KR20050080555A

KR20050080555A - 아그로박테리움에 의한 효율적인 배추의 형질전환 방법

Info

Publication number: KR20050080555A
Application number: KR1020040008610A
Authority: KR
Inventors: 박영두; 이미경; 김형석
Original assignee: 박영두
Priority date: 2004-02-10
Filing date: 2004-02-10
Publication date: 2005-08-17
Also published as: KR100523758B1

Abstract

본 발명은 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciens)를 이용하여 배추를 형질전환 시키는 방법에 관한 것이다.

더욱 자세하게는, 본 발명은 아그로박테리움 투마파시엔의 접종 전 배양 단계부터 슈트 유도의 단계에 이르기까지 배추 형질전환의 효율을 높이기 위해, 배지의 pH 및 한천(agar) 농도, 그리고 첨가물을 조절함으로써, 기존에 극히 낮았던 배추의 형질전환 효율을 크게 높인, 개량된 배추 형질전환 방법에 관한 것이다.

Description

아그로박테리움에 의한 효율적인 배추의 형질전환 방법 {Efficient method of Agrobacterium-mediated transformation in Chinese cabbage}

본 발명은 작물에 유용한 유전자를 도입할 수 있는 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciens)를 이용하여 배추를 형질전환 시키는 방법에 관한 것이다.

최근 가장 일반적으로 이용되고 있는 식물 형질전환 기술은 식물 병원균인 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 벡터로 이용하는 것이다. 이들 세균은 그들의 Ti (tumor-inducing) 또는 Ri (root-inducing) 플라스미드 DNA중 일부인 T-DNA를 감염된 식물 세포내로 전이시키는 능력을 갖고 있다. 따라서, 목적 유전자를 T-DNA내에 재조합한 후 이를 보유한 균과 식물체를 공동 배양하면 식물 세포의 형질전환이 가능해진다(Binns et al., Ann Rev Microbiol. 42: 575-606,1988).

배추(Chinese cabbage)는 김치에 주로 이용되는 채소류로, 연 생산량 240만 톤에 이르는 국내 중요 원예작물 중 하나이다. 그럼에도 불구하고, 배추는 형질전환의 연구가 거의 없는 형편으로 일반적으로 형질전환이 거의 어렵고, 간혹 되더라도 그 효율 및 안정성이 극히 낮은 상황이다. 배추의 형질전환 방법에 관한 기존의 특허로는 아그로박테리움을 접종한 배추의 배축 절편을 질산은을 첨가한 MS 배지에 치상하여 캘러스를 유기하는 방법을 제시한 한국특허 제10-0375674호 등이 있다.

본 발명은 이와 같은 종래의 문제점에 착안하여, 외래 유전자를 배추에 안정적으로 전이시켜 다수의 형질전환 배추를 얻을 수 있는 방법으로서, 기존의 기술에 비해 한층 효과가 뛰어난 형질전환 방법을 확립하는 것을 그 목적으로 한다.

상기와 같은 본 발명의 기술적 과제는, 실험실 내에서 작물에 유용한 유전자를 도입할 수 있는 아그로박테리움 투마파시엔을 이용하여 배추 배축을 형질전환 시키고, 배축으로부터 캘러스 유도배지에서 캘러스(callus)를 유도한 후, 유도된 캘러스로부터 슈트 유도배지에서 슈트(shoot)를 유도한 후, 다시 유도된 슈트로부터 뿌리 유도배지에서 뿌리(root)를 유도하는 3단계 유도과정을 통해 형질전환된 배추를 획득하되, 이때 아그로박테리움 투마파시엔의 접종 전 배양 단계부터 슈트 유도의 단계에 이르기까지 배추 형질전환의 효율을 높이기 위해 배지의 pH 및 agar 농도, 그리고 첨가물(AgNO_3, acetosyringone)을 조절함으로써 달성하였다. 본 발명의 방법에 의해 형질전환된 배추식물의 자가수정을 통해 얻어진 후대로부터 PCR 분석을 통해 유전적 안정성을 확인하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

더욱 자세하게는, 본 발명은 아그로박테리움 투마파시엔의 접종 전 배양 단계부터 슈트 유도의 단계에 이르기까지 배추 형질전환의 효율을 높이기 위해, 배지의 pH 및 agar 농도, 그리고 첨가물을 조절함으로써, 기존에 극히 낮았던 배추의 형질전환 효율을 크게 높인, 개량된 배추 형질전환 방법에 관한 것이다.

본 발명은 배추의 형질전환을 위한 매개체로 사용되는 아그로박테리움 투마파시엔을 YEP 배지에서 배양하는 단계; 배추의 배축을 아그로박테리움 투마파시엔으로 감염시켜 유전자를 형질전환 시키는 단계; 상기 형질전환된 배추 배축을 캘러스 유도배지에서 배양하여 형질전환된 조직에서만 캘러스가 유도되도록 하는 단계; 상기 유도된 캘러스를 절단하여 캘러스 유도배지와 같은 조성의 슈트 유도배지에서 배양하여 슈트를 유도하는 단계; 및 상기 유도된 슈트를 절단하여 뿌리 유도배지에서 정상적인 어린 식물로 분화시키고 질석(vermiculite) 용기에서 순화시키는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시 예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 형질전환용 운반체 제작

본 발명에 사용된 형질전환용 운반체는 하이그로마이신 저항성 유전자 함유 운반체(pRCV2)로서 2001년 11월 20일에 특허 출원된 "하이그로마이신 저항성유전자를 포함하는 rescue cloning용 식물형질전환벡터 pRCV2" (출원번호: 10-2001-0072265호, 발명자: 박영두, 김형석) 에서 개시된 것과 동일한 것을 사용하였다(도 1 참조). pRCV2는 식물형질전환용 벡터 중 하이그로마이신 저항성 유전자(hpt)를 운반하는 pCAMBIA1301에 암피실린 저항성 유전자와 박테리아 복제기점을 갖고있는 pBluescriptII KS(+)을 삽입시켜 제작한 것으로, 2003년 5월 27일자 공개특허공보에 상세히 개시되어 있다.

실시예 2 : 형질전환용 운반체(pRCV2)를 함유하고 있는 아그로박테리움 투마파시엔의 배양

배추에 접종하는 형질전환 매개체로는 상기 실시예 1의 식물형질전환용 벡터 pRCV2를 함유하고 있는 아그로박테리움 투마파시엔 LBA4404/pRCV2을 사용하였다. 상기 미생물은 2001년 11월 19일자로 한국종균협회(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KFCC 11283으로 기탁된 것이다. 이하에서 아그로박테리움 투마파시엔이라 함은 상기 아그로박테리움 투마파시엔 LBA4404/pRCV2를 말한다.

배추의 배축을 아그로박테리움 투마파시엔으로 접종시킬 때 형질전환의 효율을 높이기 위해, 먼저 형질전환용 운반체(pRCV2)를 함유하고 있는 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciens LBA4404/pRCV2)을 카나마이신(kanamycin) 50 mg/L가 함유된 고체 YEP 배지에 평판배양하여 28℃에서 48시간 배양하였고, 배양된 아그로박테리움 투마파시엔 세포 중 몇몇 콜로니(colony)를 찍어 카나마이신 50 mg/L가 함유된 5 mL 액체 YEP 배지에 접종하여 28℃에서 48시간 현탁배양하였다. 배양된 현탁에서 700㎕를 추출한 다음, 0.02 mM Acetosyringone이 첨가되고 pH가 5.6으로 조정된 50ml 액체 YEP 배지에 첨가하여 28℃에서 OD₆₀₀이 1.0이 될 때까지 현탁배양하였다. 마지막으로 배양된 현탁액은 원심분리기에서 4000rpm으로 15분간 원심분리시켜 25ml 액체 YEP 배지로 재현탁되어 배추 배축의 접종에 사용되었다.

실시예 3 : 배추 형질전환 및 캘러스 유도

배추[서울, 동부한농(주)]를 무균상태에서 발아시킨 뒤 배축을 5∼10 mm로 자르고, 실시예 2에서 설명된 방법대로 제작된 아그로박테리움 투마파시엔 현탁액에 10분간 침지시켜 접종하였다. 접종된 절편은 공동배양배지(MS기본배지, 3% sucrose, 0.8% plant agar, 4 mg/L BA, 1 mg/L NAA, 4 mg/L AgNO₃, 5 mg/L acetosyringone, pH 5.6)에서 3일간 공동배양하였다. 이 후 배추 배축을 액체 공동배양배지로 세척하여 아그로박테리움 투마파시엔을 씻어낸 후 캘러스 유도배지(MS기본배지, 3% sucrose, 0.8% plant agar, 4 mg/L BA, 1 mg/L NAA, 4 mg/L AgNO₃, 5 mg/L acetosyringone, 10 mg/L hygromycin, 200 mg/L cefotaxime, pH 5.6)에 형질전환된 배추 배축절편을 배양하여 형질전환된 조직에서만 캘러스가 유도되도록 하였다(도 2 참조).

실시예 4 : 슈트 및 뿌리 유도

유도된 형질전환 캘러스를 절단하여 슈트 유도배지(캘러스 유도배지와 동일)에 옮겨 배양하여 슈트를 유도하였고 유도된 형질전환 슈트는 뿌리 유도배지(1/2 MS기본배지, 3% sucrose, 0.7% plant agar, 200 mg/L cefotaxime, pH 5.8)로 옮겨 뿌리 발생을 유도하였다. 뿌리가 생성된 형질전환체는 멸균된 질석에 이식하여 순화시켰고 이후 화분에 이식하여 온실에서 재배하였다 (도 2 참조).

실시예 5 : 형질전환체와 그 후대에서 유전자 삽입 및 안정성 확인

발명에서 사용한 하이그로마이신 저항성 유전자가 이들 형질전환 개체에 성공적으로 삽입되었는지 확인하기 위하여 배추 형질전환체에서 genomic DNA를 분리하고 서던 블럿 분석(Southern blot analysis)을 수행하였다. 이때 하이그로마이신 유전자가 삽입되었는지를 확인하는 프로브(probe)는 하이그로마이신 유전자 내부에서 증폭될 수 있는 프라이머(primer) 쌍 3'-CCTCTACGTTATCCAGTCCGA-5'와 3'-GGTTGTTACAGGACTGCCTGT-5'를 pRCV2 plasmid DNA template에서 PCR로 증폭시킨 product로 사용하였다. 이 결과 형질전환 배추에서 0.6 kb 크기의 밴드(band)가 생성되어 하이그로마이신 유전자가 배추 게놈(genome) 내부에 안정적으로 삽입된 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 형질전환된 유전자가 배추 형질전환체의 후대로도 안정적으로 유전되는지 여부를 확인하기 위해 배추 형질전환체를 자가수정 시켜 얻은 종자를 발아시켜 그 후대개체로부터 genomic DNA를 추출하였고 이를 하이그로마이신 유전자 내부에서 증폭될 수 있는 primer 쌍 3'-CCTCTACGTTATCCAGTCCGA-5'와 3'-GGTTGTTACAGGACTGCCTGT-5'로 PCR 반응시킨 결과 배추형질전환체의 후대로도 유전자가 안정적으로 유전됨을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 아그로박테리움 투마파시엔의 접종 전 배양 단계부터 슈트 유도의 단계에 이르기까지 형질전환의 효율을 높이기 위해, 배지의 pH 및 agar 농도, 그리고 첨가물(AgNO_3, acetosyringone)을 조절함으로써 기존에 극히 낮은 효율을 보였던 배추의 형질전환 효율을 크게 높일 수 있었으며, 강력한 항생제 하이그로마이신을 형질전환체의 선발에 이용함으로써 도입하고자 하는 유전자가 제대로 삽입되지 않거나 불안정한 형질전환체의 수를 최소화 할 수 있었다. 이를 통해 원예적으로 매우 중요한 작물인 배추에 있어서 유용 유전자의 도입을 안정적으로 시도할 수 있게 되었을 뿐만 아니라, 학문적으로도 많은 수의 배추 형질전환체를 확보할 수 있게 되어 배추 유전자원의 연구를 위한 발판을 마련하게 되었으므로 본 발명은 농업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 배추를 형질전환하기 위하여 개발한 식물형질전환 운반체인 pRCV2의 식물게놈에 전달되는 부위의 유전자 구조이다.

도 2a는 아그로박테리움에 의한 배추의 형질전환 과정 중 배축을 아그로박테리움과 공동배양하는 과정을 나타낸 것이다.

도 2b는 아그로박테리움에 의한 배추의 형질전환 과정 중 캘러스 유도배지에서 형질전환된 캘러스(callus)가 유도되는 과정을 나타낸 것이다.

도 2c는 아그로박테리움에 의한 배추의 형질전환 과정 중 슈트 분화배지에서 슈트(shoot)가 발달하는 과정을 나타낸 것이다.

도 2d는 아그로박테리움에 의한 배추의 형질전환 과정 중 슈트로부터 뿌리(root)가 생성되는 과정을 나타낸 것이다.

도 2e는 아그로박테리움에 의한 배추의 형질전환 과정 중 온실에서 육성되고 있는 배추 형질전환 식물체를 나타낸 것이다.

도 3은 형질전환된 배추에 삽입된 하이그로마이신 저항성유전자를 Southern hybridization 방법으로 확인한 그림이다.

도 4는 형질전환 배추로부터 얻은 후대에서 하이그로마이신 저항성 유전자를 핵산증폭반응(PCR)으로 확인한 그림이다.

Claims

형질전환용 운반체인 pRCV2를 함유하고 있는 아그로박테리움 투마파시엔을 배양하고 현탁액을 만드는 단계; 상기 현탁액을 배추 배축에 접종하고 공동배양 배지에서 배양하여 배축 절편을 형질전환하는 단계; 상기 형질전환된 배추 배축을 캘러스 유도배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 상기 유도된 캘러스를 슈트 유도배지에서 배양하여 분화시키는 단계; 및 상기 유도된 슈트를 뿌리 유도배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계로 구성되는 아그로박테리움 투마파시엔에 의한 형질전환 배추의 제조방법에 있어서,

상기 배추 절편 접종을 위한 아그로박테리움 투마파시엔 현탁액 제조 단계는 카나마이신(kanamycin) 50 mg/L가 함유된 고체 YEP 배지에 평판배양하고, 배양된 세포 중 콜로니(colony)를 찍어 카나마이신 50 mg/L가 함유된 5ml 액체 YEP 배지에 접종하여 현탁배양한 후, 배양된 현탁에서 700㎕를 추출하여 0.02 mM Acetosyringone이 첨가되고 pH가 5.6으로 조정된 50ml 액체 YEP 배지에 첨가하고 OD₆₀₀이 1.0이 될 때까지 현탁배양하는 것을 특징으로 하는 아그로박테리움 투마파시엔에 의한 형질전환 배추의 제조방법.
형질전환용 운반체인 pRCV2를 함유하고 있는 아그로박테리움 투마파시엔을 배양하고 현탁액을 만드는 단계; 상기 현탁액을 배추 배축에 접종하고 공동배양 배지에서 배양하여 배축 절편을 형질전환하는 단계; 상기 형질전환된 배추 배축을 캘러스 유도배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 상기 유도된 캘러스를 슈트 유도배지에서 배양하여 분화시키는 단계; 및 상기 유도된 슈트를 뿌리 유도배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계로 구성되는 아그로박테리움 투마파시엔에 의한 형질전환 배추의 제조방법에 있어서,

상기 공동배양 단계에 사용하는 공동배양 배지의 조성은 3% 수크로오스(sucrose), 0.8% 식물 아가(plant agar), 4 mg/L BA, 1 mg/L NAA를 함유한 pH 5.6의 MS 기본배지에 4 mg/L AgNO₃, 5 mg/L 아세토시링원(acetosyringone)이 첨가된 것임을 특징으로 하는 아그로박테리움 투마파시엔에 의한 형질전환 배추의 제조방법.
형질전환용 운반체인 pRCV2를 함유하고 있는 아그로박테리움 투마파시엔을 배양하고 현탁액을 만드는 단계; 상기 현탁액을 배추 배축에 접종하고 공동배양 배지에서 배양하여 배축 절편을 형질전환하는 단계; 상기 형질전환된 배추 배축을 캘러스 유도배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 상기 유도된 캘러스를 슈트 유도배지에서 배양하여 분화시키는 단계; 및 상기 유도된 슈트를 뿌리 유도배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계로 구성되는 아그로박테리움 투마파시엔에 의한 형질전환 배추의 제조방법에 있어서,

상기 캘러스와 슈트 유도 단계에 사용하는 배지의 조성은 3% 수크로오스(sucrose), 0.8% 식물 아가(plant agar), 4 mg/L BA, 1 mg/L NAA, 10 mg/L 하이그로마이신(hygromycin), 200 mg/L 세포탁심(cefotaxime)을 함유한 pH 5.6의 MS 기본배지에 4 mg/L AgNO₃, 5 mg/L 아세토시링원(acetosyringone)이 첨가된 것임을 특징으로 하는 아그로박테리움 투마파시엔에 의한 형질전환 배추의 제조방법.
형질전환용 운반체인 pRCV2를 함유하고 있는 아그로박테리움 투마파시엔을 배양하고 현탁액을 만드는 단계; 상기 현탁액을 배추 배축에 접종하고 공동배양 배지에서 배양하여 배축 절편을 형질전환하는 단계; 상기 형질전환된 배추 배축을 캘러스 유도배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 상기 유도된 캘러스를 슈트 유도배지에서 배양하여 분화시키는 단계; 및 상기 유도된 슈트를 뿌리 유도배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계로 구성되는 아그로박테리움 투마파시엔에 의한 형질전환 배추의 제조방법에 있어서,

상기 뿌리 유도단계에 사용하는 배지의 조성은 3% 수크로오스(sucrose), 0.7% 식물 아가(plant agar), 200 mg/L 세포탁심(cefotaxime)을 함유한 pH 5.8의 1/2 MS 기본배지임을 특징으로 하는 아그로박테리움 투마파시엔에 의한 형질전환 배추의 제조방법.