KR100799159B1 - 아그로박테리움을 이용한 온주밀감의 체세포배발생캘러스의 형질전환 및 형질전환 식물체 - Google Patents

아그로박테리움을 이용한 온주밀감의 체세포배발생캘러스의 형질전환 및 형질전환 식물체 Download PDF

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류기중
진성범
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제주대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 국내에서 재배되고 있는 온주밀감(Citrus unshiu Marc.)을 재료로 아그로박테리움을 형질전환 매개체로 이용한 효율적인 유전자 전환 기법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 온주밀감 주요 품종의 하나인 궁천조생을 이용하여 체세포배분화를 통한 식물체 재분화계와 아그로박테리움 투마훼시안스(Agrobacterium tumefaciens )을 이용한 형질전환기술 체계를 확립한 내용에 관한 것이다.
본 발명은 온주밀감에 있어서 체세포배분화를 통한 효과적인 대량번식체계의 개발에 기여할 수 있고, 기존의 형질전환기술이 적용되기 힘들었던 배발생 캘러스로부터 다수의 식물체를 재생하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명의 배양체계는 원예학적으로 유용한 유전자를 형질전환기술을 이용한 품종개량에서 획기적으로 이용될 수 있는 것이다.
온주밀감, 형질전환, GUS, 신초, 캘러스, 아그로박테리움, 배발생

Description

아그로박테리움을 이용한 온주밀감의 체세포배발생 캘러스의 형질전환 및 형질전환 식물체{Agrobacterium-mediated transformation using somatic embryogenic callus in 'Miyagawa Wase' Satsuma Mandarin(Citrus unshiu Marc.) and transgenic plant thereof}
도 1은 형질전환에 사용된 pIG121 플라스미드 벡터의 T-DNA 그림이고,
도 2는 pIG121이 포함된 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA4404와 공동배양한 후 캘러스 세포의 GUS 발현을 나타내는 그림이고,
도 3은 접종 밀도에 따른 형질전환 효율을 나타내는 그림이고,
도 4는 접종 시간에 따른 형질전환 효율을 나타내는 그림이고,
도 5는 공동배양기간에 따른 형질전환 효율을 나타내는 그림이고,
도 6은 공동배양에 있어 acetosyringone (AS)농도에 따른 형질전환 효율을 나타내는 그림이고,
도 7은 pIG121을 포함하는 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA4404으로 형질전환된 배발생 캘러스 세포로부터 신초의 재생을 나타내는 그림이고,
도 8은 형질전환 식물체의 신초에서 GUS 발현을 관찰한 그림이고,
도 9는 GUS와 HPT 유전자를 검출할 수 있는 특이 프라이머로 형질전환 식물체의 게노믹 DNA의 PCR분석을 나타내는 그림이고,
도 10은 32P로 라벨링된 HPT 유전자 프로브로 형질전환 식물체의 게노믹 DNA의 서던 블럿 분석을 나타내는 그림이다.
본 발명은 국내에서 재배되고 있는 온주밀감(Citrus unshiu Marc.)을 재료로 아그로박테리움을 형질전환 매개체로 이용한 효율적인 유전자 전환 기법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 온주밀감 주요 품종의 하나인 궁천조생을 이용하여 체세포배분화를 통한 식물체 재분화계와 아그로박테리움을 이용한 형질전환기술 체계를 확립한 내용에 관한 것이다.
온주밀감 (Citrus unshiu Marc.)은 배우자 불임, 다배성 및 긴 유년성 등의 식물학적 특성으로 인해 교잡 육종이 매우 어려운 작물이다. 그러므로 기존의 우량 형질을 유지하고 특정형질만을 도입하는 형질전환기술이 대안으로 제시되어 왔다. 형질전환을 위해서는 재분화와 유전자전이 방법이 확립되어야 한다. 온주밀감의 경우 다른 감귤에 비하여 식물체 재분화와 유전자 전이가 특히 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 온주밀감 주요 품종의 하나인 궁천조생을 이용하여 체세포배분화를 통한 식물체 재분화계와 아그로박테리움을 이용한 형질전환기술 체계를 확립코자 수행하였다.
본 발명의 목적은 상기의 기술적인 문제에 대해 작물에 유용한 유전자를 도입할 수 있는 아그로박테리움 투마훼시안스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용하여 온주밀감 체세포배발생캘러스를 형질전환 시키고, 체세포배발생캘러스로부터 체세포배와 신초를 유도한 후 탱자 대목에 기내 접목하여 형질전환 식물체를 얻음으로써 유용한 유전자로 형질 전환된 온주밀감을 획득함에 있으며, 또 다른 목적으로는 본 발명에서 개발한 온주 밀감 형질전환 기법은 국내외적으로 보고된 바가 없고, 새로운 유전자를 짧은 시간 내에 전환하여 온주 밀감 품종개량에서 획기적으로 이용될 수 있는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 아그로박테리움을 이용하여 형질전환식물체를 제조하는 방법에 있어서,
(a) 궁천조생 성숙과실의 미수정 미발육 종자로부터 유기된 캘러스에 하이그로마이신 저항성 유전자(hpt)와 β-글루코시다제(β-glucuronidase, gus) 유전자가 삽입된 pIG121를 포함하는 아그로박테리움 투마파시엔 균을 접종하여 공동배양하는 단계와,
(b) 세포타심을 포함하는 배지에서 상기 (a)의 캘러스를 배양하는 단계와,
(c) 하이그로마이신이 포함된 선별 배지에서 배양한 형질전환된 캘러스 세포로부터 하이그로마이신 저항성 배를 재생시키는 단계와,
(d)자엽 유도 배지에서 배양한 형질전환된 체세포배로부터 비정상적인 자엽을 유도하는 단계와,
(e) 0.10 mg/L BA 및 0.01 mg/L NAA가 포함된 배지에서 배양 후 비정상적인 자엽 절편에서 여러개의 신초를 유도하는 단계와,
(f)신장된 신초의 기부를 뿌리유도배지에서 뿌리를 유도하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 형질전환 온주 밀감의 제조방법을 제공하는 것이다.
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본 발명의 또 다른 목적은 상기 (a)단계는 균 접종 밀도가 OD600가 0.6일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 (a)단계는 균 접종 시간이 20분일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 (a)단계는 공동 배양 기간이 5일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 (a)단계는 500mg/L malt extract와 50g/L sucrose가 포함된 고체 MT배지(pH5.2)에 acetosyringone (AS)농도가 100μM일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 방법에 의하여 제조된 온주밀감을 제공하는 것이다.
본 발명은 아그로박테리움을 이용한 온주밀감의 체세포배발생 캘러스의 형질전환 및 형질전환 식물체에 관한 것이다.
본 발명은 아그로박테리움을 이용하여 형질전환식물체를 제조하는 방법에 있어서,
(a) 궁천조생 성숙과실의 미수정 미발육 종자로부터 유기된 캘러스에 하이그로마이신 저항성 유전자(hpt)와 β-글루코시다제(β-glucuronidase, gus) 유전자가 삽입된 pIG121를 포함하는 아그로박테리움 투마파시엔 균을 접종하여 공동배양하는 단계와,
(b) 세포타심을 포함하는 배지에서 상기 (a)의 캘러스를 배양하는 단계와,
(c) 하이그로마이신이 포함된 선별 배지에서 배양한 형질전환된 캘러스 세포로부터 하이그로마이신 저항성 배를 재생시키는 단계와,
(d)자엽 유도 배지에서 배양한 형질전환된 체세포배로부터 비정상적인 자엽을 유도하는 단계와,
(e) 0.10 mg/L BA 및 0.01 mg/L NAA가 포함된 배지에서 배양 후 비정상적인 자엽 절편에서 여러개의 신초를 유도하는 단계와,
(f)신장된 신초의 기부를 뿌리유도배지에서 뿌리를 유도하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 형질전환 온주 밀감의 제조방법을 포함한다.
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본 발명은 상기 (a)단계는 균 접종 밀도가 OD600가 0.6일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조방법을 포함한다.
본 발명은 상기 (a)단계는 균 접종 시간이 20분일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조 방법을 포함한다.
본 발명은 상기 (a)단계는 공동 배양 기간이 5일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조방법을 포함한다.
본 발명은 상기 (a)단계는 500mg/L malt extract와 50g/L sucrose가 포함된 고체 MT배지(pH5.2)에 acetosyringone (AS)농도가 100μM일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조방법을 포함한다.
본 발명은 상기 형질전환 방법에 의하여 제조된 온주밀감을 포함한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
아그로박테리움을 이용한 온주밀감의 형질전환계를 확립하기 위하여 캘러스세포의 형질전환율에 미치는 요인들과 형질전환체 선발 조건을 조사하고, 적정화된 조건으로 형질전환식물체를 얻은 다음 도입유전자의 발현과 도입유전자의 DNA를 확인하였다. 캘러스는 궁천조생 성숙과실의 미수정 미발육 종자로부터 유기시켰고, 도 1에서와 같이 카나마이신 저항성 유전자 (nptII), 하이그로마이신 저항성 유전자 (hpt) 및 β-glucuronidase 유전자 (gus)가 들어있는 플라스미드 벡터 (pIG121)를 가진 아그로박테리움 투마훼시안스LBA4404를 이용하여 형질전환 시켰다. 형질전환효율은 캘러스에 발현되는 GUS 반점의 수로 평가하였다(도 2).
1. 형질전환율에 미치는 요인
형질전환율에 미치는 요인으로 균의 접종밀도와 접종시간, acetosyringone (AS)의 농도, 공동배양기간을 조사하였다. 균 접종밀도는 조사된 OD600=0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 중 OD600=0.6일 때 형질전환율이 가장 높았다(도 3). 균 접종시간은 0, 10, 20, 30, 40, 50 및 60 min 중 20 min에서 가장 높았으며 그 후에는 감소하였다(도 4). 공동배양기간은 조사된 범위 (0, 2, 3, 4, 5 및 6일)내에서 기간이 길수록 형질전환율이 높았으나 6일 이상 공동배양 하는 경우에 아그로박테리움의 오염이 관찰되어 공동배양기간은 5일이 적당하였다(도 5). AS의 농도는 조사된 0, 50, 100, 150 및 200 μM 중 100 μM일 때 가장 높은 형질전환율을 나타내었다(도 6).
2. 형질전환 세포로부터 신초의 유도
아그로박테리움을 접종하여 공동배양이 끝난 세포를 선발배지 (MT 기본배지에 500 mg/L malt extract, 7% lactose, 25 mg/L hygromycin과 250 mg/L cefotaxime을 첨가한 배지)에 옮겨 6주간 배양하여 지속적인 성장을 보이는 하이그로마이신 저항성 체세포배를 선발하였다. 선발된 체세포배는 다시 자엽유도배지 (MT 기본배지에 0.1 M sorbitol, 0.1 M galactose, 0.7 mg/L adenine, 25 mg/L hygromycin, 250 mg/L cefotaxime, 0.2% gelrite을 첨가한 배지)에 옮겨 8주 배양하여 자엽을 분화시켰다. 이 자엽은 짙은 녹색으로 계속 배양하더라도 정상적인 식물체로 분화되지는 않았으며, 항생제를 넣지 않고 0.10 mg/L BA및 0.01 mg/L NAA을 첨가한 MT배지에 자엽절편을 다시 배양했을 때 약 8~12주 후 정상적인 식물체 지상부로 분화되었다. 이들 식물체 지상부가 2 cm 정도로 성장했을 때 탱자 대목에 기내 접목하여 잠정 형질전환 식물체를 얻었다(도 7).
3. 형질전환 식물체에서 리포터 유전자의 발현분석과 PCR 분석과 서던 블럿 분석을 통한 도입 유전자의 분석
하이그로마이신 배지에서 선발한 식물체에 대해 도입된 유전자의 DNA와 발현을 분석하였다. GUS에 대한 조직화학적 분석결과 형질전환식물의 잎뿐만 아니라 유식물 전체에서 도입유전자가 발현되는 것이 확인되었다(도 8). GUS 양성인 식물체의 게노믹 DNA(genomic DNA)를 분리하여 polymerase chain reaction (PCR)으로 하이그로마이신 저항성 유전자(hpt)와 β-글루코시다제(β-glucuronidase, gus) 유전자에 대해 분석한 결과 조사된 8개 식물체 모두 양성이었다(도 9). 그리고 식물체 게노믹 DNA(genomic DNA)의 서던 분석을 통해 도입유전자를 재확인 하였는데 그 결과 조사된 6개 식물체 중 적어도 4개의 식물체에서 상기 2 유전자가 있는 것으로 나타났다(도 10).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1; Plant materials >
온주밀감의 배 발생 배양(Embryogenic cultures)은 초기 배양 단계에서 Yun et al., (Yun J-U, Kim B-K, Jin S-B, Ahn SY, Kim YH, Moon D-K, Song KJ (2006) Hort. Environ. Biotechnol. 47(4) (in press))의 방법에 따라 수행하였고, 증식, 배발생과 재생 단계를 위해서 Jin et al., (Jin S-B, Song KJ, Riu KZ (2006) Hort. Environ. Biotechnol. 47(4) (in press)) 방법에 따라 수행하였다. 아그로박테리움 투마훼시안스를 감염시키기 전에, 백색 캘러스는 10 mg/L kinetin과 6% sucrose가 포함된 액체 MS 기본 배지에서 2주 마다 한번씩 배지를 새로이 바꾸어 주면서 4주 동안, 120rpm으로 쉐이킹하여 배양하였다. 캘러스는 1.0 mm MINI-SilverTMMicro Sieve (Rickly Hydrological company, USA)를 이용하여 여러 조각으 로 자르고, 0.1 M galactose와 0.1 M sorbitol을 포함된 액체 MS 배지에서 1주 동안 배양한 후, 아그로박테리움을 접종하였다.
< 실시예 2; 박테리아 균주와 플라스미드 벡터>
pIG121 벡터가 형질전환된 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA4404를 형질전환을 위해 사용하였다. nopaline synthase (NOS) 프로모터에 의해 조절되는 neomycin phosphotransferaseII (NPTII) 유전자, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터에 의해 조절되는 hygromycin phosphotransferase (HPT)유전자와 CaMV35S 프로모터에 의해 조절되는 intron (GUS-intron)과 β- glucuronidase (GUS) 유전자는 바이너리 벡터 pIG121의 T-DNA부위를 구성한다(도 1).
50 mg/L 하이그로마이신과 50 mg/L 카나마이신이 첨가된 고체 YEB 배지 (5 g/L beef extract, 1.0 g/L yeast extract, 5 g/L peptone, 5 g/L sucrose, 0.5 g/L MgSO4, 5 g/L sucrose and 1.5% agar)에서 28℃, 3일 동안 박테리아를 배양한 후, 하나의 콜로니를 28℃, 150 rpm으로 쉐이킹하면서 액체 YEB에서 12시간 배양하였다. 박테리아 세포는 상온에서 3,000 ×g, 10분 동안 원심분리하여 분리한 후, 펠릿은 접종용 현탁 배지 (액체 공동배양 배지)로 재희석하였다.
< 실시예 3; 아그로박테리움을 이용한 형질전환>
pIG121을 포함한 아그로박테리움 투마훼시안스 LBA 4404은 50mg/L 카나마이신과 50 mg/L 하이그로마이신이 포함된 50ml 액체 YEB배지에서, 28℃, 150 rpm으로 쉐이킹하면서 OD가 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 또는 1.0가 될 때까지 배양하였다.
12시간 배양한 아그로박테리움 투마훼시안스는 3,000 ×g 에서 10분동안 원심분리하고, 펠릿은 500mg/L malt extract, 50g/L sucrose, 100 uM acetosyringon (AS)로 구성된 50 ml 액체 MT medium (pH 5.2 )에 재현탁 한 후 같은 세포수로 초기 배양을 시작하였다.
전배양한 배발생 캘러스(embryogenic callus)는 28℃에서 150 rpm 쉐이킹 하면서 0, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60분 동안 배양한 박테리아 배양액에 담구고 난 후, 배 발생 캘러스는 여과지로 간단히 물기를 제거하고, 500mg/L malt extract, 50, 100, 150, 200 또는 300 uM AS가 있는 50g/L sucrose가 포함된 고체 MT배지(pH5.2)에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 동안 암상태 공동배양한다.
박테리아 제거를 위해서, 배발생 캘러스는 600 mg/L 카베니실린(carbenicillin) 이 포함된 두 번 멸균수로 씻어주고 여과지로 물기를 제거한다.
배발생 캘러스는 250 mg/L 세포타짐(cefotaxime)이 첨가된 EME배지 (Grosser and Gmitter, 1990)에서 4주 동안 배양하였다.
첫 번째 선별을 위해 배발생 캘러스는 7% lactose, 500 mg/L malt extract, 25 mg/L hygromycin, 250mg/L cefotaxime과 1.2% agar가 첨가된 MT배지에서 6주 간격으로 12주 동안 배발생(embryo induction)을 위해 배양하였다.
하이그로마이신 저항성 구 배(globular embry체세포배)는 0.1 M sorbitol, 0.1 M galactose, 7 mg/L adenine, 25 mg/L hygromycin, 250 mg/L cefotaxime, 과 0.2% gelrite가 첨가된 MT배지에서 6주 간격으로 12주 동안 자엽발생(cotyledon development)을 위해 배양하였다.
하이그로마이신 저항성 자엽 절편은 0.01 mg/L NAA, 0.1 mg/L BA, 3% sucrose와 0.8% agar가 포함된 MT배지에서 12주 동안 배양한 후, 자엽절편으로부터 유기된 지상부를 탱자대목 (Poncirus trifoliana)에 기내접목하여 순화과정을 거쳐 완전한 식물체를 얻었다.
< 실시예 4; GUS 발현을 위한 조직화학적 분석>
조직화학적 GUS 염색은 Jefferson (Jefferson RA (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405)방법에 따라 수행하였고, 캘러스 세포 또는 잎은 34 mM phosphate buffered saline, 10mM EDTA (pH8.0), 0.5mM K3[Fe(CN6)]3H2O, 0.5 mM K4[Fe(CN6)]3H2O, 2mM X-gluc와 0.1% triton X-100가 포함된 X-gluc 반응 버퍼에서 37℃에서 12시간 배양하였다. 식물 조직의 클로로필은 70% 에탄올에 담구어 제거하였다. GUS 반점은 광학현미경하에서 관찰하였다.
< 실시예 5; PCR 분석>
PCR분석을 위해, Shure et al., (Shure M, Wessler S, Fedoroff N (1983) Cell. Nov; 35 : 225233)방법에 따라 비형질전환 식물체와 형질전환 식물체의 잎 조직으로부터 DNA를 200mg을 추출하였다. PCR은 다음과 같은 프라이머들을 이용하여 형질전환으로 도입된 유전자를 증폭하였다:gus, 5'-CAA CGA GCT GAA CTG GCA GA-3' (forward; 서열목록1)와 5'-GGC ACA GCA CAT CAA AGA GA-3' (reverse; 서열목록2); hpt, 5'-GAT GTA GGA GGG CGT GGA TAT GTC-3' (forward;서열목록3)와 5'-CTT CTA CAC AGC CAT CGG TCC AGA-3' (reverse;서열목록4). GUS PCR 반응의 증폭(amplification of HPT)은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. Preheating 95℃ 5분; Elongation 35 cycles 95℃ 30초 (95℃, 1분), 57℃ 1분(55℃, 1분), 72℃ 45초(72℃, 1분); Post-elongation 72℃ 10분. 증폭된 PCR 산물은 EtBr 염색으로 관찰하였다.
< 실시예 6; 서던 블럿 분석>
서던 블럿 분석을 위해서, HindIII로 자른 게노믹 DNA 10 ㎍을 0.8% (w/v) 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리하고, 10분 동안 0.25 N HCl로 깨끗이 한 후, 0.5 N NaCl 용액으로 한시간 동안 변성(denaturation)시키고, 1 M Tris (pH 7.5)와 1.5 M NaCl로 만든 용액으로 한시간 동안 중성화(neutralization)시키고, 10Ⅹ SSC 한시간 동안 균일화(homogenization)시킨다. PCR을 이용하여 gus 프로브와 hpt 프로브를 준비하였고, PCR 산물은 PCR 정제킷 (Roche, Germany)으로 정제하였다.
ExpressHyb 용액(Clontech, Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 60℃, 30분동안 전혼성화시키고, 같은 온도에서 변성시킨 프로브를 넣은 후 24시간동안 혼성화한 후, 블럿은 상온에서 40분동안 2×SSC, 0.05% SDS용액으로 여러번 씻어주고, 50℃, 40분동안 0.1×SSC, 0.1% SDS용액으로 두 번 씻어준다. 블럿은 X-ray 필름 (Biomax-MS, Kodak, NY, USA)에서 노출시킨다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 온주밀감에 있어서 체세포배분화를 통한 효과적인 대량번식체계의 개발에 기여할 수 있고, 기존의 형질전환기술이 적용되기 힘들었던 배발생 캘러스로부터 다수의 식물체를 재생하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명의 배양체계는 원예학적으로 유용한 유전자를 형질전환기술을 이용한 품종개량에서 획기적으로 이용될 수 있는 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 아그로박테리움을 이용하여 형질전환식물체를 제조하는 방법에 있어서,
    (a) 궁천조생 성숙과실의 미수정 미발육 종자로부터 유기된 캘러스에 하이그로마이신 저항성 유전자(hpt)와 β-글루코시다제(β-glucuronidase, gus) 유전자가 삽입된 pIG121를 포함하는 아그로박테리움 투마파시엔 균을 접종하여 공동배양하는 단계와,
    (b) 세포타심을 포함하는 배지에서 상기 (a)의 캘러스를 배양하는 단계와,
    (c) 하이그로마이신이 포함된 선별 배지에서 배양한 형질전환된 캘러스 세포로부터 하이그로마이신 저항성 배를 재생시키는 단계와,
    (d)자엽 유도 배지에서 배양한 형질전환된 체세포배로부터 비정상적인 자엽을 유도하는 단계와,
    (e) 0.10 mg/L BA 및 0.01 mg/L NAA가 포함된 배지에서 배양 후 비정상적인 자엽 절편에서 여러개의 신초를 유도하는 단계와,
    (f)신장된 신초의 기부를 뿌리유도배지에서 뿌리를 유도하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 형질전환 온주 밀감의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, (a)단계는 균 접종 밀도가 OD600가 0.6일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, (a)단계는 균 접종 시간이 20분일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, (a)단계는 공동 배양 기간이 5일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, (a)단계는 500mg/L malt extract와 50g/L sucrose가 포함된 고체 MT배지(pH5.2)에 acetosyringone (AS)농도가 100μM일 때 가장 높은 형질전환율을 보이는 것을 특징으로 하는 형질전환 온주밀감의 제조방법.
  6. 제 1항의 형질전환 방법에 의하여 제조된 온주밀감.
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