KR100819878B1

KR100819878B1 - 화경조직을 이용한 배추의 형질전환체 제조방법 및이로부터 생산되는 무름병 저항성이 증진된 형질전환체

Info

Publication number: KR100819878B1
Application number: KR1020070063268A
Authority: KR
Inventors: 김종기; 황병호; 이수성
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2007-06-26
Filing date: 2007-06-26
Publication date: 2008-04-08
Also published as: KR20070073715A

Abstract

본 발명은 화경조직을 이용한 배추의 형질전환체 제조방법 및 이로부터 생산되는 무름병 저항성이 증진된 형질전환체에 관한 것으로, 화경조직을 이용하여 배추의 형질전환을 수행한 결과, 형질전환율이 2.8%로, 기존의 자엽과 배축을 이용하는 방법의 0.4~0.8%에 비해 그 효율을 2배 이상 향상시키는 효과가 있다. 본 발명의 화경조직을 이용한 형질전환 방법을 배추 이외의 식물의 형질전환에 적용한다면, 기존의 방법보다 고효율의 식물형질전환시스템을 구축할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명은 상기의 형질전환방법에 따라 배추를 형질전환시킴으로써 무름병 저항성이 증진된 배추 형질전환체를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

화경조직, 배추, 형질전환체, 무름병

Description

화경조직을 이용한 배추의 형질전환체 제조방법 및 이로부터 생산되는 무름병 저항성이 증진된 형질전환체{A method for producing Chinese cabbage transformant using tissues of flower stalk and a transformant with promoted soft rot resistance obtained from the method}

도 1은 이원벡터 pCAMBIA2300-BcPGIP2의 T-DNA 부위를 도시하고 있다.

도 2는 배추의 배양된 화경조직 절편에서 형성된 부정 신초(adventitious shoot)와 형질전환된 식물의 재분화를 도시하고 있다.

도 3은 배추 형질전환체에서 nptII 유전자 확인을 위한 PCR 증폭 산물의 아가로우즈 젤 전기영동 결과를 나타내는 사진도이다.

도 4는 T₀ 형질전환체 식물에서 nptII 유전자 단편을 이용하여 게놈 DNA를 추적한 서던 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 형질전환체 식물에서 RT-PCR을 이용하여 nptII 유전자 발현을 탐지한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 형질전환체 식물에서 BcPGIP2 유전자 발현을 탐지한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 야생형과 형질전환체 배추에서 무름병 정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 화경조직을 이용한 배추의 형질전환체 제조방법 및 이로부터 생산되는 무름병 저항성이 증진된 형질전환체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 배추의 화경조직에 외래 유전자를 도입하여 조직배양하여 형질전환체를 얻는 방법과 외래 유전자로서 무름병 저항성과 관련된 유전자를 도입함으로써 무름병 저항성이 증진된 형질전환체를 제공함에 관한 것이다.

배추는 서늘한 기후를 선호하는 호냉성 채소로 우리나라에서 김치의 주재료로써 가장 중요한 채소작물이고, 연평균 채소 소비량의 25%를 차지하며(Ministry of Agriculture and Forest, 2002) 재배역사가 길고 전국적으로 널리 재배되고 있다.

배추의 구성성분은 대부분이 수분이고 칼슘, 비타민C가 풍부한 잎을 식용부위로 하는 엽채류이며, 생육 적온이 18~22℃인 비교적 서늘한 기후를 좋아하는 호냉성 채소이기 때문에 내서성이 약하고 약광 하에서도 생육이 잘되며 근군은 넓게 분포한다. 형태적으로 잎차례(葉序)는 2/5이고 나선형으로 착생되며, 줄기는 단축되어 로젯트 모양이며, 자가불화합성이 있어 타가수정을 하며 자식열세와 잡종강세로 나타난다.

기존의 배추품종개량은 주로 F1 잡종강세를 이용한 전형적인 교잡육종에 의 하여 이루어지고 있으나 이용할 수 있는 유전자원이 한정적이기 때문에 품종개량의 폭을 넓히는데 있어서 한계에 부딪히고 있다. 최근 조직배양 및 유전공학 기술의 발전으로 이를 극복하기 위한 기술 개발이 시도되고 있다.

조직배양 기술은 우량 개체를 선발하거나 특수한 형질을 가진 개체가 발견되었을 경우, 그 개체를 유지하고 증식시키는 데 그 목적이 있다. 최근에는 다양한 식물형질전환 기술들이 개발되어 식물체의 형질전환을 통한 신품종 개발이 활발히 이루어지고 있으나 낮은 재분화율이 개선되어야 할 과제로 남아있다. 따라서 식물형질전환 기술을 효과적으로 이용하기 위해 재분화율이 높은 조직배양 기술의 확립이 요구된다.

식물의 형질전환은 담배에서 최초로 성공하였으며, 이후 특정유전자의 기능 구명을 위한 매우 강력한 방법으로 이용되어 왔을 뿐만 아니라 유용한 유전자를 식물체 내로 도입하여 새로운 형질의 작물을 개발하기 위한 방법으로 이용되고 있다. 식물체 내로 유용한 유전자를 도입하는 형질전환 기술에는 일렉트로포레이션(electroporation), 다이렉트 진 트랜스퍼(direct gene transfer), 마이크로-인젝션(micro-injection), 조직 인젝션(tissue injection), PEG, Ca⁺², 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용한 방법 등이 개발되었으며, 유용 유전자가 도입된 세포의 선발과 식물체 재분화 과정을 거친 후 형질전환식물체를 획득할 수 있다.

특히, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 를 이용한 식물형질전환 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium) 이 자신의 DNA 일부를 식물에 전이시키는 기작을 이용한 것으로 유용 유전자를 가장 안정적으로 전이시키는 방법으로 알려져 있으며, 유전학적, 생화학적, 발생학적, 생리학적 기초연구 및 실제 농업에의 응용 등 식물분야 연구 전반에 걸쳐 광범위하게 사용되고 있다. 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 와 아그로박테리움 리조게네스(A. rhizogenes) 는 그람음성 토양미생물들로 식물조직의 상처부위에 감염하여 자신의 유전자를 식물로 형질전환시켜 근두암종병(crown gall)이나 모상근(hairy root) 등과 같은 암조직을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 아그로박테리움 튜머파시엔스(A. tumefaciens) 와 아그로박테리움 리조게네스(A. rhizogenes) 에 의해 유도되는 형질전환시스템은 그 미생물들이 가지고 있는 플라스미드에 기인한 것으로 아그로박테리움 튜머파시엔스(A. tumefaciens) 의 경우는 Ti(tumor inducing) 플라스미드에 의하며, 아그로박테리움 리조게네스(A. rhizogenes) 의 경우에는 Ri(root inducing) 플라스미드에 의한 것이다. 이러한 Ti 또는 Ri 플라스미드에 의한 암조직 유발은 미생물이 지니고 있는 Ti 플라스미드에 존재하는 특정 DNA 단편(T-DNA)이 식물세포에 전이됨으로 인해 발생하며, T-DNA(transfer DNA)의 전이는 Ti 플라스미드에 위치한 병원성유전자(vir genes) 들의 발현에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다.

유용 유전자를 식물체 내로 안정적으로 전이시키기 위해서는 비교적 효율이 높은 형질전환 방법의 확립이 무엇보다 중요하다. 또한 아그로박테리움(Agrobacterium) 을 이용한 형질전환의 경우에는 식물의 조직절편으로부터 재분화 능력이 높은 조직배양체계의 확립이 형질전환 효율 향상에 가장 큰 영향을 미치 는 요인 중 하나로 알려져 있다.

브라시카속(Brassica) 식물 중에서 아그로박테리움 벡터를 이용한 형질전환은 유채(B. napus)에서 가장 많이 연구되고 있는데, 형질전환에 이용되는 식물조직은 줄기, 절편조직, 표피조직, 배축, 화분 유래의 배, 자엽 등 여러 가지 조직부위가 사용되고 있다. 또한 양배추(B. oleracea), 겨자(B. juncea), 브라시카 카리나타(B. carinata), 브라시카 니그라(B. nigra) 등에서도 형질전환체를 얻었다고 보고된바 있으나, 배추(B. campestris) 의 형질전환은 다른 브라시카속 식물에 비하여 그 연구 성과가 상대적으로 매우 낮은 실정이다. 브라시카 캠페스트리스 버라이어티 파라(B. campestris var. para) 의 뿌리에 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 를 감염시켜 모상근이 발생하는 것을 처음으로 관찰한 이후 다나카(Tanaka) 등(1985)과 파스쯔코우스키(Paszkowski) 등(1986)은 브라시카 캠페스트리스 버라이어티 라파(B. campestris var. rapa) 의 잎 원형질체에 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유전자를 직접 형질전환하여 유전자가 삽입된 식물체를 얻는 데 성공하였다고 보고한 바 있고, 올손(Ohlsson)과 에릭손(Eriksson)(1988)은 브라시카 캠페스트리스 버라이어티 올레이페라(B. campestris var. oleifera) 의 배축 유래 원형질체에 아그로박테리움을 감염시켜 카나마이신 저항성 캘러스를 얻었다고 보고하였으나 형질전환된 식물체를 얻지는 못하였다. 배추(B. campestris) 에서 형질전환식물체를 얻은 예는 무코파디야이(Mukhopadhyay) 등(1992)은 브라시카 캠페스트리스 버라이어티 사손(B. campestris var. sarson) 의 배축에 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II 유전 자(neomycin phosphotransferaseⅡ gene, NPTⅡ gene)와 베타 글루쿠로니다아제-인트론 유전자(β-glucuronidase-intron gene)를 가지고 있는 아그로박테리움을 감염시킨 결과 위의 유전자가 들어간 배추형질전환체를 얻는데 성공하였으며, 준(June) 등이 브라시카 캠페스트리스 서브스페시스 페키넨시스(B. campestris ssp. pekinensis) 의 자엽을 아그로박테리움에 감염시켜 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus)의 외각 단백질 유전자(coat protein gene)와 NPTⅡ 유전자가 함유된 7개의 형질전환식물체를 획득한 것이 성공적인 형질전환의 예이다. 이와 같이 배추에 외래 유전자를 형질전환시켜 새로운 형질을 가진 재분화 식물체를 획득한 예는 다른 브라시카속 식물에 비해 그 연구성과가 매우 미흡한 실정이다.

배추의 조직배양은 배추의 자엽, 배축, 약, 엽절편 등을 이용한 조직배양을 통해 재분화 식물체를 획득하였다는 보고 등이 있으나 다른 브라시카속 식물에 비해 효율이 매우 낮은 것으로 알려져 왔으며 이에 대한 연구가 미미한 실정이다. 최근에는 배지 조성, 식물생장조절제의 조성, 배지 내 AgNO₃ 첨가 등과 같이 배양효율을 개선하기 위한 연구들이 이루어지고 있다.

기존의 배추 형질전환은 자엽과 배축조직을 이용하는 방법이 주로 이용되어 왔으나, 그 효율이 낮아 본 발명자들은 이를 개선하기 위하여 조직 채취가 용이하고 치상 방법이 간단한 화경조직을 이용하여 배추의 형질전환을 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 배추의 화경조직을 이용하여 형질전환율이 높은 보다 개선된 배추의 형질전환체 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조되는 무름병 저항성이 증진된 배추 형질전환체를 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 무름병 저항성에 관련된 유전자를 형질전환용 벡터에 도입하여 아그로박테리움속 균주에 도입하고, 배추 무름병 저항성을 증진시키기 위해 배추의 화경조직에 상기 균주를 감염시키고, 상기 화경조직을 조직배양하여 재분화시켜 형질전환율을 조사하고, 상기 재분화된 형질전환체의 잎 조직에서 게놈 DNA를 추출하여 PCR, DNA 젤 블랏 및 RT-PCR을 통해 배추의 형질전환 여부를 확인하고, 형질전환된 배추에서 무름병 저항성을 조사함으로써 달성하였다.

본 발명은 형질전환을 위한 벡터 구축 및 아그로박테리움속 균주로의 도입단계; 배추의 화경조직에 상기 균주를 감염시키는 단계; 상기 화경조직의 조직배양단계; 상기 재분화된 형질전환체의 잎 조직에서 게놈 DNA를 추출하여 PCR, DNA 젤 블랏 및 RT-PCR을 통해 배추의 형질전환 여부를 확인하는 단계; 및 형질전환된 배추의 무름병 저항성 조사단계로 구성된다.

*본 발명은 외래 유전자가 도입된 식물형질전환용 벡터를 포함하는 미생물을 배추의 화경조직에 감염시켜 조직배양하는 단계를 포함하는 배추의 형질전환체 제조방법을 제공하는 특징이 있다.

본 발명의 배추의 형질전환체 제조방법에서 사용한 상기 외래유전자는 무름 병 저항성 증진을 위한 BcPGIP2(Polygalacturonase-inhibiting protein 2) 유전자이나 필요와 목적에 따라 다른 유전자를 도입할 수 있다.

외래유전자를 도입하기 위해 본 발명의 실시예에서 사용한 미생물은 아그로박테리움속(Agrobacterium) 균주이며, 효율에 따라 다른 균주를 사용할 수 있다.

본 발명은 외래 유전자로서 무름병 저항성에 관련된 유전자를 도입하여 상기 배추 형질전환체 제조방법에 따라 제조된 무름병 저항성이 증진된 배추 형질전환체를 제공하는 특징이 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용은 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 화경조직을 이용한 배추 형질전환체 제조

배추의 화경조직을 이용한 배추의 형질전환체를 제조하기 위해, 우선 형질전환을 위한 벡터를 구축하고, 이를 아그로박테리움속 균주에 도입한 다음, 배추의 화경조직에 감염시켜 조직배양하여 형질전환율을 조사하였다.

*형질전환을 위한 벡터 구축

배추의 J3-11M-54 계통의 PGIP2 유전자를 식물형질전환용 벡터인 pCAMBIA2300에 BamHⅠ, KpnⅠ사이트를 이용하여 도입시킨 후, 이를 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 도입하여 배추의 형질전환에 이용하였다.

J3-11M-54 계통의 BcPGIP2를 식물형질전환용 벡터인 pCAMBIA2300에 BamHⅠ, KpnⅠ site를 이용하여 도입시킨 후, 이를 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 도입하여 담배와 배추의 형질전환에 이용하였다(도 1).

도 1은 이원벡터 pCAMBIA2300-BcPGIP2의 T-DNA 부위를 도시하고 있다. 이때, NPTII는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II(Neomycin phosphotransferase II), 35S Pro는 CaMV 35S 프로모터, NOS는 노팔린 신타아제 유전자 터미네이터(Nopaline synthase gene terminator)를 나타낸다.

배추의 형질전환 ( J3 -11M-44 계통 이외의 기존의 불리한 증거는 모두 삭제하 였사오니 확인하여 주시기 바랍니다.)

중앙대학교 식물응용과학과 원예작물품질 실험실에서 육성하여 보유하고 있는 J3-11M-44 계통에서 BcPGIP2 유전자 발현을 통해 무름병 저항성을 증진시키기 위해 배추를 형질전환하였다. 형질전환을 위한 조직배양은 배추의 화경조직을 이용하였다. J3-11M-44 계통의 파종 후 4주된 유묘를 4℃에서 4~6주간 저온처리하여 온실에서 재배하며 추대시켰다. 추대한 화경의 유조직을 5mm의 원통형 절편으로 잘라내어 70% EtOH로 30초간 소독한 후, 멸균수 1회 세척, 1% 소듐 하이포클로라이드(sodium hypochloride) 용액에 10분간 침지 후 멸균수로 3회 세척하였다. 멸균된 화경조직 절편을 36시간 진탕배양한 아그로박테리움(Agrobacterium) 배양액에 10분 간 침지시킨 후, 멸균된 여과지(filter papers)에서 배양액을 제거하였다. 접종이 끝난 절편은 공동배양 배지인 BI배지(MS 배지 4.4g/L, NAA 1.0mg/L, BAP 4.0mg/L, AgNO₃4.0mg/L, 파이토-아가(Phyto-agar) 8g/L, pH 5.7)에 치상 한 후 28℃ 암 조건 하에서 72시간 동안 공동배양 하였다. 72시간 동안 공동배양 후 절편 조직을 세척(Washing)배지(MS 배지 4.4g/L, NAA 1.0mg/L, BAP 4.0mg/L, 세포탁심(Cefotaxime) 200mg/L, pH 5.7)로 5분간 3회 세척하고 멸균수로 3회 세척한 후, 여과지에서 멸균수를 제거하였다. 세척이 끝난 절편은 선택배지(MS 배지 4.4g/L, 슈크로우즈 30g/L, 파이토-아가 8g/L, AgNO₃ 4.0mg/L, NAA 1.0mg/L, BAP 4.0mg/L, KM 25mg/L, 세포탁심 200mg/L, pH 5.7)에서 신초가 형성될 때까지 23℃의 온도 조건, 16시간 광조건, 8시간의 암조건에서 배양하였다. 15일 간격으로 계대배양을 실시하였으며, J3-11M-44에서 형성된 캘러스 조직을 잘라 4~6회 계대배양을 실시한 후, 카나마이신 농도를 낮춘 선택배지(MS 배지 4.4g/L, 슈크로우즈 30g/L, 파이토-아가 8g/L, AgNO₃ 4.0mg/L, NAA 1.0mg/L, BAP 4.0mg/L, KM 10mg/L, 세포탁심 200mg/L, pH 5.7)에서 4~6회 계대배양을 실시하였다. 신초가 형성되었을 때, 발근(rooting) 배지(MS 배지 4.4g/L, 슈크로우즈 30g/L, 파이토-아가 8g/L, AgNO₃ 4.0mg/L, 세포탁심 200mg/L, pH 5.7)로 이식하여 발근을 유도하였으며, 완전한 유식물체로 분화시켰다. 2~3주 후 발근된 유식물체를 무균상에서 멸균된 상토가 담긴 직경 7cm의 비닐화분에 이식한 후, 습도유지를 위해 비닐랩으로 덮개를 씌워 23℃의 온도 조건, 16시간 광조건, 8시간의 암조건에서 5~7일간 두었다. 지상부의 생육 이 정상적으로 진행되는 것을 확인하여 뿌리 활착을 점검한 후 직경 25cm 화분에 정식하여 온실에서 재배하며 실험에 이용하였다.

배추 J3-11M-44 계통의 화경조직 절편을 3회에 걸쳐 782개 조직을 형질전환 아그로박테리움을 이용하여 접종시킨 결과, J3-11M-44 계통에서 형성된 캘러스를 15일 간격으로 4~6회 선택배지에서 계대배양하는 동안 연녹색의 상태를 유지하며 부피생장을 지속적으로 하였으나, 신초가 유도되지는 않았다. 이후 선택배지의 카나마이신 농도를 10mg/L로 낮추어 15일 간격으로 4~5회 계대배양을 실시하는 동안 캘러스로부터 신초가 유도되었다. 신초를 발근배지로 이식하여 발근을 유도하였으며, 완전한 유식물체로 분화시켰다. 2~3주 후 발근된 유식물체를 각각 명명하여 T₀-1, T₀-2, T₀-3, T₀-4, T₀-6, T₀-8, T₀-9, T₀-10, T₀-11, T₀-12, T₀-15, T₀-16, T₀-17, T₀-19, T₀-20, T₀-21, T₀-31, T₀-34, T₀-36, T₀-37, T₀-38, T₀-39를 순화시켜 온실에서 재배하며 실험에 이용하였다. 그 결과를 표 1과 도 2에 나타내었다. 특히, 도 2는 배추의 배양된 화경조직 절편에서 형성된 부정 신초(adventitious shoot)와 형질전환된 식물의 재분화를 도시하고 있다. 이때, A는 배양 5 내지 6주 후 절편에서 형성된 신초를, B는 발근 동안 배지에 옮긴 신초를, C는 형질전환 유식물체를, D는 화아(flower bud)가 형성된 형질전환 식물체를 나타낸다.

표 1과 도 2에 나타난 바와 같이, 신초는 총 52개체가 유도되었고, 이중 39개체가 발근되었으며 22개체가 순화되었다. 즉, 형질전환율이 2.8%로, 기존의 자엽과 배축을 이용하는 방법의 0.4~0.8%에 비해 그 효율을 2배 이상 향상시킬 수 있었 다.

배추 계통에서 캘러스 유도 및 재분화율

계통	감염 절편의 수(A)	캘러스형성절편의 수(B)	신초형성절편의 수(C)	형질전환유식물체의 수(D)	빈도(%)
					B/A	C/A	D/A
J3-11M-44	782	375	52	22	48.0	6.6	2.8

실시예 2: 배추의 형질전환체의 외래 유전자 도입 여부 확인

상기 실시예 1에서 제조된 배추 형질전환체의 nptⅡ 및 BcPGIP2 도입 여부를 확인하기 위하여 PCR 및 DNA 젤 블랏을 수행하였다.

실험예 1: PCR 분석을 통한 nptII 유전자의 도입 여부 확인

J3-11M-44 계통의 화경조직 절편에 아그로박테리움을 접종하여 재분화된 개체를 발근시킨 후 비닐 화분으로 이식할 때 잘라낸 개체별 잎 조직 0.1g을 액체질소와 막자사발을 이용하여 마쇄한 후, DNeasy 플랜트 미니 키트(DNeasy Plant mini kit, 큐아젠사 제품)을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 추출한 게놈 DNA는 분광광도계(spectrophotometer)로 정량한 후 보관하며 PCR분석에 사용하였다.

형질전환된 배추에 BcPGIP2와 함께 도입된 카나마이신 저항성 유전자인 nptⅡ 유전자의 도입 여부를 검증하기 위하여 PCR을 수행하였다. 상기에서 추출한 게놈 DNA 100ng을 주형으로 하고 AccuPower PCR premix(바이오니아사 제품)를 이용하여 PCR을 수행하였다. nptⅡ (forward)5'-ATGGGGATTGAACAAGATGGATTGC-3'와 (reverse)5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAG-3' 프라이머로 94℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성 시킨 후, 94℃에서 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분 조건으로 30 사이클을 반복수행 하였으며, 최종적으로 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 용액을 1.2% 아가로우즈 젤에 전기영동을 실시하여 798bp 크기의 DNA 단편을 확인하고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 M은 1kb 플러스 DNA 래더, 레인 1은 대조 식물체에서 얻은 증폭 산물을, 레인 2 내지 15는 형질전환체에서 얻은 증폭 산물을 나타낸다. 특히, 레인 2;T₀-1, 레인 3;T₀-2, 레인 4;T₀-3, 레인 5;T₀-4, 레인 6;T₀-6, 레인 7;T₀-8, 레인 8;T₀-9, 레인 9;T₀-10, 레인 10;T₀-11, 레인 11;T₀-12, 레인 12;T0-15, 레인 13;T₀-16, 레인 14;T₀-17, 레인 15;T₀-19를 나타내고, P는 양성대조군(벡터 pCAMBIA 2300-BcPGIP2)를 나타낸다.

PCR 결과, nptⅡ의 도입을 확인할 수 있었다(도 3).

실험예 2: DNA 젤 블랏을 이용한 nptII 의 도입 확인

J3-11M-44 계통으로부터 재분화된 형질전환 개체들의 DNA 젤 블랏 분석을 위해 온실에서 재배되고 있는 개체들의 잎을 채취한 후, 각각 200mg의 시료를 액체질소와 막자 사발을 이용하여 마쇄한 후, 65℃로 예열한 추출용 완충액(1.25% SDS, 0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl, 0.05M EDTA, 0.38% 소듐바이설파이트(sodiumbisufite), pH 8.0)을 700㎕ 가하여 65℃에서 20분간 혼합하여 반응시켰다. 반응 후 700㎕의 페놀:클로로포름(1:1=v:v) 용액을 첨가하여 10분간 천천히 섞어준 후, 15℃, 13,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 분리하여 2㎕의 RNase(10mg/mL)를 가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응액과 동량의 -20℃ EtOH를 첨가해 천천히 혼합한 후 -20℃에서 침전시켰다. 침전된 DNA를 파스퇴르 파이펫을 이용하여 새로운 1.5mL 튜브로 옮긴 후 70% EtOH로 2회 세척하였다. 세척 후 건조하여 TE(10mM Tris-Cl pH 8.0, 1mM EDTA) 완충액에 현탁하여 대조군 DNA와 전기영동하여 정량한 후 보관하며 DNA 젤 블랏에 이용하였다.

게놈 DNA 10㎍을 BamHⅠ과 Xho Ⅰ로 절단한 후, 1.0% 아가로우즈 젤에서 30V 전압으로 16시간 전기영동하였다. 전개된 DNA를 확인한 후 0.25N HCl 용액으로 10분간 탈퓨린화(depurination)하고 알칼라인 트랜스퍼(alkaline transfer) 방법으로 나일론 멤브레인(nylon membrane)에 하룻밤 전이시켰다. DNA 전이 여부는 블랏팅시킨 젤을 EtBr로 염색하여 확인하였다. nptⅡ 프로브는 벡터 플라스미드 DNA를 주형으로하고, 상기 실험예 1의 방법에 따라 PCR을 수행하여 생성된 DNA 단편을 BcaBest 라벨링 키트(BcaBest labelling kit, 다카라사 제품)을 이용하여 준비하였고, 65℃에서 24시간 동안 혼성화 시켰다. 0.1×SSC, 1%SDS 용액으로 65℃에서 30분간 최종 세척 후 X-선 필름에 감광시키고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 M은 람다 DNA/HindⅢ, C는 야생형 대조군 J3-11M-44을, 레인 1 내지 19는 형질전환체 식물을 나타낸다. 특히, 레인 1;T₀-1, 레인 2;T₀-2, 레인 3;T₀-3, 레인 4;T₀-6, 레인 5;T₀-8, 레인 6;T₀-9, 레인 7;T₀-10, 레인 8;T₀-11, 레인 9;T₀-12, 레인 10;T₀-15, 레인 11;T₀-16, 레인 12;T₀-17,레인 13;T₀-19,레인 14;T₀-20, 레인 15;T₀-21, 레인 16;T₀-34, 레인 17;T₀-36, 레인 18;T₀-38, 레인 19;T₀-39를 나타낸다. 또한, B는 BamHⅠ로 절단한 샘플을, X는 XbaⅠ로 절단한 샘플을 나타낸다.

도 4에 나타난 바와 같이, nptⅡ 유전자 도입이 확인되었고, T₀-1, T₀-2, T₀-3, T₀-20이 같은 밴드 패턴을 보였고, T₀-6, T₀-8, T₀-9, T₀-10, T₀-11, T₀-12, T₀-15, T₀-16, T₀-17, T₀-21, T₀-34, T₀-36, T₀-38, T₀-39가 같은 밴드 패턴을 보였다. 이러한 결과는 유전자 삽입시 두 형태의 유전자 재조합이 일어났으며, 이후 형성된 신초들은 이 두 종류의 캘러스로부터 증식된 것으로 사료된다.

실험예 3: RT - PCR 을 통한 npt Ⅱ 및 BcPGIP2 의 발현 확인

배추 형질전환체 T₀-6, T₀-10, T₀-12, T₀-15, T₀-16, T₀-17, T₀-20, T₀-21에 도입된 npt Ⅱ 및 BcPGIP2의 발현을 확인하기 위해 얻어진 개체들의 잎을 채취하여 RNeasy 플랜트 미니 키트(RNeasy Plant mini kit, 큐아젠사 제품)로 총 RNA를 분리한 후, 분광광도계로 정량하였다. 5㎍의 총 RNA에서 슈퍼스크립트 펄스트 스트랜드 합성 키트(Superscript 1st-Strand Synthesis Kit, 미국 인비트로젠사 제품)를 이용하여 합성한 제1차 cDNA 가닥(1st strand cDNA)을 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하였다. nptⅡ의 발현 확인을 위한 RT-PCR은 실험예 1의 방법에 따라 수행하였으며 BcPGIP2의 발현 확인을 위해 사용한 RT-PCR의 프라이머는 다음과 같다:

(forward): 5'-AGTCGGATCCATGGGTAAGACAACGACACTGCTTTTG-3'

(reverse): 5'-GGCTGCGGTACCCTTTTACTTGCAACTATCAAGAG-3'

상기 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분 조건으로 30 사이클을 반복수행하였으며, 최종적으로 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 대조군으로서 배추의 액틴 유전자를 증폭하기위해 사용한 프라이머 BcActin는 다음과 같다:

(forward): 5'-ATGACATGGAGAAGATCTGG-3'

(reverse): 5'-TGAGCTTGTTTTGGAAGTCT-3'

상기 프라이머 쌍을 이용하여 합성한 제1차 cDNA 가닥(1st strand cDNA)을 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분 조건으로 30 사이클을 반복수행하였으며, 최종적으로 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 용액을 1.2% 아가로우즈 젤에 전기영동을 실시하여 DNA 단편을 확인하였다.

도 5는 형질전환체 식물에서 RT-PCR을 이용하여 nptII 유전자 발현을 탐지한 결과를 나타낸 것이다. 이때 M은 1kb 플러스 DNA 래더를, 레인 1은 야생형 J3-11M-44를, 레인 2 내지 9는 형질전환체 식물을 나타낸다. 특히, 레인 2;T₀-6, 레인 3;T₀-10, 레인 4;T₀-12, 레인 5;T₀-15, 레인 6;T₀-16, 레인 7;T₀-17,레인 8;T₀-20, 레인 9;T₀-21를 나타낸다.

또한, 도 6은 형질전환체 식물에서 BcPGIP2 유전자 발현을 탐지한 결과를 나타낸 것이다. 이때, M은 1kb 플러스 DNA 래더를 레인 1 내지 3은 야생형 식물, 레인 4 내지 11은 형질전환체 식물을 나타낸다. 특히, 레인 4;T₀-6, 레인 5;T₀-10, 레인 6;T₀-12,레인 7;T₀-15, 레인 8;T₀-16, 레인 9;T₀-17, 레인 10;T₀-20, 레인 11;T₀-21를 나타낸다.

도 5 및 6에 나타난 바와 같이, npt Ⅱ 및 BcPGIP2이 정상적으로 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 배추 형질전환체의 무름병 저항성 확인

상기 실시예 1에서 형질전환된 배추의 무름병에 대한 저항성을 측정하기 위하여 PCR 및 DNA 젤 블랏과 RT-PCR을 실시하여 BcPGIP2 유전자의 도입과 발현이 확인된 정식후 60일된 J3-11M-44 계통의 형질전환 배추와 야생형의 잎을 채취하여 무름병에 대한 이병성을 엽 기부 접종방법(point inoculation method, Park et al., 2004)으로 무름병원균을 1.2x10⁵ cfu/㎕ 접종한 후, 6시간 간격으로 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36시간에 병반의 진전 정도를 조사하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7(A)의 결과는 4개의 반복구(replicates)들의 평균±표준편차로 나타내었다. 도 7(B)는 접종 후 12시간째에 배추 잎의 모습을 나타낸 사진도이다.

도 7에 나타난 바와 같이, 대조군인 야생형에 비하여 형질전환체인 T₀-21은 접종 후 12시간부터 병반이 관찰되었으며 대조군에 비해 12시간에는 54.6%, 18시간에는 52.5%, 24시간에는 29.1%, 30시간에는 19.7%, 36시간에는 20.3% 병저항성이 증가하였다.

상기 실시예 및 실험예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 화경조직을 이용한 배추의 형질전환체 제조방법 및 이로부터 생산되는 무름병 저항성이 증진된 형질전환체에 관한 것으로, 화경조직을 이용하여 배추의 형질전환을 수행한 결과, 형질전환율이 2.8%로, 기존의 자엽과 배축을 이용하는 방법의 0.4~0.8%에 비해 그 효율을 2배 이상 향상시키는 효과가 있다. 본 발명의 화경조직을 이용한 형질전환 방법을 배추 이외의 식물의 형질전환에 적용한다면, 기존의 방법보다 고효율의 식물형질전환시스템을 구축할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명은 상기의 형질전환방법에 따라 배추를 형질전환시킴으로써 무름병 저항성이 증진된 배추 형질전환체를 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 작물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용하여 배추의 형질전환체를 제조하는 방법에 있어서,

상기 균주를 배추의 화경조직에 감염시켜 조직배양하는 단계를 포함하되 상기 배추는 J3-11M-44 계통인 것을 특징으로 하는 배추의 형질전환체 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 아그로박테리움 튜머파시엔스는 아그로박테리움 튜머파시엔스속(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주인 것을 특징으로 하는 상기 배추의 형질전환체 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)는 외래 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 상기 배추의 형질전환체 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 외래 유전자는 BcPGIP2(Polygalacturonase-inhibiting protein) 또는 npt Ⅱ 유전자인 것을 특징으로 하는 상기 배추의 형질전환체 제조방 법.
제1항의 방법으로 제조된 배추의 형질전환체.