥中的一种或多种。
在本发明的一个实施方案中，其中破坏包括破坏所述基因的功能、表达水平、活性或其组合。
在本发明的另一个实施方案中，其中破坏是通过敲除或敲低所述基因例如通过RNAi技术实现的。
在本发明的又一个实施方案中，其中破坏是通过调控所述基因的上游调控基因例如通过调控DRL1和/或DRL2而实现的，任选地例如通过调控DRL1和/或DRL2的表达水平、活性或其组合，又任选地例如通过调控DRL1和/或DRL2与靶标的结合。
在本发明的另一个实施方案中，其中破坏是通过基因组编辑系统例如CRISP/Cas、TALEN、ZFN或其他基因组编辑系统实现的。
在另一个方面，本发明涉及一种蛋白在调控植物株型例如叶夹角中的用途，其中所述蛋白包含(i)或(ii)所定义的序列：
(i)SEQ ID No：27所示的氨基酸序列；
(ii)与SEQ ID No：27所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列；
(iii)由以上序列通过修饰如添加和/或取代和/或缺失一个或多个氨基酸残基获得的氨基酸序列，
其中上述氨基酸序列能够用于调控植物株型例如叶夹角，
其中优选所述植物为单子叶植物或双子叶植物，更优选所述植物为粮食作物，进一步更优选所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、芸薹属植物(例如芸薹、甘蓝、油菜、芜菁、芥菜、擘蓝)、苜蓿、黑麦、大豆、向日葵、粟、烟草、马铃薯、花生、棉花、咖啡、可可、菠萝、茶、香蕉、芒果、橄榄、木瓜甜菜、甘蔗、燕麦、草莓、蓝莓、拟南芥中的一种或多种。
在进一步的方面，本发明涉及一种编码如本发明所定义的蛋白的基因在调控植物株型例如叶夹角中的用途，其中优选所述植物为单子叶植物或双子叶植物，更优选所述植物为粮食作物，进一步更优选所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、芸薹属植物(例如芸薹、甘蓝、油菜、芜菁、芥菜、擘蓝)、苜蓿、黑麦、大豆、向日葵、粟、烟草、马铃薯、花生、棉花、咖啡、可可、菠萝、茶、香蕉、芒果、橄榄、木瓜甜菜、甘蔗、燕麦、草莓、蓝莓、拟南芥中的一种或多种。
在一个实施方案中，其中编码所述蛋白的基因包含以下序列：
(i)SEQ ID No：26所示的核苷酸序列；
(ii)SEQ ID No：26所示的核苷酸序列的cDNA序列；
(iii)SEQ ID No：26所示的核苷酸序列的启动子序列；
(iv)与SEQ ID No：26所示的核苷酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列；
(v)(iv)的核苷酸序列的cDNA序列；
(vi)(iv)的核苷酸序列的启动子序列；
(vii)由以上序列通过修饰如添加和/或取代和/或缺失一个或多个氨基酸残基获得的核苷酸序列，
其中上述序列能够用于调控植物株型例如叶夹角，
其中优选所述植物为单子叶植物或双子叶植物，更优选所述植物为粮食作物，进一步更优选所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、芸薹属植物(例如芸薹、甘蓝、油菜、芜菁、芥菜、擘蓝)、苜蓿、黑麦、大豆、向日葵、粟、烟草、马铃薯、花生、棉花、咖啡、可可、菠萝、茶、香蕉、芒果、橄榄、木瓜甜菜、甘蔗、燕麦、草莓、蓝莓、拟南芥中的一种或多种。
在更进一步的方面，本发明涉及一种编码如本发明所定义的蛋白的基因在耐密型植物培育中的用途，其中优选所述植物为单子叶植物或双子叶植物，更优选所述植物为粮食作物，进一步更优选所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、芸薹属植物(例如芸薹、甘蓝、油菜、芜菁、芥菜、擘蓝)、苜蓿、黑麦、大豆、向日葵、粟、烟草、马铃薯、花生、棉花、咖啡、可可、菠萝、茶、香蕉、芒果、橄榄、木瓜甜菜、甘蔗、燕麦、草莓、蓝莓、拟南芥中的一种或多种。
在又一个方面，本发明涉及一种RNAi载体，其包含靶向控制植物株型例如叶夹角的基因的序列，其中优选所述植物为单子叶植物或双子叶植物，更优选所述植物为粮食作物，进一步更优选所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、芸薹属植物(例如芸薹、甘蓝、油菜、芜菁、芥菜、擘蓝)、苜蓿、黑麦、大豆、向日葵、粟、烟草、马铃薯、花生、棉花、咖啡、可可、菠萝、茶、香蕉、芒果、橄榄、木瓜甜菜、甘蔗、燕麦、草莓、蓝莓、拟南芥中的一种或多种。
在进一步的方面，本发明涉及一种Cas9的靶点gDNA，其序列为CTCTTCGAGTAGGTTTTCC(SEQ ID No：54)。
在其他方面，本发明还涉及多核苷酸序列，其包含选自以下的序列：
a)SEQ ID No：1的序列；
b)与SEQ ID No：1所示的序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％或99.5％同一性的序列；
c)a)或b)中所示序列的互补序列；
d)a)或b)中所示序列的反向序列；
e)a)或b)中所示序列的反向互补序列，
f)由以上序列通过修饰如添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而获得的序列，
其中上述序列能够用于控制植物株型，其中优选所述植物为单子叶植物或双子叶植物，更优选所述植物为粮食作物，进一步更优选所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、高粱、芸薹属植物(例如芸薹、甘蓝、油菜、芜菁、芥菜、擘蓝)、苜蓿、黑麦、大豆、向日葵、粟、烟草、马铃薯、花生、棉花、咖啡、可可、菠萝、茶、香蕉、芒果、橄榄、木瓜甜菜、甘蔗、燕麦、草莓、蓝莓、拟南芥中的一种或多种。
在本发明中所使用的术语“核酸”能够为任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别的限制。对于用于构建重组构建体的核酸，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
为确定两条核苷酸序列或氨基酸序列之间的同一性百分比，将序列进行用于最优比较目的的比对(例如，为了与另一核苷酸序列或氨基酸序列进行最优化比对，可以将空位引入到第一条核苷酸序列或氨基酸序列的序列中)。两条序列间的同一性百分比是序列所共有的相同核苷酸或氨基酸残基的位置数的函数(即，同一性％＝(相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量#/位置的总数#)乘以100)。如果所比较的是不同长度的序列，应用较短的序列确定位置的总数。两条序列之间的同一性百分比的确定也可以通过数学算法来完成。
用于两条序列比较的非限制性数学算法应用的示例是BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。当利用BLAST程序时，可以应用程序的缺省参数，也可以根据需要对缺省参数进行调整。本领域技术人员知晓如何进行参数调整，并且本领域技术人员知晓如何参照NCBI的文档进行相应调整。
本发明能够选育出茎叶夹角小、叶片上冲的自交系，将株型改良与杂种优势利用相结合，从而培育耐密高产的优良品种。
本发明与现有技术相比有益的技术效果至少在于以下几点：
1、通过精细定位将控制叶夹角表型功能位点定位至240bp(B73参考基因组)，并通过分子生物学实验证实：在UPA2-NIL8759和UPA2-NILW22中，一个TG插入或缺失导致结合DRL1蛋白能力的不同，进而对抑制LG1激活下游ZmRAVL1的表达程度不同，从而产生不同的夹角表型。本发明中能够减小叶夹角的等位基因来自玉米的野生种大刍草(8759)，并且通过对大刍草、地方种和现代育种自交系组成的关联群体测序显示，该等位基因特异性存在于大刍草中。现在育种的关键在于选择优良的自交系，但由于现在育种中使用的种质资源经过不断的人工选择和性状改良，遗传基础越来越狭窄。本发明中的优良等位基因来自大刍草，证实大刍草中携带着能够在育种中利用的优良等位基因，而这部分优良等位基因可能在玉米驯化和改良过程中丢失了。因此，本发明扩展了获得优良等位基因的来源，拓宽了控制表型变异的遗传基础。
2、ZmRAVL1的表达水平影响了叶夹角的变化，表达量升高，夹角变大，表达量降低，叶夹角变小。因此，本发明提供了基因工程育种的新思路，通过降低ZmRAVL1的表达量获得株型紧凑的玉米株型。同时，本发明使用CRISPR/CAS9系统，获得ZmRAVL1基因敲除系，通过分离获得了ZmRAVL1蛋白丧失功能的纯合突变体，该突变体叶夹角更小，株型更紧凑，并且没有表现出突变体容易伴随不利表型，新获得突变体更符合育种的需要。因此，本发明提供了通过调控ZmRAVL1转录水平调控叶夹角变异的基因工程技术，为基因工程育种提供了优良基因资源；同时，本发明利用基因编辑技术获得了更符合育种需求的优良等位基因，大大缩短了优良等位基因的选择进程，这为叶夹角减小的紧凑株型在育种实践中快速广泛应用提供了可能。
3、传统育种中优良性状的改良，需要将携带该优良性状材料(供体亲本)与所需改良的材料(受体亲本)杂交，再经过6～8代的回交和繁琐的背景选择，最终从后代中选择出其他性状与受体亲本相似、同时携带来自于供体亲本优良性状，用于下一步育种。这个过程费时费力、成本高昂，而且由于受制于表型观察准确性和遗传累赘效应等影响，所得的结果并不总能与预期目标相符。因此，利用传统育种的经典方式，同时结合分子辅助选择技术是提高优良性状和基因型聚合效率的重要手段。本发明中，在大刍草中定位到减小叶夹角的优良等位基因，并结合回交导入和分子辅助选择技术，改良杂交种农大108，证实来自于大刍草的优良自然变异能够利用于育种实践中并能够通过提高玉米种植密度而增加产量。另一方面，利用基因工程技术，结合传统育种方法，通过对BAR抗性标记筛选能够产生携带RNAi载体阳性株系，进而获得叶夹角减小的自交系；利用基因编辑技术产生的更为优良的等位基因，亦可结合分子辅助选择技术快速获得叶夹角减小的自交系。
综上所述，本发明拓宽了植物育种中可用的优良等位基因的来源，为获得优良等位基因提供了新的思路；大大缩短了优良等位基因的选择进程，为优良等位基因的应用提供了可能；结合分子辅助选择技术，能够快速、精准地改良或产生优良自交系。
附图说明
图1为玉米和大刍草BC2S3群体中穗上叶夹角精细定位。
图2为ZmRAVL1的核酸分子序列。
图3为ZmRAVL1的蛋白序列。
图4为玉米、高粱、水稻和拟南芥中B3结构域蛋白进化树分析，其中玉米、水稻、高粱和拟南芥中含B3结构域蛋白的进化树分析，图中红色标注为水稻中RAVL1和玉米中ZmRAVL1。
图5为近等基因系叶夹角表型比较，其中(A)近等基因系(UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759)整株表型图片和(B)对应的表型统计数据。白色箭头指示的分别是穗下叶夹角(LLA)、穗上叶夹角(MLA)和倒二叶角(ULA)。
图6为近等基因系叶耳面积和远轴端叶耳宽度表型比较，其中(A)近等基因系的穗下叶、穗上叶和旗叶的成熟叶耳图片；(B)近等基因系(UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759)叶耳面积的表型统计数值；和(C)近等基因系远轴端叶耳宽度表型比较。数据统计显著性值(P值)均位于柱子顶端。
图7为UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759成熟叶片叶耳、叶耳细胞大小及未成熟叶环带电镜扫描图，其中：UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759成熟叶片叶耳电镜扫描图(上)、叶耳细胞大小扫描图(中)和未成熟叶片叶环带宽度扫描图(下)，白色虚线表示叶耳区域，方框表示叶耳细胞扫描的区域。三图比例尺分别为3mm(上)、200μm(中)、500μm(下)。
图8为近等基因系叶环区横切面组织形态比较，其中：(A)近等基因系中L2成熟叶耳区横切面，三行分别表示第二叶成熟叶耳取样部位(上)、远轴端横切片(中)和近轴端横切片(下)，比例尺为100μm；(B-E)近等基因系石蜡切片表型比较；(B)远轴端后壁细胞厚度；(C)远轴端后壁细胞层数；(D)近轴端后壁细胞厚度；和(E)近轴端后壁细胞层数。
图9为近等基因系中ZmRAVL1的表达模式，其中：在V5发育时期，对近等基因系材料的不同部位进行取样，检测ZmRAVL1的表达。L5表示最上部的成熟叶片，L6和L7表示向内两片未成熟叶片。L5(Leaf5)、L6(Leaf6)和L7(Leaf7)都分为叶片、叶舌和叶鞘。
图10为RNAi转基因植株叶夹角减小，其中：(A)野生型WT和两个RNAi转基因整株表型图片，白色箭头指示的分别是穗下叶夹角(LLA)、穗上叶夹角(MLA)和倒二叶角(ULA)；(B)野生型WT和两个RNAi转基因系ZmRAVL1的相对表达量；(C)野生型WT和两个RNAi转基因系ZmRAVL1转基因事件的表型统计比较。数据统计显著性值(P值)均位于柱子顶端。
图11为过表达转基因植株表型分析图，其中：(A)野生型WT和两个过表达转基因事件整株表型照片，白色箭头指示的分别是穗下叶夹角(LLA)、穗上叶夹角(MLA)和倒二叶角(ULA)；(B)野生型WT和两个过表达转基因事件ZmRAVL1的相对表达量；(C)野生型WT和两个过表达转基因事件ZmRAVL1-OE#1和ZmRAVL1-OE#2的表型统计值比较。数据统计显著性值(P值)均位于柱子顶端。
图12为CRISPR/Cas9转基因植株减小叶夹角。其中：(A)野生型WT和两个CRISPR/Cas9转基因整株表型图片，白色箭头指示的分别是穗下叶夹角(LLA)、穗上叶夹角(MLA)和倒二叶角(ULA)；(B)ZmRAVL1基因结构和位于ZmRAVL1外显子的CRISPR/Cas9切割靶位点以及2个CRISPR/Cas9基因敲除事件的编辑情况；(C)WT和两个CRISPR/Cas9转基因事件的表型统计比较。数据统计显著性值(P值)均位于柱子顶端。
图13为野生型WT和CRISPR/Cas9敲除系成熟植株叶耳面积和远轴端叶耳宽度表型比较，其中：(A)野生型WT和CRISPR/Cas9敲除系上部、穗上和穗下叶的成熟叶耳区，比例尺为1cm；(B)野生型WT和CRISPR/Cas9敲除系叶耳面积表型值比较；(C)近等基因系远轴端叶远轴端耳宽度表型数据分析。
图14为CRISPR/Cas9转基因植株成熟叶片叶耳和叶舌及未成熟叶环带扫描电镜分析，其中：(A)野生型WT和CRISPR/Cas9转基因事件1(ZmRAVL1-KO#1)成熟叶片叶耳电镜扫描图(上)、叶耳细胞形态图(中)和未成熟叶环带(下)，上图中的红色方框表示中图扫描的区域，上比例尺为3mm；中比例尺为200μm；下比例尺为500μm；(B-G)野生型WT和CRISPR/Cas9转基因事件1(ZmRAVL1-KO#1)成熟叶耳区和未成熟叶环带的表型比较：(B)成熟叶耳外侧边缘宽度；(C)成熟叶耳中部宽度；(D)成熟叶耳内侧边缘宽度；(E、F)成熟叶耳区细胞的长度和宽度；(G)未成熟叶环带的宽度。
图15为野生型和CRISPR/Cas9转基因阳性植株叶环区横切面组织形态分析，其中：(A)野生型和CRISPR/Cas9转基因阳性植株L2成熟叶环区横切面，三行分别表示第二叶成熟叶耳取样部位(上)、远轴端横切片(中)和近轴端横切片(下)，比例尺为100μm；(B-E)近等基因系石蜡切片表型比较：(B)远轴端后壁细胞厚度；(C)远轴端后壁细胞层数；(D)近轴端后壁细胞厚度；(E)近轴端后壁细胞层数。
图16为ZmRAVL1-KO#1或ZmRAVL1-RNAi#1和WT与自交系杂交构建F1测验杂交种，其中：野生型是ZmRAVL1-KO#1或ZmRAVL1-RNAi#1转基因受体材料。
图17为ZmRAVL1-KO#1和WT密植高产小区分布(2018，辽宁铁岭)。
图18为ZmRAVL1-KO#1和WT密植高产小区实验(2018，辽宁铁岭)。其中：(A)2018年铁岭ZmRAVL1-KO#1和野生型不同种植密度下收获的玉米果穗，比例尺为4厘米；(B-E)在不同种植密度下，ZmRAVL1-KO#1和野生型穗部性状的表型比较：(B)百粒重；(C)单株穗粒数；(D)单株产量；(E)产量。数据是平均值±SD。不同的字母表示显著差异(P<0.05)。
图19为ZmRAVL1-KO#1和WT密植高产小区实验(2018，海南三亚)。其中：(A)2017年三亚田间实验中，ZmRAVL1-KO#1和野生型玉米植株的不同种植密度；(B-E)在不同种植密度下，ZmRAVL1-KO#1和野生型穗部性状的表型比较：(B)百粒重；(C)单株穗粒数；(D)单株产量；(E)产量。数据是平均值±SD。不同的字母表示显著差异(P<0.05)。
图20为近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759精细定位区间240bp核酸序列比对。其中：(A)精细定位区间240bp到基因ZmRAVL1的模式图。240bp定位区间距下游基因ZmRAVL1起始编码子9.54kb。粉色和灰色区域分别代表ZmRAVL1的外显子和非编码区。(B)近等基因系定位区间240bp核酸序列比对。S1-S4表示近等基因系间的4个序列变异(红色字体灰色背景标注)。红色虚线框内为C2C2结合基序。
图21为DRL1蛋白结合S2位点附近序列。其中：(A)凝胶阻滞实验显示DRL1能够在体外结合S2位点附近序列且对UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759的结合能力不同；(B)ChIP-qPCR数据分析表明DRL1能够在体内结合S2位点附近序列。F3片段包含C2C2结合基序。
图22为原生质体双荧光报告系统证实DRL1蛋白通过结合在S2位点抑制下游基因表达。其中：(A)用于玉米原生质体瞬时表达的载体结构图。Control表示effector空载体，DRL1表示连有DRL1的CDS的effector载体，UPA2-NILW22表示不含TG插入的玉米自交系W22等位基因的reporter载体图，UPA2-NIL8759表示含TG插入的玉米野生种8759等位基因的reporter载体图谱。(B)不同载体组合间LUC/REN的统计分析比较。
图23为近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759密植高产小区实验(2017，辽宁铁岭)。其中：(A)2017年中国铁岭的田间试验中，UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759玉米植株的不同种植密度(顶部)和收获的玉米果穗(底部)。比例尺为5厘米。(B-E)在不同种植密度下，UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759穗部性状的表型比较：(B)百粒重；(C)单株穗粒数；(D)单株产量；(E)产量。数据是平均值±SD。不同的字母表示显著差异(P<0.05)。
图24为近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759密植高产小区实验(2018，海南三亚)。其中：(A)2018年海南三亚的田间试验中，UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759玉米植株的不同种植密度(顶部)和收获的玉米果穗(底部)。比例尺为5厘米。(B-E)在不同种植密度下，UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759穗部性状的表型比较：(B)百粒重；(C)单株穗粒数；(D)单株产量；(E)产量。数据是平均值±SD。不同的字母表示显著差异(P<0.05)。
图25为改良农大108UPA2-8759和常规农大108F1杂交种密度实验(2018年，海南三亚)。其中：(A)2018年海南三亚的田间试验中，改良农大108UPA2-8759和常规农大108F1杂交种玉米植株的不同种植密度(顶部)和收获的玉米果穗(底部)。比例尺为2厘米。(B-E)在不同种植密度下，UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759穗部性状的表型比较：(B)百粒重；(C)单株穗粒数；(D)单株产量；(E)产量。数据是平均值±SD。不同的字母表示显著差异(P<0.05)。
图26是ubi：p1305载体的图谱。
图27是pGreenII 62-SK载体的图谱。
具体实施方式
为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定的语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。本说明书中所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。
下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
下述实施例对本发明的具体实施方式做出进一步的说明和描述，但本发明并不仅限于下述实施例。
实施例1ZmRAVL1基因的初定位和精细定位
利用一套由玉米自交系W22和祖先种-大刍草CIMMYT 8759(本文中简称8759)回交和自交构建的RIL群体进行叶夹角QTL初定位，将两年三点穗上叶夹角和旗叶夹角的表型值Blup后作为QTL定位的表型输入值，结合19378个高密度、高质量的分子标记，利用R/qtl中的多QTL模型，使用R软件(Version 3.1.0)进行QTL定位。经过1000次置换检验(Permutation test)(显著性P＝0.01)，确定了穗上叶夹角和旗叶夹角的QTL显著性阈值均为LOD＝5。
对于玉米穗上叶夹角，总共定位到10个QTL，其中位于第2染色体上的UPA2(Compact Plant Architecture 2)效应最大，可以解释12.1％的表型变异。本发明人选择该QTL作为进一步精细定位的目标QTL。该QTL的2个LOD置信区间遗传距离约为1.1cM，物理区间约为2Mb(图1A和B)。本发明人将该置信区间作为UPA2的初定位区间，进而进行精细定位。
利用初定位QTL区间杂合且其他遗传背景相对简单一致的HIF家系MR0220筛选交换单株，共筛选到152个有效交换单株(图1C)。在初定位区间内不同物理位置上开发多对分子标记，鉴定重组交换单株的交换位点，共筛选到不同物理位置发生交换且非重复有效交换单株19个。将获得的19个重组交换单株进行F3代家系种植，对后代利用分子标记M137和M159(其正向和反向引物序列见下文)进行家系内纯合重组体和纯合非重组体的进行基因分型和显著性测验。若二者表型差异显著，则控制UPA2夹角差异的候选基因位于重组交换单株的杂合区段；若二者表型差异不显著，则候选基因位于纯合区段。本发明人利用这14个交换单株将UPA2定位在分子标记M148-2到M152(其正向和反向引物序列见下文)之间大约110kb的区间内(图1C)。在分子标记M148-2到M152之间继续开发出M148-5、149、150-1、150-3、150-6、150-7、151等7个新的分子标记，筛选到5个关键的重组交换单株。利用这5个关键交换单株进行后代表型鉴定和显著性测验，最终将UPA2定位在一个240bp的非编码区(图20B，SEQ ID No：1)，该非编码区位于一个编码B3结构域转录因子基因上游约9.54kb的地方(图1D)。将该B3结构域转录因子基因作为候选基因，将其命名为ZmRAVL1。
其中，240bp的非编码区序列如下：
UPA2-NIL8759
ATAGAAGAGAGTGATCACTGTTTTTGTGGTTGTTCAGCTTTTACTATCCCTGGGAAAAAAAGTGTCAGCAGTAATCTACTTTGAGTAGTGTTTCCATAGAAAACAAAACTGCGCATGCGCGCGCTGAGTGTGGTCCTTCTCTTTTAATTACTACTGCGTGGTGTGTGTGTGCTGCCAACAGTAGTAACCATCTGGCACCTCCCTATATTTTTCAGGAAAAATTAAATGAACTGTACTAATTCA(SEQ ID No：1)
UPA2-NILW22
ATAGAAGAGAGTGATCACTGTTTTTGTGGTTGTTCAGCTTTTACTATCCCTGGGAAAAAAAAGTGTCAGCAGTAATCTACTTTGAGTAGTGTTTCCATAGAAAACAAAACTGCGCATGCGCGCGCTGAGTGGTCCTTCTCTTTTAATTACTACTGTGTGGTGTGTGTGCTGCCAACAGTAGTAACCATCTGGCACCTCCCTATATTTTTCAGGAAAAATTAAATGAACTGTACTAATTCA(SEQ ID No：2)
相关分子标记序列如下：
M137-F CATCTATCTCTGATACACACATGCAG(SEQ ID No：3)
M137-R ATCAGACACTGCACTGCACA(SEQ ID No：4)
M159-F CTACACCATAGTGTGCTGCTCT(SEQ ID No：5)
M159-R GCAATTTACGAAATTTAAACTGGA(SEQ ID No：6)
M148-2-F GAGCACATCTTATTTTATGACAAACA(SEQ ID No：7)
M148-2-R ATTGCGCTAGCAGGATTCAT(SEQ ID No：8)
M152-F GGATTGCGGAAAGAAAGAACC(SEQ ID No：9)
M152-R AGGCAAACATCTTCAAGTTCACA(SEQ ID No：10)
M148-5-F TTGAGCTCGTACGTGTCTGG(SEQ ID No：11)
M148-5-R TGGCAACACAAACAGTGACA(SEQ ID No：12)
M149-F GTACGTGGCAGAGCTAGACT(SEQ ID No：13)
M149-R CTCGCAGTTGATACCACCCT(SEQ ID No：14)
M150-1F TCCAGAAGACTCGTGCTGAA(SEQ ID No：15)
M150-1R CCCACTTCCTGTACGTACGT(SEQ ID No：16)
M150-3F CATGTGGGACCGGAATCAGA(SEQ ID No：17)
M150-3R ACTTTAGACAGTGACGACCTC(SEQ ID No：18)
M150-6F GCTTGCTTCTTCGCCTACAA(SEQ ID No：19)
M150-6R CCAGATGGTTACTACTGTTGGC(SEQ ID No：20)
M150-7F CCATAGAAAACAAAACTGCGCA(SEQ ID No：21)
M150-7R TCCTTCCTCTCCCAACCAAC(SEQ ID No：22)
M151-F CGTGCCTTTCTTGCATCATA(SEQ ID No：23)
M151-R TTGTCTTGCCATGCTTTCTG(SEQ ID No：24)
基因的表达通常受到顺式作用元件和反式作用元件调控，二者相互作用共同调控功能基因的表达水平。顺式作用元件指与结构基因串联的特定DNA序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率；通常包括启动子、增强子和沉默子。反式作用元件指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白因子，主要包括转录激活因子和转录抑制因子。精细定位区间的240bp序列属于非编码区，并且在ZmRAVL1的上游，猜测240bp的非编码区可能是该基因的顺式作用元件，同样的调控方式在玉米中已有大量报道(Studer et al.2011；Hung et al.2012；Huang et al.2018)。因此，将ZmRAVL1作为调控叶夹角变异的候选功能基因。通过进化树分析(图4)，发现ZmRAVL1与水稻中RAVL1基因的亲缘关系较近，并且在水稻中RAVL1调控叶夹角的表型变异；通过对240bp的非编码区进行反式作用因子结合位点预测发现，在序列GAGTGTG/--(SEQ ID No：25)(图20)处有一个C2C2结合域，并且通过EMSA、ChIP-qPCR和原生质体瞬时表达(图21、22)证实DRL1与C2H2结合域结合并抑制下游基因的表达；最后，通过RNAi、CRISPR/CAS9和过表达3个转基因载体证实，ZmRAVL1是调控叶夹角变异的功能基因(图10、11和12)，并且240bp的非编码区包含调控ZmRAVL1表达的顺式作用元件，是调控ZmRAVL1转录的沉默子。
实施例2ZmRAVL1的核酸分子信息
ZmRAVL1的核酸分子序列在maizeGDB(https://www.maizegdb.org/)上获得(由于玉米自交系B73的基因组以及多个其他玉米自交系的基因组序列已经测通，因此仅对于核酸序列而言，绝大数基因的序列都是已知的，包括该基因在内的所有基因的序列都能够从maizeGDB等多个网站上获得；虽然本基因在maizeGDB等网站上可以预测其功能，但是该基因调控玉米叶夹角的功能是本发明人首次发现的。本发明中用到的材料是玉米自交系W22和玉米野生种大刍草8759，W22已完成测序，基因组序列也已释放；大刍草8759中该基因的序列是参照W22和B73基因组克隆获得，详细信息如图2以及SEQ ID No：26所示(B73参考基因组序列为例)：
(1)启动子区：5’UTR上游；
(2)基因区：如图2中基因组序列所示，标注下划线的序列为基因组的编码区；
(3)UTR区：5’UTR区为ATG上游核酸序列为红色标注的序列；3’UTR为TGA下游核酸序列为红色标注的序列。
实施例3ZmRAVL1的蛋白分子信息
(1)编码蛋白的序列
(https://www.maizegdb.org/gene_center/gene/GRMZM2G102059)
MEFASSSSRFSREEDEEEEQEEEEEEEEASPREIPFMTAAATADTGAAASSSSPSAAASSGPAAAPRSSDGAGASGSGGGGSDDVQVIEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAEKYFPLDAAANEKGQLLSFEDRAGKLWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTVSFCRGAGDTARDRLFIDWKRRADSRDPHRMPRLPLPMAPVASPYGPWGGGGGGGAGGFFMPPAPPATLYEHHRFRQALDFRNINAAAAPARQLLFFGSAGMPPRASMPQQQQPPPPPHPPLHSIMLVQPSPAPPTASVPMLLDSVPLVNSPTAASKRVRLFGVNLDNPQPGTSAESSQDANALSLRTPGWQRPGPLRFFESPQRGAESSAASSPSSSSSSKREAHSSLDLDL
(SEQ ID No：27)(参见图3)
(2)编码蛋白的结构域
(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl)
在Smart网站中对该基因编码的氨基酸序列进行结构域预测显示，该基因编码的氨基酸序列中包含一个B3结构域(图3中红色标注的氨基酸序列)。在gramene网站中，该基因的注释为“B3 domain-containing transcription factor NGA2”。
(3)玉米、高粱、水稻和拟南芥中与该基因所编码蛋白同源的氨基酸序列分析
在玉米、高粱、水稻和拟南芥中，与ZmRAVL1蛋白序列进行同源性比对，取P＝1x10-50为域值，选取不同做物种中同源性较高的蛋白序列进行进化树分析。所使用的详细蛋白序列如下(玉米：SEQ ID No：28-33，高粱：SEQ ID No：34-37，水稻：SEQ ID No：38-40，拟南芥：SEQ ID No：41-44)：
玉米：
>Zm00001d026005_P001/ABi3-2
MEFASSSSRFSKEEEEQEEEEDEEVSPREIPFMTAAATAGTGATSSSPSPSAAASASASSSAAALRSSGGGGGGDDDMEVVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAEKYFPLDAAANEKGLLLSFEDRAGKLWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTVSFCRGAADAARDRLFIDWRKRSADSSRHPHRMLPRLPLHMPPLASPYGYGPWGGGAGGFFVPPATLYEHHRFRQALDFRNVSAAAAPARQLLFFGSAGMPPRASIPQQQQPPPPSLHSIMMVQPSPEATAGLPMLLDSVPLVNSPTAAAKRVRLFGVNLDNPQPGSSAESSHDTNALSLRMPGWQRPGPLRFFESTPQRGAAGAAAGAESSAASSPSSPSSSKREAHSSVDLDL(SEQ ID No：28)
>Zm00001d017618_P001/ABi3-16
MDQFAASGRFSREEEADEEQEDASNSMREISFMPPAAASSSSAAASASASASTSASACASGSSSAPFRSASASGDAAGASGSGGPADADAEAEAVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQYAEKYFPLDAAANEKGLLLSFEDSAGKHWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLVAGDTVSFSRAAAEDARHRLFIDWKRRVDTRGPLRFSGLALPMPLPSSHYGGPHHYSPWGFGGGGGGGGGFFMPPSPPATLYEHRLRQGLDFRSMTTTYPAPTVGRQLLFFGSARMPPHHAPPPQPRPFSLPLHHYTVQPSAAGVTAASRPVLLDSVPVIESPTTAAKRVRLFGVNLDNNPDGGGEASHQGDALSLQMPGWQQRTPTLRLLELPRHGGESSAASSPSSSSSSKREARSALDLDL(SEQ ID No：29)
>Zm00001d010077_P001/ABi3-42
MEFTTPPPATRSGGGEERAAAEHNQHHQQQHATVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAEKYFPLDAAANEKGLLLSFEDRTGKPWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTVSFGRGISEAARDRLFIDWRCRPDPPVVHHQYHHRLPLPSAVVPYAPWAAHAHHHHYPADGHTEPVTPCLCATLVATEMRASSSQLSLTRSNLSRPPQPRIARVDGAQPRPSSSPRQP(SEQ ID No：30)
>Zm00001d027409_P001/ABi3-8
MEFTAPPPATRSGGGEERAAAEHHQQQQQATVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAERYFPLDAAANDKGLLLSFEDRAGKPWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTVSFGRGVGEAARGRLFIDWRRRPDPPVVHHQYHHHRLPLPSAVVPYAPWAAAAHAHHHHYPAAGVGAARTTTTTTTTVLHHLPPSPSPLYLDTRRRHVGYDAYGAGTRQLLFYRPHQQPSTTVMLDSVPVRLPPTPGQHAEPPPPAVASSASKRVRLFGVNLDCAAAAGSEEENVGGWRTSAPPTQQASSSSSYSSGKARCSLNLDL(SEQ ID No：31)
>Zm00001d048815_P001
MEFTTPPPATRSGGGEERAAAEHNQHHQQQHATVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAEKYFPLDAAANEKGLLLSFEDRTGKPWRYRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTDSFGRGISEAARGRLFIDWRCRPDPPVVHHQYHHRLPLPSAVVPYAPFLEKDVALDPTNRSHGERPTFLEKDVALDAARVAAEGAGSDLEVDDDLDRRWEGRISELASLI(SEQ ID No：32)
>Zm00001d051471_P001
MDQFAASRRFSRNDGADEEQEDVSNSMREISFMPGAASSSAAASASASGSSCAPFRSASADGAGASGSGGDGDGSGDVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQYAEKYFPLDAAGNEKGLLLSFEDSDGKHWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLVAGDTVSFSRSRSAAEVVDDARRHRLFIDWKRRGLDTRGPLRFSGLALPMPLASYYGAPHHYSSWGLGGGGGFFMPPSPPATLYEHRLRQGLDFRGMTTYPALTVGRQLLFFGSPRMPPHHAQPQPRPLPLPLHHYTMQPSAAGVTAASASRPLVVDVDSVPAIESPTTAAKRVRLFGVNLDNKPLSVSDGGREASHQSGSGNALLPLPQMPGGWQQRTPTLRLLELPRHGAESSAASSPSSSSSAKREARSAALDLDL(SEQ ID No：33)
高粱：
>SORBI_3006G190400
MEFASSSSRFSKEEDEEEEGEEEDEEASPREIPFMTAAAATADTGPAAASSSSPSAAGASASASGSAAALRSGDGAGASGSGGGGGGSDDVEVIEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAEKYFPLDAAANEKGLLLSFEDRAGKLWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTVSFCRGAGEAARDRLFIDWKRRADSRDPHRMPRLPLPMAPVASPYGLGPWGGGAGGFFMPPAPPATLYEHHRFRQALDFRNINAAAAPARQLLFFGSQGMPPRASMPLQQQQPQPQPSLPPPPPPLHSIMMVQPGSPAVTHGLPMVLDSVPLVNSPTAAAKRVRLFGVNLDNPQQGSSAESSQDANALSLRMPGWQRPGPLRFFESPQRGAAESSAASSPSSSSSSKREAHSSLDLDL(SEQ ID No：34)
>SORBI_3004G280500
MDQFAASGRFSREEEADEEQEDASNSMREISFMPAAAAAGTAPSSSAAASAASTSASASAASGSSSAAAPFRSASGDAAGASGSGGGGGAAADVEAVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQYAEKYFPLDAAANEKGLLLSFEDSAGKHWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLVAGDTVSFSRAAAEDARHRLFIDWKRRVDTRGPLRFSGLALPMPLASHYGPHHYSPWGFGIGGVGGGGGGGGFFMPPSPPATLYEHRLRQGLDFRSMTNYPAPTVGRQQLLFFGSARMPPHHAPAPQPRPLSLPLHHFTVQPSAAAGVTAASRPVVLDSVPVIESPTTAAKRVRLFGVNLDNNPLSEPDGGVGEASHQGNALSLQMPGWQQRTTPTLRLLELPRHGAAESSAASSPSSSSSSKREARSALDLDL(SEQ ID No：35)
>SORBI_3001G528200_OQU93364
MEFTAPPTAARSGGGEERAAEHQQQQQQQLAAVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAEKYFPLDAAANEKGLLLSFEDRTGKPWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTVSFGRGVGDAARGRLFIDWRRRPDPPVHHQYHHRLPLPSVVPYAPWPHAHHHHYPAAAAAVGVGVGAGAGAARTTTVLHLPPSPSSLYDPHLRHVGYDAYGAGTRQLLFYRPLHHQQPSTAVVLDSVPVRLPTTPGQHAEPPAPVVASSASKRVRLFGVNLDCAGSEEENGGGGGWRTSAPPTPHGLPSPPSSSSSSSGKARCSLNLDL(SEQ ID No：36)
>SORBI_3001G528200_EER95618
MEFTAPPTAARSGGGEERAAEHQQQQQQQLAAVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAEKYFPLDAAANEKGLLLSFEDRTGKPWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTVSFGRGVGDAARGRLFIDWRRRPDPPVHHQYHHRLPLPSVVPYAPWPHAHHHHYPAAAAAVGVGVGAGAGAARTTTVLHLPPSPSSLYDPHLRHVGYDAYGAGTRQLLFYRPLHHQQPSTAVVLDSVPVRLPTTPGQHAEPPAPVVASSASKRVRLFGVNLDCAGSEEENGGGGGWRTSAPPTPHGLPSPPSSSSSSSGKARCSLNLDL(SEQ ID No：37)
水稻：
>Os02t0683500_01
MEFTTSSRFSKEEEDEEQDEAGRREIPFMTATAEAAPAPTSSSSSPAHHAASASASASASGSSTPFRSDDGAGASGSGGGGGGGGEAEVVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQYAEKYFPLDAAANEKGLLLNFEDRAGKPWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTVSFSRGIGDEAARHRLFIDWKRRADTRDPLRLPRGLPLPMPLTSHYAPWGIGGGGGFFVQPSPPATLYEHRLRQGLDFRAFNPAAAMGRQVLLFGSARIPPQAPLLARAPSPLHHHYTLQPSGDGVRAAGSPVVLDSVPVIESPTTAAKRVRLFGVNLDNPHAGGGGGAAAGESSNHGNALSLQTPAWMRRDPTLRLLELPPHHHHGAESSAASSPSSSSSSKRDAHSALDLDL(SEQ ID No：38)
>RAVL1_Os04t0581400_01
MEQEQDEEEEEAEASPREIPFMTSAAAAATASSSSPTSVSPSATASAAASTSASGSPFRSSDGAGASGSGGGGGGEDVEVIEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAEKYFPLDSAANEKGLLLSFEDRTGKLWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTVSFCRGAAEATRDRLFIDWKRRADVRDPHRFQRLPLPMTSPYGPWGGGAGASSCRPRRPPRSTSITAFARASTSATSTPLCRRGSSSSSAPQGRGFISTRPCHRRRRHLRLLTNSTLRCTTRAP(SEQID No：39)
>Os03t0120900_01
MEFITPIVRPASAAAGGGEVQESGGRSLAAVEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAEKYFPLDAASNEKGLLLSFEDRTGKPWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKRLDAGDTVSFGRGVGEAARGRLFIDWRRRPDVVAALQPPTHRFAHHLPSSIPFAPWAHHHGHGAAAAAAAAAGARFLLPPSSTPIYDHHRRHAHAVGYDAYAAATSRQVLFYRPLPPQQQHHPAVVLESVPVRMTAGHAEPPSAPSKRVRLFGVNLDCANSEQDHAGVVGKTAPPPLPSPPSSSSSSSGKARCSLNLDL(SEQ ID No：40)
拟南芥：
>AT1G01030.2
MDLSLAPTTTTSSDQEQDRDQELTSNIGASSSSGPSGNNNNLPMMMIPPPEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAERYFPLDSSNNQNGTLLNFQDRNGKMWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKKLDAGDIVSFQRGIGDESERSKLYIDWRHRPDMSLVQAHQFEYNSVPIHRGLNIGNHQRSYYNTQRQEFVGYGYGNLAGRCYYTGSPLDHRNIVGSEPLVIDSVPVVPGRLTPVMLPPLPPPPSTAGKRLRLFGVNMECGNDYNQQEESWLVPRGEIGASSSSSSALRLNLSTDHDDDNDDGDDGDDDQFAKKGKSSLSLNFNP(SEQ ID No：41)
>AT2G46870.1_NGA1
MMTDLSLTRDEDEEEAKPLAEEEGAREVADREHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAERFFPLDSSSNEKGLLLNFEDLTGKSWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKDKKLDAGDIVSFQRCVGDSGRDSRLFIDWRRRPKVPDHPHFAAGAMFPRFYSFPSTNYSLYNHQQQRHHHSGGGYNYHQIPREFGYGYFVRSVDQRNNPAAAVADPLVIESVPVMMHGRANQELVGTAGKRLRLFGVDMECGESGMTNSTEEESSSSGGSLPRGGGGGASSSSFFQLRLGSSSEDDHFTKKGKSSLSFDLDQ(SEQ ID No：42)
>AT1G01030.1_NGA3
MDLSLAPTTTTSSDQEQDRDQELTSNIGASSSSGPSGNNNNLPMMMIPPPEKEHMFDKVVTPSDVGKLNRLVIPKQHAERYFPLDSSNNQNGTLLNFQDRNGKMWRFRYSYWNSSQSYVMTKGWSRFVKEKKLDAGDIVSFQRGIGDESERSKLYIDWRHRPDMSLVQAHQFGNFGFNFNFPTTSQYSNRFHPLPEYNSVPIHRGLNIGNHQRSYYNTQRQEFVGYGYGNLAGRCYYTGSPLDHRNIVGSEPLVIDSVPVVPGRLTPVMLPPLPPPPSTAGKRLRLFGVNMECGNDYNQQEESWLVPRGEIGASSSSSSALRLNLSTDHDDDNDDGDDGDDDQFAKKGKSSLSLNFNP(SEQ ID No：43)
>AT1G13260.1_RAV1(该基因编码的蛋白与ZmRAVL1蛋白同源性比对域值P＝1X10-27)
MESSSVDESTTSTGSICETPAITPAKKSSVGNLYRMGSGSSVVLDSENGVEAESRKLPSSKYKGVVPQPNGRWGAQIYEKHQRVWLGTFNEEDEAARAYDVAVHRFRRRDAVTNFKDVKMDEDEVDFLNSHSKSEIVDMLRKHTYNEELEQSKRRRNGNGNMTRTLLTSGLSNDGVSTTGFRSAEALFEKAVTPSDVGKLNRLVIPKHHAEKHFPLPSSNVSVKGVLLNFEDVNGKVWRFRYSYWNSSQSYVLTKGWSRFVKEKNLRAGDVVSFSRSNGQDQQLYIGWKSRSGSDLDAGRVLRLFGVNISPESSRNDVVGNKRVNDTEMLSLVCSKKQRIFHAS(SEQ ID No：44)
上述编码蛋白的进化树分析结果见图4。进化树分析显示，玉米中ZmRAVL1基因与水稻中已克隆的RAVL1亲缘关系较近(图4)。在水稻中，RAVL1调控油菜素内酯(BR)合成基因和受体基因的表达，维持水稻体内BR含量的平衡，进而调控水稻的株型。过表达RAVL1，水稻叶夹角变大，株型松散；突变体ravl1-1/-2叶夹角减小，株型紧凑。综上所述，与RAVL1高度同源的玉米中基因ZmRAVL1可能参与调控玉米叶夹角的变异。
实施例4 ZmRAVL1转基因载体的构建
4.1 RNAi载体的构建
(1)在基因ZmRAVL1 cDNA区选择特异性片段(150-300bp)设计引物，分别引入酶切位点扩增正义片段和反义片段。扩增正义片段时，在正向引物5’端引入BamH I和Nco I酶切位点和反向引物5’端引入Spe I酶切位点；扩增反义片段时，在正向引物5’端引入Bgl II和BstE II并在反向引物5’端引入Xba I酶切位点。以自交系B73-329的cDNA为模板，分别扩增正义片段和反义片段，测序检测扩增片段碱基序列的准确性；
RNAi靶向序列：
GGACGAGGAGGAAGAGCAGGAGGAAGAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGTCTCCGCGCGAGATCCCCTTCATGACAGCGGCAGCGACGGCCGACACCGGAGCCGCCGCCTCCTCGTCCTCGCCTTCCGCGGCGGCCTCATCGGGTCCTGCTGCTGCCCCCCGCTCGAGCGACGGCGCCGGGGCGTCCGGGAGCGGCGGCGGCGGGAGCGACGACGTGCAGGTGATCGAGAAGGA(SEQ ID No：45)
引物名称及序列
RNAi-1-F CGGGATCCCCATGGGGACGAGGAGGAAGAGCA(SEQ ID No：46)
RNAi-1-R GGACTAGTTCCTTCTCGATCACCTGCAC(SEQ ID No：47)
RNAi-2-F GAAGATCTGGTTACCGGACGAGGAGGAAGAGCA(SEQ ID No：48)
RNAi-2-R GCTCTAGATCCTTCTCGATCACCTGCAC(SEQ ID No：49)
(2)使用大肠杆菌扩繁P1022质粒，同时使用Bgl II和Xba I(Takara)双酶切体系对P1022质粒和反义片段进行酶切，双酶切体系如下：
Figure GDA0003603624440000211
在37℃水浴条件下，孵育3小时以上；
(3)将酶切后的产物使用纯化试剂盒(OMEGA)进行纯化，用T4连接酶(Takara)将反义片段引入P1022载体，连接体系如下：
Figure GDA0003603624440000212
Figure GDA0003603624440000221
在16℃条件下连接8小时以上，最好过夜连接；
(4)将构建好的含有反义片段的P1022载体转化大肠杆菌DH5α进行扩繁，并挑选阳性单克隆测序验证碱基序列的准确性，提取质粒备用；
(5)同时使用BamH I和Spe I的双酶切体系对含有反向片段的P1022质粒和正义片段进行双酶切，酶切体系如下：
Figure GDA0003603624440000222
在37℃水浴条件下，孵育3小时以上；
(6)同样将双酶切后的产物使用纯化试剂盒(OMEGA)进行纯化，并用T4连接酶将正义片段引入P1022载体，连接体系同上；
(7)P1022载体引入正向片段和反方向片段后，形成发卡结构，将该载体转化大肠杆菌DH5α进行扩繁，挑选阳性单克隆正反向测序鉴定，提取质粒备用；
(8)使用Nco I和BstE II(Takara)双酶切体系酶切包含有发卡结构的P1022载体和pCAMBIA3301，使用胶回收试剂盒(Biotake)分别回收酶切下来的发卡结构片段(约350bp片段)和双酶切后的pCAMBIA3301载体(约10kb)，切胶纯化流程按照Biotake胶回收试剂盒的操作流程进行；
(9)使用T4连接酶将回收到的发卡结构片段连接到双酶切后的pCAMBIA3301载体上，连接体系同上。将构建好的载体转化大肠杆菌DH5α进行扩繁，并挑选单克隆测序鉴定，提取质粒于-20℃，以备转化农杆菌。
4.2过表达载体的构建
(1)以自交系W22的基因组为参考序列，设计包含ZmRAVL1基因编码区(CDS)全长的扩增引物，以自交系W22的CDNA为扩增模板，将扩增产物连接pEASY-T1(Transgene)，以该质粒为模板，扩增基因ZmRAVL1的全长编码区(CDS)，并将扩增产物使用纯化试剂盒(OMEGA)进行纯化，以上扩增均使用高保真酶；引物名称及序列如下：
AP2-3F GGCCTCATCGCGGATAGAT(SEQ ID No：50)
AP2-3R TTCGCCAGCTGATCGATCTC(SEQ ID No：51)
overE-1F ATGGAGTTCGCGAGCTCTTC(SEQ ID No：52)
overE-1R TCACAGATCGAGATCCAAGG(SEQ ID No：53)
(2)使用Xcm1(NEB)酶切载体pBCXUN，酶切体系如下：
Figure GDA0003603624440000231
在37℃条件下酶切6小时，65℃条件下失活20分钟后备用；
(3)将纯化后的片段与酶切后的载体pBCXUN连接，连接体系如下：
Figure GDA0003603624440000232
在16℃条件下过夜连接；
(4)将连接好的载体转化大肠杆菌DH5α进行扩繁，挑选阳性单克隆测序鉴定，使用质粒提取试剂盒(TIANGEN)提取质粒，备用转化农杆菌。
4.3Cas9载体的构建
(1)筛选靶点。登陆到网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/进行ZmRAVL1基因靶位点的设计，原则主要包括靶位点位于基因CDS上且尽量靠近起始编码子ATG、靶位点特异性高脱靶率低、靶位点结合目标序列评估效率高和靶位点CG含量为55％-60％较好；通过分析确定ATG后11bp处的CTCTTCGAGTAGGTTTTCC(SEQ ID No：54)核酸序列为gRNA。
(2)引物退火合成双链。合成靶点时，在正向引物5’端添加序列GGCG(SEQ ID No：55)和反向互补引物5’端添加序列AAAC(SEQ ID No：56)，正向引物和反向互补引物各5μL，共10μL体系，退火条件如下：
变性 95℃ 10分钟
退火 (Tm值减去3-5)℃ 10分钟，斜率(R)为3-5％
保温 16℃
引物名称序列
B3-cas9-F GCTCTTCGAGTAGGTTTTCC(SEQ ID No：57)
B3-cas9-R GGAAAACCTACTCGAAGAGC(SEQ ID No：58)
(3)酶切载体pBUE411。酶切体系如下：
Figure GDA0003603624440000241
在37℃水浴条件下，酶切4小时以上；
(4)靶点与载体连接。使用T4连接酶将靶点引入酶切后的pBUE411载体上，连接体系如下：
Figure GDA0003603624440000242
Figure GDA0003603624440000251
在16℃控温条件下，过夜连接；
(5)将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选单克隆，使用引物TaU3-FD3和靶点反向互补序列鉴定菌落PCR，使用TaU3-FD3测序验证靶点序列。扩繁阳性单克隆，提取质粒，以备转化农杆菌。
引物序列：
TaU3-FD3 TTAGTCCCACCTCGCCAGTTTACAG(SEQ ID No：59)
4.4制备感受态农杆菌
YEB培养基的配制(PH＝7.0)：
Figure GDA0003603624440000252
注：YEB固体培养基，则需要加入以上试剂溶解后加入15g琼脂粉。
50mg/mL利福平母液的配制：称取1g利福平，加入20mL的甲醇；
(1)将保存于-80℃的农杆菌菌株EHA105在YEB固体(含0.1mg/mL利福平)平板上划线，于28℃避光培养48小时；
(2)挑选性状规则圆滑的直径2-3mm的农杆菌菌斑接种到5mL YEB液体培养基(含0.05mg/mL利福平)中，在摇床上28℃条件下220rpm避光过夜培养；
(3)在50mL YEB液体培养基(含0.05mg/mL利福平)中加入2mL上述培养液，在28℃条件下，以转速220rpm培养，培养菌液的OD值到0.5-1.0之间；
(4)将培养好的菌液转入离心管，置于冰上冷却，然后在4℃条件下，以转速5000rpm离心5分钟；
(5)将离心后的上清液去掉，加入适量提前预冷的100mM NaCl重新悬起菌液，清洗菌体，在4℃条件下，以转速5000rpm离心5分钟；
(6)去除离心后的上清液，加入1mL冰上预冷的20mM的CaCl2重新悬起菌体，分装成50μL每管，于液氮中速冻保存于-80℃备用。
4.5农杆菌转化(液氮速冻法)
(1)取-80℃保存的感受态农杆菌置于冰中融化(不可反复冻融)，于50μL感受态农杆菌中加入1μg质粒(在超净台中操作)，轻轻摇动混匀，插于冰中冰浴30分钟；
(2)冰浴完成后，将样品放于液氮中速冻5分钟，然后迅速转入37℃水浴锅中热激5分钟，接着立即置于冰内2分钟；
(3)在超净台中加入1mL无抗YEB培养液，在28℃条件下，以转速200rpm避光震荡3-4小时；
(4)在常温下以转速5000rpm离心2min收集农杆菌菌体，去除900μL上清液，用剩余上清液重悬菌体；
(5)将重悬混合均匀的菌体均匀涂布于含有抗生素的YEB固体培养基(含0.05mg/mL利福平和0.1mg/mL卡那霉素)上，在28℃条件下暗培养48小时；
4.6农杆菌介导玉米幼胚遗传转化
(1)摇菌。将保存于-80℃的农杆菌菌液接种到25mL含抗生素的YEB液体培养基(0.05mg/mL利福平和0.1mg/mL卡那霉素)中，在28℃条件下以转速180rpm避光过夜震荡培养。于第二天早上将10mL过夜培养的菌液加入到40mL含抗生素的YEB液体培养基(菌液按1：5稀释)中，以28℃条件下转速180rpm避光培养至下午五点左右。分装菌液至50mL离心管中，以4000rpm离心10分钟收集农杆菌菌体，去除上清液，加入诱导培养基25mL，重新悬起菌体沉淀至其OD660＝0.1，28℃条件下转速180rpm避光过夜震动培养。第三天早上将过夜培养的菌液分装至50mL离心管中，以4000rpm离心10分钟收集菌体，加入适量的侵染培养基(Inf+200μM AS)，使其OD660＝0.8，分装至2mL中，放于22℃暗培养箱中备用；
(2)剥胚。取自交系B73-329自交授粉10-13天的幼穗，去除顶端1cm左右，在上部轴心处插入镊子，放入杀菌溶液(50％商业漂白剂和一滴Tween20)中浸泡20分钟，杀菌溶液需没过幼穗，之后用灭菌后的ddH2O清洗三次，或用70％的乙醇清洗45-60秒，再用无菌水清洗2次。用灭菌后的手术刀切去籽粒表面1/3，用灭菌后的小手术刀的刀背挤出幼胚，挑选1.2-2mm的幼胚(须保证幼胚的完整性)放到侵染培养基中，胚的体积达到0.5mL处，放于22℃暗培养箱中备用；
(3)侵染。将放入侵染液中的幼胚上下颠倒清洗，用枪吸去侵染液，再加入新鲜侵染液清洗幼胚1-2次，最后加入能够没过幼胚的侵染液，于45℃条件下热激5分钟，用枪头去除侵染液，加入含有农杆菌的侵染培养基1.8mL，轻轻地上下颠倒数次，室温下静置离心管30分钟，完成侵染过程，除去侵染液，注意不要破坏胚的完整性。
(4)共培养。侵染完成后，将幼胚用长柄勺轻轻转移到共培养培养基上，用长柄勺的背面将幼胚均匀分开(注意不要损坏幼胚)，用灭菌后的小手术刀尖将胚翻转为弓形面朝上，封口写号，于22℃避光培养20-24小时，不宜超过24小时。此步骤需注意，共培养培养基中含有AgNO3，在光下操作尽量要快；
(5)筛选培养。用灭菌后的小手术刀刀尖将共培养培养基上的幼胚转移到筛选培养基上，每个平板上均匀放置25个幼胚，将受伤或不完整的幼胚丢弃，以免污染培养基，将平板封口并写号，在30℃条件下避光培养2周。筛选培养基中也含AgNO3，在光下操作尽量要快；
(6)预分化。用灭过菌的镊子挑选筛选培养基中的愈伤组织转移到预分化培养基上，每个平板平均分布15个愈伤组织，其中不生长的幼胚、太小和褐化的愈伤组织不可转入预分化培养基。将培养平板封口并写号，在温度26℃、湿度55％条件下光照(光：暗为16：8)培养一周，培养时需在培养皿上盖一层白纱布。
(7)分化。将预分化培养基中预分化良好且变绿的愈伤组织轻柔转移到分化培养基上，每个培养平板平均分布10个愈伤组织，将培养平板封口并写号，放于26℃条件下光照培养1-2个月，培养期间每2周更换一次培养基。在更换培养基过程中，可将较大的幼苗或成型较小幼苗转移至生根培养基上。愈伤组织有死叶片的或褐化的要小心去掉，愈伤太大的可分成直径约5mm的小块；
(8)生根。将在分化培养基中分化完好的玉米幼苗转移到生根培养基上，将有根的部分幼苗的根轻轻置于生根培养基中，盖上盖子，在26℃条件下光照培养2周，若幼苗长势良好则进行下一步移栽，若20天未长根则丢弃；
(9)移栽。将长势及生根完好的幼苗移栽到土壤中，放于温室中精心管理。
实施例5ZmRAVL1功能验证
5.1近等基因系表型分析
5.1.1近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759叶夹角变异分析
筛选遗传背景相对纯合，目标区段杂合的HIF(Heterogeneous Inbred Family)家系MR0220，构建UPA2的近等基因系，命名为UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759。通过测量穗下叶夹角(Lower)、穗上叶夹角(Middle)和倒二叶夹角(Upper)衡量近等基因系整株叶夹角的差异(图5)。研究结果表明，与UPA2-NILW22相比，UPA2-NIL8759的穗下叶夹角、穗上叶夹角和倒二叶夹角减小。说明UPA2调控玉米穗下叶夹角、穗上叶夹角和倒二叶夹角的大小。
5.1.2叶耳处组织学和细胞学分析
(1)叶耳面积和近远轴端叶耳宽度
为了研究引起UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759叶夹角差异的原因，本发明人测量了叶耳面积和近远轴端叶耳宽度(图6)。结果显示，UPA2-NIL8759的穗下叶耳面积、穗上叶耳面积和倒二叶耳面积均显著小于UPA2-NILW22。同时，尽管UPA2-NIL8759穗下、穗上和倒二叶的近轴端叶耳宽度无显著性差异，但远轴端叶耳宽度显著小于UPA2-NILW22。这表明，近等基因系间叶夹角的差异部分是由叶耳面积的大小引起的，并且与远轴端叶耳宽度呈正相关。
(2)远轴端叶耳边缘细胞电镜扫描
在V2时期，取近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759成熟叶片(L2)叶环和发育中叶片(L4)叶环的样品进行固定，利用扫描电镜技术(SEM)观察L2和L4的叶耳处细胞形态学发育特征。首先，本发明人对近等基因系的L2叶环进行扫描电镜。结果显示，UPA2-NILW22的成熟叶耳面积和叶耳宽度明显大于UPA2-NIL8759；同时对发育中叶片的前叶环带扫描，显示UPA2-NIL8759的前叶环带宽度显著小于UPA2-NILW22，以上结果表明UPA2-NIL8759较小的叶耳面积是由于前叶环带的宽度小引起的(图7)。
扫描近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759成熟叶片L2叶环远轴端叶耳处细胞，统计细胞的长度和宽度统计并检测差异显著性，发现近等基因系中二者均不表现显著差异(图7)。以上结果表明，近等基因系成熟叶耳面积的大小不同是由前叶环带宽度差异使发育成叶耳处细胞数不同而引起的，最终表现出二者叶夹角的变异。
5.1.3近轴端或远轴端厚壁细胞的层数和厚度分析
研究表明，近轴端或远轴端叶环细胞的不平衡发育、机械组织的发育和机械强度、维管束的形成和大小以及细胞壁的成分均能够影响叶夹角的大小(Ning et al.2011)。因此，对叶环处横切面组织细胞学分析显得尤为重要。在V2时期，取成熟叶片L2的叶环(叶片完全展开)于FAA固定液中(图8A)，制备石蜡样品，用于UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759横切面组织细胞形态学的差异研究。
在显微镜下观察UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759叶环横切面的石蜡切片，统计近远轴端厚壁细胞的厚度和层数(图8A)。叶环横切面分析结果显示，UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759在远轴端厚壁细胞的厚度和层数均无显著性差异(图8B和C)；而UPA2-NIL8759近轴端厚壁细胞的厚度和层数显著大于UPA2-NILW22(图8D和E)。这表明，近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759之间叶夹角的差异与近轴端厚壁细胞的厚度和层数相关。在二者叶环横切面上，近轴端厚壁细胞层数越多，厚度越大，叶脉对叶片的支撑作用越强，从而使UPA2-NIL8759保持较小的叶夹角。以上结果表明，近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759的叶夹角的差异部分是由叶环区近轴端厚壁细胞的层数或厚度引起的。
5.2近等基因系的表达分析
在V5时期，对近等基因系进行各组织部位进行取样，取样部位主要包括：成熟叶(L5)和靠近成熟叶的两片未成熟叶(L6和L7)的叶片(Blade)、叶环(Ligule region)、叶鞘(Sheath)；去掉三片叶后的基部(Base)；幼根(Root)。除此之外，在V9时期取幼嫩的雄穗(Tassel，约1cm)。
对各组织部位的样品进行研磨、提取RNA、纯化和反转录，得到cDNA后进行实时定量(RT-qPCR)分析近等基因系间ZmRAVL1的表达情况。结果显示，ZmRAVL1在不同时期各个组织部位均有表达，且在成熟组织表达量高于未成熟组织(图9)，这说明ZmRAVL1是一个广谱表达的基因不具有组织特异性。比较近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759之间的表达，发现ZmRAVL1的表达在未成熟叶(L6和L7)中存在显著性差异，在发育完全成熟的叶片(L5)中表达差异不显著。除此之外，ZmRAVL1在近等基因系的根中有大约两倍的表达差异，在其他的组织部位中差异不显著。
综合以上结果说明，ZmRAVL1在玉米各个组织部位均有表达且成熟组织(如成熟叶片)中表达量高，近等基因系间表达的差异主要体现在未成熟的叶片中且在UPA2-NILW22中的表达量显著高于UPA2-NIL8759。
5.3转基因株系的表达或编辑类型以及表型分析
5.3.1RNAi转基因株系的表达和表型分析
在V5时期，按照NILs的取样方式，取2个RNAi转基因事件中阳性株系和阴性对照L7叶片的叶环区，检测ZmRAVL1的表达水平显示，ZmRAVL1在2个事件中均表现为阳性株系的表达量显著低于阴性对照(图10B)。
玉米雄穗和雌穗发育完全且叶夹角固定(约授粉后15天)后，对2个RNAi转基因事件中阳性株系和阴性对照3个叶位的叶夹角进行表型测量。如图10所示，ZmRAVL1的转录水平受干扰后，整个玉米植株株型变得紧凑；统计分析测量数据发现，与阴性对照相比两个干扰系ZmRAVL1-RNAi#1和ZmRAVL1-RNAi#2穗下叶夹角、穗上叶夹角和倒二叶夹角均显著小于阴性对照。该结果表明，降低基因ZmRAVL1表达量能够减小玉米叶夹角，使玉米植株紧凑。以上结果表明ZmRAVL1参与叶夹角的调控途径并且可以通过降低ZmRAVL1的表达减小玉米叶夹角，使植株株型紧凑。
5.3.2过表达转基因株系的表达和表型分析
检测V5时期过表达事件ZmRAVL1-OE#1和ZmRAVL1-OE#2和阴性对照表达量变化。检测结果显示，与阴性对照相比，ZmRAVL1在两个过表达转基因事件中均表现为表达量显著上调(图11B)。
玉米植株成熟且叶夹角固定(授粉后约15天)，对两个过表达转基因阳性事件和阴性对照进行叶夹角表型测量(图11)。三个叶位叶夹角统计数据分析显示，伴随ZmRAVL1基因的表达量上调，2个阳性事件ZmRAVL1-OE#1和ZmRAVL1-OE#2叶夹角增大，使玉米整体株型变得松散。以上结果同样表明ZmRAVL1参与叶夹角的调控途径并且可以通过上调ZmRAVL1表达增大叶夹角，使植株株型松散。
5.3.3CRISPR/Cas9技术编辑ZmRAVL1的突变位点和表型分析
利用CRISPR/Cas9技术，编辑ZmRAVL1的CDS区，获得7个T1代转基因事件。在T2代株系中，在靶位点侧翼设计引物cas9-F和cas9-R扩增T2株系基因组DNA并进行单株测序，测序结果显示有2个事件中存在测序单峰植株。与野生型进行目标区段的序列比对发现，这2个株系分别为14bp缺失和单碱基插入的纯合突变体。将2个株系中单峰的植株自交留种，获得2个纯合突变的独立转基因事件。将这2个通过基因编辑获得纯合突变体分别命名为ZmRAVL1-KO#1和ZmRAVL1-KO#2(图12A和B)。
将2个纯合突变体ZmRAVL1-KO#1和ZmRAVL1-KO#2与阴性对照进行田间种植，植株成熟且叶夹角固定后(即授粉后约15-20天)进行表型调查。数据分析显示，ZmRAVL1-KO#1和ZmRAVL1-KO#2的穗下叶夹角、穗上叶夹角和倒二叶夹角均显著小于野生型(图12C)。以上结果表明，ZmRAVL1是调控叶夹角变异的重要基因，其功能缺失能够显著减小整个植株的叶夹角。
引物序列及名称：
cas9-F CAGCCAGCTAGTCAGTCTCC(SEQ ID No：60)，
cas9-R TGTCATGAAGGGGATCTCGC(SEQ ID No：61)。
5.3.4ZmRAVL1-KO#1和WT叶耳区组织学和细胞学分析
(1)叶耳面积和近远轴端叶耳宽度分析
测量ZmRAVL1-KO#1和WT叶耳的面积以及近远轴端叶耳宽度的大小(图13)。结果显示，ZmRAVL1-KO#1的穗下叶、穗上叶和旗叶倒二叶叶耳面积以及远轴端叶耳宽度均显著小于WT。结果证实，ZmRAVL1通过调控叶耳面积大小影响叶夹角的大小。
(2)远轴端叶耳边缘细胞电镜扫描分析
对ZmRAVL1-KO#1和WT成熟叶片L2的叶耳以及未成熟叶片L4的前叶舌带进行电镜扫描(图14A)，结果显示ZmRAVL1-KO#1成熟叶片L2的叶耳宽度(图14B、C和D)和L4前叶环带宽度显著小于WT(图14G)，表明ZmRAVL1-KO#1较小的叶耳面积是由于前叶环带的宽度小引起的。
对ZmRAVL1-KO#1和WT成熟叶片L2的远轴端叶耳处细胞的长度和宽度统计检测，发现二者不存在显著性差异(图14E和F)。以上结果证实，ZmRAVL1-1通过调控前叶环带宽度而影响发育成叶耳处细胞数目的多少，最终导致叶耳面积的差异而表现出叶夹角的变异。
(3)近远轴端厚壁细胞的层数和厚度分析
统计ZmRAVL1-KO#1和WT V2时期成熟叶片叶环处横切面近远轴端厚壁细胞的厚度和层数，统计数据显示(图15)，ZmRAVL1-KO#1和WT在远轴端厚壁细胞的厚度和层数均无显著性差异；而ZmRAVL1-KO#1近轴端厚壁细胞的厚度和层数显著多于WT。以上结果证实，ZmRAVL1通过调控近轴端厚壁细胞的层数或厚度增强叶脉对叶片的支撑强度，进而表现出较小的叶夹角，维持株型紧凑。
5.4构建F1杂交种基因效应分析
5.4.1ZmRAVL1-KO#1或ZmRAVL1-RNAi#1和WT与优良自交系构建F1测验杂交种
为了验证ZmRAVL1在基因工程育种中的潜在利用价值，利用携带CRISPR/Cas9载体的纯合阳性株系ZmRAVL1-KO#1和野生型WT分别与多个优良自交系(HC、Xu178、C7-2、Z58、PH4CV和PH6WC)杂交构建F1测验杂交种。按照相同的方法，利用RNAi纯合阳性株系ZmRAVL1-RNAi#1和野生型WT分别构建F1测验杂交种。
(1)F1测验杂交种叶夹角差异分析
测量F1测验杂交种穗下、穗上和倒二叶的叶夹角大小。数据分析显示(图16)，自交系与ZmRAVL1-KO#1或ZmRAVL1-RNAi#1杂交产生F1杂交种的穗下、穗上和倒二叶叶夹角显著小于自交系与WT杂交产生F1杂交种的3个叶位叶夹角大小。以上结果表明：在基因工程育种中，结合回交改良和转基因技术能够通过降低ZmRAVL1表达水平或使ZmRAVL1功能缺失减小杂交种亲本的叶夹角大小，进而培育株型紧凑的杂交种，提高单位面积玉米种植密度。
5.5ZmRAVL1-KO#1和WT小区产量实验
5.5.1 2018年TL小区实验
(1)小区的实验设计
2018年春季在辽宁省铁岭市铁岭县进行ZmRAVL1-KO#1和WT的密植高产实验，采取裂区实验设计，主区为生物学重复，副区为不同的种植密度和基因型。设置3个生物学重复，每个生物学重复下设3000、4500、6000、7500和9000株/亩5个密度；每个密度下种植5行ZmRAVL1-KO#1和5行WT；设定行长5米，行宽0.5米(图17)。在玉米各生育期，对不同的重复之间实施相同一致的田间管理措施，统一施肥、除草、防治病虫害等。玉米在自然开放状态下完成授粉，不进行任何人工辅助授粉工作。玉米籽粒生理状态达到完熟期时进行收获，每个基因型收获中间3行用于考种测产。
(2)CAS9小区穗部性状和产量因子分析
收获后的玉米果穗进行充分晾晒，之后进行考种工作。主要考察的性状包括百粒重、穗粒数、穗粒重和单位面积产量。百粒重指考察穗子中部一百粒籽粒的质量，穗粒数指玉米果穗上所有完成授粉并已形成籽粒雏形的籽粒数量，穗粒重指玉米果穗上所有籽粒的质量。单位面积产量指通过3行考种的果穗质量计算出该小区内平均果穗质量，进而换算成亩产量(M＝(m1+m2+m3……mn)/n*N，M：每亩玉米籽粒产量，mn：单个果穗重，N：每亩玉米株数)。在3000、4500株/亩的密度下，ZmRAVL1-KO#1和WT每亩产量之间没有显著性差异，而在6000、7500和9000株/亩的密度下，ZmRAVL1功能缺失夹角较小的ZmRAVL1-KO#1亩产量较WT显著增产(图18)。分析影响产量因子发现，玉米平均单株产量是决定每亩产量差异的因素，而夹角较小的ZmRAVL1-KO#1单穗粒数显著多于叶夹角较大WT的粒数且二者的百粒重无显著性差异。这表明，单穗粒数是引起ZmRAVL1-KO#1和WT的产量差异的主要因子。
5.5.2 2018年HN小区实验
(1)小区的实验设计
2018年冬季在海南省三亚市南滨农场进行ZmRAVL1-KO#1和WT的密植高产实验，采取裂区实验设计，主区为生物学重复，副区为不同的种植密度和基因型。设置3个生物学重复，每个生物学重复下设3000、4500、6000、7500和9000株/亩5个密度；每个密度下种植5行ZmRAVL1-KO#1和5行WT；设定行长5米，行宽0.5米。在玉米各生育期，对不同的重复之间实施相同一致的田间管理措施，统一施肥、除草、防治病虫害等。玉米在自然开放状态下完成授粉，不进行任何人工辅助授粉工作。玉米籽粒生理状态达到完熟期时进行收获，每个基因型收获中间3行用于考种测产。
(2)CAS9小区穗部性状和产量因子分析
收获后的玉米果穗进行充分晾晒，之后进行考种工作。主要考察的性状包括百粒重、穗粒数、穗粒重和单位面积产量。百粒重指考察穗子中部一百粒籽粒的质量，穗粒数指玉米果穗上所有完成授粉并已形成籽粒雏形的籽粒数量，穗粒重指玉米果穗上所有籽粒的质量。单位面积产量指通过3行考种的果穗质量计算出该小区内平均果穗质量，进而换算成亩产量(M＝(m1+m2+m3……mn)/n*N，M：每亩玉米籽粒产量，mn：单个果穗重，N：每亩玉米株数)。在3000株/亩的密度下，ZmRAVL1-KO#1和WT每亩产量之间没有显著性差异，而在4500、6000、7500和9000株/亩的密度下，ZmRAVL1功能缺失夹角较小的ZmRAVL1-KO#1的产量较野生型显著增加(图19)。分析影响产量的因子发现，玉米平均单株产量是决定每亩产量差异的因素，而夹角较小的ZmRAVL1-KO#1单穗粒数显著多于叶夹角较大WT的粒数且二者的百粒重除在6000、7500株/亩密度下其他密度无显著性差异。这表明，单穗粒数是引起ZmRAVL1-KO#1和WT的产量差异的主要因子。
实施例6功能位点验证
6.1精细定位区间240bp核酸序列分析
通过精细定位，将UPA2定位区间缩小至240bp非编码区，该区间距下游基因ZmRAVL1的物理距离约为9.54kb(图20A)。将精细定位区间240bp的核酸序列在近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759之间进行测序比对，发现1个1bp的碱基变异和3个1-2bp的插入缺失，将4个多态性位点分别命名为S1、S2、S3和S4(图20B)。
6.2S2位点功能验证
利用PPAN2.0软件对定位区间240bp的4个变异位点及部分侧翼序列进行上游转录因子结合位点的基序预测。预测结果显示，只有在变异位点S2的位置上UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759的结合基序有差异，其他3个变异位点没有预测到有差异的蛋白结合基序。进一步分析发现，在UPA2-NIL8759携带的TG插入等位基因附近上存在C2C2转录因子结合位点(GAGTGTG(SEQ ID No：25))，而UPA2-NILW22的对应核酸序列上则没有预测到一致的蛋白结合基序(图20B)。最近，Strable等人(2017)克隆了2个调控玉米叶夹角变异的基因DRL1(Dropping Leaf 1)和DRL2，2个基因的突变体表现出显著增大叶夹角的表型，特别是双基因突变体表型更剧烈，表现出叶片下垂的披散状表型(Strable et al.2017)。DRL1和DRL2均是YABBY转录因子，在N端含一个C2C2锌指结构域。因此，猜测DRL蛋白能否直接结合在S2位点附近调控下游基因ZmRAVL1的表达？由于DRL1和DRL2蛋白高度同源，选择突变体表型更明显DRL1做进一步分析。
利用EMSA(electrophoretic mobility shift assay)验证这一推测。首先，分别针对UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759的序列设计生物素标记的EMSA探针(UPA2-NILW22生物素探针：UPA2-NILW22-F,UPA2-NILW22-R；UPA2-NILW22竞争性探针：UPA2-NILW22-com-F,UPA2-NILW22-com-R；UPA2-NIL8759生物素探针：UPA2-NIL8759-F,UPA2-NIL8759-R；UPA2-NIL8759竞争性探针：UPA2-NIL8759-com-F,UPA2-NIL8759-com-R)，探针包含有C2C2结合基序及上下游侧翼序列各22bp，同时合成无生物素标记的对应序列作为竞争性探针。接着，利用同源重组法将DRL1 CDS区重组到PET32a原核表达载体上，构建DRL1-His融合蛋白表达载体，导入表达菌株Rosetta中，诱导DRL1-His融合蛋白的表达。最后，使用镍柱磁珠纯化得到DRL1-His融合蛋白。DRL1-His融合蛋分别与生物素标记探针UPA2-NILW22-Bio和UPA2-NIL8759-Bio及竞争性探针在常温下孵育20min，经非变性胶电泳、转膜、交联和化学发光显色等步骤观察探针DNA的迁移率。实验结果显示，DRL1-His融合蛋能够与生物素标记的探针UPA2-NILW22-Bio和UPA2-NIL8759-Bio形成阻滞带，且化学发光显示与探针UPA2-NIL8759-Bio的形成的阻滞带比与探针UPA2-NILW22-Bio形成的条带稍亮(图21A)。加入竞争性探针后，DRL1蛋白与生物素标记探针UPA2-NILW22-Bio和UPA2-NIL8759-Bio的结合带均消失(图21A)。以上结果表明，DRL1蛋白在体外能够分别与包含C2C2结合基序的UPA2-NILW22-Bio和UPA2-NIL8759-Bio探针结合，且对包含TG插入的UPA2-NILW22-Bio探针结合能力稍强于缺失TG碱基的UPA2-NIL8759-Bio探针。因此，S2位点可能是通过与DRL1蛋白结合强弱影响下游基因ZmRAVL1表达差异。
为了进一步验证DRL1蛋白能够在体内与预测的C2C2结合基序结合，本发明人将DRL1 CDS区重组到ubi：p1307载体(载体信息见图26)上，构建DRL1-Flag融合蛋白过表达载体，将其转化到原生质体中表达DRL1-Flag融合蛋白，使用Flag抗体孵育结合原生质体内DRL1-Flag融合蛋白，通过免疫共沉淀等过程获得DRL1-Flag融合蛋白富集的核酸序列。同时，在C2C2结合基序附近及上游选取3个片段分别设计1对引物，记为F1(F1-F和F1-R)、F2(F2-F和F2-R)和F3(F3-F和F3-R)。以纯化免疫共沉淀富集的DNA片段为模板，使用3对引物进行Chip-qPCR定量分析。Chip-qPCR检测结果显示，包含S2位点的DNA片段显著富集。该结果表明，DRL1蛋白在体内能够与位于基因ZmRAVL1上游约9.54kb处的S2位点附近序列结合(图21B)。
其中，引物名称及序列如下：
UPA2-NILW22-F AACTGCGCATGCGCGCGCTGAGTGGTCCTTCTCTTTTAATTACTACTG(SEQ IDNo：62)
UPA2-NILW22-R CAGTAGTAATTAAAAGAGAAGGACCACTCAGCGCGCGCATGCGCAGTT(SEQ IDNo：63)
UPA2-NILW22-com-F AACTGCGCATGCGCGCGCTGAGTGGTCCTTCTCTTTTAATTACTACTG(SEQID No：64)
UPA2-NILW22-com-R CAGTAGTAATTAAAAGAGAAGGACCACTCAGCGCGCGCATGCGCAGTT(SEQID No：65)
UPA2-NIL8759-F AACTGCGCATGCGCGCGCTGAGTGTGGTCCTTCTCTTTTAATTACTACTG(SEQID No：66)
UPA2-NIL8759-R CAGTAGTAATTAAAAGAGAAGGACCACACTCAGCGCGCGCATGCGCAGTT(SEQID No：67)
UPA2-NIL8759-com-F AACTGCGCATGCGCGCGCTGAGTGTGGTCCTTCTCTTTTAATTACTACTG(SEQ ID No：68)
UPA2-NIL8759-com-R CAGTAGTAATTAAAAGAGAAGGACCACACTCAGCGCGCGCATGCGCAGTT(SEQ ID No：69)
F1-F ATGCGGACGATGTGTGATTG(SEQ ID No：70)
F1-R ACGGCTGCGAATTTCACTTT(SEQ ID No：71)
F2-F ACACGTCGAAATCAAAGGGG(SEQ ID No：72)
F2-R TCATTGGTGCCGAGTTGTTC(SEQ ID No：73)
F3-F GAACAACTCGGCACCAATGA(SEQ ID No：74)
F3-R GCACACACACCACACAGTAG(SEQ ID No：75)
6.3功能位点的效应验证
ZmRAVL1通过转录水平调控玉米叶夹角的变异，因此，在UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759中，S2位点可能作为顺式作用元件通过与DRL1蛋白结合强弱影响下游基因ZmRAVL1的表达，进而影响叶耳处细胞形态和数目的发育，最终表现出叶夹角差异。对于这一猜想，本发明人利用原生质体双荧光报告系统进行验证。
首先，利用同源重组法将DRL1基因的CDS区重组到pGreenII 62-SK载体(载体信息见图27)上，构建Effector载体DRL1(图22A)。其次，将来自B73参考基因组的ZmRAVL1基因ATG上游约1.7kb启动子序列克隆到双荧光瞬时报告系统中的Reporter载体骨架上，用于启动报告基因LUC的表达。接着，将近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759中定位区间序列约240bp重组到改造后的Reporter载体上，分别构建报告载体UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759(图22A)。将构建好的载体质粒转化到玉米黄化苗提取的原生质体中，通过检测荧光素酶(LUC)的活性计算LUC/REN的值来分析240bp对下游基因的调控作用。
分析结果显示，报告载体UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759均加入62-SK空载时，携带TG插入等位基因的UPA2-NIL8759报告载体LUC表达量显著低于缺失TG等位基因的UPA2-NILW22报告载体LUC表达量；报告载体UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759均加入Effector载体DRL1时，分别与阴性对照(分别加入62-SK空载的UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759)相比，DRL1蛋白均可显著抑制LUC荧光素酶的表达且UPA2-NIL8759报告载体中LUC荧光素酶表达受到更强的抑制作用(图22B)。以上结果证实，在UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759中，DRL1蛋白能够通过结合在S2位点附近序列的强弱来调控下游基因ZmRAVL1的表达，与其结合能力强，则对下游基因表达的抑制作用强，ZmRAVL1的表达量低，表现紧凑的叶夹角表型；与其结合能力弱，则对下游基因表达的抑制作用弱，ZmRAVL1的表达量高，表现松散的叶夹角表型。
6.4驯化瓶颈效应下优良等位基因丢失分析
在UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759中，UPA2作为顺式调控因子通过调控下游基因ZmRAVL1的表达进而影响叶耳区细胞形态和数目的发育，最终表现出叶夹角的差异。为了研究UPA2是否在调控玉米叶夹角的自然变异中发挥重要作用，将508份玉米自交系组成的关联群体进行测序，序列比对分析显示，没有玉米自交系携带S2位点是TG插入的等位基因(表1)。进一步测序地理分布更为广泛的50个玉米地方种，结果显示(表1)：在S2位点，无玉米地方种携带控制紧凑株型的TG插入等位基因。以上结果显示，S2位点处TG插入的等位基因可能仅存在于大刍草中。为了验证这一猜想，测序来源广泛的45个大刍草系，结果显示，仅有2个(4.4％)大刍草中携带TG插入等位变异。综上所述，S2位点是一个仅存在大刍草中的稀有等位变异，在玉米驯化过程中可能由于遗传瓶颈效应而丢失。
表1：S2位点TG插入等位基因在大刍草、地方野生种和玉米自交系中的频率分布
Figure GDA0003603624440000391
6.5近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759小区实验
6.5.1 2017年铁岭密植高产实验
(1)小区的实验设计
2017年春季在辽宁省铁岭市铁岭县进行UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759的密植高产实验，采取裂区实验设计，主区为生物学重复，副区为不同的种植密度和基因型。设置3个生物学重复，每个生物学重复下设3000、5000、7000、8000和9000株/亩5个密度；每个密度下种植5行UPA2-NILW22和5行UPA2-NIL8759；设定行长5米，行宽0.5米。在玉米各生育期，对不同的重复之间实施相同一致的田间管理措施，统一施肥、除草、防治病虫害等。玉米在自然开放状态下完成授粉，不进行任何人工辅助授粉工作。玉米籽粒生理状态达到完熟期时进行收获，每个基因型收获中间3行用于考种测产。
(2)小区穗部性状和产量因子分析
收获后的玉米果穗进行充分晾晒，之后进行考种工作。主要考察的性状包括，百粒重、穗粒数、穗粒重和单位面积产量。百粒重指考察穗子中部一百粒籽粒的质量，穗粒数指玉米果穗上所有完成授粉并已形成籽粒雏形的籽粒数量，穗粒重指玉米果穗上所有籽粒的质量。单位面积产量指通过3行考种的果穗质量计算出该小区内平均果穗质量，进而换算成每亩产量(M＝(m1+m2+m3……mn)/n*N，M：每亩玉米籽粒产量，mn：单个果穗重，N：每亩玉米株数)。在3000、4000株/亩的密度下，UPA2-NILW22的产量显著高于UPA2-NIL8759；而在7500和9000株/亩的密度下，携带TG插入等位基因的UPA2-NIL8759产量显著高于携带缺失TG等位基因的UPA2-NILW22产量(图23)。分析影响产量的因子发现，玉米平均单株产量是决定亩产量差异的因素，而在高密度种植条件下，夹角较小的UPA2-NIL8759单穗粒数显著多于叶夹角较大WT的粒数且二者的百粒重无显著性差异。这表明，单穗粒数是引起UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759的产量差异的主要因子。
6.5.2 2018年HN小区实验
(1)近等基因系UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759小区实验设计
2018年冬季，在海南三亚进行UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759的密植高产实验，采取裂区实验设计，主区为生物学重复，副区为不同的种植密度和基因型。设置3个生物学重复，每个生物学重复下设3000、4500、6000、7500和9000株/亩5个密度；每个密度下种植5行UPA2-NILW22和5行UPA2-NIL8759；设定行长5米，行宽0.5米。在玉米各生育期，对不同的重复之间实施相同一致的田间管理措施，统一施肥、除草、防治病虫害等。玉米在自然开放状态下完成授粉，不进行任何人工辅助授粉工作。玉米籽粒生理状态达到完熟期时进行收获，每个基因型收获中间3行用于考种测产。
(2)小区穗部性状和产量因子分析
收获后的玉米果穗进行充分晾晒，之后进行考种工作。主要考察的性状包括，百粒重、穗粒数、穗粒重和单位面积产量。百粒重指考察穗子中部一百粒籽粒的质量，穗粒数指玉米果穗上所有完成授粉并已形成籽粒雏形的籽粒数量，穗粒重指玉米果穗上所有籽粒的质量。单位面积产量指通过3行考种的果穗质量计算出该小区内平均果穗质量，进而换算成每亩产量(M＝(m1+m2+m3……mn)/n*N，M：每亩玉米籽粒产量，mn：单个果穗重，N：每亩玉米株数)。在3000、4000株/亩的密度下，UPA2-NILW22的产量显著高于UPA2-NIL8759；而在6000、7500和9000株/亩的密度下，携带TG插入等位基因的UPA2-NIL8759产量显著高于携带缺失TG等位基因的UPA2-NILW22产量(图24)。分析影响产量的因子发现，玉米平均单株产量是决定每公顷产量差异的因素，而在高密度种植条件下，夹角较小的UPA2-NIL8759百粒重显著多于叶夹角较大WT的百粒重且二者的穗粒数无著性差异。这表明，百粒重是引起UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759的产量差异的主要因子。
6.6利用优良等位基因改良农大108
农大108曾是中国广泛种植的玉米品种，HuangC和Xu178是其亲本。农大108属于半紧凑大穗型品种，单株叶面积较大，一般适宜种植密度在3000-3500株/亩。提高种植密度，穗数增多，但经济系数降低，产量并无显著性增加。8759UPA2能够减小叶夹角，在高密度种植条件下显著增产。因此，利用8759UPA2这一来自大刍草的优良等位基因，结合回交渗入和分子标记辅助选择，改良农大108的亲本，期望进一步减小杂交种的叶夹角，使其株型更紧凑，减少上部叶片的遮光作用，增加冠层透光性，提高净光合作用效率。
利用UPA2-NIL8759分别与HuangC和Xu178杂交，以对应的亲本为轮回亲本回交4代，得到BC4F1家系。回交渗入过程中，选用UPA2置信区间内分子标记M149(序列)和M152(序列)进行分子标记辅助选择，BC4F1家系自交得到HuangC和Xu178的改良系HuangCUPA2-8759和Xu178UPA2-8759。改良系HuangCUPA2-8759和Xu178UPA2-8759以及HuangC和Xu178分别杂交产生改良农大108UPA2-8759和常规农大108F1代杂交种，设置3000、5000和7000株/亩进行密植小区实验(实验设计同上)。
实验结果显示(图25)，在3000和5000株每亩的种植密度下，改良农大108UPA2-8759和常规农大108之间亩产量没有显著性差异；在7000株每亩的种植密度下，改良农大108UPA2 -8759与常规农大108杂交种相比差异极显著，增产量达到了11.25％。接着分析了影响亩产量的3个产量因子，单株产量和穗粒数的差异是影响亩产量的重要因素，在7000株每亩的种植密度下改良农大108UPA2-8759比常规农大108的单株产量和穗粒数均显著增加；改良农大108UPA2-8759比常规农大108的百粒重无显著性差异。该试验结果分析表明，单株产量和穗粒数是共同引起改良农大108UPA2-8759和常规农大108产量差异的2个要产量因子。
本说明书的实施例只是用于对本发明的内容进行阐述，而不是对本发明进行任何限制；因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应该认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。
本说明书中引用的所有非专利文献和专利文献均通过引用并入本说明书，如同每个单独的非专利文献或专利文献被具体地和单独地指明通过引用并入本说明书。此外，本说明书所记载的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和说明书中详细示出和描述了本发明，但是附图和说明书应当被认为是说明性的而不是限制性的。
参考文献
Duncan WG,Hesketh JD(1968)Net photosynthetic rates relative leafgrowth rates and leaf numbers of 22races of maize grown at 8temperatures.CropSci.8:670-&
Duvick DN(2005)Genetic progress in yield of united states maize(Zeamays L.).Maydica 50:193-202
Huang C,Sun HY,Xu DY,Chen QY,Liang YM,Wang XF,Xu GH,Tian JG,Wang CL,Li D,Wu LS,Yang XH,Jin WW,Doebley JF,Tian F(2018)ZmCCT9 enhances maizeadaptation to higher latitudes.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.115:E334-E341
Hung HY,Shannon LM,Tian F,Bradbury PJ,Chen C,Flint-Garcia SA,McMullenMD,Ware D,Buckler ES,Doebley JF,Holland JB(2012)ZmCCT and the genetic basisof day-length adaptation underlying the postdomestication spread of maize.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109:E1913-E1921
Ku LX,Zhang J,Guo SL,Liu HY,Zhao RF,Chen YH(2012)Integrated multiplepopulation analysis of leaf architecture traits in maize(Zea mays L.).J.Exp.Bot.63:261-274
Ku LX,Zhao WM,Zhang J,Wu LC,Wang CL,Wang PA,Zhang WQ,Chen YH(2010)Quantitative trait loci mapping of leaf angle and leaf orientation value inmaize(Zea mays L.).Theor.Appl.Genet.121:951-959
Lambert RJ,Johnson RR(1978)Leaf langle,tassel morphology,andpeformance of maize hybrids.Crop Sci.18:499-502
Mickelson SM,Stuber CS,Senior L,Kaeppler SM(2002)Quantitative traitloci controlling leaf and tassel traits in a B73 x MO17 population ofmaize.Crop Sci.42:1902-1909
Mock JJ,Pearce RB(1975)Ideotype of maize.Euphytica 24:613-623
Ning J,Zhang BC,Wang NL,Zhou YH,Xiong LZ(2011)Increased Leaf Angle1,aRaf-Like MAPKKK That Interacts with a Nuclear Protein Family,RegulatesMechanical Tissue Formation in the Lamina Joint of Rice.Plant Cell 23:4334-4347
Pendleton JW,Smith GE,Winter SR,Johnston TJ(1968)Field investigationsof relationships of leaf angle in corn(Zea mays L.)to grain yield andapparent photosynthesis Agron.J.60:422-+
Strable J,Wallace JG,Unger-Wallace E,Briggs S,Bradbury PJ,Buckler ES,Vollbrecht E(2017)Maize YABBY Genes drooping leaf1 and drooping leaf2Regulate Plant Architecture.Plant Cell 29:1622-+
Studer,Q Z,J R-I,J D(2011)Identification of a functional transposoninsertion in the maize domestication gene tb1.Nature Genet.43:1160-1163
Tian F,Bradbury PJ,Brown PJ,Hung H,Sun Q,Flint-Garcia S,Rocheford TR,McMullen MD,Holland JB,Buckler ES(2011)Genome-wide association study of leafarchitecture in the maize nested association mapping population.NatureGenet.43:159-U113
王元东,段民孝,邢锦丰,王继东,张春原,张雪原,赵久然(2008)玉米理想株型育种的研究进展与展望.玉米科学16:47-50
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途
<130> IDC190122
<160> 75
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 243
<212> DNA
<213> 玉米野生种大刍草8759
<400> 1
atagaagaga gtgatcactg tttttgtggt tgttcagctt ttactatccc tgggaaaaaa 60
agtgtcagca gtaatctact ttgagtagtg tttccataga aaacaaaact gcgcatgcgc 120
gcgctgagtg tggtccttct cttttaatta ctactgcgtg gtgtgtgtgt gctgccaaca 180
gtagtaacca tctggcacct ccctatattt ttcaggaaaa attaaatgaa ctgtactaat 240
tca 243
<210> 2
<211> 240
<212> DNA
<213> 玉米自交系W22
<400> 2
atagaagaga gtgatcactg tttttgtggt tgttcagctt ttactatccc tgggaaaaaa 60
aagtgtcagc agtaatctac tttgagtagt gtttccatag aaaacaaaac tgcgcatgcg 120
cgcgctgagt ggtccttctc ttttaattac tactgtgtgg tgtgtgtgct gccaacagta 180
gtaaccatct ggcacctccc tatatttttc aggaaaaatt aaatgaactg tactaattca 240
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
catctatctc tgatacacac atgcag 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcagacact gcactgcaca 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctacaccata gtgtgctgct ct 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcaatttacg aaatttaaac tgga 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagcacatct tattttatga caaaca 26
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
attgcgctag caggattcat 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggattgcgga aagaaagaac c 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aggcaaacat cttcaagttc aca 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ttgagctcgt acgtgtctgg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tggcaacaca aacagtgaca 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtacgtggca gagctagact 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctcgcagttg ataccaccct 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tccagaagac tcgtgctgaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cccacttcct gtacgtacgt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
catgtgggac cggaatcaga 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
actttagaca gtgacgacct c 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gcttgcttct tcgcctacaa 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccagatggtt actactgttg gc 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ccatagaaaa caaaactgcg ca 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tccttcctct cccaaccaac 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cgtgcctttc ttgcatcata 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ttgtcttgcc atgctttctg 20
<210> 25
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gagtgtg 7
<210> 26
<211> 6662
<212> DNA
<213> 玉米野生种大刍草8759
<400> 26
gcggttggcg tgctagcttt gatcccccat atcatgacaa ggacgagctc acatgagccc 60
aaccagctga ttcatgcggg ccccacccta ctcccgccat catcctctcc tcactcacca 120
cccgcccggc ccggcctcct ccctgcaaag ctacactaca cagcgcgcgg ctgctgcacc 180
acagcctact ttcccccggc cggcctgctg cctaattacc tgctcatcaa ctaccggagc 240
cattcacatt caatatgtac tttctttctt cctttttttt taccgcgtgg tcagcagacg 300
acgcaaattc ccaccccccg aaattcaaag ggacagacat cagcgcattg gctttttttt 360
ggctatatat ggacatgcat gtgctatgtg tgtgtttagc ggtataagtt tatgcacatc 420
atcatttctt gcctagcaat tcatggggac taccccaggc cttgttcgtt tgtgtcggat 480
cggtgggtcg aaacgattct taaccggatt gcttctctaa tttatataaa ctttgattaa 540
cttgaacgat ttcgggtgta atccgacaca aacgaacaag acctcattat tttcgaagaa 600
aaggttggca cggatttgtg cgttggcgcc ttttacatga accgtttcgt tcaacgtctt 660
gctaatgctg ggtatatata taaatgcagt gtgctgtgtg cgttggcttt atttatttca 720
aagaaaagaa agcacccatt tcttgcctaa ctagtctata ctatacttaa agcaccagtt 780
tcaacggtcg tcatgcgtca ttttttttac aaataacctc tcacagctat ttcaaattaa 840
tccgatgcac atctatagat gccaaacgac gcccgacacg agctagatat acgcaagcca 900
caactatggc acagacacgt catgccggcc tgctaactgt gtcgggccag cccgttagcc 960
cgtcgatcca tttaattaaa tcagcgtaac gacgcccgac acgggctaga tgcacgcggc 1020
ctgctaacta tgtcgggcca gcctattagg tcgtcgatcc atttaattaa attagcgtaa 1080
aatgttaaaa aacggtgttg gagttggggt ttgaaccatg ccctgatgga agaagggcgg 1140
gagacactgg gtgaaactgt ttaaccagta gaacatcaca ctaaaatatt tttaatattg 1200
aatataaatt gtatataggt atatacgttt ttttgtaaaa taaaaaaata atcgtgtcgg 1260
gccgggccag cactacgggc tgaggctaca gcccaagcac ggcacgacgt ccttggctct 1320
tgcaagcatt aggtcgtttc tgagaccaca ttagcgcaat ggactacatg gtgtttgagg 1380
ttgctgaatt ggatggagta gcaatgattt gtcacactaa cagcaaaatg aaaggtcatt 1440
tgttggtttt aaacgttagt aattgctacg aagtagcata atttatatgg agcacatcca 1500
atttttattg atgcctgact ttagcaatca ctccatattt tgatctatct tttttataag 1560
tttgacttca tgagacttat tttagaaact tgatctcaca aactttctct tatttggtct 1620
atgtatgatg gaattatgtc attttataat atctgtttat tcagtcaacc gttgtgaact 1680
atcttataat cgctcacttc attggccgtg ttgtaccaag acatatttgt atggagtaaa 1740
taataacatc agttagtcaa ataaaaaata tattatataa agagaggaga caatcaataa 1800
aaaatcttga atttttttga tagatagtat acgtgggtat tgttgtaagc cgtcgcaacg 1860
cacggacaac cgactagtgt tattcaatag accggccgga aaacacaata ctgaaagaag 1920
gcaaagcatg cagtaggacc atgcaatacg ctgcttgaag ctaaggacat gtttaaaagt 1980
ctccggtttt taagaaacta gtttataaaa atagaagtga ttctaaacat atcgatttct 2040
tagaaactag attctcagtt tcttaaaaac caagaatcta gctcctctaa ctaaaactag 2100
tttatagaag tttcttaaaa accaagaatc tagcttctct aactaaaact agtttataga 2160
aattgagatg gttccaaaca ctattaacta ttgttttttc ataacccagt ttcaaaaaca 2220
ctagaaatcg aaagtgcatt cttaaaaact aggttgtttg taaacatggt cctacaactc 2280
agcagtaact ctcagaatag aaatgcataa tgcaatgcac cattatattc ctactaggaa 2340
taggaatacg atcggtaggg tgcgcccggc caccttcgag gaatcttcta gggcagtcag 2400
tgccccccct ccgtgtgtgt ctccctcccc tcgccagctc gcatccccgc cctgtgggca 2460
gtggccagtg ggctgggctg gaatggaact ccctcctccc ggcccttgtg ggcgcgcagc 2520
aagcggctag cagctttccc acagctcgct ttacccctcc caacaagcgc caccaatcgc 2580
tggagactgg agagagagaa gaaccagcca cacaactcta attaccacgc actctctctc 2640
tctctccgtc ctatcgatcc cggcctccct cccccagccc cagcggatcg gagcccccgg 2700
ctggcttcct accctgcccc ctcttcctcc gacgcgcggg cggaggagtt cgatccgagc 2760
gcgagaggga aggagagaga aactaaagaa agagaggggc agagagcaga cagataggag 2820
tggtagatat agataggctg gggctggcct catcgcggat agatccccct cctcctcctc 2880
ctcactctcc ccagcgagca agcaaccaag cagccagcta gtcagtctcc gccaagcagg 2940
gaccgcgtcg catcaaagcc gctgcccgca acagggacaa ggcaggccag cgcgcgctcg 3000
aaaggggagg cgtcgttcta cacgaagacg aggaggagga gccctgcagg gcgtagctag 3060
ctatggagtt cgcgagctct tcgagtaggt tttccaggga ggaggacgag gaggaagagc 3120
aggaggaaga ggaggaggag gaggaggcgt ctccgcgcga gatccccttc atgacagcgg 3180
cagcgacggc cgacaccgga gccgccgcct cctcgtcctc gccttccgcg gcggcctcat 3240
cgggtcctgc tgctgccccc cgctcgagcg acggcgccgg ggcgtccggg agcggcggcg 3300
gcgggagcga cgacgtgcag gtgatcgaga aggagcacat gttcgacaag gtggtgacgc 3360
ccagcgacgt ggggaagctc aaccggctgg tgatcccgaa gcagcacgcg gagaagtact 3420
tcccgctgga cgcggcggcc aacgagaagg gccagctgct cagcttcgag gaccgcgccg 3480
gtaagctctg gcgcttccgc tactcctact ggaacagcag ccagagctac gtcatgacca 3540
agggctggag ccgcttcgtc aaggagaagc gcctcgacgc cggcgacacc gtctccttct 3600
gccgcggcgc cggcgacacc gcgcgggacc gcctcttcat cgactggaag cgccgcgccg 3660
actcccgcga cccgcaccgc atgccgcgcc tcccgctccc catggcgccc gtcgcgtcgc 3720
cctacggccc ctggggcggc ggcggcggcg gcggcgcggg cggtttcttc atgccgcccg 3780
cgccgcccgc cacactctac gagcaccacc gcttccgcca ggccctcgac ttccgcaaca 3840
tcaacgccgc ggccgcgccg gccaggcagc tcctcttctt cggctcagcc ggcatgcccc 3900
cgcgcgcgtc catgccgcag cagcagcagc cgcctccgcc cccgcacccg cctctgcaca 3960
gcattatgtt ggtgcaaccc agccccgcgc cgcccacggc cagcgtgccc atgcttctcg 4020
actcggtacc gctcgtcaac agcccaacgg cagcgtcgaa gcgcgtccgc ctgtttgggg 4080
tcaacctcga caacccgcaa ccaggcacaa gtgcggagtc aagccaagat gccaacgcat 4140
tgtcgctgag gacaccggga tggcaaaggc cggggccgtt gaggttcttc gaatcgcctc 4200
aacgcggcgc cgagtcatct gcagcctcct cgccgtcgtc atcgtcgtcc tccaagagag 4260
aagcgcactc gtccttggat ctcgatctgt gagcgagaga tcgatcagct ggcgaactcg 4320
atcgatcggg ggagtaaaaa aggaaagttg aaaatttcct ccttccgtct gctaccttct 4380
tcttcacctt ttgagattcc attataactt ttgatcatag gatctagagt agccttctta 4440
acacttgttc tccgattttt ctttcggcca ttcaaattct tgtgctggct tgacaatata 4500
tatagagaga agttaggcga attaattaat caattattgt tgctttcata tggcttgaaa 4560
tctgactcgg tttttgcttc gctactattg ctttatcctt tttttgctgg tatgattgga 4620
ctccttaagg taccatttca ctcttatgta gtttggttgc acaattccga ttgtcgtatg 4680
ttcctactcc ctacatatga taacacaact ccaaattcgc gctctccaca ccatcactgc 4740
taagatctga atccctagca ccatgaatgc ggtgcaatat acatcgtgcc tttcttgcat 4800
catatgtgtg atctgttctc gtcctagatt ggagttgcaa ccgcagtgtt ctcagaaagc 4860
atggcaagac aagaacattg acagtccatg tccatcagca gcactcaact tacagccggc 4920
aaagcctatg gagctagcta gaagcatttg caggtcagtt gtttaacttc tgaatcgtct 4980
catcttcttt catcggtact gctcaccatc tctcttgttt atattatgag tcctggtgct 5040
ggcactcttg ttttcatttt cgtgcttttg ccggttgcca cttttctgta ctgttgctca 5100
ctctttgtcc atactacata tgtataccat ggtgcatcat gccataatgt agtagatcgt 5160
atggtaggca gttagttgct acgcgcgcac caccacacaa gcaaactgga agacttctct 5220
tgtgctttta cgcaaggtca actgaaaatt aaccctaccg tgggctaaat catgtcatgt 5280
gtagtacgtt tgatttgtct gggccttgag tggtatagac tccaatagtt ctttatggcc 5340
ctctggcagt ctgtaaagga gagggtgagc cagaggggaa ggcattgcta ctggccttaa 5400
cttctttgta cgtctgatgg acgatttatt ggggaagagc cgaagagggc cagcctcagt 5460
actaacacta ctgtttctgt agtagtagga acagtgctgc gtcgatatgc atctctctct 5520
catggagatg gagagccttg gttgcgttct gtgttcttgt cctttgtgtg cgagagacag 5580
tgaggagaga gactgtacat taccgtctct cctctttttt ttttctctct ctctcctttc 5640
actgcattga gtaggtacgg cgtgtgtgct agctccttgc tgggagcaat ggaggcaaat 5700
gccacgtacc ggctcagcaa taggtatcct taactagtaa ggtgtaggag ggggatcttt 5760
ttgcactgct gaggctagaa tagacatgta tagatgctgt gtctactgac aaaagtacct 5820
ttggtacgtt gtaagctgga aaaggcaatg gggagttatg ggggagggaa aaaaaaagag 5880
ccaggagcag tgtctgcatg catgtttttg cttgttatac gttctttcta ccctttgcat 5940
atggttgttc aattcatctt tcttttctga tcatacagcc ctgagtcggg gtattatctc 6000
aagaacagcg tcttgtgacc tcgatctcac aaagaatata ggaagtcctc catataaact 6060
acatttgtgg aaacaaaaaa ttgaaaatca tgtgtaattt agactcttac aggcgaaata 6120
tgtaaatgct aattaactaa catattctgt cgtttagcaa ggaagatgca ttgagatgaa 6180
tagccaagtt cgttaattgt ccaagcataa gttgcactcc attgccattt tttgtagaac 6240
acatgttggc gcataccata ccttggttaa tcacgctgtc actgtgatat gttagaccta 6300
ctatagccaa tgaccattat ctcaaataat gatgtgatga ctgaatgatc aggctaatta 6360
ttgcataatg cgtatactag ttccgtattg atttttctgc ggttattatc ctccttcata 6420
ttcctagaga gaaagggctg aattttggcg ctcatataaa gaacataacc acatctctgt 6480
tatattactc tttgtacgta catgcaagat atgttacaca tacaaaaaag atgaggtgga 6540
tatcatgtat ctgtatagct tgaaatgctg aggtatattg atatttattg cttttgacag 6600
tttcattgac atctccatcg ctatggaaat catttcatgc actacatttc tgaagaaact 6660
ta 6662
<210> 27
<211> 409
<212> PRT
<213> 玉米野生种大刍草8759
<400> 27
Met Glu Phe Ala Ser Ser Ser Ser Arg Phe Ser Arg Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ser Pro Arg
20 25 30
Glu Ile Pro Phe Met Thr Ala Ala Ala Thr Ala Asp Thr Gly Ala Ala
35 40 45
Ala Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ser Gly Pro Ala Ala
50 55 60
Ala Pro Arg Ser Ser Asp Gly Ala Gly Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Asp Asp Val Gln Val Ile Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys
85 90 95
Val Val Thr Pro Ser Asp Val Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro
100 105 110
Lys Gln His Ala Glu Lys Tyr Phe Pro Leu Asp Ala Ala Ala Asn Glu
115 120 125
Lys Gly Gln Leu Leu Ser Phe Glu Asp Arg Ala Gly Lys Leu Trp Arg
130 135 140
Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys
145 150 155 160
Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Arg Leu Asp Ala Gly Asp Thr
165 170 175
Val Ser Phe Cys Arg Gly Ala Gly Asp Thr Ala Arg Asp Arg Leu Phe
180 185 190
Ile Asp Trp Lys Arg Arg Ala Asp Ser Arg Asp Pro His Arg Met Pro
195 200 205
Arg Leu Pro Leu Pro Met Ala Pro Val Ala Ser Pro Tyr Gly Pro Trp
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Phe Phe Met Pro Pro Ala
225 230 235 240
Pro Pro Ala Thr Leu Tyr Glu His His Arg Phe Arg Gln Ala Leu Asp
245 250 255
Phe Arg Asn Ile Asn Ala Ala Ala Ala Pro Ala Arg Gln Leu Leu Phe
260 265 270
Phe Gly Ser Ala Gly Met Pro Pro Arg Ala Ser Met Pro Gln Gln Gln
275 280 285
Gln Pro Pro Pro Pro Pro His Pro Pro Leu His Ser Ile Met Leu Val
290 295 300
Gln Pro Ser Pro Ala Pro Pro Thr Ala Ser Val Pro Met Leu Leu Asp
305 310 315 320
Ser Val Pro Leu Val Asn Ser Pro Thr Ala Ala Ser Lys Arg Val Arg
325 330 335
Leu Phe Gly Val Asn Leu Asp Asn Pro Gln Pro Gly Thr Ser Ala Glu
340 345 350
Ser Ser Gln Asp Ala Asn Ala Leu Ser Leu Arg Thr Pro Gly Trp Gln
355 360 365
Arg Pro Gly Pro Leu Arg Phe Phe Glu Ser Pro Gln Arg Gly Ala Glu
370 375 380
Ser Ser Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Arg Glu
385 390 395 400
Ala His Ser Ser Leu Asp Leu Asp Leu
405
<210> 28
<211> 404
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 28
Met Glu Phe Ala Ser Ser Ser Ser Arg Phe Ser Lys Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Pro Arg Glu Ile Pro Phe
20 25 30
Met Thr Ala Ala Ala Thr Ala Gly Thr Gly Ala Thr Ser Ser Ser Pro
35 40 45
Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala
50 55 60
Leu Arg Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Asp Asp Met Glu Val
65 70 75 80
Val Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val
85 90 95
Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Lys Tyr
100 105 110
Phe Pro Leu Asp Ala Ala Ala Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser Phe
115 120 125
Glu Asp Arg Ala Gly Lys Leu Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn
130 135 140
Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys
145 150 155 160
Glu Lys Arg Leu Asp Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Cys Arg Gly Ala
165 170 175
Ala Asp Ala Ala Arg Asp Arg Leu Phe Ile Asp Trp Arg Lys Arg Ser
180 185 190
Ala Asp Ser Ser Arg His Pro His Arg Met Leu Pro Arg Leu Pro Leu
195 200 205
His Met Pro Pro Leu Ala Ser Pro Tyr Gly Tyr Gly Pro Trp Gly Gly
210 215 220
Gly Ala Gly Gly Phe Phe Val Pro Pro Ala Thr Leu Tyr Glu His His
225 230 235 240
Arg Phe Arg Gln Ala Leu Asp Phe Arg Asn Val Ser Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Pro Ala Arg Gln Leu Leu Phe Phe Gly Ser Ala Gly Met Pro Pro Arg
260 265 270
Ala Ser Ile Pro Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Ser Leu His Ser
275 280 285
Ile Met Met Val Gln Pro Ser Pro Glu Ala Thr Ala Gly Leu Pro Met
290 295 300
Leu Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Asn Ser Pro Thr Ala Ala Ala Lys
305 310 315 320
Arg Val Arg Leu Phe Gly Val Asn Leu Asp Asn Pro Gln Pro Gly Ser
325 330 335
Ser Ala Glu Ser Ser His Asp Thr Asn Ala Leu Ser Leu Arg Met Pro
340 345 350
Gly Trp Gln Arg Pro Gly Pro Leu Arg Phe Phe Glu Ser Thr Pro Gln
355 360 365
Arg Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Glu Ser Ser Ala Ala Ser
370 375 380
Ser Pro Ser Ser Pro Ser Ser Ser Lys Arg Glu Ala His Ser Ser Val
385 390 395 400
Asp Leu Asp Leu
<210> 29
<211> 422
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 29
Met Asp Gln Phe Ala Ala Ser Gly Arg Phe Ser Arg Glu Glu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Glu Glu Gln Glu Asp Ala Ser Asn Ser Met Arg Glu Ile Ser Phe
20 25 30
Met Pro Pro Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ser
35 40 45
Ala Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ser Ala Cys Ala Ser Gly Ser Ser Ser
50 55 60
Ala Pro Phe Arg Ser Ala Ser Ala Ser Gly Asp Ala Ala Gly Ala Ser
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Pro Ala Asp Ala Asp Ala Glu Ala Glu Ala Val Glu
85 90 95
Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val Gly Lys
100 105 110
Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln Tyr Ala Glu Lys Tyr Phe Pro
115 120 125
Leu Asp Ala Ala Ala Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser Phe Glu Asp
130 135 140
Ser Ala Gly Lys His Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn Ser Ser
145 150 155 160
Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys
165 170 175
Arg Leu Val Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Arg Ala Ala Ala Glu
180 185 190
Asp Ala Arg His Arg Leu Phe Ile Asp Trp Lys Arg Arg Val Asp Thr
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Arg Phe Ser Gly Leu Ala Leu Pro Met Pro Leu Pro
210 215 220
Ser Ser His Tyr Gly Gly Pro His His Tyr Ser Pro Trp Gly Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe Phe Met Pro Pro Ser Pro Pro
245 250 255
Ala Thr Leu Tyr Glu His Arg Leu Arg Gln Gly Leu Asp Phe Arg Ser
260 265 270
Met Thr Thr Thr Tyr Pro Ala Pro Thr Val Gly Arg Gln Leu Leu Phe
275 280 285
Phe Gly Ser Ala Arg Met Pro Pro His His Ala Pro Pro Pro Gln Pro
290 295 300
Arg Pro Phe Ser Leu Pro Leu His His Tyr Thr Val Gln Pro Ser Ala
305 310 315 320
Ala Gly Val Thr Ala Ala Ser Arg Pro Val Leu Leu Asp Ser Val Pro
325 330 335
Val Ile Glu Ser Pro Thr Thr Ala Ala Lys Arg Val Arg Leu Phe Gly
340 345 350
Val Asn Leu Asp Asn Asn Pro Asp Gly Gly Gly Glu Ala Ser His Gln
355 360 365
Gly Asp Ala Leu Ser Leu Gln Met Pro Gly Trp Gln Gln Arg Thr Pro
370 375 380
Thr Leu Arg Leu Leu Glu Leu Pro Arg His Gly Gly Glu Ser Ser Ala
385 390 395 400
Ala Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Arg Glu Ala Arg Ser
405 410 415
Ala Leu Asp Leu Asp Leu
420
<210> 30
<211> 240
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 30
Met Glu Phe Thr Thr Pro Pro Pro Ala Thr Arg Ser Gly Gly Gly Glu
1 5 10 15
Glu Arg Ala Ala Ala Glu His Asn Gln His His Gln Gln Gln His Ala
20 25 30
Thr Val Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp
35 40 45
Val Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Lys
50 55 60
Tyr Phe Pro Leu Asp Ala Ala Ala Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser
65 70 75 80
Phe Glu Asp Arg Thr Gly Lys Pro Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp
85 90 95
Asn Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val
100 105 110
Lys Glu Lys Arg Leu Asp Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Gly Arg Gly
115 120 125
Ile Ser Glu Ala Ala Arg Asp Arg Leu Phe Ile Asp Trp Arg Cys Arg
130 135 140
Pro Asp Pro Pro Val Val His His Gln Tyr His His Arg Leu Pro Leu
145 150 155 160
Pro Ser Ala Val Val Pro Tyr Ala Pro Trp Ala Ala His Ala His His
165 170 175
His His Tyr Pro Ala Asp Gly His Thr Glu Pro Val Thr Pro Cys Leu
180 185 190
Cys Ala Thr Leu Val Ala Thr Glu Met Arg Ala Ser Ser Ser Gln Leu
195 200 205
Ser Leu Thr Arg Ser Asn Leu Ser Arg Pro Pro Gln Pro Arg Ile Ala
210 215 220
Arg Val Asp Gly Ala Gln Pro Arg Pro Ser Ser Ser Pro Arg Gln Pro
225 230 235 240
<210> 31
<211> 327
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 31
Met Glu Phe Thr Ala Pro Pro Pro Ala Thr Arg Ser Gly Gly Gly Glu
1 5 10 15
Glu Arg Ala Ala Ala Glu His His Gln Gln Gln Gln Gln Ala Thr Val
20 25 30
Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val Gly
35 40 45
Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Arg Tyr Phe
50 55 60
Pro Leu Asp Ala Ala Ala Asn Asp Lys Gly Leu Leu Leu Ser Phe Glu
65 70 75 80
Asp Arg Ala Gly Lys Pro Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn Ser
85 90 95
Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys Glu
100 105 110
Lys Arg Leu Asp Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Gly Arg Gly Val Gly
115 120 125
Glu Ala Ala Arg Gly Arg Leu Phe Ile Asp Trp Arg Arg Arg Pro Asp
130 135 140
Pro Pro Val Val His His Gln Tyr His His His Arg Leu Pro Leu Pro
145 150 155 160
Ser Ala Val Val Pro Tyr Ala Pro Trp Ala Ala Ala Ala His Ala His
165 170 175
His His His Tyr Pro Ala Ala Gly Val Gly Ala Ala Arg Thr Thr Thr
180 185 190
Thr Thr Thr Thr Thr Val Leu His His Leu Pro Pro Ser Pro Ser Pro
195 200 205
Leu Tyr Leu Asp Thr Arg Arg Arg His Val Gly Tyr Asp Ala Tyr Gly
210 215 220
Ala Gly Thr Arg Gln Leu Leu Phe Tyr Arg Pro His Gln Gln Pro Ser
225 230 235 240
Thr Thr Val Met Leu Asp Ser Val Pro Val Arg Leu Pro Pro Thr Pro
245 250 255
Gly Gln His Ala Glu Pro Pro Pro Pro Ala Val Ala Ser Ser Ala Ser
260 265 270
Lys Arg Val Arg Leu Phe Gly Val Asn Leu Asp Cys Ala Ala Ala Ala
275 280 285
Gly Ser Glu Glu Glu Asn Val Gly Gly Trp Arg Thr Ser Ala Pro Pro
290 295 300
Thr Gln Gln Ala Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Ser Gly Lys Ala Arg
305 310 315 320
Cys Ser Leu Asn Leu Asp Leu
325
<210> 32
<211> 232
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 32
Met Glu Phe Thr Thr Pro Pro Pro Ala Thr Arg Ser Gly Gly Gly Glu
1 5 10 15
Glu Arg Ala Ala Ala Glu His Asn Gln His His Gln Gln Gln His Ala
20 25 30
Thr Val Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp
35 40 45
Val Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Lys
50 55 60
Tyr Phe Pro Leu Asp Ala Ala Ala Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser
65 70 75 80
Phe Glu Asp Arg Thr Gly Lys Pro Trp Arg Tyr Arg Tyr Ser Tyr Trp
85 90 95
Asn Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val
100 105 110
Lys Glu Lys Arg Leu Asp Ala Gly Asp Thr Asp Ser Phe Gly Arg Gly
115 120 125
Ile Ser Glu Ala Ala Arg Gly Arg Leu Phe Ile Asp Trp Arg Cys Arg
130 135 140
Pro Asp Pro Pro Val Val His His Gln Tyr His His Arg Leu Pro Leu
145 150 155 160
Pro Ser Ala Val Val Pro Tyr Ala Pro Phe Leu Glu Lys Asp Val Ala
165 170 175
Leu Asp Pro Thr Asn Arg Ser His Gly Glu Arg Pro Thr Phe Leu Glu
180 185 190
Lys Asp Val Ala Leu Asp Ala Ala Arg Val Ala Ala Glu Gly Ala Gly
195 200 205
Ser Asp Leu Glu Val Asp Asp Asp Leu Asp Arg Arg Trp Glu Gly Arg
210 215 220
Ile Ser Glu Leu Ala Ser Leu Ile
225 230
<210> 33
<211> 420
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 33
Met Asp Gln Phe Ala Ala Ser Arg Arg Phe Ser Arg Asn Asp Gly Ala
1 5 10 15
Asp Glu Glu Gln Glu Asp Val Ser Asn Ser Met Arg Glu Ile Ser Phe
20 25 30
Met Pro Gly Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser
35 40 45
Gly Ser Ser Cys Ala Pro Phe Arg Ser Ala Ser Ala Asp Gly Ala Gly
50 55 60
Ala Ser Gly Ser Gly Gly Asp Gly Asp Gly Ser Gly Asp Val Glu Lys
65 70 75 80
Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val Gly Lys Leu
85 90 95
Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln Tyr Ala Glu Lys Tyr Phe Pro Leu
100 105 110
Asp Ala Ala Gly Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser Phe Glu Asp Ser
115 120 125
Asp Gly Lys His Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn Ser Ser Gln
130 135 140
Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Arg
145 150 155 160
Leu Val Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Arg Ser Arg Ser Ala Ala
165 170 175
Glu Val Val Asp Asp Ala Arg Arg His Arg Leu Phe Ile Asp Trp Lys
180 185 190
Arg Arg Gly Leu Asp Thr Arg Gly Pro Leu Arg Phe Ser Gly Leu Ala
195 200 205
Leu Pro Met Pro Leu Ala Ser Tyr Tyr Gly Ala Pro His His Tyr Ser
210 215 220
Ser Trp Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Phe Phe Met Pro Pro Ser Pro
225 230 235 240
Pro Ala Thr Leu Tyr Glu His Arg Leu Arg Gln Gly Leu Asp Phe Arg
245 250 255
Gly Met Thr Thr Tyr Pro Ala Leu Thr Val Gly Arg Gln Leu Leu Phe
260 265 270
Phe Gly Ser Pro Arg Met Pro Pro His His Ala Gln Pro Gln Pro Arg
275 280 285
Pro Leu Pro Leu Pro Leu His His Tyr Thr Met Gln Pro Ser Ala Ala
290 295 300
Gly Val Thr Ala Ala Ser Ala Ser Arg Pro Leu Val Val Asp Val Asp
305 310 315 320
Ser Val Pro Ala Ile Glu Ser Pro Thr Thr Ala Ala Lys Arg Val Arg
325 330 335
Leu Phe Gly Val Asn Leu Asp Asn Lys Pro Leu Ser Val Ser Asp Gly
340 345 350
Gly Arg Glu Ala Ser His Gln Ser Gly Ser Gly Asn Ala Leu Leu Pro
355 360 365
Leu Pro Gln Met Pro Gly Gly Trp Gln Gln Arg Thr Pro Thr Leu Arg
370 375 380
Leu Leu Glu Leu Pro Arg His Gly Ala Glu Ser Ser Ala Ala Ser Ser
385 390 395 400
Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ala Lys Arg Glu Ala Arg Ser Ala Ala Leu
405 410 415
Asp Leu Asp Leu
420
<210> 34
<211> 420
<212> PRT
<213> 高粱
<400> 34
Met Glu Phe Ala Ser Ser Ser Ser Arg Phe Ser Lys Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Asp Glu Glu Ala Ser Pro Arg Glu Ile
20 25 30
Pro Phe Met Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Asp Thr Gly Pro Ala Ala
35 40 45
Ala Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ser
50 55 60
Gly Ser Ala Ala Ala Leu Arg Ser Gly Asp Gly Ala Gly Ala Ser Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asp Asp Val Glu Val Ile Glu Lys
85 90 95
Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val Gly Lys Leu
100 105 110
Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Lys Tyr Phe Pro Leu
115 120 125
Asp Ala Ala Ala Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser Phe Glu Asp Arg
130 135 140
Ala Gly Lys Leu Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Arg
165 170 175
Leu Asp Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Cys Arg Gly Ala Gly Glu Ala
180 185 190
Ala Arg Asp Arg Leu Phe Ile Asp Trp Lys Arg Arg Ala Asp Ser Arg
195 200 205
Asp Pro His Arg Met Pro Arg Leu Pro Leu Pro Met Ala Pro Val Ala
210 215 220
Ser Pro Tyr Gly Leu Gly Pro Trp Gly Gly Gly Ala Gly Gly Phe Phe
225 230 235 240
Met Pro Pro Ala Pro Pro Ala Thr Leu Tyr Glu His His Arg Phe Arg
245 250 255
Gln Ala Leu Asp Phe Arg Asn Ile Asn Ala Ala Ala Ala Pro Ala Arg
260 265 270
Gln Leu Leu Phe Phe Gly Ser Gln Gly Met Pro Pro Arg Ala Ser Met
275 280 285
Pro Leu Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ser Leu Pro Pro Pro
290 295 300
Pro Pro Pro Leu His Ser Ile Met Met Val Gln Pro Gly Ser Pro Ala
305 310 315 320
Val Thr His Gly Leu Pro Met Val Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Asn
325 330 335
Ser Pro Thr Ala Ala Ala Lys Arg Val Arg Leu Phe Gly Val Asn Leu
340 345 350
Asp Asn Pro Gln Gln Gly Ser Ser Ala Glu Ser Ser Gln Asp Ala Asn
355 360 365
Ala Leu Ser Leu Arg Met Pro Gly Trp Gln Arg Pro Gly Pro Leu Arg
370 375 380
Phe Phe Glu Ser Pro Gln Arg Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ala Ala Ser
385 390 395 400
Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Arg Glu Ala His Ser Ser Leu
405 410 415
Asp Leu Asp Leu
420
<210> 35
<211> 434
<212> PRT
<213> 高粱
<400> 35
Met Asp Gln Phe Ala Ala Ser Gly Arg Phe Ser Arg Glu Glu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Glu Glu Gln Glu Asp Ala Ser Asn Ser Met Arg Glu Ile Ser Phe
20 25 30
Met Pro Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ala Ala
35 40 45
Ala Ser Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Ala Ala Ala Pro Phe Arg Ser Ala Ser Gly Asp Ala Ala Gly
65 70 75 80
Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Asp Val Glu Ala
85 90 95
Val Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val
100 105 110
Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln Tyr Ala Glu Lys Tyr
115 120 125
Phe Pro Leu Asp Ala Ala Ala Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser Phe
130 135 140
Glu Asp Ser Ala Gly Lys His Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys
165 170 175
Glu Lys Arg Leu Val Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Arg Ala Ala
180 185 190
Ala Glu Asp Ala Arg His Arg Leu Phe Ile Asp Trp Lys Arg Arg Val
195 200 205
Asp Thr Arg Gly Pro Leu Arg Phe Ser Gly Leu Ala Leu Pro Met Pro
210 215 220
Leu Ala Ser His Tyr Gly Pro His His Tyr Ser Pro Trp Gly Phe Gly
225 230 235 240
Ile Gly Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe Phe Met Pro
245 250 255
Pro Ser Pro Pro Ala Thr Leu Tyr Glu His Arg Leu Arg Gln Gly Leu
260 265 270
Asp Phe Arg Ser Met Thr Asn Tyr Pro Ala Pro Thr Val Gly Arg Gln
275 280 285
Gln Leu Leu Phe Phe Gly Ser Ala Arg Met Pro Pro His His Ala Pro
290 295 300
Ala Pro Gln Pro Arg Pro Leu Ser Leu Pro Leu His His Phe Thr Val
305 310 315 320
Gln Pro Ser Ala Ala Ala Gly Val Thr Ala Ala Ser Arg Pro Val Val
325 330 335
Leu Asp Ser Val Pro Val Ile Glu Ser Pro Thr Thr Ala Ala Lys Arg
340 345 350
Val Arg Leu Phe Gly Val Asn Leu Asp Asn Asn Pro Leu Ser Glu Pro
355 360 365
Asp Gly Gly Val Gly Glu Ala Ser His Gln Gly Asn Ala Leu Ser Leu
370 375 380
Gln Met Pro Gly Trp Gln Gln Arg Thr Thr Pro Thr Leu Arg Leu Leu
385 390 395 400
Glu Leu Pro Arg His Gly Ala Ala Glu Ser Ser Ala Ala Ser Ser Pro
405 410 415
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Lys Arg Glu Ala Arg Ser Ala Leu Asp Leu
420 425 430
Asp Leu
<210> 36
<211> 330
<212> PRT
<213> 高粱
<400> 36
Met Glu Phe Thr Ala Pro Pro Thr Ala Ala Arg Ser Gly Gly Gly Glu
1 5 10 15
Glu Arg Ala Ala Glu His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Ala Ala
20 25 30
Val Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val
35 40 45
Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Lys Tyr
50 55 60
Phe Pro Leu Asp Ala Ala Ala Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser Phe
65 70 75 80
Glu Asp Arg Thr Gly Lys Pro Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn
85 90 95
Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys
100 105 110
Glu Lys Arg Leu Asp Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Gly Arg Gly Val
115 120 125
Gly Asp Ala Ala Arg Gly Arg Leu Phe Ile Asp Trp Arg Arg Arg Pro
130 135 140
Asp Pro Pro Val His His Gln Tyr His His Arg Leu Pro Leu Pro Ser
145 150 155 160
Val Val Pro Tyr Ala Pro Trp Pro His Ala His His His His Tyr Pro
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Val Gly Val Gly Ala Gly Ala Gly Ala
180 185 190
Ala Arg Thr Thr Thr Val Leu His Leu Pro Pro Ser Pro Ser Ser Leu
195 200 205
Tyr Asp Pro His Leu Arg His Val Gly Tyr Asp Ala Tyr Gly Ala Gly
210 215 220
Thr Arg Gln Leu Leu Phe Tyr Arg Pro Leu His His Gln Gln Pro Ser
225 230 235 240
Thr Ala Val Val Leu Asp Ser Val Pro Val Arg Leu Pro Thr Thr Pro
245 250 255
Gly Gln His Ala Glu Pro Pro Ala Pro Val Val Ala Ser Ser Ala Ser
260 265 270
Lys Arg Val Arg Leu Phe Gly Val Asn Leu Asp Cys Ala Gly Ser Glu
275 280 285
Glu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Gly Trp Arg Thr Ser Ala Pro Pro Thr
290 295 300
Pro His Gly Leu Pro Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly
305 310 315 320
Lys Ala Arg Cys Ser Leu Asn Leu Asp Leu
325 330
<210> 37
<211> 330
<212> PRT
<213> 高粱
<400> 37
Met Glu Phe Thr Ala Pro Pro Thr Ala Ala Arg Ser Gly Gly Gly Glu
1 5 10 15
Glu Arg Ala Ala Glu His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Ala Ala
20 25 30
Val Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val
35 40 45
Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Lys Tyr
50 55 60
Phe Pro Leu Asp Ala Ala Ala Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser Phe
65 70 75 80
Glu Asp Arg Thr Gly Lys Pro Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn
85 90 95
Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys
100 105 110
Glu Lys Arg Leu Asp Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Gly Arg Gly Val
115 120 125
Gly Asp Ala Ala Arg Gly Arg Leu Phe Ile Asp Trp Arg Arg Arg Pro
130 135 140
Asp Pro Pro Val His His Gln Tyr His His Arg Leu Pro Leu Pro Ser
145 150 155 160
Val Val Pro Tyr Ala Pro Trp Pro His Ala His His His His Tyr Pro
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Val Gly Val Gly Ala Gly Ala Gly Ala
180 185 190
Ala Arg Thr Thr Thr Val Leu His Leu Pro Pro Ser Pro Ser Ser Leu
195 200 205
Tyr Asp Pro His Leu Arg His Val Gly Tyr Asp Ala Tyr Gly Ala Gly
210 215 220
Thr Arg Gln Leu Leu Phe Tyr Arg Pro Leu His His Gln Gln Pro Ser
225 230 235 240
Thr Ala Val Val Leu Asp Ser Val Pro Val Arg Leu Pro Thr Thr Pro
245 250 255
Gly Gln His Ala Glu Pro Pro Ala Pro Val Val Ala Ser Ser Ala Ser
260 265 270
Lys Arg Val Arg Leu Phe Gly Val Asn Leu Asp Cys Ala Gly Ser Glu
275 280 285
Glu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Gly Trp Arg Thr Ser Ala Pro Pro Thr
290 295 300
Pro His Gly Leu Pro Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly
305 310 315 320
Lys Ala Arg Cys Ser Leu Asn Leu Asp Leu
325 330
<210> 38
<211> 412
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 38
Met Glu Phe Thr Thr Ser Ser Arg Phe Ser Lys Glu Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
Glu Gln Asp Glu Ala Gly Arg Arg Glu Ile Pro Phe Met Thr Ala Thr
20 25 30
Ala Glu Ala Ala Pro Ala Pro Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ala His
35 40 45
His Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Ser Gly Ser Ser Thr
50 55 60
Pro Phe Arg Ser Asp Asp Gly Ala Gly Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Glu Val Val Glu Lys Glu His Met Phe
85 90 95
Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val
100 105 110
Ile Pro Lys Gln Tyr Ala Glu Lys Tyr Phe Pro Leu Asp Ala Ala Ala
115 120 125
Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Asn Phe Glu Asp Arg Ala Gly Lys Pro
130 135 140
Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met
145 150 155 160
Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Arg Leu Asp Ala Gly
165 170 175
Asp Thr Val Ser Phe Ser Arg Gly Ile Gly Asp Glu Ala Ala Arg His
180 185 190
Arg Leu Phe Ile Asp Trp Lys Arg Arg Ala Asp Thr Arg Asp Pro Leu
195 200 205
Arg Leu Pro Arg Gly Leu Pro Leu Pro Met Pro Leu Thr Ser His Tyr
210 215 220
Ala Pro Trp Gly Ile Gly Gly Gly Gly Gly Phe Phe Val Gln Pro Ser
225 230 235 240
Pro Pro Ala Thr Leu Tyr Glu His Arg Leu Arg Gln Gly Leu Asp Phe
245 250 255
Arg Ala Phe Asn Pro Ala Ala Ala Met Gly Arg Gln Val Leu Leu Phe
260 265 270
Gly Ser Ala Arg Ile Pro Pro Gln Ala Pro Leu Leu Ala Arg Ala Pro
275 280 285
Ser Pro Leu His His His Tyr Thr Leu Gln Pro Ser Gly Asp Gly Val
290 295 300
Arg Ala Ala Gly Ser Pro Val Val Leu Asp Ser Val Pro Val Ile Glu
305 310 315 320
Ser Pro Thr Thr Ala Ala Lys Arg Val Arg Leu Phe Gly Val Asn Leu
325 330 335
Asp Asn Pro His Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly Glu Ser
340 345 350
Ser Asn His Gly Asn Ala Leu Ser Leu Gln Thr Pro Ala Trp Met Arg
355 360 365
Arg Asp Pro Thr Leu Arg Leu Leu Glu Leu Pro Pro His His His His
370 375 380
Gly Ala Glu Ser Ser Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser
385 390 395 400
Lys Arg Asp Ala His Ser Ala Leu Asp Leu Asp Leu
405 410
<210> 39
<211> 293
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 39
Met Glu Gln Glu Gln Asp Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Ala Ser Pro
1 5 10 15
Arg Glu Ile Pro Phe Met Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Pro Thr Ser Val Ser Pro Ser Ala Thr Ala Ser Ala Ala
35 40 45
Ala Ser Thr Ser Ala Ser Gly Ser Pro Phe Arg Ser Ser Asp Gly Ala
50 55 60
Gly Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Asp Val Glu Val
65 70 75 80
Ile Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val
85 90 95
Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Lys Tyr
100 105 110
Phe Pro Leu Asp Ser Ala Ala Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser Phe
115 120 125
Glu Asp Arg Thr Gly Lys Leu Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn
130 135 140
Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys
145 150 155 160
Glu Lys Arg Leu Asp Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Cys Arg Gly Ala
165 170 175
Ala Glu Ala Thr Arg Asp Arg Leu Phe Ile Asp Trp Lys Arg Arg Ala
180 185 190
Asp Val Arg Asp Pro His Arg Phe Gln Arg Leu Pro Leu Pro Met Thr
195 200 205
Ser Pro Tyr Gly Pro Trp Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ser Ser Cys Arg
210 215 220
Pro Arg Arg Pro Pro Arg Ser Thr Ser Ile Thr Ala Phe Ala Arg Ala
225 230 235 240
Ser Thr Ser Ala Thr Ser Thr Pro Leu Cys Arg Arg Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Ser Ala Pro Gln Gly Arg Gly Phe Ile Ser Thr Arg Pro Cys His
260 265 270
Arg Arg Arg Arg His Leu Arg Leu Leu Thr Asn Ser Thr Leu Arg Cys
275 280 285
Thr Thr Arg Ala Pro
290
<210> 40
<211> 311
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 40
Met Glu Phe Ile Thr Pro Ile Val Arg Pro Ala Ser Ala Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Gly Glu Val Gln Glu Ser Gly Gly Arg Ser Leu Ala Ala Val Glu
20 25 30
Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val Gly Lys
35 40 45
Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Lys Tyr Phe Pro
50 55 60
Leu Asp Ala Ala Ser Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Ser Phe Glu Asp
65 70 75 80
Arg Thr Gly Lys Pro Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn Ser Ser
85 90 95
Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys
100 105 110
Arg Leu Asp Ala Gly Asp Thr Val Ser Phe Gly Arg Gly Val Gly Glu
115 120 125
Ala Ala Arg Gly Arg Leu Phe Ile Asp Trp Arg Arg Arg Pro Asp Val
130 135 140
Val Ala Ala Leu Gln Pro Pro Thr His Arg Phe Ala His His Leu Pro
145 150 155 160
Ser Ser Ile Pro Phe Ala Pro Trp Ala His His His Gly His Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Arg Phe Leu Leu Pro Pro
180 185 190
Ser Ser Thr Pro Ile Tyr Asp His His Arg Arg His Ala His Ala Val
195 200 205
Gly Tyr Asp Ala Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Arg Gln Val Leu Phe Tyr
210 215 220
Arg Pro Leu Pro Pro Gln Gln Gln His His Pro Ala Val Val Leu Glu
225 230 235 240
Ser Val Pro Val Arg Met Thr Ala Gly His Ala Glu Pro Pro Ser Ala
245 250 255
Pro Ser Lys Arg Val Arg Leu Phe Gly Val Asn Leu Asp Cys Ala Asn
260 265 270
Ser Glu Gln Asp His Ala Gly Val Val Gly Lys Thr Ala Pro Pro Pro
275 280 285
Leu Pro Ser Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Lys Ala Arg
290 295 300
Cys Ser Leu Asn Leu Asp Leu
305 310
<210> 41
<211> 335
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 41
Met Asp Leu Ser Leu Ala Pro Thr Thr Thr Thr Ser Ser Asp Gln Glu
1 5 10 15
Gln Asp Arg Asp Gln Glu Leu Thr Ser Asn Ile Gly Ala Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Gly Pro Ser Gly Asn Asn Asn Asn Leu Pro Met Met Met Ile Pro
35 40 45
Pro Pro Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp
50 55 60
Val Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Arg
65 70 75 80
Tyr Phe Pro Leu Asp Ser Ser Asn Asn Gln Asn Gly Thr Leu Leu Asn
85 90 95
Phe Gln Asp Arg Asn Gly Lys Met Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Asn Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val
115 120 125
Lys Glu Lys Lys Leu Asp Ala Gly Asp Ile Val Ser Phe Gln Arg Gly
130 135 140
Ile Gly Asp Glu Ser Glu Arg Ser Lys Leu Tyr Ile Asp Trp Arg His
145 150 155 160
Arg Pro Asp Met Ser Leu Val Gln Ala His Gln Phe Glu Tyr Asn Ser
165 170 175
Val Pro Ile His Arg Gly Leu Asn Ile Gly Asn His Gln Arg Ser Tyr
180 185 190
Tyr Asn Thr Gln Arg Gln Glu Phe Val Gly Tyr Gly Tyr Gly Asn Leu
195 200 205
Ala Gly Arg Cys Tyr Tyr Thr Gly Ser Pro Leu Asp His Arg Asn Ile
210 215 220
Val Gly Ser Glu Pro Leu Val Ile Asp Ser Val Pro Val Val Pro Gly
225 230 235 240
Arg Leu Thr Pro Val Met Leu Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Thr
245 250 255
Ala Gly Lys Arg Leu Arg Leu Phe Gly Val Asn Met Glu Cys Gly Asn
260 265 270
Asp Tyr Asn Gln Gln Glu Glu Ser Trp Leu Val Pro Arg Gly Glu Ile
275 280 285
Gly Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Leu Arg Leu Asn Leu Ser Thr
290 295 300
Asp His Asp Asp Asp Asn Asp Asp Gly Asp Asp Gly Asp Asp Asp Gln
305 310 315 320
Phe Ala Lys Lys Gly Lys Ser Ser Leu Ser Leu Asn Phe Asn Pro
325 330 335
<210> 42
<211> 310
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 42
Met Met Thr Asp Leu Ser Leu Thr Arg Asp Glu Asp Glu Glu Glu Ala
1 5 10 15
Lys Pro Leu Ala Glu Glu Glu Gly Ala Arg Glu Val Ala Asp Arg Glu
20 25 30
His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp Val Gly Lys Leu Asn
35 40 45
Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Arg Phe Phe Pro Leu Asp
50 55 60
Ser Ser Ser Asn Glu Lys Gly Leu Leu Leu Asn Phe Glu Asp Leu Thr
65 70 75 80
Gly Lys Ser Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn Ser Ser Gln Ser
85 90 95
Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys Asp Lys Lys Leu
100 105 110
Asp Ala Gly Asp Ile Val Ser Phe Gln Arg Cys Val Gly Asp Ser Gly
115 120 125
Arg Asp Ser Arg Leu Phe Ile Asp Trp Arg Arg Arg Pro Lys Val Pro
130 135 140
Asp His Pro His Phe Ala Ala Gly Ala Met Phe Pro Arg Phe Tyr Ser
145 150 155 160
Phe Pro Ser Thr Asn Tyr Ser Leu Tyr Asn His Gln Gln Gln Arg His
165 170 175
His His Ser Gly Gly Gly Tyr Asn Tyr His Gln Ile Pro Arg Glu Phe
180 185 190
Gly Tyr Gly Tyr Phe Val Arg Ser Val Asp Gln Arg Asn Asn Pro Ala
195 200 205
Ala Ala Val Ala Asp Pro Leu Val Ile Glu Ser Val Pro Val Met Met
210 215 220
His Gly Arg Ala Asn Gln Glu Leu Val Gly Thr Ala Gly Lys Arg Leu
225 230 235 240
Arg Leu Phe Gly Val Asp Met Glu Cys Gly Glu Ser Gly Met Thr Asn
245 250 255
Ser Thr Glu Glu Glu Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ser Leu Pro Arg Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ala Ser Ser Ser Ser Phe Phe Gln Leu Arg Leu Gly
275 280 285
Ser Ser Ser Glu Asp Asp His Phe Thr Lys Lys Gly Lys Ser Ser Leu
290 295 300
Ser Phe Asp Leu Asp Gln
305 310
<210> 43
<211> 358
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 43
Met Asp Leu Ser Leu Ala Pro Thr Thr Thr Thr Ser Ser Asp Gln Glu
1 5 10 15
Gln Asp Arg Asp Gln Glu Leu Thr Ser Asn Ile Gly Ala Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Gly Pro Ser Gly Asn Asn Asn Asn Leu Pro Met Met Met Ile Pro
35 40 45
Pro Pro Glu Lys Glu His Met Phe Asp Lys Val Val Thr Pro Ser Asp
50 55 60
Val Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys Gln His Ala Glu Arg
65 70 75 80
Tyr Phe Pro Leu Asp Ser Ser Asn Asn Gln Asn Gly Thr Leu Leu Asn
85 90 95
Phe Gln Asp Arg Asn Gly Lys Met Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Asn Ser Ser Gln Ser Tyr Val Met Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val
115 120 125
Lys Glu Lys Lys Leu Asp Ala Gly Asp Ile Val Ser Phe Gln Arg Gly
130 135 140
Ile Gly Asp Glu Ser Glu Arg Ser Lys Leu Tyr Ile Asp Trp Arg His
145 150 155 160
Arg Pro Asp Met Ser Leu Val Gln Ala His Gln Phe Gly Asn Phe Gly
165 170 175
Phe Asn Phe Asn Phe Pro Thr Thr Ser Gln Tyr Ser Asn Arg Phe His
180 185 190
Pro Leu Pro Glu Tyr Asn Ser Val Pro Ile His Arg Gly Leu Asn Ile
195 200 205
Gly Asn His Gln Arg Ser Tyr Tyr Asn Thr Gln Arg Gln Glu Phe Val
210 215 220
Gly Tyr Gly Tyr Gly Asn Leu Ala Gly Arg Cys Tyr Tyr Thr Gly Ser
225 230 235 240
Pro Leu Asp His Arg Asn Ile Val Gly Ser Glu Pro Leu Val Ile Asp
245 250 255
Ser Val Pro Val Val Pro Gly Arg Leu Thr Pro Val Met Leu Pro Pro
260 265 270
Leu Pro Pro Pro Pro Ser Thr Ala Gly Lys Arg Leu Arg Leu Phe Gly
275 280 285
Val Asn Met Glu Cys Gly Asn Asp Tyr Asn Gln Gln Glu Glu Ser Trp
290 295 300
Leu Val Pro Arg Gly Glu Ile Gly Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala
305 310 315 320
Leu Arg Leu Asn Leu Ser Thr Asp His Asp Asp Asp Asn Asp Asp Gly
325 330 335
Asp Asp Gly Asp Asp Asp Gln Phe Ala Lys Lys Gly Lys Ser Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Asn Phe Asn Pro
355
<210> 44
<211> 344
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 44
Met Glu Ser Ser Ser Val Asp Glu Ser Thr Thr Ser Thr Gly Ser Ile
1 5 10 15
Cys Glu Thr Pro Ala Ile Thr Pro Ala Lys Lys Ser Ser Val Gly Asn
20 25 30
Leu Tyr Arg Met Gly Ser Gly Ser Ser Val Val Leu Asp Ser Glu Asn
35 40 45
Gly Val Glu Ala Glu Ser Arg Lys Leu Pro Ser Ser Lys Tyr Lys Gly
50 55 60
Val Val Pro Gln Pro Asn Gly Arg Trp Gly Ala Gln Ile Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Gln Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asn Glu Glu Asp Glu Ala Ala
85 90 95
Arg Ala Tyr Asp Val Ala Val His Arg Phe Arg Arg Arg Asp Ala Val
100 105 110
Thr Asn Phe Lys Asp Val Lys Met Asp Glu Asp Glu Val Asp Phe Leu
115 120 125
Asn Ser His Ser Lys Ser Glu Ile Val Asp Met Leu Arg Lys His Thr
130 135 140
Tyr Asn Glu Glu Leu Glu Gln Ser Lys Arg Arg Arg Asn Gly Asn Gly
145 150 155 160
Asn Met Thr Arg Thr Leu Leu Thr Ser Gly Leu Ser Asn Asp Gly Val
165 170 175
Ser Thr Thr Gly Phe Arg Ser Ala Glu Ala Leu Phe Glu Lys Ala Val
180 185 190
Thr Pro Ser Asp Val Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys His
195 200 205
His Ala Glu Lys His Phe Pro Leu Pro Ser Ser Asn Val Ser Val Lys
210 215 220
Gly Val Leu Leu Asn Phe Glu Asp Val Asn Gly Lys Val Trp Arg Phe
225 230 235 240
Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn Ser Ser Gln Ser Tyr Val Leu Thr Lys Gly
245 250 255
Trp Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Asn Leu Arg Ala Gly Asp Val Val
260 265 270
Ser Phe Ser Arg Ser Asn Gly Gln Asp Gln Gln Leu Tyr Ile Gly Trp
275 280 285
Lys Ser Arg Ser Gly Ser Asp Leu Asp Ala Gly Arg Val Leu Arg Leu
290 295 300
Phe Gly Val Asn Ile Ser Pro Glu Ser Ser Arg Asn Asp Val Val Gly
305 310 315 320
Asn Lys Arg Val Asn Asp Thr Glu Met Leu Ser Leu Val Cys Ser Lys
325 330 335
Lys Gln Arg Ile Phe His Ala Ser
340
<210> 45
<211> 231
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ggacgaggag gaagagcagg aggaagagga ggaggaggag gaggcgtctc cgcgcgagat 60
ccccttcatg acagcggcag cgacggccga caccggagcc gccgcctcct cgtcctcgcc 120
ttccgcggcg gcctcatcgg gtcctgctgc tgccccccgc tcgagcgacg gcgccggggc 180
gtccgggagc ggcggcggcg ggagcgacga cgtgcaggtg atcgagaagg a 231
<210> 46
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cgggatcccc atggggacga ggaggaagag ca 32
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ggactagttc cttctcgatc acctgcac 28
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gaagatctgg ttaccggacg aggaggaaga gca 33
<210> 49
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gctctagatc cttctcgatc acctgcac 28
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ggcctcatcg cggatagat 19
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ttcgccagct gatcgatctc 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
atggagttcg cgagctcttc 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
tcacagatcg agatccaagg 20
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ctcttcgagt aggttttcc 19
<210> 55
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ggcg 4
<210> 56
<211> 4
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
aaac 4
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gctcttcgag taggttttcc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ggaaaaccta ctcgaagagc 20
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ttagtcccac ctcgccagtt tacag 25
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
cagccagcta gtcagtctcc 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
tgtcatgaag gggatctcgc 20
<210> 62
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
aactgcgcat gcgcgcgctg agtggtcctt ctcttttaat tactactg 48
<210> 63
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
cagtagtaat taaaagagaa ggaccactca gcgcgcgcat gcgcagtt 48
<210> 64
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
aactgcgcat gcgcgcgctg agtggtcctt ctcttttaat tactactg 48
<210> 65
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
cagtagtaat taaaagagaa ggaccactca gcgcgcgcat gcgcagtt 48
<210> 66
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
aactgcgcat gcgcgcgctg agtgtggtcc ttctctttta attactactg 50
<210> 67
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
cagtagtaat taaaagagaa ggaccacact cagcgcgcgc atgcgcagtt 50
<210> 68
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
aactgcgcat gcgcgcgctg agtgtggtcc ttctctttta attactactg 50
<210> 69
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
cagtagtaat taaaagagaa ggaccacact cagcgcgcgc atgcgcagtt 50
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
atgcggacga tgtgtgattg 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
acggctgcga atttcacttt 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
acacgtcgaa atcaaagggg 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
tcattggtgc cgagttgttc 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
gaacaactcg gcaccaatga 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
gcacacacac cacacagtag 20

Claims (16)

1.多核苷酸序列在植物育种中的用途，其中所述多核苷酸序列为SEQ ID No：1的序列，
其中上述序列能够用于控制植物株型，其中控制植物株型是控制植物叶夹角，
其中所述植物为玉米，
其中所述玉米具有位于所述多核苷酸序列下游9.54kb处的被调控基因ZmRAVL1基因，所述ZmRAVL1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：27所示。
2.控制植物株型的方法，包括破坏植物中ZmRAVL1基因，所述ZmRAVL1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：27所示，其中控制植物株型是控制植物叶夹角，并且其中所述植物为玉米。
3.根据权利要求2所述的方法，其中破坏包括破坏所述基因的表达水平、活性或其组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其中破坏是通过敲除或敲低所述基因实现的。
5.根据权利要求3所述的方法，其中破坏是通过RNAi技术实现的。
6.根据权利要求3所述的方法，其中破坏是通过调控DRL1实现的。
7.根据权利要求3所述的方法，其中破坏是通过调控DRL1的表达水平、活性或其组合实现的。
8.根据权利要求3所述的方法，其中破坏是通过调控DRL1与靶标的结合实现的。
9.根据权利要求3所述的方法，其中破坏是通过基因组编辑系统实现的。
10.根据权利要求3所述的方法，其中破坏是通过CRISPR/Cas、TALEN、ZFN或其他基因组编辑系统实现的。
11.一种蛋白在调控植物株型中的用途，其中所述蛋白的序列为SEQ ID No：27所定义的氨基酸序列，
其中破坏所述蛋白的表达或活性能够用于调控植物株型，其中调控植物株型是调控植物叶夹角，并且
其中所述植物为玉米。
12.一种编码如权利要求11所定义的蛋白的基因在调控植物株型中的用途，其中破坏所述蛋白的表达或活性能够用于调控植物株型，其中调控植物株型是调控植物叶夹角，并且其中所述植物为玉米。
13.根据权利要求12所述的用途，其中编码所述蛋白的基因为：
(i)SEQ ID No：26所示的核苷酸序列；
(ii)SEQ ID No：26所示的核苷酸序列的cDNA序列，
其中上述序列能够用于调控植物株型，
其中所述植物为玉米。
14.一种抑制权利要求11所定义的蛋白的表达的试剂在耐密型植物培育中的用途，其中所述植物为玉米。
15.一种Cas9的靶点gDNA，其序列为CTCTTCGAGTAGGTTTTCC(SEQ ID No：54)。
16.多核苷酸序列，其为SEQ ID No：1的序列，
其中上述序列能够用于控制植物株型，其中控制植物株型是控制植物叶夹角，其中所述植物为玉米，并且其中所述玉米具有位于所述多核苷酸序列下游9.54kb处的被调控基因ZmRAVL1基因，所述ZmRAVL1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：27所示。
CN201910496614.6A 2019-06-10 2019-06-10 玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途 Active CN112063626B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910496614.6A CN112063626B (zh) 2019-06-10 2019-06-10 玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途
CA3142548A CA3142548A1 (en) 2019-06-10 2020-06-09 Maize gene zmravl1 and functional site and use thereof
PCT/CN2020/095099 WO2020248971A1 (en) 2019-06-10 2020-06-09 Maize gene zmravl1 and functional site and use thereof
BR112021024737A BR112021024737A2 (pt) 2019-06-10 2020-06-09 Gene de milho zmravl1 e sitio funcional e uso dos mesmos
US17/617,142 US20230175000A1 (en) 2019-06-10 2020-06-09 Maize gene zmravl1 and functional site and use thereof
ARP200101625A AR122273A1 (es) 2019-06-10 2020-06-09 Gen de maíz zmravl1 y sitio funcional y uso del mismo

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910496614.6A CN112063626B (zh) 2019-06-10 2019-06-10 玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112063626A CN112063626A (zh) 2020-12-11
CN112063626B true CN112063626B (zh) 2022-07-15

Family

ID=73658147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910496614.6A Active CN112063626B (zh) 2019-06-10 2019-06-10 玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230175000A1 (zh)
CN (1) CN112063626B (zh)
AR (1) AR122273A1 (zh)
BR (1) BR112021024737A2 (zh)
CA (1) CA3142548A1 (zh)
WO (1) WO2020248971A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114644695B (zh) * 2020-12-17 2023-09-01 中国农业大学 用于调控玉米抗旱性的蛋白质及其应用
CN112795692B (zh) * 2021-03-24 2022-02-18 湖南农业大学 与玉米株高连锁的分子标记及其应用
CN114085852B (zh) * 2021-06-10 2024-02-13 中国科学院西双版纳热带植物园 调控植物半矮化株型和叶比值的cll1基因及其豆科的直系同源基因的应用
CN114657207B (zh) * 2022-03-25 2024-07-19 浙江农林大学 一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用
CN114736914B (zh) * 2022-06-15 2022-08-23 中国农业科学院作物科学研究所 ZmTGA4基因及其在调控玉米叶夹角和增密增产中的应用
CN117512202B (zh) * 2024-01-04 2024-03-22 中国热带农业科学院三亚研究院 一种与番木瓜果实腔室直径显著相关的snp分子标记、方法及应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011136909A1 (en) * 2010-04-30 2011-11-03 E.I. Dupont De Nemours And Company Alteration of plant architecture characteristics in plants
CN104561043B (zh) * 2015-01-07 2017-08-18 华南农业大学 水稻b3转录因子家族基因rav2的应用
WO2016124918A1 (en) * 2015-02-03 2016-08-11 The Institute Of Genetics And Developmental Biology Plants with increased seed size
CN104878020B (zh) * 2015-04-29 2017-09-15 华中农业大学 一种控制水稻叶片直立性发育的基因及其应用
CN106701967B (zh) * 2017-01-22 2020-03-31 甘肃农业大学 调控玉米叶夹角主效qtl的分子标记及其应用方法
CN109022450B (zh) * 2018-08-15 2021-09-24 河南农业大学 一种调控玉米叶夹角的ZmCLA2-1基因及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3142548A1 (en) 2020-12-17
WO2020248971A1 (en) 2020-12-17
BR112021024737A2 (pt) 2022-03-22
AR122273A1 (es) 2022-08-31
US20230175000A1 (en) 2023-06-08
CN112063626A (zh) 2020-12-11
WO2020248971A9 (en) 2021-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112063626B (zh) 玉米基因ZmRAVL1和功能位点及其用途
WO2014036946A1 (en) Rice brown planthopper resistance gene bph9 and molecular markers, and uses thereof
CN103183732B (zh) 一种棉花Gh FPF1蛋白及其编码基因和应用
CN109112146B (zh) 控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qSLWA9的克隆与育种应用
CN110066774B (zh) 玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用
WO2020249108A1 (zh) Up基因及其在植物改良中的应用
CN111826392B (zh) 水稻基因ljs5-2及其同源基因在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
CN114250233B (zh) 拟南芥钙离子通道基因AtCNGC3在菌核病防控中的应用
CN117987458A (zh) 调控玉米光周期敏感性的基因及其编码蛋白与应用
CN111171127A (zh) 紫云英lhy基因及其应用
WO2023096614A1 (en) Method for developing haploid-inducing lines in tomato via mutant centromere- specific histone 3 protein (mtcenh3)
CN108456683B (zh) 一个调控水稻抽穗期基因sid1的功能及应用
CN115838756A (zh) 一种烟草NtMAB1基因沉默植株的制备方法及该植株的应用
CN103710379B (zh) GmBRI1蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用
WO2020243361A9 (en) Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing
CN117305266B (zh) 一种与水稻抗逆相关的基因OsBDG1及其编码蛋白的应用
CN117431256B (zh) 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用
CN114836439B (zh) 油菜BnaBPA03基因及其调控油菜株型的应用及方法
CN111909939B (zh) 水稻基因ljs4-2在控制水稻叶枕发育和叶夹角大小中的应用
CN113652434B (zh) 一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实dna分子及其应用
US20220195450A1 (en) Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing
CN112342218B (zh) Boc1蛋白在调控水稻愈伤组织褐化中的应用
Kaur Understanding the Genetic Mechanisms of Development Rate in Petunia and Stevia
CN118240864A (zh) 水稻OsFD1基因启动子区的STR或靶向删除该STR的方法在水稻分子育种中的应用
CN118126150A (zh) GmSIG1基因在调控大豆株型中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant