CN114657207B - 一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用，涉及遗传转化技术领域。本发明提供一种以发根农杆菌K599介导的，直接对芸香科植物的枝条进行遗传转化的遗传转化体系。利用本发明所述遗传转化体系可进行遗传转化和基因编辑，能够有效克服农杆菌转化法的诸多缺陷；遗传转化体系周期为14～28天，节省时间，有效缩短柑橘基因功能研究周期；遗传稳定性高，可以避免嵌合体的形成。利用本发明所述遗传转化体系进行遗传转化或基因编辑，获得的转化再生植株或基因编辑植株可以实现基因功能的验证，且所述遗传转化或基因编辑方法，无需无菌环境培育无菌苗，并且免除愈伤组织的诱导及组织培养的过程，简化实验操作，降低实验成本。

Description

一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用
技术领域
本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用。
背景技术
遗传转化方法根据目的基因进入宿主细胞的方式可以分为载体介导目的基因转移系统和目的基因直接导入系统。其中，前者包括农杆菌介导法和病毒介导法，后者包括基因枪法、电击法、超声波法、显微注射法、花粉管通道法、PEG(聚乙二醇)法等。农杆菌又分为根癌农杆菌和发根农杆菌两种。已有研究表明，根癌农杆菌介导的遗传转化，因为其转化率较高且重复性较好已经成为植物遗传转化中最常规、最广泛的基因转化途径。
农杆菌转化一般要经过以下几个过程：材料选择、预培养、共培养、筛选培养和植株再生。农杆菌转化法以植物的离体再生技术为依托，常选用的外植体包括胚轴、茎、叶片等。一般情况下要先对种子消毒，培养出相应材料的无菌苗，然后再选择合适的外植体进行下一步。该方法下选择的外植体需具有成熟的离体再生体系。整个转化过程耗时长，组培期间容易被细菌、真菌污染。此外，受体材料需对选择性抗生素敏感、对抑菌性抗生素不敏感以保证在农杆菌侵染受体后的脱菌以及后续筛选阳性植株阶段能够顺利进行；受体材料需能接受外源基因整合并可稳定遗传，在目的基因的表达过程中应避免宿主发生变异才有可能获得有目标性状的转基因植株。此外，组织培养中外植体常出现褐化的现象，由于伤流从外植体剪口处大量流出，其中的酚类物质在多酚氧化酶的作用下氧化成为醌类物质，从而对外植体产生毒害，造成外植体的死亡。
目前，在MS培养基中生长4周的柑橘实生苗上胚轴是较为理想的柑橘遗传转化受体材料。因对上胚轴进行遗传转化需通过组培以进行共培养、筛选培养、芽诱导、根诱导等环节，因此获得40cm高的植株往往需要半年甚至更久。此外，用该方法获得的大部分柑橘品种的基因编辑植株童期往往在3-5年，这给研究人员对柑橘花、果、种性状相关调控基因的研究增加了极大时间成本。
发根农杆菌是根瘤菌科农杆菌属的一种革兰氏阴性土壤细菌，可侵染大多数双子叶植物、部份单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。发根农杆菌之所以具有这种致根性，是因为它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒。Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250kb的大质粒，带有冠瘿合成酶基因。在Ri质粒上，存在与转化有关的两个主要功能区，即T-DNA(转移区)和Vir(致病区)。Vir区基因并不发生转移，但它对T-DNA的转移非常重要。当发根农杆菌感染植物时Ri质粒上的T-DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。
目前，发根农杆菌介导的植物转基因绝大数是利用植株的无菌苗或叶片或茎段作为外植体获得转基因根。农杆菌介导植株转基因方法的应用大多集中在茄科、菊科、十字花科、旋花科、伞形科、豆科、石竹科、蓼科等草本植物中广泛应用，而在木本植物中的应用普遍存在转化率较低的现象。常规的发根农杆菌介导转基因植物的构建方法大多以无菌材料为侵染对象，需要大量的时间进行愈伤组织诱导、分化和继代，周期长，操作繁琐，效率低。而木本植物大多次生代谢物较多，组培过程中易发生褐化，严重影响外植体的脱分化和培养物的再分化进程。其次木本植物组培苗时间较草本植物长，成本高，技术要求严。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用，不仅可跳过繁琐的组培环节，从而提高遗传转化效率，还具备在成株上进行操作的可行性，为缩短花、果、种等表型相关基因功能研究的周期提供了可能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种芸香科植物的遗传转化体系，所述遗传转化体系以发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)K599介导，以芸香科植物的枝条为转化材料。
本发明还提供了一种芸香科植物的遗传转化方法，包括以下步骤：将待转的基因转入发根农杆菌K599的感受态细胞中，挑取阳性菌株经培养后提取菌体，利用MES浸润液重悬所述菌体至OD值为0.6-1.0，于黑暗条件下放置3h，得介导液；
将芸香科植物的枝条底部完全浸入所述介导液中真空浸润10-30min，得浸润枝条；
将所述浸润枝条扦插后生根，得遗传转化芸香科植株。
优选的，所述待转的基因包括用于基因编辑的Cas9质粒。
优选的，所述Cas9质粒包括1380-Cas9-HA，所述1380-Cas9-HA的核苷酸序列如SEQID NO.66所示。
优选的，所述阳性菌株包括经Kana和Str两种抗生素筛选、菌液PCR和测序均显示阳性的菌株。
优选的，所述阳性菌株的培养包括在包含50mg/L Kana和50mg/L Str的TY培养基上进行培养。
优选的，所述枝条的长度为8～12cm，并携带1～2片叶，每片叶保留1/3面积。
优选的，所述扦插的基质包括蛭石，并保持温度26～30℃。
优选的，在所述生根后，还包括对生根植株进行遗传转化的检测。
本发明还提供了上述遗传转化体系在免组培的芸香科植物基因编辑中的应用。
有益效果：本发明提供了一种以发根农杆菌K599介导的，直接对芸香科植物的枝条进行遗传转化的遗传转化体系。本发明所述遗传转化体系以柑橘枝条为转化材料，具有获取方便、数量多、成本低、无季节限制等优点，有效克服了农杆菌转化法的诸多缺陷；发根农杆菌K599介导的遗传转化体系周期为14～28天，节省时间，有效缩短柑橘基因功能研究周期；发根农杆菌K599诱导的毛状根由单个细胞发育而来，遗传稳定性高，可以避免嵌合体的形成。利用本发明所述遗传转化体系进行遗传转化或基因编辑，获得的转化再生植株或基因编辑植株可以实现基因功能的验证，且所述遗传转化或基因编辑方法，无需无菌环境培育无菌苗，并且免除了愈伤组织的诱导及组织培养的过程，简化了实验操作，降低了实验成本。
附图说明
图1为遗传转化的具体方法流程；
图2为1380-Cas9-HA质粒图谱；
图3为随机选择基因的20个gRNA初始载体；
图4为1380-Cas9-HA浸润香橼荧光对照图，其中未经浸润直接扦插的野生型对照在激发光照射下无荧光，而经1380-Cas9-HA浸润的香橼在激发光照射下能够看到绿色荧光；
图5为靶标溃疡病菌的20个gRNA浸润香橼与野生型对照，其中未经浸润直接扦插的野生型对照在激发光照射下无荧光，而经20个gRNA浸润的香橼在激发光照射下能够看到绿色荧光；
图6为共聚焦显微镜下转化植株与野生型对照的根系横截面与纵截面；
图7为浸润香橼的基因编辑测序结果；
图8为验证GFP、neo、Cas9基因整合到香橼基因组的结果，20个gRNA浸润香橼中GFP、neo和Cas9的条带，其中第一行和第二行为GFP条带，第三行和第四行为neo条带，第五行和第六行为Cas9条带；
图9为验证GFP、neo、Cas9基因整合到香橼基因组的结果，1380-Cas9-HA转化植株中GFP、neo和Cas9的条带；
图10为gRNA被成功编辑的验证结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种芸香科植物的遗传转化体系，所述遗传转化体系以发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)K599介导，以芸香科植物的枝条为转化材料。
本发明所述发根农杆菌K599优选为感受态菌株，本发明对所述感受态菌株的来源并没有特殊限定，优选包括自制或购买，实施例中选择购自唯地生物。
本发明对所述芸香科植物的具体种类并没有特殊限定，优选包括柑橘属植物，实施例中以香橼为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明以所述芸香科植物的枝条作为转化材料，锁住枝条的直径优选为0.5～1cm。本发明在进行遗传转化前，优选还包括对枝条进行修剪，使所述枝条的长度优选达到8～12cm，并携带1～2片叶，每片叶保留1/3面积。本发明所述修剪优选包括斜剪。
本发明还提供了一种芸香科植物的遗传转化方法，包括如图1所示的步骤：将待转的基因转入发根农杆菌K599的感受态细胞中，挑取阳性菌株经培养后提取菌体，利用MES浸润液重悬所述菌体至OD值为0.6-1.0，于黑暗条件下放置3h，得介导液；
将芸香科植物的枝条底部完全浸入所述介导液中真空浸润10-30min，得浸润枝条；
将所述浸润枝条扦插后生根，得遗传转化芸香科植株。
本发明所述基因优选包括用于基因编辑的Cas9质粒，实施例中优选1380-Cas9-HA(图2)，且所示1380-Cas9-HA的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.66所示；随机选择基因的gRNA的20个质粒(表1和图3)。在本发明实施例中，为方便查看遗传转化的阳性，在所述20个质粒中均插入绿色荧光蛋白GFP基因。
表1随机选择基因的20个gRNA
本发明优选利用冻融法将所述质粒转入K599感受态细胞中，并涂板添加两种抗生素的TY平板上，所述抗生素包括Kana和Str，且所述抗生素的浓度均为50mg/L。本发明挑取所述TY平板上的单菌落于700μLTY液体培养基中，摇菌，进行菌液PCR验证并进行测序验证，保证质粒成功转入K599中。本发明将确认阳性的菌液与体积百分含量为50％的甘油溶液按照1:1的体积比进行混合，置于-80℃冰箱保存，以便后续使用。
本发明优选取出保存的菌种在TY平板(+50mg/LKana+50mg/L Str)上划单斑，放置于28℃培养箱培养2d；挑单斑于提前加好TY培养基(+50mg/LKana+50mg/L Str)的1.5mL离心管中，每个质粒挑6～12管，于28℃、180rpm振荡培养过夜(12～16h)；将1.5mL离心管中菌液以1:50的比例加入新鲜的TY液体培养基(+50mg/L Kana+50mg/L Str)中，28℃、180rpm震荡培养过夜，直至OD600>1；将菌液分装至50mL离心管，称量配平，室温6000rpm离心10min，收集菌液沉淀，弃上清，加入适量MES浸润液重新悬浮菌体沉淀，用枪吸打混匀，倒入容器中，然后再将离心管二次润洗后液体倒入容器；向容器倒入适量MES悬浮液，调整至菌液OD值为0.6-1.0，然后将悬浮好的菌液于黑暗条件下放置3h。
本发明所述TY培养基的配方，优选包括：胰蛋白胨5g/L、酵母提取物3g/L和10mL1mol/L的CaCl2；当配制TY平板时，则加入15g/L的琼脂粉。
本发明所述MES浸润液优选包括：MgCl2·6H2O 2.035g/L、MES 10mL/L和AS 400μL/L，所述MES优选为将10.66gMES溶于50mL H2O中形成的溶液。
本发明将经上述处理后的枝条底部完全浸入所述介导液中，枝条与浸润液同时放入真空泵中真空浸润10-30min。
本发明将所述浸润枝条扦插后生根，得遗传转化芸香科植株，所述扦插优选在气候室内进行，方便全年操作。本发明所述扦插用基质优选包括蛭石，所述蛭石的直径优选为3～5mm，实施例中优选将所述蛭石于高温灭菌锅121℃灭菌15min，冷却后装入扦插盆中，厚度为3～3.5cm，加入适量清水，使蛭石湿润但底部不积水为宜，扦插时枝条最好相距5cm以上，覆盖配套透明盖保温保湿。期间保证土壤温度在26～30℃、土壤湿度适宜；等待2-3周后查看生根情况。
本发明在所述生根后，优选还包括对生根植株进行遗传转化的检测，所述检测优选包括利用手持激发光进行初步检验，查看根系是否存在绿色荧光，由此来判断是否成功对其进行编辑；取有荧光的根系提取DNA，进行PCR检测和测序检测，进一步确定编辑结果。
利用本发明所述遗传转化方法，可在14～28d内完成全部的遗传转化，免去了组培过程，并且K599发根农杆菌诱导的毛状根由单个细胞发育而来，遗传稳定性高，可以避免嵌合体的形成。
本发明还提供了上述遗传转化体系在免组培的芸香科植物基因编辑中的应用。本发明所述基因编辑的方法优选与上述遗传转化方法相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
遗传转化体系的建立
一、实验材料
1.柑橘(香橼)苗龄：1～2年生
2.柑橘苗培养环境：培养基质，泥炭：椰糠：蛭石：珍珠岩＝2∶2：1∶1(体积比)；通气空隙9％～14％，持水孔隙40％～53％，基质气水比1∶4，光照15000lux；温度24～28℃；湿度50～60％；
4.扦插苗培养：3～5cm厚度蛭石；
5.质粒：1380-Cas9-HA(含有绿色荧光蛋白GFP基因)；
6.试剂和器材：唯地生物K599发根农杆菌感受态、抗生素(卡那霉素Kana，链霉素Str)、AS(乙酰丁香酮，用DMSO配成250mM母液)、MES(1M)、MgCl2(1M)、TY培养基、CaCl2。
二、实验方法与步骤
1.使用冻融法将上述质粒转入K599感受态细胞中，挑取在添加Kana+Str两种抗生素的TY平板上长出的单斑于700μLTY液体培养基中，摇菌，进行菌液PCR验证(表2GFP引物)并进行测序验证，保证质粒成功转入K599中。确保无误后将上述700μL菌液取500μL与50％甘油一比一混匀，放入-80℃冰箱保存，以便后续使用。
表2全部引物
2.取出保存的菌种在TY平板(+50mg/L Kana+50mg/L Str，以下所有TY培养基皆加入此浓度抗生素)上划单斑，放置于28℃培养箱培养2d。
3.挑单斑于提前加好TY培养基的1.5ml离心管中，视材料的多少，每个质粒挑6～12管，28℃、180rpm振荡培养过夜。
4.将1.5mL离心管中菌液以1:50的比例加入新鲜的TY液体培养基中，28℃、180rpm震荡培养过夜，直至OD600>1。
5.将菌液分装至50mL离心管，称量配平，室温6000rpm离心10min，收集菌液沉淀，离心的同时配置MES浸润液。
6.将离心好的菌液拿出，弃上清，加入适量MES浸润液重新悬浮菌体沉淀，用枪吸打混匀，倒入容器中，然后再将离心管二次润洗后液体倒入容器。
7.向容器倒入适量悬浮液，尽量少量多次，调整至菌液OD值为0.6-1.0，然后将悬浮好的菌液于黑暗条件下放置3h。
8.黑暗静置期间将香橼枝条剪成10cm左右长度(直径0.5～1cm，将枝条斜剪，修枝剪使用前做好消毒)备用，每根枝条可保留1～2片叶子，将每片叶子减去2/3只保留1/3面积即可。
9.将枝条底部完全浸入菌液中，放入真空泵真空浸润10-30min。
10.浸润后的枝条气候室扦插(选择3-5mm的蛭石，高温灭菌锅121℃灭菌15min，冷却后装入扦插盆中，厚度为3～3.5cm，加入适量清水，使蛭石湿润但底部不积水为宜，扦插时枝条最好相距5cm以上，覆盖配套透明盖保温保湿。期间保证土壤温度在26～30℃、土壤湿度适宜。等待2～3周后查看生根情况。)，同时直接扦插未经菌液浸润的枝条作为野生型对照。
11.扦插枝条生根后可以使用手持激发光进行检验，查看根系是否存在绿色荧光，由此来判断是否成功转化。结果如图4所示，经1380-Cas9-HA浸润的根系发出绿色荧光而野生型对照无荧光。
12.为进一步确定根系荧光，在共聚焦显微镜下进行了观察(图5)，结果显示在横切与纵切两种情况下转化成功的根系细胞都发出绿色荧光，而野生型对照根系细胞无荧光。
实施例2
基于此遗传转化体系进行基因编辑
一、实验材料
质粒为随机选择基因的gRNA的20个质粒(含有绿色荧光蛋白GFP基因)，其余部分与实施例1相同。
二、试验方法与步骤
1～10步与实施例1相同
11.扦插枝条生根后可以使用手持激发光进行初步检验，查看根系是否存在绿色荧光，由此来判断是否成功对其进行编辑。结果图6所示，共获得了1、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20号有荧光根材料。
12.取有荧光的根系提取DNA，利用表2中的测序引物进行PCR检测和测序检测，进一步确定编辑结果。(同一gRNA浸润后产生荧光根的不同植株以数字-数字表示，例如1-1、1-20)
(1)在gRNA两端设计引物，PCR片段扩增后送公司进行测序，测序结果如图7所示，1、4、7、8、9、10、11、13、16、19、20号质粒浸润材料中相应gRNA被成功编辑。
(2)为了证明载体中的GFP、neo、Cas9成功整合到香橼基因组DNA中，在GFP、neoR两端设计引物，在Cas9蛋白序列中设计引物，利用表2中GFP、NEO、Cas9引物进行PCR扩增，结果如图8和图9所示，其中红色为测序失败、黄色为测序成功但是未成功编辑的、白色为编辑成功。
(3)为了显示gRNA被成功编辑，我们根据测序结果，在gRNA编辑位点设计引物，利用表2中的缺失位点引物进行PCR扩增，并设置野生型对照，结果如图10所示，野生型有条带，转化子无条带，说明确实gRNA被成功编辑。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江农林大学
浙江养生堂天然药物研究所有限公司
赣南师范大学
<120> 一种芸香科植物的遗传转化体系、遗传转化方法和应用
<160> 66
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acagattgct ggactaagaa 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgtccacga tagaagacta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tggggagccg aaaggcaaga 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgagacctca tcttcaacaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tctcatatcc aaactcgccc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccgtcagtag tagtttcggc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagcccgtag acttctccgt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggcgacattg gagatgacac 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cttaaccctg aaaatggcgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagccagtac ctcctcaatg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcttcacggc cacttttctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tggcgggact ttggattcta 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatttagcaa acacgcagcg 20
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acaacccacc cgacatatca 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcgatttct gaggcaacgg 20
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tgctaatgaa ggatgaccgt 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acggctgagt tacagttacc 20
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<211> 20
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<400> 29
tccgattatc gccgaaatcg 20
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cagctaaccg atactcgtgc 20
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<211> 20
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ggctctgtcc ctatatgtgg 20
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ccagtgggaa cctgttcaga 20
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttctatcgt ggacgtgcac 20
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<211> 20
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gcagggagtc actgagtttt 20
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<211> 20
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agggcgagtt tggatatgag 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aaacgacaat gccctcagtc 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ccggtgtcat ctccaatgtc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cttaaccctg aaaatggcgg 20
<210> 39
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aaatatagcc cgtccaagcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ttcgcagatc tgtcgatcga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggtgatggtg gtgcttgtac 20
<210> 42
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gccatgggga ttgaacaaga 20
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tagaggatcg atccgaaccc 20
<210> 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cgacagcttc ttccacagac 20
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<211> 20
<212> DNA
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attccctcgg tcacgtattt 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aacctcgaaa gaaacatc 18
<210> 47
<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tagtccaaca ccaccact 18
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttattcaac aacccaac 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcactctact ctaccgtc 18
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttctatataa acccccgt 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggacttttg aaccactg 18
<210> 52
<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaaacagga atacaaga 18
<210> 53
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ttcaacaata gcccatca 18
<210> 54
<211> 18
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ccgtcatagt tctcagag 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
atccagttgg ttttctctc 19
<210> 56
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<400> 56
atactgaccc agctacccc 19
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<211> 19
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<400> 57
aaaattcaaa ccaaaaggc 19
<210> 58
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<400> 58
ataatgagaa aaaaagcag 19
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<211> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
taaggataag gagaagtga 19
<210> 60
<211> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ccactggaac tccactttg 19
<210> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
tgttaatccc gatacgctt 19
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gtctctctct tccgttctc 19
<210> 63
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
taatcctctg ttttggttt 19
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgcatgttgg gtacgtttc 19
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ggctggctca cctgggata 19
<210> 66
<211> 15607
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aaagcttcgg gggatctgga ttttagtact ggattttggt tttaggaatt agaaatttta 60
ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg tttcttatat gctcaacaca 120
tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc cttatctggg aactactcac acattattat 180
ggagaaattt tcgagctctt aaagctcatc atgtttgtat agttcatcca tgccatgtgt 240
aatcccagca gctgttacaa actcaagaag gaccatgtgg tctctctttt cgttgggatc 300
tttcgaaagg gcagattgtg tggacaggta atggttgtct ggtaaaagga cagggccatc 360
gccaattgga gtattttgtt gataatggtc tgctagttga acgcttccat cttcaatgtt 420
gtgtctaatt ttgaagttag ctttgattcc attcttttgt ttgtctgccg tgatgtatac 480
gttgtgggag ttgtagttgt attccaactt gtggccgagg atgtttccgt cctccttgaa 540
atcgattccc ttaagctcga tcctgttgac gagggtgtct ccctcaaact tgacttcagc 600
acgtgtcttg tagttcccgt cgtccttgaa agagatggtc ctctcctgca cgtatccctc 660
aggcatggcg ctcttgaaga agtcgtgccg cttcatatga tctgggtatc ttgaaaagca 720
ttgaacacca taagtgaaag tagtgacaag tgttggccat ggaacaggta gttttccagt 780
agtgcaaata aatttaaggg taagttttcc gtatgttgca tcaccttcac cctctccact 840
gacagaaaat ttgtgcccat taacatcacc atctaattca acaagaattg ggacaactcc 900
agtgaaaagt tcttctcctt tactgaattg tacctgcaca tcaacaaatt ttggtcatat 960
attagaaaag ttataaatta aaatatacac acttataaac tacagaaaag caattgctat 1020
atactacatt cttttatttt gaaaaaaata tttgaaatat tatattacta ctaattaatg 1080
ataattatta tatatatatc aaaggtagaa gcagaaactt acgtacaatt cggccgagga 1140
taatgatagg agaagtgaaa agatgagaaa gagaaaaaga ttagtcttca tctcgacaaa 1200
cttacaaatt tctctgaagt tgtatcctca gtacttcaaa gaaaatagct tacaccaaat 1260
tttttcttgt tttcacaaat gccgaacttg gttccttata taggaaaact caagggcaaa 1320
aatgacacgg aaaaatataa aaggataagt agtgggggat aagattcctt tgtgataagg 1380
ttactttccg cccttacatt ttccacctta catgtgtcct ctatgtctct ttcacaatca 1440
ccgaccttat cttcttcttt tcattgttgt cgtcagtgct tacgtcttca agattctttt 1500
cttcgcctgg ttcttctttt tcaatttcta cgtattcttc ttcgtattct ggcagtatag 1560
gatcttgtat ctgtacattc ttcatttttg aacataggtt gcatatgtgc cgcatattga 1620
tctgcttctt gctgagctca cataatactt ccatagtttt tcccgtaaac attggattct 1680
tgatgctaca tcttggataa ttaccttctg cagcccttac attttccacc ttacatgtgt 1740
cctctatgtc tctttcacaa tcaccgacct tatcttcttc ttttcattgt tgtcgtcagt 1800
gcttacgtct tcaagattct tttcttcgcc tggttcttct ttttcaattt ctacgtattc 1860
ttcttcgtat tctggcagta taggatcttg tatctgtaca ttcttcattt ttgaacatag 1920
gttgcatatg tgccgcatat tgatctgctt cttgctgagc tcacataata cttccatagt 1980
ttttcccgta aacattggat tcttgatgct acatcttgga taattacctt ctggcgcggg 2040
catgcaagct tgcatgcctg caggtcccca gattagcctt ttcaatttca gaaagaatgc 2100
taacccacag atggttagag aggcttacgc agcaggtctc atcaagacga tctacccgag 2160
caataatctc caggaaatca aataccttcc caagaaggtt aaagatgcag tcaaaagatt 2220
caggactaac tgcatcaaga acacagagaa agatatattt ctcaagatca gaagtactat 2280
tccagtatgg acgattcaag gcttgcttca caaaccaagg caagtaatag agattggagt 2340
ctctaaaaag gtagttccca ctgaatcaaa ggccatggag tcaaagattc aaatagagga 2400
cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga acagttcata cagagtctct tacgactcaa 2460
tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt ggagcacgac acacttgtct actccaaaaa 2520
tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat 2580
atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cactttattg tgaagatagt 2640
ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga 2700
agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga 2760
aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata tctccactga 2820
cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag 2880
ttcatttcat ttggagagaa cacgggggac tctagaaata attttgttta actttaagaa 2940
ggagatatac catgcccaag aagaagagga aggtgatgga taagaaatac tcaataggct 3000
tagatatcgg cacaaatagc gtcggatggg cggtgatcac tgatgaatat aaggttccgt 3060
ctaaaaagtt caaggttctg ggaaatacag accgccacag tatcaaaaaa aatcttatag 3120
gggctctttt atttgacagt ggagagacag cggaagcgac tcgtctcaaa cggacagctc 3180
gtagaaggta tacacgtcgg aagaatcgta tttgttatct acaggagatt ttttcaaatg 3240
agatggcgaa agtagatgat agtttctttc atcgacttga agagtctttt ttggtggaag 3300
aagacaagaa gcatgaacgt catcctattt ttggaaatat agtagatgaa gttgcttatc 3360
atgagaaata tccaactatc tatcatctgc gaaaaaaatt ggtagattct actgataaag 3420
cggatttgcg cttaatctat ttggccttag cgcatatgat taagtttcgt ggtcattttt 3480
tgattgaggg agatttaaat cctgataata gtgatgtgga caaactattt atccagttgg 3540
tacaaaccta caatcaatta tttgaagaaa accctattaa cgcaagtgga gtagatgcta 3600
aagcgattct ttctgcacga ttgagtaaat caagacgatt agaaaatctc attgctcagc 3660
tccccggtga gaagaaaaat ggcttatttg ggaatctcat tgctttgtca ttgggtttga 3720
cccctaattt taaatcaaat tttgatttgg cagaagatgc taaattacag ctttcaaaag 3780
atacttacga tgatgattta gataatttat tggcgcaaat tggagatcaa tatgctgatt 3840
tgtttttggc agctaagaat ttatcagatg ctattttact ttcagatatc ctaagagtaa 3900
atactgaaat aactaaggct cccctatcag cttcaatgat taaacgctac gatgaacatc 3960
atcaagactt gactctttta aaagctttag ttcgacaaca acttccagaa aagtataaag 4020
aaatcttttt tgatcaatca aaaaacggat atgcaggtta tattgatggg ggagctagcc 4080
aagaagaatt ttataaattt atcaaaccaa ttttagaaaa aatggatggt actgaggaat 4140
tattggtgaa actaaatcgt gaagatttgc tgcgcaagca acggaccttt gacaacggct 4200
ctattcccca tcaaattcac ttgggtgagc tgcatgctat tttgagaaga caagaagact 4260
tttatccatt tttaaaagac aatcgtgaga agattgaaaa aatcttgact tttcgaattc 4320
cttattatgt tggtccattg gcgcgtggca atagtcgttt tgcatggatg actcggaagt 4380
ctgaagaaac aattacccca tggaattttg aagaagttgt cgataaaggt gcttcagctc 4440
aatcatttat tgaacgcatg acaaactttg ataaaaatct tccaaatgaa aaagtactac 4500
caaaacatag tttgctttat gagtatttta cggtttataa cgaattgaca aaggtcaaat 4560
atgttactga aggaatgcga aaaccagcat ttctttcagg tgaacagaag aaagccattg 4620
ttgatttact cttcaaaaca aatcgaaaag taaccgttaa gcaattaaaa gaagattatt 4680
tcaaaaaaat agaatgtttt gatagtgttg aaatttcagg agttgaagat agatttaatg 4740
cttcattagg tacctaccat gatttgctaa aaattattaa agataaagat tttttggata 4800
atgaagaaaa tgaagatatc ttagaggata ttgttttaac attgacctta tttgaagata 4860
gggagatgat tgaggaaaga cttaaaacat atgctcacct ctttgatgat aaggtgatga 4920
aacagcttaa acgtcgccgt tatactggtt ggggacgttt gtctcgaaaa ttgattaatg 4980
gtattaggga taagcaatct ggcaaaacaa tattagattt tttgaaatca gatggttttg 5040
ccaatcgcaa ttttatgcag ctgatccatg atgatagttt gacatttaaa gaagacattc 5100
aaaaagcaca agtgtctgga caaggcgata gtttacatga acatattgca aatttagctg 5160
gtagccctgc tattaaaaaa ggtattttac agactgtaaa agttgttgat gaattggtca 5220
aagtaatggg gcggcataag ccagaaaata tcgttattga aatggcacgt gaaaatcaga 5280
caactcaaaa gggccagaaa aattcgcgag agcgtatgaa acgaatcgaa gaaggtatca 5340
aagaattagg aagtcagatt cttaaagagc atcctgttga aaatactcaa ttgcaaaatg 5400
aaaagctcta tctctattat ctccaaaatg gaagagacat gtatgtggac caagaattag 5460
atattaatcg tttaagtgat tatgatgtcg atcacattgt tccacaaagt ttccttaaag 5520
acgattcaat agacaataag gtcttaacgc gttctgataa aaatcgtggt aaatcggata 5580
acgttccaag tgaagaagta gtcaaaaaga tgaaaaacta ttggagacaa cttctaaacg 5640
ccaagttaat cactcaacgt aagtttgata atttaacgaa agctgaacgt ggaggtttga 5700
gtgaacttga taaagctggt tttatcaaac gccaattggt tgaaactcgc caaatcacta 5760
agcatgtggc acaaattttg gatagtcgca tgaatactaa atacgatgaa aatgataaac 5820
ttattcgaga ggttaaagtg attaccttaa aatctaaatt agtttctgac ttccgaaaag 5880
atttccaatt ctataaagta cgtgagatta acaattacca tcatgcccat gatgcgtatc 5940
taaatgccgt cgttggaact gctttgatta agaaatatcc aaaacttgaa tcggagtttg 6000
tctatggtga ttataaagtt tatgatgttc gtaaaatgat tgctaagtct gagcaagaaa 6060
taggcaaagc aaccgcaaaa tatttctttt actctaatat catgaacttc ttcaaaacag 6120
aaattacact tgcaaatgga gagattcgca aacgccctct aatcgaaact aatggggaaa 6180
ctggagaaat tgtctgggat aaagggcgag attttgccac agtgcgcaaa gtattgtcca 6240
tgccccaagt caatattgtc aagaaaacag aagtacagac aggcggattc tccaaggagt 6300
caattttacc aaaaagaaat tcggacaagc ttattgctcg taaaaaagac tgggatccaa 6360
aaaaatatgg tggttttgat agtccaacgg tagcttattc agtcctagtg gttgctaagg 6420
tggaaaaagg gaaatcgaag aagttaaaat ccgttaaaga gttactaggg atcacaatta 6480
tggaaagaag ttcctttgaa aaaaatccga ttgacttttt agaagctaaa ggatataagg 6540
aagttaaaaa agacttaatc attaaactac ctaaatatag tctttttgag ttagaaaacg 6600
gtcgtaaacg gatgctggct agtgccggag aattacaaaa aggaaatgag ctggctctgc 6660
caagcaaata tgtgaatttt ttatatttag ctagtcatta tgaaaagttg aagggtagtc 6720
cagaagataa cgaacaaaaa caattgtttg ttgagcagca taagcattat ttagatgaga 6780
ttattgagca aatcagtgaa ttttctaagc gtgttatttt agcagatgcc aatttagata 6840
aagttcttag tgcatataac aaacatagag acaaaccaat acgtgaacaa gcagaaaata 6900
ttattcattt atttacgttg acgaatcttg gagctcccgc tgcttttaaa tattttgata 6960
caacaattga tcgtaaacga tatacgtcta caaaagaagt tttagatgcc actcttatcc 7020
atcaatccat cactggtctt tatgaaacac gcattgattt gagtcagcta ggaggtgacc 7080
atcaccacca ccatcactaa tgactcgagg taccgtcgac tacccatacg acgttcctga 7140
ctatgcgtca ctctacccct atgacgtacc ggattatgca tccctatatc cgtatgatgt 7200
tccagattac gcttctctat aataggaatt caggcctcga atttccccga tcgttcaaac 7260
atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata 7320
taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt 7380
atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac 7440
aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat 7500
cggcgcgccg ggccctgtca aacactgata gtttaaactg aaggcgggaa acgacaatct 7560
gatcatgagc ggagaattaa gggagtcacg ttatgacccc cgccgatgac gcgggacaag 7620
ccgttttacg tttggaactg acagaaccgc aacgttgaag gagccactca gccgcgggtt 7680
tctggagttt aatgagctaa gcacatacgt cagaaaccat tattgcgcgt tcaaaagtcg 7740
cctaaggtca ctatcagcta gcaaatattt cttgtcaaaa atgctccact gacgttccat 7800
aaattcccct cggtatccaa ttagagtctc atattcactc tcaatccaaa taatctgcac 7860
cggatctgga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc 7920
ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 7980
cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc 8040
cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg 8100
cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt 8160
gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc 8220
catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga 8280
ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga 8340
tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct 8400
caaggcgcgc atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc 8460
gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt 8520
ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg 8580
cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat 8640
cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctaagtcgag tttctccata ataatgtgtg 8700
agtagttccc agataaggga attagggttc ctatagggtt tcgctcatgt gttgagcata 8760
taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt ctatcaataa aatttctaat 8820
tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agatcccccg aattaattcg gcgttaattc 8880
agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac 8940
cacaatatat cctgccacca gccagccaac agctccccga ccggcagctc ggcacaaaat 9000
caccactcga tacaggcagc ccatcagtcc gggacggcgt cagcgggaga gccgttgtaa 9060
ggcggcagac tttgctcatg ttaccgatgc tattcggaag aacggcaact aagctgccgg 9120
gtttgaaaca cggatgatct cgcggagggt agcatgttga ttgtaacgat gacagagcgt 9180
tgctgcctgt gatcaccgcg gtttcaaaat cggctccgtc gatactatgt tatacgccaa 9240
ctttgaaaac aactttgaaa aagctgtttt ctggtattta aggttttaga atgcaaggaa 9300
cagtgaattg gagttcgtct tgttataatt agcttcttgg ggtatcttta aatactgtag 9360
aaaagaggaa ggaaataata aatggctaaa atgagaatat caccggaatt gaaaaaactg 9420
atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt ctcctgctaa ggtatataag 9480
ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg acagccggta taaagggacc 9540
acctatgatg tggaacggga aaaggacatg atgctatggc tggaaggaaa gctgcctgtt 9600
ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca atctgctcat gagtgaggcc 9660
gatggcgtcc tttgctcgga agagtatgaa gatgaacaaa gccctgaaaa gattatcgag 9720
ctgtatgcgg agtgcatcag gctctttcac tccatcgaca tatcggattg tccctatacg 9780
aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac tgaataacga tctggccgat 9840
gtggattgcg aaaactggga agaagacact ccatttaaag atccgcgcga gctgtatgat 9900
tttttaaaga cggaaaagcc cgaagaggaa cttgtctttt cccacggcga cctgggagac 9960
agcaacatct ttgtgaaaga tggcaaagta agtggcttta ttgatcttgg gagaagcggc 10020
agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt cgatcaggga ggatatcggg 10080
gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga tcaagcctga ttgggagaaa 10140
ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagtacc tagaatgcat gaccaaaatc 10200
ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 10260
tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 10320
ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 10380
ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 10440
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gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 10800
cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 10860
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cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg 11040
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agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg 11160
actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 11220
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agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcaggg tgccttgatg tgggcgccgg 11340
cggtcgagtg gcgacggcgc ggcttgtccg cgccctggta gattgcctgg ccgtaggcca 11400
gccatttttg agcggccagc ggccgcgata ggccgacgcg aagcggcggg gcgtagggag 11460
cgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgc agctcttcgg ctgtgcgctg gccagacagt 11520
tatgcacagg ccaggcgggt tttaagagtt ttaataagtt ttaaagagtt ttaggcggaa 11580
aaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtc acttacatgt gtgaccggtt cccaatgtac 11640
ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt acggctttgg gttcccaatg 11700
tacgtgctat ccacaggaaa gagacctttt cgaccttttt cccctgctag ggcaatttgc 11760
cctagcatct gctccgtaca ttaggaaccg gcggatgctt cgccctcgat caggttgcgg 11820
tagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgc cccgcctcct ccttcaaatc gtactccggc 11880
aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga acttcttgaa ctctccggcg 11940
ctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaac aaccatctgg cttctgcctt gcctgcggcg 12000
cggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccg atgccgggat cgatcaaaaa gtaatcgggg 12060
tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct cgcggtacat ccaatcagct 12120
agctcgatct cgatgtactc cggccgcccg gtttcgctct ttacgatctt gtagcggcta 12180
atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt tcttggcctt cttcgtacgc 12240
tgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccga atgcaggttt ctaccaggtc gtctttctgc 12300
tttccgccat cggctcgccg gcagaacttg agtacgtccg caacgtgtgg acggaacacg 12360
cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca tggattcggt tagatgggaa 12420
accgccatca gtaccaggtc gtaatcccac acactggcca tgccggccgg ccctgcggaa 12480
acctctacgt gcccgtctgg aagctcgtag cggatcacct cgccagctcg tcggtcacgc 12540
ttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatg atgctgcgac tatcgcgggt gcccacgtca 12600
tagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgc tcgtcgccct tgggcggctt cctaatcgac 12660
ggcgcaccgg ctgccggcgg ttgccgggat tctttgcgga ttcgatcagc ggccgcttgc 12720
cacgattcac cggggcgtgc ttctgcctcg atgcgttgcc gctgggcggc ctgcgcggcc 12780
ttcaacttct ccaccaggtc atcacccagc gccgcgccga tttgtaccgg gccggatggt 12840
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aggcaaccca gccgcttacg cctggccaac cgcccgttcc tccacacatg gggcattcca 12960
cggcgtcggt gcctggttgt tcttgatttt ccatgccgcc tcctttagcc gctaaaattc 13020
atctactcat ttattcattt gctcatttac tctggtagct gcgcgatgta ttcagatagc 13080
agctcggtaa tggtcttgcc ttggcgtacc gcgtacatct tcagcttggt gtgatcctcc 13140
gccggcaact gaaagttgac ccgcttcatg gctggcgtgt ctgccaggct ggccaacgtt 13200
gcagccttgc tgctgcgtgc gctcggacgg ccggcactta gcgtgtttgt gcttttgctc 13260
attttctctt tacctcatta actcaaatga gttttgattt aatttcagcg gccagcgcct 13320
ggacctcgcg ggcagcgtcg ccctcgggtt ctgattcaag aacggttgtg ccggcggcgg 13380
cagtgcctgg gtagctcacg cgctgcgtga tacgggactc aagaatgggc agctcgtacc 13440
cggccagcgc ctcggcaacc tcaccgccga tgcgcgtgcc tttgatcgcc cgcgacacga 13500
caaaggccgc ttgtagcctt ccatccgtga cctcaatgcg ctgcttaacc agctccacca 13560
ggtcggcggt ggcccatatg tcgtaagggc ttggctgcac cggaatcagc acgaagtcgg 13620
ctgccttgat cgcggacaca gccaagtccg ccgcctgggg cgctccgtcg atcactacga 13680
agtcgcgccg gccgatggcc ttcacgtcgc ggtcaatcgt cgggcggtcg atgccgacaa 13740
cggttagcgg ttgatcttcc cgcacggccg cccaatcgcg ggcactgccc tggggatcgg 13800
aatcgactaa cagaacatcg gccccggcga gttgcagggc gcgggctaga tgggttgcga 13860
tggtcgtctt gcctgacccg cctttctggt taagtacagc gataaccttc atgcgttccc 13920
cttgcgtatt tgtttattta ctcatcgcat catatacgca gcgaccgcat gacgcaagct 13980
gttttactca aatacacatc acctttttag acggcggcgc tcggtttctt cagcggccaa 14040
gctggccggc caggccgcca gcttggcatc agacaaaccg gccaggattt catgcagccg 14100
cacggttgag acgtgcgcgg gcggctcgaa cacgtacccg gccgcgatca tctccgcctc 14160
gatctcttcg gtaatgaaaa acggttcgtc ctggccgtcc tggtgcggtt tcatgcttgt 14220
tcctcttggc gttcattctc ggcggccgcc agggcgtcgg cctcggtcaa tgcgtcctca 14280
cggaaggcac cgcgccgcct ggcctcggtg ggcgtcactt cctcgctgcg ctcaagtgcg 14340
cggtacaggg tcgagcgatg cacgccaagc agtgcagccg cctctttcac ggtgcggcct 14400
tcctggtcga tcagctcgcg ggcgtgcgcg atctgtgccg gggtgagggt agggcggggg 14460
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cgctcggcaa tgtccagtag gtcgcgggtg ctgcgggcca ggcggtctag cctggtcact 14700
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cgttggttgg tcaagtcctg gtcgtcggtg ctgacgcggg catagcccag caggccagcg 14880
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cgactaaaac acgcgacaag aaaacgccag gaaaagggca gggcggcagc ctgtcgcgta 15000
acttaggact tgtgcgacat gtcgttttca gaagacggct gcactgaacg tcagaagccg 15060
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ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt ttcacgccct tttaaatatc 15180
cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc gccaatatat cctgtcaaac 15240
actgatagtt taattcccga tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct 15300
agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa 15360
tcataaaaac ccatctcata aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa 15420
cgtaattcaa cagaaattat atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta 15480
agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat cggggaaatt cgagctggtc acctgtaatt 15540
cacacgtggt ggtggtggtg gtggctagcg ttaacactag tcagatctac catggtggac 15600
tcctctt 15607

Claims (4)

1.一种香橼的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：将用于基因编辑的Cas9质粒转入发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)K599的感受态细胞中，挑取阳性菌株经培养后提取菌体，利用MES浸润液重悬所述菌体至OD600值为0.6-1.0，于黑暗条件下放置3h，得介导液；
将香橼的枝条底部完全浸入所述介导液中并真空浸润10-30min，得浸润枝条；
将所述浸润枝条扦插后生根，得遗传转化香橼植株；
所述枝条的长度为8～12cm，并携带1～2片叶，每片叶保留1/3面积；所述扦插的基质包括蛭石，并保持温度26～30℃；
在所述生根后，还包括对生根植株进行遗传转化的检测。
2.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，所述Cas9质粒包括1380-Cas9-HA，所述1380-Cas9-HA的核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示。
3.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，所述阳性菌株包括经Kana和Str两种抗生素筛选、菌液PCR和测序均显示阳性的菌株。
4.根据权利要求1或3所述遗传转化方法，其特征在于，所述阳性菌株的培养包括在包含50mg/LKana和50mg/L Str的TY培养基上进行培养。
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