JP2009516524A - 花茎組織を用いたハクサイの形質転換体の製造方法及びそれから生産される軟腐病抵抗性の向上した形質転換体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の他の目的は、前記方法によって製造される軟腐病抵抗性の向上したハクサイの形質転換体を提供するところにある。
外来遺伝子を導入するために、本発明の実施例で使用した微生物は、アグロバクテリウム属菌株であり、効率に応じて他の菌株を使用することができる。
ハクサイの花茎組織を用いたハクサイの形質転換体を製造するために、まず、形質転換のためのベクターを構築し、それをアグロバクテリウム属菌株に導入した後、ハクサイの花茎組織に感染させて組織培養し、その形質転換率を調査した。
形質転換のためのベクターの構築
ハクサイのJ3−11M−54系のPGIP2遺伝子を植物形質転換用のベクターであるpCAMBIA2300に、BamHI、KpnIサイトを用いて導入させた後、それをアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404に導入してハクサイの形質転換に利用した。
図1は、バイナリーベクターpCAMBIA2300−BcPGIP2のT−DNA部位を示す図である。このとき、nptIIは、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼII(Neomycin phosphotransferase II)を示し、35SProは、CaMV 35Sプロモーターを示し、NOSは、ノパリンシンターゼ遺伝子ターミネータ(Nopaline synthase gene terminator)を示す。
中央大学校の植物応用科学科の園芸作物品質実験室で育成して保有しているJ3−11M−3系、J3−11M−44系及びJ3−11M−54系において、BcPGIP2遺伝子の発現を通じて軟腐病抵抗性を向上させるためにハクサイを形質転換した。形質転換のための組織培養は、ハクサイの花茎組織を用いた。J3−11M−3系、J3−11M−44系及びJ3−11M−54系を種まきしてから4週目になった幼苗を4℃で4週間ないし6週間低温処理して、温室で栽培して抽台させた。抽台した花茎の幼組織を5mmの円筒形の切片に切って、70%のEtOHで30秒間消毒した。その後、滅菌水で1回洗浄し、1%の次亜塩素酸ナトリウム(sodium hypochloride)溶液に10分間浸漬した後、滅菌水で3回洗浄した。
前記実施例1で製造されたハクサイの形質転換体にnptII及びBcPGIP2が導入されたか否かを確認するために、PCR及びDNAゲルブロットを行った。
J3−11M−44系の花茎組織の切片にアグロバクテリウムを接種して再分化された個体を発根させた後、ビニール鉢に移植するとき、切り出した個体別の葉組織0.1gを、液体窒素及びすり鉢を用いて磨砕した後、DNeasyプラント・ミニ・キット(DNeasy Plant mini kit 、キアゲン社製)を用いてゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAは、分光光度計(spectrophotometer)で定量した後、それを保管してPCR分析に使用した。
PCRの結果、nptIIの導入を確認することができた(図3)。
J3−11M−44系から再分化された形質転換個体のDNAゲルブロット分析のために、温室で栽培されている個体の葉を採取した後、それぞれ200mgの試料を液体窒素及びすり鉢を用いて磨碎した後、65℃に予熱した抽出用の緩衝液(1.25% SDS、0.1M Tris−HCl、0.5M NaCl、0.05M EDTA、0.38%の重亜硫酸ナトリウム(sodium bisufite)、pH 8.0)700ulを加えて、65℃で20分間混合して反応させた。反応後700ulのフェノール:クロロホルム(1:1=v:v)溶液を添加して10分間ゆっくり混合した後、15℃、13,000rpmで10分間遠心分離した。上澄み液を分離して、2ulのRNase(10mg/mL)を加えて常温で10分間反応させた。反応液と同量の−20℃のEtOHを添加してゆっくり混合した後、−20℃で沈澱させた。沈澱されたDNAをパスツール・ピペットを用いて新たな1.5mLのチューブに移した後、70%のEtOHで2回洗浄した。洗浄後に乾燥させて、TE(10m MTris−Cl pH 8.0、1m MEDTA)緩衝液に懸濁して、対照群DNAと電気泳動して定量した後、それを保管してDNAゲルブロットに利用した。
ハクサイの形質転換体T0−6、T0−10、T0−12、T0−15、T0−16、T0−17、T0−20、T0−21に導入されたnptII及びBcPGIP2の発現を確認するために、得られた個体の葉を採取して、RNeasyプラント・ミニ・キット(RNeasy Plant mini kit 、キアゲン社製)で総RNAを分離した後、分光光度計で定量した。5μgの総RNAにおいて、スーパースクリプト・ファースト‐ストランド合成キット(Superscript 1st-Strand Synthesis Kit 、米国インビトロジェン社製)を用いて合成した第1次cDNA鎖(1st strand cDNA)を鋳型として、RT−PCRを行った。nptIIの発現確認のためのRT−PCRは、実験例1の方法によって行い、BcPGIP2の発現確認のために使用したRT−PCRのプライマーは、次の通りである:
(forward): 5'-AGTCGGATCCATGGGTAAGACAACGACACTGCTTTTG-3'
(reverse): 5'-GGCTGCGGTACCCTTTTACTTGCAACTATCAAGAG-3'
(forward): 5'-ATGACATGGAGAAGATCTGG-3'
(reverse): 5'-TGAGCTTGTTTTGGAAGTCT-3'
図5及び図6に示すように、nptII及びBcPGIP2が正常に発現されていることを確認することができた。
前記実施例1で形質転換されたハクサイの軟腐病に対する抵抗性を測定するために、PCR及びDNAゲルブロット及びRT−PCRを実施して、BcPGIP2遺伝子の導入及び発現を確認し、定植してから60日目になったJ3−11M−44系の形質転換ハクサイ及び野生型の葉を採取して、軟腐病に対する罹病性を調査した。葉基部接種方法(point inoculation method, Park et al., 2004)によって軟腐病原菌を1.2x105cfu/μl接種した後、6時間間隔で0、6、12、18、24、30、36時間に病斑の進展程度を調査し、その結果を図7に示した。図7Aの結果は、4個の反復区(replicates)の平均±標準偏差で示したグラフである。図7Bは、接種後12時間目のハクサイ葉を示す写真である。
Claims (3)
- ハクサイの形質転換体の製造方法であって、
外来遺伝子の導入された植物形質転換用のベクターを含む微生物を、ハクサイの花茎組織に感染させて組織培養するステップを含むことを特徴とする、前記製造方法。 - ハクサイの形質転換体の製造方法であって、
BcPGIP2(Polygalacturonase-inhibiting protein 2)遺伝子の導入された植物形質転換用のベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404菌株を、ハクサイの花茎組織に感染させて組織培養するステップを含むことを特徴とする、請求項1に記載のハクサイの形質転換体の製造方法。 - 請求項2に記載の方法によって製造される軟腐病抵抗性の向上したハクサイの形質転換体。
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