JP6876877B2 - 形質転換植物の作製方法及び形質転換剤 - Google Patents
形質転換植物の作製方法及び形質転換剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6876877B2 JP6876877B2 JP2020542455A JP2020542455A JP6876877B2 JP 6876877 B2 JP6876877 B2 JP 6876877B2 JP 2020542455 A JP2020542455 A JP 2020542455A JP 2020542455 A JP2020542455 A JP 2020542455A JP 6876877 B2 JP6876877 B2 JP 6876877B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- strain
- agrobacterium
- plant
- target gene
- transformed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 27
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 227
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 195
- 240000006162 Chenopodium quinoa Species 0.000 claims description 176
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 159
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 128
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 103
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 99
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 58
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 53
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 38
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 36
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 31
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 235000004954 quinua Nutrition 0.000 claims 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 72
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 57
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 56
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 44
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 42
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 31
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 31
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 30
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 28
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 16
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 14
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- QSRAJVGDWKFOGU-WBXIDTKBSA-N rebaudioside c Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]1(CC[C@H]2[C@@]3(C)[C@@H]([C@](CCC3)(C)C(=O)O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)CC3)C(=C)C[C@]23C1 QSRAJVGDWKFOGU-WBXIDTKBSA-N 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000016614 betalains Nutrition 0.000 description 9
- 101150085703 vir gene Proteins 0.000 description 9
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 8
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 8
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 6
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000021918 systemic acquired resistance Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 4
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 210000003443 bladder cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 4
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 4
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 3
- 241000219317 Amaranthaceae Species 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 235000015493 Chenopodium quinoa Nutrition 0.000 description 3
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 3
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 3
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 2-cis-abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\C1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-LXGGSRJLSA-N 0.000 description 2
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589176 Agrobacterium vitis Species 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000219312 Chenopodium Species 0.000 description 2
- 240000006122 Chenopodium album Species 0.000 description 2
- 235000011498 Chenopodium album var missouriense Nutrition 0.000 description 2
- 235000013328 Chenopodium album var. album Nutrition 0.000 description 2
- 235000014052 Chenopodium album var. microphyllum Nutrition 0.000 description 2
- 235000014050 Chenopodium album var. stevensii Nutrition 0.000 description 2
- 235000013012 Chenopodium album var. striatum Nutrition 0.000 description 2
- 244000191502 Chenopodium murale Species 0.000 description 2
- 235000000751 Chenopodium murale Nutrition 0.000 description 2
- 244000300310 Chenopodium rubrum Species 0.000 description 2
- 235000009332 Chenopodium rubrum Nutrition 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 2
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- -1 potassium ferricyanide Chemical compound 0.000 description 2
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- DHJFFLKPAYHPHU-BYNIDDHOSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide Chemical compound O1[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 DHJFFLKPAYHPHU-BYNIDDHOSA-N 0.000 description 1
- 235000006760 Acer pensylvanicum Nutrition 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001136782 Alca Species 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 240000001592 Amaranthus caudatus Species 0.000 description 1
- 235000009328 Amaranthus caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 241000554155 Andes Species 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000871189 Chenopodiaceae Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 101000953492 Homo sapiens Inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol-pentakisphosphate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000962469 Homo sapiens Transcription factor MafF Proteins 0.000 description 1
- 102100037739 Inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol-pentakisphosphate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241001344131 Magnaporthe grisea Species 0.000 description 1
- 101710202061 N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102100039187 Transcription factor MafF Human genes 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 244000126002 Ziziphus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000008529 Ziziphus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 108010050516 adenylate isopentenyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 235000012735 amaranth Nutrition 0.000 description 1
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000021321 essential mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 101150104752 iaaH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150063121 iaaM gene Proteins 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 101150046289 tms2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/10—Seeds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、形質転換植物の作製方法及び形質転換剤に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2019-053945号優先権を請求する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2019-053945号優先権を請求する。
キヌア(Chenopodium quinoa)は、ヒユ科アカザ亜科アカザ属に属するアンデス発祥の異質倍数性植物である。
キヌアの種子は、タンパク質、必須アミノ酸およびミネラルを豊富に含み、米の代替的な存在になりうるとして期待されている（非特許文献１、非特許文献２）。
さらに、キヌアの耐塩性、耐寒性といった優れた環境ストレス耐性は、劣悪環境下での栽培が期待でき（非特許文献３）、国際連合食糧農業機関（FAO）は世界の食料危機の重要な解決手段になり得ると評価した（非特許文献４）。アンデスの重要な食糧であったキヌアは、今や世界へと広がり、研究および商業用栽培が行われている。さらに、キヌアのゲノムが解読されたことを契機に（非特許文献５）、キヌアの優れた環境ストレス耐性に関与する遺伝子の研究が進められている（非特許文献６）。形質転換技術を用いることにより、キヌアにさらなる環境ストレス耐性能力を付与できると考えられる。
キヌアの種子は、タンパク質、必須アミノ酸およびミネラルを豊富に含み、米の代替的な存在になりうるとして期待されている（非特許文献１、非特許文献２）。
さらに、キヌアの耐塩性、耐寒性といった優れた環境ストレス耐性は、劣悪環境下での栽培が期待でき（非特許文献３）、国際連合食糧農業機関（FAO）は世界の食料危機の重要な解決手段になり得ると評価した（非特許文献４）。アンデスの重要な食糧であったキヌアは、今や世界へと広がり、研究および商業用栽培が行われている。さらに、キヌアのゲノムが解読されたことを契機に（非特許文献５）、キヌアの優れた環境ストレス耐性に関与する遺伝子の研究が進められている（非特許文献６）。形質転換技術を用いることにより、キヌアにさらなる環境ストレス耐性能力を付与できると考えられる。
現在、植物の形質転換法は、細菌のDNA を植物細胞へ組み込む能力を利用したアグロバクテリウム（Rhizobium radiobacter；旧称Agrobacteriumtumefaciens）法が主流となっている。このアグロバクテリウムにより植物細胞へ組み込まれるDNAは、T-DNA（Transferred DNA）と呼ばれ、T-DNAの移行はプラスミド上のvir（virulence）遺伝子群の働きにより行われる。宿主植物の損傷によりフェノール化合物が分泌されると、アグロバクテリウムは植物細胞に誘引され、植物表面に付着する。菌体内では、フェノール化合物を感知したVirAがVirGをリン酸化し、他のvir遺伝子群を活性化する。活性化されたVirD1/D2はプラスミド上のT-DNA領域に切り込みを入れ、その5’末端にVirD2が結合する。さらに、T複合体の保護の役割を担うVirE2が結合する。T鎖とVirD2、VirE2の複合体はVirBの働きにより、植物細胞へと輸送され、植物の核内へ移行し、最終的に染色体へと組み込まれる（非特許文献７）。
アグロバクテリウム法による形質転換系の多くは、in vitroの無菌条件下で目的植物に遺伝子導入を行い、薬剤耐性遺伝子を用いて選抜を行う。そして、遺伝子導入細胞を組織培養技術により再分化する必要がある。再分化には、高度な技術や多くの時間を要すること、再分化の過程で遺伝子に変異が生じること、そして、適用できる植物種が制限されるといった欠点がある（非特許文献８）。
キヌアを含むアカザ属においても再分化系を用いたアグロバクテリウムによる形質転換が試みられてきた。バイナリーベクターを用いたキヌア培養細胞への形質転換（非特許文献９）、アカバアカザ（Chenopodium rubrum）実生への超音波（SAAT）法を用いたアグロバクテリウムによる形質転換（非特許文献１０）、そしてアカバアカザおよびミナトアカザ（Chenopodium murale L）のRhizobium rhizogenesによる毛状根誘導が報告されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。これらの研究において、スーパービルレンスもしくはハイパービルレンスと呼ばれる形質転換効率が高いアグロバクテリウムA281株が用いられたことにより、遺伝子導入に成功している（非特許文献９、非特許文献１３）。しかし、キヌアの再分化系が確立されておらず、キヌアの形質転換法は未だ確立されていない。
キヌアを含むアカザ属においても再分化系を用いたアグロバクテリウムによる形質転換が試みられてきた。バイナリーベクターを用いたキヌア培養細胞への形質転換（非特許文献９）、アカバアカザ（Chenopodium rubrum）実生への超音波（SAAT）法を用いたアグロバクテリウムによる形質転換（非特許文献１０）、そしてアカバアカザおよびミナトアカザ（Chenopodium murale L）のRhizobium rhizogenesによる毛状根誘導が報告されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。これらの研究において、スーパービルレンスもしくはハイパービルレンスと呼ばれる形質転換効率が高いアグロバクテリウムA281株が用いられたことにより、遺伝子導入に成功している（非特許文献９、非特許文献１３）。しかし、キヌアの再分化系が確立されておらず、キヌアの形質転換法は未だ確立されていない。
タバコで初めての形質転換植物体が報告されて以降（非特許文献１４、非特許文献１５）、モデル植物を中心に、様々な植物で高効率かつ安定的な形質転換系が確立され、植物科学において不可欠な方法となっている。キヌアは潜在的に優れた形質を持つ。そして、未知遺伝子の機能解明や環境的、社会的変化に対応するため、一層優れた形質の付与が望まれる。キヌア研究の進展のために、形質転換法の確立が必須と考えられる。
Vega-Galvez A, Miranda M, Vergara J, Uribe E,Puente L, Martinez EA(2010) Nutrition facts and functional potential of quinoa(Chenopodium quinoa willd.), an ancient Andean grain: a review. Journal of theScience of Food and Agriculture 90: 2541-2547
Mota C, Santos M, Mauro R, Samman N, MatosAS, Torres D, Castanheira I (2016) Protein content and amino acids profile ofpseudocereals. Food Chemistry 193:55-61
Hinojosa L, Gonzalez JA, Barrios-Masias FH,Fuentes F, Murphy KM (2018)Quinoa Abiotic Stress Responses: A Review. Plants7(4)
Food and Agriculture Organization of theUnited Nations (2013) State of the Art Report on Quinoa Around the World in 2013.
Jarvis DE, Ho YS, Lightfoot DJ, Schmockel SM,Li B, Borm TJ, Ohyanagi H, Mineta K, Michell CT, Saber N, Kharbatia NM, RupperRR, Sharp AR, Dally N, Boughton BA, Woo YH, Gao G, Schijlen EG, Guo X, MominAA, Negrao S, Al-Babili S, Gehring C, Roessner U, Jung C, Murphy K, Arold ST,Gojobori T, Linden CG, van Loo EN, Jellen EN, Maughan PJ, Tester M (2017) Thegenome of Chenopodium quinoa. Nature 542(7641):307-312
Morton MJL, Awlia M, Al-Tamimi N, Saade S,Pailles Y, Negrao S, Tester M (2019) Salt stress under the scalpel - dissectingthe genetics of salt tolerance. The Plant Journal 97(1):148-163
Zupan JR, Zambryski P (1995) Transfer ofT-DNA from Agrobacterium to the plant cell. Plant Physiol 107(4):1041-1047
清水碩, 久保田進, 藤森嶺, (1987) 植物バイオテクノロジー, オーム社
Komari T (1990) Transformation of culturedcells of Chenopodiumquinoa by binary vectors that carry a fragment of DNA fromthe virulenceregion of pTiBo542. Plant Cell Reports 9:303-306
Flores Solis J.I, Mlejnek P, Studena K,Prochazka S (2003)Application of sonication-assisted Agrobacterium-mediatedtransformation inChenopodium rubrum L. Plant, Soil and Environment 49:255-260
Mitic N, Dmitrovic S, Djordjevic M,Zdravkovic-Korac S, Nikolic, Raspor M, Djordjevic T, Maksimovic V, Zivkovic S,Krstic-Milosevic D, StanisicM, Ninkovic S, (2012) Use of Chenopodium murale L.transgenic hairy root invitro culture system as a new tool for allelopathicassays. Journal of Plant Physiology 169:1203-1211
Dmitrovic S, Mitic N, Zdravkovic-Korac S,Vinterhalter B, Ninkovic Sand Culafic L.J (2010) Hairy roots formation inrecalcitrant-to-transform plant Chenopodium rubrum. Biologia Plantarum 54(3):566-570
Jin SG, Komari T, Gordon MP, Nester EW(1987) Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacteriumtumefaciens A281. Journal of Bacteriology 169(10):4417-4425
Block MD, Herrera-Estrella L, Montagu MV,Schell J, Zambryski1 P(1984) Expression of foreign genes in regenerated plantsand in their progeny. The EMBO Journal 3(8): 1681-1689
Horsch RB, Fraley RT, Rogers SG, Sanders PR,Lloyd A, Hoffmann N(1984) Inheritance of functional foreign genes in plants.Science 223(4635):496-498
上述したような従来の技術の問題を解消するために、本発明は、キヌアの形質転換法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、floral dip法に密閉処理を加えることにより、キヌアの雌性器官に形質転換できることを見出し、さらに、該形質転換によって導入された遺伝子は後代に遺伝させることができることを確認して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
１．以下の工程を含む形質転換植物、該植物の種子又は該植物のカルスの作製方法：
（１−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（１−２）植物体を切断する工程、及び
（１−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にして、目的遺伝子が導入された植物体を得る工程、
又は、
（２−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（２−２）植物体を切断する工程、
（２−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（２−４）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程、
又は、
（３−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（３−２）接種した植物体を多湿・暗条件下にする工程、
（３−３）植物体を切断する工程、
（３−４）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（３−５）該植物体からカルスを作製する工程。
２．前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株又はMAFF311303株である、前項１に記載の方法。
３．前記アグロバクテリウムが、さらにT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドを形質転換されたアグロバクテリウムである、前項１又は２に記載の方法。
４．前記植物体がキヌアである、前項１〜３のいずれか１に記載の方法。
５．前記植物体がキヌア変異体ghy又はキヌア変異体ghy/rebcである、前項１〜４のいずれか１に記載の方法。
６． さらに工程（１−１）若しくは工程（２−１）の前に、工程（１−１）若しくは工程（２−１）と同時に、又は、工程（１−１）及び工程（１−２）の間若しくは（２−１）及び工程（２−２）の間に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程を含む、前項１〜５のいずれか１に記載の方法。
７．T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含む形質転換剤。
８．アグロバクテリウムMAFF311303株を含む雌性器官特異的形質転換剤。
９．アブシジン酸を含むアグロバクテリウムを使用した植物用形質転換補助剤。
１０．アグロバクテリウムMAFF301276株を含むキヌア用形質転換剤。
１１．以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程。
１２．以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
１３．以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
１４．前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株又はMAFF311303株である、前項１２に記載の方法。
１５．以下の工程を含む形質転換植物の種子の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程、及び
（３）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程。
１６．前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株又はMAFF311303株である、前項１５に記載の方法。
１７．前記植物体がキヌアである、前項１１〜１６のいずれか１に記載の方法。
１８．前記植物体がキヌア変異体ghy又はキヌア変異体ghy/rebcである、前項１１〜１７のいずれか１に記載の方法。
１．以下の工程を含む形質転換植物、該植物の種子又は該植物のカルスの作製方法：
（１−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（１−２）植物体を切断する工程、及び
（１−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にして、目的遺伝子が導入された植物体を得る工程、
又は、
（２−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（２−２）植物体を切断する工程、
（２−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（２−４）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程、
又は、
（３−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（３−２）接種した植物体を多湿・暗条件下にする工程、
（３−３）植物体を切断する工程、
（３−４）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（３−５）該植物体からカルスを作製する工程。
２．前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株又はMAFF311303株である、前項１に記載の方法。
３．前記アグロバクテリウムが、さらにT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドを形質転換されたアグロバクテリウムである、前項１又は２に記載の方法。
４．前記植物体がキヌアである、前項１〜３のいずれか１に記載の方法。
５．前記植物体がキヌア変異体ghy又はキヌア変異体ghy/rebcである、前項１〜４のいずれか１に記載の方法。
６． さらに工程（１−１）若しくは工程（２−１）の前に、工程（１−１）若しくは工程（２−１）と同時に、又は、工程（１−１）及び工程（１−２）の間若しくは（２−１）及び工程（２−２）の間に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程を含む、前項１〜５のいずれか１に記載の方法。
７．T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含む形質転換剤。
８．アグロバクテリウムMAFF311303株を含む雌性器官特異的形質転換剤。
９．アブシジン酸を含むアグロバクテリウムを使用した植物用形質転換補助剤。
１０．アグロバクテリウムMAFF301276株を含むキヌア用形質転換剤。
１１．以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程。
１２．以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
１３．以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
１４．前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株又はMAFF311303株である、前項１２に記載の方法。
１５．以下の工程を含む形質転換植物の種子の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程、及び
（３）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程。
１６．前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株又はMAFF311303株である、前項１５に記載の方法。
１７．前記植物体がキヌアである、前項１１〜１６のいずれか１に記載の方法。
１８．前記植物体がキヌア変異体ghy又はキヌア変異体ghy/rebcである、前項１１〜１７のいずれか１に記載の方法。
本発明は、形質転換植物の作製方法及び形質転換剤を提供することができた。
本発明の形質転換植物の作製方法（floral dip切断密閉法）は、（１）植物体を切断することによりアグロバクテリウムが感染しやすくする、（２）植物体を密閉容器内等に設置することにより多湿条件を保ち、多湿にすることによりアグロバクテリウムの生育・増殖を高め、アグロバクテリウムを感染しやすくさせる、（３）暗条件にすることにより、植物体のアグロバクテリウムに対する抵抗性および生育を低下させ、アグロを感染しやすくさせると共に光による切断した植物体への損傷を抑える、ことを目的とする方法である。すなわち、（１）〜（３）のいずれか１、２又は全部を実施することができれば方法・工程は特に限定できない。
［本発明の形質転換植物の作製方法］
本発明の形質転換植物の作製方法は、以下のいずれか１以上を対象とする。
（floral dip切断密閉法）
以下の工程を含む形質転換植物、該植物の種子又は該植物のカルスの作製方法：
（１−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（１−２）植物体を切断する工程、及び
（１−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にして、目的遺伝子が導入された植物体を得る工程、
又は
（２−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（２−２）植物体を切断する工程、
（２−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（２−４）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程。
本発明の形質転換植物の作製方法は、以下のいずれか１以上を対象とする。
（floral dip切断密閉法）
以下の工程を含む形質転換植物、該植物の種子又は該植物のカルスの作製方法：
（１−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（１−２）植物体を切断する工程、及び
（１−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にして、目的遺伝子が導入された植物体を得る工程、
又は
（２−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（２−２）植物体を切断する工程、
（２−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（２−４）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程。
工程（１−１）及び／又は（２−１）の対象の植物体は、発芽後の日数は特に限定されない。栽培条件によっても異なるが、発芽後１０〜１００日、３０〜６０日でもよく、発芽後４０〜５０日が好ましい。
工程（１−１）及び／又は（２−１）の「接触させることによりアグロバクテリウムを接種」は、前記アグロバクテリウムを対象の植物体に接触することで植物体内に導入する。接触方法は、特に限定されないが、例えばアグロバクテリウムを液体（例えば滅菌水、スクロース溶液。例えばSilwet L-77等の任意の添加物を含んでもよい）に懸濁した菌懸濁液を植物体の雌性器官（例えば穂）に滴下する、植物体の雌性器官を浸漬する、あるいは該菌懸濁液を植物体の雌性器官に噴霧又は塗布することにより接触させる。
アグロバクテリウムは、懸濁前に例えばＬＢ培地等の液体培地で任意のＯＤ（例えばOD600:約2.0）まで培養し、遠心分離により集菌したものを用いてもよい。
工程（１−１）及び／又は（２−１）のアグロバクテリウムは、さらにT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドを形質転換されていてもよい。
前記形質転換植物の作製方法は、さらに工程（１−１）及び／又は（２−１）の前に、工程（１−１）及び／又は（２−１）と同時に、又は工程（１−１）及び／又は（２−１）と工程（１−２）及び／又は（２−２）の間に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程を含んでもよい。
工程（１−１）及び／又は（２−１）の「接触させることによりアグロバクテリウムを接種」は、前記アグロバクテリウムを対象の植物体に接触することで植物体内に導入する。接触方法は、特に限定されないが、例えばアグロバクテリウムを液体（例えば滅菌水、スクロース溶液。例えばSilwet L-77等の任意の添加物を含んでもよい）に懸濁した菌懸濁液を植物体の雌性器官（例えば穂）に滴下する、植物体の雌性器官を浸漬する、あるいは該菌懸濁液を植物体の雌性器官に噴霧又は塗布することにより接触させる。
アグロバクテリウムは、懸濁前に例えばＬＢ培地等の液体培地で任意のＯＤ（例えばOD600:約2.0）まで培養し、遠心分離により集菌したものを用いてもよい。
工程（１−１）及び／又は（２−１）のアグロバクテリウムは、さらにT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドを形質転換されていてもよい。
前記形質転換植物の作製方法は、さらに工程（１−１）及び／又は（２−１）の前に、工程（１−１）及び／又は（２−１）と同時に、又は工程（１−１）及び／又は（２−１）と工程（１−２）及び／又は（２−２）の間に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程を含んでもよい。
工程（１−３）及び／又は（２−３）の「多湿・暗条件下にする」は、アグロバクテリウムを接触した植物体を以下のような多湿・暗条件下にできればよく、例えば以下のような多湿・暗条件下において放置、設置又は撹拌してもよく、好ましくは以下のような多湿・暗条件下において放置する。
多湿（多湿条件）とは、湿度５０％以上であればよく、湿度９０％〜１００％が好ましい。
暗条件とは、特に限定されないが、例えば０〜０．５ルクス、０〜１ルクス、０〜２ルクス等の植物にダメージがなく抵抗性が低下する暗さが挙げられる。
多湿・暗条件を実現する方法は特に限定されないが、密閉容器等の通気性の低い容器内に植物体と水を設置（放置）することにより多湿かつ暗条件にすることが好ましく、密閉容器内に植物体（植木鉢、土、肥料等を含んでもよい）を設置し、密閉容器内に5 mL〜5000 mL、10 mL〜2000 mL、50 mL〜1000mL、100 mL〜1000 mL又は500 mL〜1000 mLの水を張ることがより好ましい。
密閉容器は、容器内の湿度を９０〜１００％に保持できかつ暗所にできれば特に限定されないが、例えばミッペール（富士システムパック）等のゴムパッキンにより密閉された容器が挙げられる。
多湿・暗条件下にする温度は、植物が生存可能な温度であれば特に限定されないが、１５℃〜３０℃が好ましく、２０℃〜２５℃がより好ましく、約２２℃が最も好ましい。
多湿・暗条件下にする期間は、特に限定されないが、１時間〜２週間、１２時間〜１週間でもよく、１〜６日間が好ましく、１〜５日間がより好ましく、１〜４日間がさらに好ましい。
多湿（多湿条件）とは、湿度５０％以上であればよく、湿度９０％〜１００％が好ましい。
暗条件とは、特に限定されないが、例えば０〜０．５ルクス、０〜１ルクス、０〜２ルクス等の植物にダメージがなく抵抗性が低下する暗さが挙げられる。
多湿・暗条件を実現する方法は特に限定されないが、密閉容器等の通気性の低い容器内に植物体と水を設置（放置）することにより多湿かつ暗条件にすることが好ましく、密閉容器内に植物体（植木鉢、土、肥料等を含んでもよい）を設置し、密閉容器内に5 mL〜5000 mL、10 mL〜2000 mL、50 mL〜1000mL、100 mL〜1000 mL又は500 mL〜1000 mLの水を張ることがより好ましい。
密閉容器は、容器内の湿度を９０〜１００％に保持できかつ暗所にできれば特に限定されないが、例えばミッペール（富士システムパック）等のゴムパッキンにより密閉された容器が挙げられる。
多湿・暗条件下にする温度は、植物が生存可能な温度であれば特に限定されないが、１５℃〜３０℃が好ましく、２０℃〜２５℃がより好ましく、約２２℃が最も好ましい。
多湿・暗条件下にする期間は、特に限定されないが、１時間〜２週間、１２時間〜１週間でもよく、１〜６日間が好ましく、１〜５日間がより好ましく、１〜４日間がさらに好ましい。
本発明の形質転換植物の作製方法は、工程（１−１）と工程（１−２）の間、工程（２−１）と工程（２−２）の間に、「該植物体を任意の条件で生育する工程」をさらに含んでもよい。「任意の条件で生育」は、植物体を目的遺伝子が発現するまで生育させることができれば特に限定されないが、好ましくは蕾がつくまで生育する。
生育の温度条件は、植物が生存可能な温度であれば特に限定されないが、１５℃〜３０℃が好ましく、２０℃〜２５℃がより好ましく、約２２℃が最も好ましい。
生育の明暗条件は、植物が生存可能であれば特に限定されない。例えば、８〜１６時間明条件（Light条件）／１６〜８時間暗条件（Dark条件）、９〜１３時間明条件（Light条件）／１５〜１１時間暗条件（Dark条件）であってもよく、１１時間明条件／１３時間暗条件が好ましい。
生育の温度条件は、植物が生存可能な温度であれば特に限定されないが、１５℃〜３０℃が好ましく、２０℃〜２５℃がより好ましく、約２２℃が最も好ましい。
生育の明暗条件は、植物が生存可能であれば特に限定されない。例えば、８〜１６時間明条件（Light条件）／１６〜８時間暗条件（Dark条件）、９〜１３時間明条件（Light条件）／１５〜１１時間暗条件（Dark条件）であってもよく、１１時間明条件／１３時間暗条件が好ましい。
工程（１−２）及び／又は（２−２）の「植物体を切断する工程」は特に限定されないが、目的遺伝子を導入された部位及び／又は雌性器官（例えば穂）を含むように切断することが好ましい。目的遺伝子を導入された部位及び／又は雌性器官（例えば穂）を含むように切断する方法として、例えば植物体を茎中心付近で切断してもよく、好ましくは植物体を茎の先端（茎頂）から８〜１５ｃｍを含むように切断する。
工程（２−４）の「種子を収穫できるまで生育」は、植物体を、種子を収穫できるまで生育させることができれば特に限定されないが、得られる種子の数を増やす観点から受粉させる工程を含むことが望ましい。受粉は、自家受粉及び他家受粉を含み、好ましくは他家受粉である。
生育の温度条件は、植物体を種子を収穫できるまで生育させることが可能な温度であれば特に限定されないが、１５℃〜３０℃が好ましく、２０℃〜２５℃がより好ましく、約２２℃が最も好ましい。
生育の明暗条件は、植物体を種子を収穫できるまで生育させることが可能であれば特に限定されない。例えば、８〜１６時間明条件（Light条件）／１６〜８時間暗条件（Dark条件）、９〜１３時間明条件（Light条件）／１５〜１１時間暗条件（Dark条件）であってもよく、１１時間明条件／１３時間暗条件が好ましい。
工程（２−４）の「目的遺伝子が導入された種子」は、細胞内、好ましくはゲノム内に目的遺伝子の塩基配列を含む核酸分子を有すれば特に限定されないが、目的遺伝子のホモ接合体及び／又はヘテロ接合体を含む。
本発明の形質転換植物の作製方法は、工程（２−４）の後に、「目的遺伝子が導入された種子から目的遺伝子のホモ接合体を含む種子を選抜する工程を含んでもよい。
生育の温度条件は、植物体を種子を収穫できるまで生育させることが可能な温度であれば特に限定されないが、１５℃〜３０℃が好ましく、２０℃〜２５℃がより好ましく、約２２℃が最も好ましい。
生育の明暗条件は、植物体を種子を収穫できるまで生育させることが可能であれば特に限定されない。例えば、８〜１６時間明条件（Light条件）／１６〜８時間暗条件（Dark条件）、９〜１３時間明条件（Light条件）／１５〜１１時間暗条件（Dark条件）であってもよく、１１時間明条件／１３時間暗条件が好ましい。
工程（２−４）の「目的遺伝子が導入された種子」は、細胞内、好ましくはゲノム内に目的遺伝子の塩基配列を含む核酸分子を有すれば特に限定されないが、目的遺伝子のホモ接合体及び／又はヘテロ接合体を含む。
本発明の形質転換植物の作製方法は、工程（２−４）の後に、「目的遺伝子が導入された種子から目的遺伝子のホモ接合体を含む種子を選抜する工程を含んでもよい。
（floral dip非切断密閉法１）
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程。
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程。
（floral dip非切断密閉法２）
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
（floral dip非切断密閉法３）
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子、又は目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
［本発明の形質転換剤、形質転換補助剤］
本発明は、以下の形質転換剤を対象とする。
T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含む形質転換剤。
また、本発明は、アブシジン酸を含むアグロバクテリウムを使用した植物用形質転換補助剤も対象とする。
アブシジン酸を含むアグロバクテリウムを使用した植物用形質転換補助剤は、アグロバクテリウムを用いた植物の形質転換法（例えばfloral dip法）に使用できる。使用態様は特に限定されないが、アグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程の前、同時、又は後に、アブシジン酸を含む植物用形質転換補助剤を対象の植物体に接触させることにより使用できる。例えば、目的遺伝子を有するアグロバクテリウムを含む懸濁液に、アブシジン酸を含む植物用形質転換補助剤を混合し、混合液を形質転換する植物体に接触、塗布又は噴霧することにより形質転換できる。
本発明は、以下の形質転換剤を対象とする。
T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含む形質転換剤。
また、本発明は、アブシジン酸を含むアグロバクテリウムを使用した植物用形質転換補助剤も対象とする。
アブシジン酸を含むアグロバクテリウムを使用した植物用形質転換補助剤は、アグロバクテリウムを用いた植物の形質転換法（例えばfloral dip法）に使用できる。使用態様は特に限定されないが、アグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることにより菌を接種する工程の前、同時、又は後に、アブシジン酸を含む植物用形質転換補助剤を対象の植物体に接触させることにより使用できる。例えば、目的遺伝子を有するアグロバクテリウムを含む懸濁液に、アブシジン酸を含む植物用形質転換補助剤を混合し、混合液を形質転換する植物体に接触、塗布又は噴霧することにより形質転換できる。
（植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター）
植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーターは、特に限定されないが、例えば、CaMV 35Sプロモーター、アグロバクテリウム由来のプロモーター（例えばNos (Nopaline synthase) promoter等）、薬剤誘導プロモーター（例えばアルコール脱水素酵素（alcA）プロモーター、UASプロモーター等）、植物遺伝子のプロモーター（例えばユビキチンプロモーター等）等が挙げられ、好ましくはCaMV 35Sプロモーターである。
植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーターは、特に限定されないが、例えば、CaMV 35Sプロモーター、アグロバクテリウム由来のプロモーター（例えばNos (Nopaline synthase) promoter等）、薬剤誘導プロモーター（例えばアルコール脱水素酵素（alcA）プロモーター、UASプロモーター等）、植物遺伝子のプロモーター（例えばユビキチンプロモーター等）等が挙げられ、好ましくはCaMV 35Sプロモーターである。
（目的遺伝子）
目的遺伝子は、植物細胞内で発現可能な遺伝子であれば、特に限定されない。例えば、塩ストレス等の環境ストレス耐性遺伝子、ベタレイン色素等の有用2次代謝物質合成酵素遺伝子、開花誘導遺伝子、草丈を制御する遺伝子、エタノールで活性化される転写因子遺伝子、エストロジェンで転写活性される転写因子遺伝子、デキサメタゾンで活性化される転写因子遺伝子等の有用遺伝子が挙げられる。有用遺伝子は、ゲノム編集や目的遺伝子の過剰発現及び／又は発現抑制等を行うことにより単離・利用できる。
目的遺伝子は、植物細胞内で発現可能な遺伝子であれば、特に限定されない。例えば、塩ストレス等の環境ストレス耐性遺伝子、ベタレイン色素等の有用2次代謝物質合成酵素遺伝子、開花誘導遺伝子、草丈を制御する遺伝子、エタノールで活性化される転写因子遺伝子、エストロジェンで転写活性される転写因子遺伝子、デキサメタゾンで活性化される転写因子遺伝子等の有用遺伝子が挙げられる。有用遺伝子は、ゲノム編集や目的遺伝子の過剰発現及び／又は発現抑制等を行うことにより単離・利用できる。
（薬剤耐性遺伝子）
薬剤耐性遺伝子は、形質転換植物から目的遺伝子が導入された種子の選抜ができれば特に限定されないが、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子（hygromycin phosphotransferase；HPT）、ビアラホス（ビアラフォス）耐性遺伝子（phosphinothricinN-acetyltransferase；Bar）、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が挙げられる。
薬剤耐性遺伝子は、形質転換植物から目的遺伝子が導入された種子の選抜ができれば特に限定されないが、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子（hygromycin phosphotransferase；HPT）、ビアラホス（ビアラフォス）耐性遺伝子（phosphinothricinN-acetyltransferase；Bar）、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が挙げられる。
（発現ベクター）
発現ベクターは、植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターであれば、特に限定されない。例えば、pCAMBIA1301、pCAMBIA-CqCYP76AD1-1、pBIC35BP、pBI121、pER8、pTA70001、pBICERToMV等が挙げられるが、pCAMBIA1301が好ましい。
発現ベクターの植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を挿入することにより、植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターを作製できる。
発現ベクターは、植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターであれば、特に限定されない。例えば、pCAMBIA1301、pCAMBIA-CqCYP76AD1-1、pBIC35BP、pBI121、pER8、pTA70001、pBICERToMV等が挙げられるが、pCAMBIA1301が好ましい。
発現ベクターの植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を挿入することにより、植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を担持した発現ベクターを作製できる。
（アグロバクテリウム）
アグロバクテリウムは、発現ベクターを植物細胞内に組み込む能力を有する。アグロバクテリウムは、発現ベクターを好ましくは核内に、より好ましくは染色体に、組み込む能力を有する。
本発明に使用するアグロバクテリウムは特に限定されないが、例えばRhizobium radiobacter（例えばGV3101株（参照：Bioimpacts. 2017;7(4):247-254.doi: 10.15171/bi.2017.29. Epub 2017 Sep 18.）、MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株等（農業生物資源ジーンバンクhttps://www.gene.affrc.go.jp/databases-micro_search.phpにてMAFF番号から検索可能））、Rhizobiumrhizogenes（例えばATCC15834株（アメリカ・タイプカルチャーコレクションから入手可能）、MAFF211729株等）およびRhizobium vitis（例えばMAFF663001株等）等が挙げられ、floral dip切断密閉法及びfloral dip非切断密閉法においてMAFF301276株、MAFF311303株が好ましい。後述する実施例において、MAFF301276はキヌア植物において他の菌株よりきわめて高い形質転換能力を持つこと、MAFF311303は非病原性にもかかわらず雌性器官にのみ特異的に感染できることを確認した。
本発明の形質転換作製方法は、２種類のアグロバクテリウム株を混合して用いてもよい。
２種類のアグロバクテリウム株の組み合わせは、特に限定されないが、floral dip切断密閉法では、Kd系統においてはGV3301株×ATCC15834株、GV3301株×MAFF211729株、GV3301株×MAFF663001株、MAFF212033株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株が好ましく、変異体ghy又は変異体ghy/rebcにおいてはGV3301株×MAFF311303株、MAFF301276株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株、MAFF211729株×MAFF663001株が好ましい。
アグロバクテリウムは、発現ベクターを植物細胞内に組み込む能力を有する。アグロバクテリウムは、発現ベクターを好ましくは核内に、より好ましくは染色体に、組み込む能力を有する。
本発明に使用するアグロバクテリウムは特に限定されないが、例えばRhizobium radiobacter（例えばGV3101株（参照：Bioimpacts. 2017;7(4):247-254.doi: 10.15171/bi.2017.29. Epub 2017 Sep 18.）、MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株等（農業生物資源ジーンバンクhttps://www.gene.affrc.go.jp/databases-micro_search.phpにてMAFF番号から検索可能））、Rhizobiumrhizogenes（例えばATCC15834株（アメリカ・タイプカルチャーコレクションから入手可能）、MAFF211729株等）およびRhizobium vitis（例えばMAFF663001株等）等が挙げられ、floral dip切断密閉法及びfloral dip非切断密閉法においてMAFF301276株、MAFF311303株が好ましい。後述する実施例において、MAFF301276はキヌア植物において他の菌株よりきわめて高い形質転換能力を持つこと、MAFF311303は非病原性にもかかわらず雌性器官にのみ特異的に感染できることを確認した。
本発明の形質転換作製方法は、２種類のアグロバクテリウム株を混合して用いてもよい。
２種類のアグロバクテリウム株の組み合わせは、特に限定されないが、floral dip切断密閉法では、Kd系統においてはGV3301株×ATCC15834株、GV3301株×MAFF211729株、GV3301株×MAFF663001株、MAFF212033株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株が好ましく、変異体ghy又は変異体ghy/rebcにおいてはGV3301株×MAFF311303株、MAFF301276株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株、MAFF211729株×MAFF663001株が好ましい。
（対象の植物体）
本発明の形質転換植物の作製方法及び本発明の形質転換剤を使用する対象の植物体は、特に限定されない。例えば、被子植物、裸子植物、双子葉植物、単子葉植物、ヒユ科植物、イネ科植物、アカザ属植物、キヌア（Chenopodium quinoa）、イネ、オオムギ、コムギ、ホウレンソウ、ビート、シロイヌナズナ、アマランサス、シロザ、タルウマゴヤシ等が挙げられ、被子植物が好ましく、キヌアがより好ましい。
キヌアは、特に限定されないが、Kd系統、85系統、108系統、変異体green hypocotyl（ghy）（Imamura T, Takagi H, Miyazato A, OhkiS, Mizukoshi H, Mori M (2018)Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 496(2):280-286）、変異体reducedepidermalbladder cells 1（rebc：全長482アミノ酸残基からなり、139から432番目まで領域にWD40ドメインを持つタンパク質（Acc.No. XP_021715187）をコードするREBC遺伝子の1139番目のG(グアニン)がA(アデニン)に変化することにより380番目のアミノ酸であるTrp(トリプトファン)がSTOPに変化している変異体）、並びに、ghyおよび変異体rebcを交配して得た変異体ghy/rebcであってもよく、変異体ghy、変異体ghy/rebcが好ましい。
本発明の形質転換植物の作製方法及び本発明の形質転換剤を使用する対象の植物体は、特に限定されない。例えば、被子植物、裸子植物、双子葉植物、単子葉植物、ヒユ科植物、イネ科植物、アカザ属植物、キヌア（Chenopodium quinoa）、イネ、オオムギ、コムギ、ホウレンソウ、ビート、シロイヌナズナ、アマランサス、シロザ、タルウマゴヤシ等が挙げられ、被子植物が好ましく、キヌアがより好ましい。
キヌアは、特に限定されないが、Kd系統、85系統、108系統、変異体green hypocotyl（ghy）（Imamura T, Takagi H, Miyazato A, OhkiS, Mizukoshi H, Mori M (2018)Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 496(2):280-286）、変異体reducedepidermalbladder cells 1（rebc：全長482アミノ酸残基からなり、139から432番目まで領域にWD40ドメインを持つタンパク質（Acc.No. XP_021715187）をコードするREBC遺伝子の1139番目のG(グアニン)がA(アデニン)に変化することにより380番目のアミノ酸であるTrp(トリプトファン)がSTOPに変化している変異体）、並びに、ghyおよび変異体rebcを交配して得た変異体ghy/rebcであってもよく、変異体ghy、変異体ghy/rebcが好ましい。
（T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド）
T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドは、T-DNA領域が除去されていれば特に限定されない。
T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドは、T-DNA領域が除去されていれば特に限定されない。
以下に具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
［植物材料］
本実施例で用いたキヌアKd系統は京都大学、85系統および108系統はU.S. Department of Agriculture（USDA）（Independence Avenue、 Washington DC、 USA）から入手した。また、108系統由来のEMS突然変異種子（M1）を、M3世代が得られるまで生育し、その中からgreen hypocotyl（ghy）（Imamura T, Takagi H, Miyazato A, OhkiS, Mizukoshi H, Mori M (2018) Biochemicaland Biophysical ResearchCommunications 496(2):280-286）およびreduced epidermal bladder cells（rebc）を得た。さらに変異体ghyおよび変異体rebcを交配しghy/rebcを作出した（図２〜図５）。
本実施例で用いたキヌアKd系統は京都大学、85系統および108系統はU.S. Department of Agriculture（USDA）（Independence Avenue、 Washington DC、 USA）から入手した。また、108系統由来のEMS突然変異種子（M1）を、M3世代が得られるまで生育し、その中からgreen hypocotyl（ghy）（Imamura T, Takagi H, Miyazato A, OhkiS, Mizukoshi H, Mori M (2018) Biochemicaland Biophysical ResearchCommunications 496(2):280-286）およびreduced epidermal bladder cells（rebc）を得た。さらに変異体ghyおよび変異体rebcを交配しghy/rebcを作出した（図２〜図５）。
［菌株およびプラスミド］
実験に使用した菌株は、Rhizobium radiobacter（GV3101株、MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株）、Rhizobium rhizogenes（ATCC15834株、MAFF211729株）およびRhizobium vitis（MAFF663001株）の7菌株を使用した（表１）。本実施例で新たに使用したMAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株、MAFF211729株、MAFF663001株は、農業生物資源ジーンバンク（つくば、日本）より入手した日本産の野生株である。
バイナリーベクターpBIC35BP（Mori M,Kaindo M, Okuno T, Frusawa I (1993) Federation BiochemicalSocieties336(1):171-174）はカリフラワーモザイクウイルス（Cauliflower mosaic virus：CaMV）の35Sプロモーター制御下にビアラホス耐性遺伝子（phosphinothricin N-acetyltransferase；Bar）、バイナリーベクターpCAMBIA1301はCaMV 35Sプロモーター制御下にイントロン-gusA遺伝子（β-glucuronidase；GUS ）（Jefferson RA,Kavanagh TA, Bevan MW(1987) The EMBO Journal 6(13):3901-3907）およびハイグロマイシン耐性遺伝子（hygromycinphosphotransferase；HPT）、バイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1は、CaMV 35Sプロモーター制御下にベタレイン色素合成関連遺伝子CqCYP76AD1-1を保有する（図６）（Imamura T, Takagi H,Miyazato A, Ohki S, Mizukoshi H, Mori M (2018) Biochemicaland BiophysicalResearch Communications 496(2):280-286）。MAFF301276株にはバイナリーベクターpCAMBIA1301およびバイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1、その他の6菌株にはバイナリーベクターpCAMBIA1301をtriparental mating法（Wise AA, Liu Z,Binns AN(2006) Methods in Molecular Biology 343:43-53）により形質転換し、感染実験に使用した。
実験に使用した菌株は、Rhizobium radiobacter（GV3101株、MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株）、Rhizobium rhizogenes（ATCC15834株、MAFF211729株）およびRhizobium vitis（MAFF663001株）の7菌株を使用した（表１）。本実施例で新たに使用したMAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株、MAFF211729株、MAFF663001株は、農業生物資源ジーンバンク（つくば、日本）より入手した日本産の野生株である。
バイナリーベクターpBIC35BP（Mori M,Kaindo M, Okuno T, Frusawa I (1993) Federation BiochemicalSocieties336(1):171-174）はカリフラワーモザイクウイルス（Cauliflower mosaic virus：CaMV）の35Sプロモーター制御下にビアラホス耐性遺伝子（phosphinothricin N-acetyltransferase；Bar）、バイナリーベクターpCAMBIA1301はCaMV 35Sプロモーター制御下にイントロン-gusA遺伝子（β-glucuronidase；GUS ）（Jefferson RA,Kavanagh TA, Bevan MW(1987) The EMBO Journal 6(13):3901-3907）およびハイグロマイシン耐性遺伝子（hygromycinphosphotransferase；HPT）、バイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1は、CaMV 35Sプロモーター制御下にベタレイン色素合成関連遺伝子CqCYP76AD1-1を保有する（図６）（Imamura T, Takagi H,Miyazato A, Ohki S, Mizukoshi H, Mori M (2018) Biochemicaland BiophysicalResearch Communications 496(2):280-286）。MAFF301276株にはバイナリーベクターpCAMBIA1301およびバイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1、その他の6菌株にはバイナリーベクターpCAMBIA1301をtriparental mating法（Wise AA, Liu Z,Binns AN(2006) Methods in Molecular Biology 343:43-53）により形質転換し、感染実験に使用した。
［組織培養技術を用いた実験］
（無菌キヌア植物体の育成）
キヌア種子（約10粒）を、1 mLの滅菌溶液（20 ml/L Plant Preservative Mixture；PPM（Plant Cell Technology、 Jefferson、 Washington DC、 USA）、20 ml/L Tween20、1 ml/L 1 M MgCl2）に入れ、プチローター（ワケンビーテック、京都、日本）を用いて6時間攪拌した（1.5 mLエッペンチューブ使用）。その後、チューブ中の滅菌溶液を除去し、同じ組成の滅菌溶液を500 μL加え、ピペットを用いて攪拌し洗浄した。同様の操作を1回行った後、クリーンベンチ内で発芽培地へ置床した（表２）。そして20℃、8時間Light/16時間Dark条件下で生育した。
（無菌キヌア植物体の育成）
キヌア種子（約10粒）を、1 mLの滅菌溶液（20 ml/L Plant Preservative Mixture；PPM（Plant Cell Technology、 Jefferson、 Washington DC、 USA）、20 ml/L Tween20、1 ml/L 1 M MgCl2）に入れ、プチローター（ワケンビーテック、京都、日本）を用いて6時間攪拌した（1.5 mLエッペンチューブ使用）。その後、チューブ中の滅菌溶液を除去し、同じ組成の滅菌溶液を500 μL加え、ピペットを用いて攪拌し洗浄した。同様の操作を1回行った後、クリーンベンチ内で発芽培地へ置床した（表２）。そして20℃、8時間Light/16時間Dark条件下で生育した。
（アグロバクテリウムによる癌腫形成の誘導）
実験に用いた菌株は、100 mg/Lカナマイシンおよび100mg/Lハイグロマイシンを添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を、白金耳を用いて100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加した50 mL LB液体培地（300 mL三角フラスコ使用）へ移植し、振とう式恒温水槽BW201（ヤマト科学、東京、日本）を用いて、26℃、約24時間、約130 rpmの条件で培養した（表２）。培養後、菌培養液（OD600＝約2.0）を50 mL コニカルチューブに移し、Mx-301 Highspeed Refrigerated Micro Centrifuge（トミー精工、東京、日本）を用いて遠心分離した（10分間、60,000rpm）。上清を破棄後、10 mLの滅菌水を加えてVORTEX-GENIE2（Scientific Industries、 Bohemia、 NY、 USA）を用いて再懸濁し、菌懸濁液を作成した。1.6 mLの菌懸濁液とともに無菌状態で生育した播種後3日目のキヌアをプラスチックシャーレに入れ、菌懸濁液に浸しながらキヌアの胚軸中央部をメスで切断した。切断後、感染キヌアを共存培地へ置床し、20℃、24時間Dark条件下で4日間、共存培養を行った（表２）。共存培養を行ったキヌアを、滅菌水に100 mg/L カルベニシリンを添加した洗浄液の入った300 mL ビーカーへ入れ、軽く振盪させながら洗浄した。新しい洗浄液と交換し、同様の洗浄操作を、さらに2回行った。洗浄後、キヌアに付着した洗浄液を滅菌ろ紙で除去し、癌腫誘導培地へ置床した（表２）。その後、20℃、8時間Light/16時間Dark条件下で培養した。
実験に用いた菌株は、100 mg/Lカナマイシンおよび100mg/Lハイグロマイシンを添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を、白金耳を用いて100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加した50 mL LB液体培地（300 mL三角フラスコ使用）へ移植し、振とう式恒温水槽BW201（ヤマト科学、東京、日本）を用いて、26℃、約24時間、約130 rpmの条件で培養した（表２）。培養後、菌培養液（OD600＝約2.0）を50 mL コニカルチューブに移し、Mx-301 Highspeed Refrigerated Micro Centrifuge（トミー精工、東京、日本）を用いて遠心分離した（10分間、60,000rpm）。上清を破棄後、10 mLの滅菌水を加えてVORTEX-GENIE2（Scientific Industries、 Bohemia、 NY、 USA）を用いて再懸濁し、菌懸濁液を作成した。1.6 mLの菌懸濁液とともに無菌状態で生育した播種後3日目のキヌアをプラスチックシャーレに入れ、菌懸濁液に浸しながらキヌアの胚軸中央部をメスで切断した。切断後、感染キヌアを共存培地へ置床し、20℃、24時間Dark条件下で4日間、共存培養を行った（表２）。共存培養を行ったキヌアを、滅菌水に100 mg/L カルベニシリンを添加した洗浄液の入った300 mL ビーカーへ入れ、軽く振盪させながら洗浄した。新しい洗浄液と交換し、同様の洗浄操作を、さらに2回行った。洗浄後、キヌアに付着した洗浄液を滅菌ろ紙で除去し、癌腫誘導培地へ置床した（表２）。その後、20℃、8時間Light/16時間Dark条件下で培養した。
（形質転換カルス実験）
実験に用いた菌株は、100 mg/Lの抗生物質（バイナリーベクターpBIC35BP を保有する菌株の培養にはカナマイシンおよびビアラホス、バイナリーベクターpCAMBIA1301を保有する菌株の培養にはカナマイシンおよびハイグロマイシン）を添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を薬さじでかき取り、50 mL 共存培養液体培地（100 mL三角フラスコ内）へ移植した（表２）。移植後、振とう式恒温水槽BW201を用いて26℃、約30分間、約120 rpmの条件で培養した。植物培養試験管に、菌培養液（OD600＝約0.2）を4 mL入れ、その中で無菌キヌア切片を2分間感染させた。滅菌ろ紙を用いて、胚軸切片に付着した過剰な菌培養液を除去し、共存培養固体培地へ置床した（表２）。置床後、20℃、24時間Dark条件下で2日間培養した。共存培養を行った切片を、滅菌水に100 mg/L カルベニシリンを添加した洗浄液が約10 mL入った植物培養試験管に入れ、P1000ピペットマン（Gilson、 Manhattan、NY、 USA）で攪拌しながら洗浄した。新しい洗浄液と交換し、同様の洗浄操作を、さらに1回行った。洗浄後、切片に付着した洗浄液を滅菌ろ紙で除去し、カルス誘導選抜培地へ置床した（表２）。その後、20℃、8時間Light/16時間Dark条件下で培養し、3週間ごとに新しい培地へ移植した。（本手法は、形質転換プロトコール「植物編」に記載の大谷によるサツマイモの形質転換法を一部改変して実施した（田部井豊 (2012) 形質転換プロトコール. 化学同人, pp.71-78）。）
実験に用いた菌株は、100 mg/Lの抗生物質（バイナリーベクターpBIC35BP を保有する菌株の培養にはカナマイシンおよびビアラホス、バイナリーベクターpCAMBIA1301を保有する菌株の培養にはカナマイシンおよびハイグロマイシン）を添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を薬さじでかき取り、50 mL 共存培養液体培地（100 mL三角フラスコ内）へ移植した（表２）。移植後、振とう式恒温水槽BW201を用いて26℃、約30分間、約120 rpmの条件で培養した。植物培養試験管に、菌培養液（OD600＝約0.2）を4 mL入れ、その中で無菌キヌア切片を2分間感染させた。滅菌ろ紙を用いて、胚軸切片に付着した過剰な菌培養液を除去し、共存培養固体培地へ置床した（表２）。置床後、20℃、24時間Dark条件下で2日間培養した。共存培養を行った切片を、滅菌水に100 mg/L カルベニシリンを添加した洗浄液が約10 mL入った植物培養試験管に入れ、P1000ピペットマン（Gilson、 Manhattan、NY、 USA）で攪拌しながら洗浄した。新しい洗浄液と交換し、同様の洗浄操作を、さらに1回行った。洗浄後、切片に付着した洗浄液を滅菌ろ紙で除去し、カルス誘導選抜培地へ置床した（表２）。その後、20℃、8時間Light/16時間Dark条件下で培養し、3週間ごとに新しい培地へ移植した。（本手法は、形質転換プロトコール「植物編」に記載の大谷によるサツマイモの形質転換法を一部改変して実施した（田部井豊 (2012) 形質転換プロトコール. 化学同人, pp.71-78）。）
（GUS染色によるgusAの確認）
GUS遺伝子の発現を確認するため、感染したキヌア実生切片（「アグロバクテリウムによる癌腫形成の誘導」）、もしくは誘導したカルス（「形質転換カルス実験」参照）を5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronidecyclohexylamine salt（X-Gluc）染色液へ浸漬した（Jefferson RA, Kavanagh TA,Bevan MW (1987) The EMBO Journal6(13):3901-3907）（表４）。この時、組織間へ染色液が入るようにvacuum infiltrationを行った。その後、37℃、24時間Dark条件下で培養した。培養後、染色液を除去し、70％エタノールへ浸漬した。
GUS遺伝子の発現を確認するため、感染したキヌア実生切片（「アグロバクテリウムによる癌腫形成の誘導」）、もしくは誘導したカルス（「形質転換カルス実験」参照）を5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronidecyclohexylamine salt（X-Gluc）染色液へ浸漬した（Jefferson RA, Kavanagh TA,Bevan MW (1987) The EMBO Journal6(13):3901-3907）（表４）。この時、組織間へ染色液が入るようにvacuum infiltrationを行った。その後、37℃、24時間Dark条件下で培養した。培養後、染色液を除去し、70％エタノールへ浸漬した。
［floral dip法を用いた実験］
（キヌアの育生）
種まき培土（タキイ種苗、京都、日本）へ播種し（200穴トレイを使用）、22℃、11時間Light/13時間Dark条件下の植物培養室内で生育した。
（キヌアの育生）
種まき培土（タキイ種苗、京都、日本）へ播種し（200穴トレイを使用）、22℃、11時間Light/13時間Dark条件下の植物培養室内で生育した。
（floral dip法を用いたキヌア穂への菌接種実験）
実験に用いた菌は、100 mg/Lカナマイシンおよび100mg/Lハイグロマイシンを添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を、100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加した50 mL LB液体培地（300 mL三角フラスコ内）へ移植し、振とう式恒温水槽BW201を用いて26℃、約24時間、約130 rpmの条件で培養した。培養後、菌培養液（OD600＝約2.0）を50 mL コニカルチューブに移し、Mx-301 Highspeed Refrigerated Micro Centrifugeを用いて遠心分離した（10分間、60,000rpm）。上清を破棄後、Silwet L-77を含む5%（w/v）スクロース溶液20 mLを加え、VORTEX-GENIE2を用いて再懸濁し、菌懸濁液を作成した（実施例１に示す結果は0.02%（v/v）、実施例３に示す結果は0.04％（v/v）のSilwet L-77を使用して接種実験を行った）。菌懸濁液の接種時、使用するキヌアを、水を張った密閉容器（ミッペール（富士システムパック、東京、日本））へ入れ、P200ピペットマン（Gilson、Manhattan、 NY、 USA）を用いて穂へ菌懸濁液を滴下した。接種後、密閉容器の蓋を閉じてDark条件とし、22℃の植物培養室内で2日間放置した。その後は、22℃、11時間Light/13時間Dark条件下の植物培養室内で育生した。
実験に用いた菌は、100 mg/Lカナマイシンおよび100mg/Lハイグロマイシンを添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を、100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加した50 mL LB液体培地（300 mL三角フラスコ内）へ移植し、振とう式恒温水槽BW201を用いて26℃、約24時間、約130 rpmの条件で培養した。培養後、菌培養液（OD600＝約2.0）を50 mL コニカルチューブに移し、Mx-301 Highspeed Refrigerated Micro Centrifugeを用いて遠心分離した（10分間、60,000rpm）。上清を破棄後、Silwet L-77を含む5%（w/v）スクロース溶液20 mLを加え、VORTEX-GENIE2を用いて再懸濁し、菌懸濁液を作成した（実施例１に示す結果は0.02%（v/v）、実施例３に示す結果は0.04％（v/v）のSilwet L-77を使用して接種実験を行った）。菌懸濁液の接種時、使用するキヌアを、水を張った密閉容器（ミッペール（富士システムパック、東京、日本））へ入れ、P200ピペットマン（Gilson、Manhattan、 NY、 USA）を用いて穂へ菌懸濁液を滴下した。接種後、密閉容器の蓋を閉じてDark条件とし、22℃の植物培養室内で2日間放置した。その後は、22℃、11時間Light/13時間Dark条件下の植物培養室内で育生した。
（菌を接種した穂の切断および密閉処理）
菌接種後2週間目にキヌアを胚軸中心付近で切断した。切断後、キヌアをシャーレやタッパーの中に入れ、ビニールテープで容器の隙間を塞ぎ、3日間、多湿条件下に置いた。その後、育苗培土（タキイ種苗）の入った育苗用ポリポット（6cm）に挿し、22℃、11時間Light/13時間Dark条件下で種子が収穫できるまで生育した。
菌接種後2週間目にキヌアを胚軸中心付近で切断した。切断後、キヌアをシャーレやタッパーの中に入れ、ビニールテープで容器の隙間を塞ぎ、3日間、多湿条件下に置いた。その後、育苗培土（タキイ種苗）の入った育苗用ポリポット（6cm）に挿し、22℃、11時間Light/13時間Dark条件下で種子が収穫できるまで生育した。
（GUS発現個体の計測）
切断・密閉処理（−）の場合、接種処理後2週目のキヌアに、前述の「GUS染色によるgusAの確認」と同じ手順でGUS染色を行った。切断・密閉処理（＋）の場合、接種処理後2週目のキヌアに、切断・密閉処理（「菌を接種した穂の切断および密閉処理」参照）を行い、その後、「GUS染色によるgusAの確認」と同じ手順でGUS染色を行った。GUS染色および脱色処理後、発現が認められる個体数を計測した。「GUS発現を示す１個体」は、穂においてはGUS発現を１か所以上、雌性器官においては器官全体的にGUS発現を示す雌性器官を1つ以上有する個体とし、穂および雌性器官において、GUS染色率を計測した（図１）。雌性器官におけるGUS発現の計測は、実体顕微鏡Stemi2000-C（Carl Zeiss、 Jena、 Germany）を用いて行った。
切断・密閉処理（−）の場合、接種処理後2週目のキヌアに、前述の「GUS染色によるgusAの確認」と同じ手順でGUS染色を行った。切断・密閉処理（＋）の場合、接種処理後2週目のキヌアに、切断・密閉処理（「菌を接種した穂の切断および密閉処理」参照）を行い、その後、「GUS染色によるgusAの確認」と同じ手順でGUS染色を行った。GUS染色および脱色処理後、発現が認められる個体数を計測した。「GUS発現を示す１個体」は、穂においてはGUS発現を１か所以上、雌性器官においては器官全体的にGUS発現を示す雌性器官を1つ以上有する個体とし、穂および雌性器官において、GUS染色率を計測した（図１）。雌性器官におけるGUS発現の計測は、実体顕微鏡Stemi2000-C（Carl Zeiss、 Jena、 Germany）を用いて行った。
［菌および癌腫の解析］
（癌腫誘導）
MAFF301276株にバイナリーベクターpCAMBIA1301又はバイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1を導入した形質転換株を作成した（図６）。これらの菌は、100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間暗Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を、100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加した50 mL LB液体培地（300 mL三角フラスコ使用）へ移植し、振とう式恒温水槽BW201を用いて、26 ℃、約24時間、約130 rpmの条件で培養した。そして菌培養液（OD600＝約2.0）を50 mL コニカルチューブに移し、Mx-301 Highspeed Refrigerated Micro Centrifugeを用いて遠心分離した（10分間、60,000 rpm）。上清を破棄後、10 mLの共存液体培地を加えて、VORTEX-GENIE2を用いて再懸濁し、菌懸濁液を作成した（表２）。1.6 mLの菌懸濁液とともに無菌状態で生育した播種後7日目のキヌアをプラスチックシャーレに入れ、菌懸濁液に浸しながらキヌアの胚軸中央部をメスで切断した。切断後、「アグロバクテリウムによる癌腫形成の誘導」と同様の操作を行った。
（癌腫誘導）
MAFF301276株にバイナリーベクターpCAMBIA1301又はバイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1を導入した形質転換株を作成した（図６）。これらの菌は、100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加したLB固形培地に画線を引き、26℃、24時間暗Dark条件下で2日間培養した（表３）。増殖した菌を、100 mg/Lカナマイシンおよび100 mg/Lハイグロマイシンを添加した50 mL LB液体培地（300 mL三角フラスコ使用）へ移植し、振とう式恒温水槽BW201を用いて、26 ℃、約24時間、約130 rpmの条件で培養した。そして菌培養液（OD600＝約2.0）を50 mL コニカルチューブに移し、Mx-301 Highspeed Refrigerated Micro Centrifugeを用いて遠心分離した（10分間、60,000 rpm）。上清を破棄後、10 mLの共存液体培地を加えて、VORTEX-GENIE2を用いて再懸濁し、菌懸濁液を作成した（表２）。1.6 mLの菌懸濁液とともに無菌状態で生育した播種後7日目のキヌアをプラスチックシャーレに入れ、菌懸濁液に浸しながらキヌアの胚軸中央部をメスで切断した。切断後、「アグロバクテリウムによる癌腫形成の誘導」と同様の操作を行った。
（アグロバクテリウムMAFF301276株およびキヌアに生じた癌腫のDNA抽出）
MAFF301276株および3.5.1の実験で誘導した癌腫より、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN、 Valencia、 CA、 USA）を用いて付属のプロトコールに従い、DNAを抽出した。
MAFF301276株および3.5.1の実験で誘導した癌腫より、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN、 Valencia、 CA、 USA）を用いて付属のプロトコールに従い、DNAを抽出した。
（MinIONおよびサンガーシーケンスによる塩基配列の解析）
抽出したDNAをPCRにより増幅した。この増幅断片をExoSAP-IT Express PCR Cleanup Reagents（ThermoFisher Scientific、 Waltham、 MA、 USA）を用いて付属のプロトコールに従い精製した。精製断片を鋳型DNAとし、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ThermoFisherScientific）を用いてサンプルを調整し、96℃・1 分間、続いて96℃・10秒間、50℃・10秒間、60℃・2.5分間を35サイクルの条件でPCRを行った。シーケンス反応後、エタノールおよびホルムアルデヒドを用いてサンプルを精製し、ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer（AppliedBiosystems、 Foster City、 CA、 USA）を用いて塩基配列の解析を行った。さらに、同じDNAを石川県立大学の植物遺伝子機能学研究室に依頼し、MinION（Oxford Nanopore Technologies、 Oxford、 UK）による解析を行った（Lu H, Giordano F, Ning Z (2016) Genomics ProteomicsBioinformatics14(5): 265-279）。これらの解析結果とBlastおよびBlastx （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて、導入した遺伝子とキヌアゲノムを共に保持するリードの有無を分析した。
抽出したDNAをPCRにより増幅した。この増幅断片をExoSAP-IT Express PCR Cleanup Reagents（ThermoFisher Scientific、 Waltham、 MA、 USA）を用いて付属のプロトコールに従い精製した。精製断片を鋳型DNAとし、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ThermoFisherScientific）を用いてサンプルを調整し、96℃・1 分間、続いて96℃・10秒間、50℃・10秒間、60℃・2.5分間を35サイクルの条件でPCRを行った。シーケンス反応後、エタノールおよびホルムアルデヒドを用いてサンプルを精製し、ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer（AppliedBiosystems、 Foster City、 CA、 USA）を用いて塩基配列の解析を行った。さらに、同じDNAを石川県立大学の植物遺伝子機能学研究室に依頼し、MinION（Oxford Nanopore Technologies、 Oxford、 UK）による解析を行った（Lu H, Giordano F, Ning Z (2016) Genomics ProteomicsBioinformatics14(5): 265-279）。これらの解析結果とBlastおよびBlastx （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて、導入した遺伝子とキヌアゲノムを共に保持するリードの有無を分析した。
（PCR解析）
5種類のプライマーを設計し（図７、表５）、BlastによってT-DNAの挿入が予想されるキヌアゲノム領域（Quinoa genomedatabase Contig: Cqu_c08939）にMAFF301276株由来のTiプラスミドのT-DNA領域が導入されていることを調べるため、サーマルサイクラーBiometra TAdvanced（Analytik Jena, Jena、 Germany）を使用し、初期の熱変性は98.0℃・2分間、続いて98.0℃・10秒、51.6℃・30秒間、72.0℃・5分間を45サイクルの条件でPCRを行った。
5種類のプライマーを設計し（図７、表５）、BlastによってT-DNAの挿入が予想されるキヌアゲノム領域（Quinoa genomedatabase Contig: Cqu_c08939）にMAFF301276株由来のTiプラスミドのT-DNA領域が導入されていることを調べるため、サーマルサイクラーBiometra TAdvanced（Analytik Jena, Jena、 Germany）を使用し、初期の熱変性は98.0℃・2分間、続いて98.0℃・10秒、51.6℃・30秒間、72.0℃・5分間を45サイクルの条件でPCRを行った。
（キヌアにおけるfloral dip法に適した菌の作成および感染実験）
MAFF301276株およびMAFF311303株の特性を利用して、floral dip法に適した菌株を以下の手順で作成した。（１）MAFF301276株が保持しているTiプラスミド（pTiMAFF301276株T-DNA）からT-DNA領域を除去。（２）T-DNAを除去したTiプラスミド（pTiMAFF301276株ΔT-DNA）をMAFF311303株に導入。（３）pTiMAFF301276株ΔT-DNAを保持したMAFF311303 株（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）に、バイナリーベクターpCAMBIA1301を導入。
作成した菌株を使用し、「floral dip法を用いたキヌア穂への菌接種実験」の手順でキヌアへのfloral dip実験を行った。その後、「GUS発現個体の計測」の手順でGUS染色およびGUS発現個体の計測を行った。
MAFF301276株およびMAFF311303株の特性を利用して、floral dip法に適した菌株を以下の手順で作成した。（１）MAFF301276株が保持しているTiプラスミド（pTiMAFF301276株T-DNA）からT-DNA領域を除去。（２）T-DNAを除去したTiプラスミド（pTiMAFF301276株ΔT-DNA）をMAFF311303株に導入。（３）pTiMAFF301276株ΔT-DNAを保持したMAFF311303 株（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）に、バイナリーベクターpCAMBIA1301を導入。
作成した菌株を使用し、「floral dip法を用いたキヌア穂への菌接種実験」の手順でキヌアへのfloral dip実験を行った。その後、「GUS発現個体の計測」の手順でGUS染色およびGUS発現個体の計測を行った。
［floral dip切断密閉法の構築］
floral dip法を用いて遺伝子導入を試みた。
バイナリーベクターpCAMBIA1301が導入されたGV3101株を用いて、従来のfloral dip法で播種後30、40、45、50、55日目のKd系統の穂にGUS遺伝子の形質転換を試みた。その結果、穂におけるGUS染色は認められなかった（図８）。そこで、GV3101株の接種処理後2週目に、菌を接種したキヌアの茎を切断し、3日間の多湿密閉処理を行った。その結果、播種後40、45、50日目に接種実験を行ったキヌアの穂で、GUS発現が認められた（図９、表６）。穂の染色部位を解体すると、雌性器官でGUS染色が認められた（図１０）。MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株、ATCC15834株、MAFF211729株MAFF663001株においても同様の方法でGUS遺伝子の形質転換を試みた結果、同様の結果が得られた。
floral dip法に多湿・暗所条件（密閉）処理を加えた本手法を、「floral dip切断密閉法」とした（図１１）。
floral dip法を用いて遺伝子導入を試みた。
バイナリーベクターpCAMBIA1301が導入されたGV3101株を用いて、従来のfloral dip法で播種後30、40、45、50、55日目のKd系統の穂にGUS遺伝子の形質転換を試みた。その結果、穂におけるGUS染色は認められなかった（図８）。そこで、GV3101株の接種処理後2週目に、菌を接種したキヌアの茎を切断し、3日間の多湿密閉処理を行った。その結果、播種後40、45、50日目に接種実験を行ったキヌアの穂で、GUS発現が認められた（図９、表６）。穂の染色部位を解体すると、雌性器官でGUS染色が認められた（図１０）。MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株、ATCC15834株、MAFF211729株MAFF663001株においても同様の方法でGUS遺伝子の形質転換を試みた結果、同様の結果が得られた。
floral dip法に多湿・暗所条件（密閉）処理を加えた本手法を、「floral dip切断密閉法」とした（図１１）。
［脱分化細胞（カルス）の形質転換実験］
（Kd系統におけるアグロバクテリウム7菌株の形質転換カルス形成能力の比較）
バイナリーベクターpCAMBIA1301を持つアグロバクテリウム7菌株（GV3101株、ATCC15834株、MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株、MAFF211729株、MAFF663001株）を、Kd系統の胚軸切片に感染し、形質転換カルスの誘導を試みた。その結果、GV3101株およびMAFF301276株により誘導したカルスで、GUS発現が認められた（図１２、図１３）。GV3101株およびMAFF301276株の形質転換効率は、それぞれ4.4 ± 7.7%および85.6 ± 1.9%であった（平均値 ± 標準偏差）（図１４、表７）。
（Kd系統におけるアグロバクテリウム7菌株の形質転換カルス形成能力の比較）
バイナリーベクターpCAMBIA1301を持つアグロバクテリウム7菌株（GV3101株、ATCC15834株、MAFF301276株、MAFF212033株、MAFF311303株、MAFF211729株、MAFF663001株）を、Kd系統の胚軸切片に感染し、形質転換カルスの誘導を試みた。その結果、GV3101株およびMAFF301276株により誘導したカルスで、GUS発現が認められた（図１２、図１３）。GV3101株およびMAFF301276株の形質転換効率は、それぞれ4.4 ± 7.7%および85.6 ± 1.9%であった（平均値 ± 標準偏差）（図１４、表７）。
（アグロバクテリウムGV3101株およびMAFF301276株により感染実験を行ったキヌア6系統における形質転換カルス形成能力の比較）
キヌアは、ストレス耐性に関与するブラッダー細胞を茎頂や葉表面に形成する。ブラッダー細胞によるキヌアの形質転換への影響も考慮し、これらの組織形成能力が低下した変異体（rebc）、およびベタレイン色素合成能力とブラッダー細胞形成能力がともに低下した変異体（ghy/rebc）も形質転換効率を調査した。GV3101株をキヌアKd系統、85系統、108系統、変異体ghy、変異体rebcおよび変異体ghy/rebcの6系統に感染した場合、変異体ghy/rebc以外の5系統でカルスが形成された（図１５）。その中でGUS発現が確認できた系統は、85系統、変異体rebcおよび変異体ghyであり、GUS発現カルス形成率は、それぞれ21.1 ± 6.9%、6.7 ± 3.3%および1.1 ± 1.9%であった（平均値 ± 標準偏差）（図１６、図１７、表８）。一方、MAFF301276株をキヌア6系統に感染した場合、すべてのキヌア系統で形質転換カルスが形成され、GV3101株を用いた感染実験と比較して、GUS発現カルスの形成率は全系統で増加した（図１８−図２０、表９）。 Kd系統、85系統および変異体rebcは60％以上の形質転換効率が認められ、85系統は80.0±5.8%と最も高かった（平均値 ± 標準偏差）。
キヌアは、ストレス耐性に関与するブラッダー細胞を茎頂や葉表面に形成する。ブラッダー細胞によるキヌアの形質転換への影響も考慮し、これらの組織形成能力が低下した変異体（rebc）、およびベタレイン色素合成能力とブラッダー細胞形成能力がともに低下した変異体（ghy/rebc）も形質転換効率を調査した。GV3101株をキヌアKd系統、85系統、108系統、変異体ghy、変異体rebcおよび変異体ghy/rebcの6系統に感染した場合、変異体ghy/rebc以外の5系統でカルスが形成された（図１５）。その中でGUS発現が確認できた系統は、85系統、変異体rebcおよび変異体ghyであり、GUS発現カルス形成率は、それぞれ21.1 ± 6.9%、6.7 ± 3.3%および1.1 ± 1.9%であった（平均値 ± 標準偏差）（図１６、図１７、表８）。一方、MAFF301276株をキヌア6系統に感染した場合、すべてのキヌア系統で形質転換カルスが形成され、GV3101株を用いた感染実験と比較して、GUS発現カルスの形成率は全系統で増加した（図１８−図２０、表９）。 Kd系統、85系統および変異体rebcは60％以上の形質転換効率が認められ、85系統は80.0±5.8%と最も高かった（平均値 ± 標準偏差）。
（次世代シーケンサーおよびPCRを用いたキヌア実生癌腫組織におけるT-DNA挿入部位の解析）
MAFF301276株によるキヌアゲノムへの遺伝子導入部位を決定するために、MAFF301276株のゲノムDNAおよびMAFF301276株により誘導された癌腫（図２１）のゲノムDNAを、石川県立大学の植物遺伝子機能学研究室へ委託し、次世代シーケンサーMinIONを用いた解析を行った。癌腫より抽出したゲノムDNAを解析した結果、300万リード（約8 Gbp）の中に、バイナリーベクターpCAMBIA1301とキヌアゲノムが融合したリードが1リード存在した（図２２）。ゲノム挿入領域をBlastxで解析すると、バイナリーベクターpCAMBIA1301由来のハイグロマイシン遺伝子、MAFF301276株pTiプラスミド由来の2つオーキシン合成遺伝子（iaaH、iaaM）およびサイトカイニン合成酵素遺伝子（ipt）が存在しており、2種類のT-DNAが融合した状態でゲノムに挿入されていた。また、バイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1を有するMAFF301276株を感染したキヌア癌腫のゲノムDNAで、同様の解析を行った結果、バイナリーベクターpCAMBIA1301と同様に、2種類のT-DNAが融合した状態でキヌアゲノムへ挿入されていた。MAFF301276株のT-DNAとキヌアゲノムが隣接する部分に5種類のプライマーを設計し、6つのペアでPCR解析を行った結果（図７、表５）、菌とキヌアのゲノムの連結部を示すプライマーセット1、2、4および5で、遺伝子の増幅が認められた。PCRおよび次世代シーケンサーを用いた解析の結果、MAFF301276株は、キヌアゲノムに遺伝子を導入できることが明らかとなった。
MAFF301276株によるキヌアゲノムへの遺伝子導入部位を決定するために、MAFF301276株のゲノムDNAおよびMAFF301276株により誘導された癌腫（図２１）のゲノムDNAを、石川県立大学の植物遺伝子機能学研究室へ委託し、次世代シーケンサーMinIONを用いた解析を行った。癌腫より抽出したゲノムDNAを解析した結果、300万リード（約8 Gbp）の中に、バイナリーベクターpCAMBIA1301とキヌアゲノムが融合したリードが1リード存在した（図２２）。ゲノム挿入領域をBlastxで解析すると、バイナリーベクターpCAMBIA1301由来のハイグロマイシン遺伝子、MAFF301276株pTiプラスミド由来の2つオーキシン合成遺伝子（iaaH、iaaM）およびサイトカイニン合成酵素遺伝子（ipt）が存在しており、2種類のT-DNAが融合した状態でゲノムに挿入されていた。また、バイナリーベクターpCAMBIA-CqCYP76AD1-1を有するMAFF301276株を感染したキヌア癌腫のゲノムDNAで、同様の解析を行った結果、バイナリーベクターpCAMBIA1301と同様に、2種類のT-DNAが融合した状態でキヌアゲノムへ挿入されていた。MAFF301276株のT-DNAとキヌアゲノムが隣接する部分に5種類のプライマーを設計し、6つのペアでPCR解析を行った結果（図７、表５）、菌とキヌアのゲノムの連結部を示すプライマーセット1、2、4および5で、遺伝子の増幅が認められた。PCRおよび次世代シーケンサーを用いた解析の結果、MAFF301276株は、キヌアゲノムに遺伝子を導入できることが明らかとなった。
［floral dip切断密閉法による形質転換キヌアの作出］
（floral dip切断密閉法におけるキヌア4系統へのアグロバクテリウム7菌株のGUS遺伝子導入能力の比較）
雌性器官への遺伝子導入が可能であるfloral dip切断密閉法に適したキヌア系統およびアグロバクテリウム株の評価を行った。播種後50〜60日目のキヌア4系統（Kd、ghy、rebc、ghy/rebc）、およびバイナリーベクターpCAMBIA1301を導入したアグロバクテリウム7菌株（GV3101、ATCC15834、MAFF301276、MAFF212033、MAFF311303、MAFF211729、MAFF663001）を種々の組み合わせでfloral dip切断密閉法を行い、遺伝子の導入をGUS染色により評価した（表１０）。その結果、MAFF212033株、MAFF311303株およびMAFF211729株を用いた個体で、雌性器官においてGUS発現が認められ、特にMAFF311303株を用いた場合に、高い割合でGUS発現が認められた（図２３b、図２４、図２５）。これらの GUS発現は、がくや葯組織でも生じていたことから、雌性器官非特異的なGUS発現であると考えられた。これまでの実験では、切断・密閉処理が、floral dip法によるキヌアへの遺伝子導入に必要であったが、MAFF15834株、MAFF301276株、MAFF311303株、MAFF663001株を用いた感染実験では、切断・密閉処理（−）で、穂におけるGUS発現が認められ、形質転換カルス形成能力が最も高かったMAFF301276株は（図１４、表８）、供試したキヌア全系統の穂でGUS発現が認められた（図２６）。また、ブラッダー形成が抑制されているキヌア変異体2系統は、GUS発現個体の割合が高い傾向にあった。しかし、これらの切断・密閉処理（−）条件では、雌性器官におけるGUS発現は認められなかった（図２３a）。
（floral dip切断密閉法におけるキヌア4系統へのアグロバクテリウム7菌株のGUS遺伝子導入能力の比較）
雌性器官への遺伝子導入が可能であるfloral dip切断密閉法に適したキヌア系統およびアグロバクテリウム株の評価を行った。播種後50〜60日目のキヌア4系統（Kd、ghy、rebc、ghy/rebc）、およびバイナリーベクターpCAMBIA1301を導入したアグロバクテリウム7菌株（GV3101、ATCC15834、MAFF301276、MAFF212033、MAFF311303、MAFF211729、MAFF663001）を種々の組み合わせでfloral dip切断密閉法を行い、遺伝子の導入をGUS染色により評価した（表１０）。その結果、MAFF212033株、MAFF311303株およびMAFF211729株を用いた個体で、雌性器官においてGUS発現が認められ、特にMAFF311303株を用いた場合に、高い割合でGUS発現が認められた（図２３b、図２４、図２５）。これらの GUS発現は、がくや葯組織でも生じていたことから、雌性器官非特異的なGUS発現であると考えられた。これまでの実験では、切断・密閉処理が、floral dip法によるキヌアへの遺伝子導入に必要であったが、MAFF15834株、MAFF301276株、MAFF311303株、MAFF663001株を用いた感染実験では、切断・密閉処理（−）で、穂におけるGUS発現が認められ、形質転換カルス形成能力が最も高かったMAFF301276株は（図１４、表８）、供試したキヌア全系統の穂でGUS発現が認められた（図２６）。また、ブラッダー形成が抑制されているキヌア変異体2系統は、GUS発現個体の割合が高い傾向にあった。しかし、これらの切断・密閉処理（−）条件では、雌性器官におけるGUS発現は認められなかった（図２３a）。
（floral dip切断密閉法におけるアグロバクテリウム2菌株の共接種による形質転換効率への影響）
抗菌物質を生産するPseudomonas fluorescens LRB3W1株と、細胞壁溶解酵素を生産するSerratia marcescensstrain B2株の共接種により、糸状菌の生育抑止効果が増加したことが報告されている（Someya N, Tsuchiya K, Yoshida T, T. Noguchi M, Akuthu K, SawadaH(2007) Biocontrol Science. 12(1):1-6；吉田重信 (2009) 異種微生物間の相互作用およびその生物防除への活用の可能性. 植物防疫 63(10):619-623）。このような相互作用が、アグロバクテリウム株間に存在していれば、アグロバクテリウム2菌株の共接種により、雌性器官への遺伝子導入効率の向上が期待できる。そこで、実施例３で用いたアグロバクテリウム7菌株のうち、2菌株の菌懸濁液を、1：1で混合した21の組合せで、播種後50〜60日目のKd系統および変異体ghyへの接種実験を行った（表１０）。その結果、雌性器官で染色を確認した組合せは、Kd系統においては、GV3301株×ATCC15834株、GV3301株×MAFF211729株、GV3301株×MAFF663001株、MAFF212033株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株の5試験区であり（表１１）、変異体ghyにおいては、GV3301株×MAFF311303株、MAFF301276株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株、MAFF211729株×MAFF663001株の4試験区であった（表１２）。これらの雌性器官のGUS染色は、実施例３の結果と同様、がくや葯組織でも生じていたことから、雌性器官非特異的な発現であると考えられた。一方、切断・密閉処理（−）で、穂におけるGUS発現を確認した組合せは、Kd系統においてはGV3301株×MAFF301276株、GV3301株×MAFF663001株、ATCC15834株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF663001株の5試験区であり（表１１）、変異体ghyにおいては、GV3301株×MAFF301276株、ATCC15834株×MAFF301276株、ATCC15834株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF212033株、MAFF301276株×MAFF311303株、MAFF301276株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF663001株の7試験区であった（表１２）。2菌株の共接種実験においても切断・密閉処理（−）条件における雌性器官のGUS発現は認めらなかった。
抗菌物質を生産するPseudomonas fluorescens LRB3W1株と、細胞壁溶解酵素を生産するSerratia marcescensstrain B2株の共接種により、糸状菌の生育抑止効果が増加したことが報告されている（Someya N, Tsuchiya K, Yoshida T, T. Noguchi M, Akuthu K, SawadaH(2007) Biocontrol Science. 12(1):1-6；吉田重信 (2009) 異種微生物間の相互作用およびその生物防除への活用の可能性. 植物防疫 63(10):619-623）。このような相互作用が、アグロバクテリウム株間に存在していれば、アグロバクテリウム2菌株の共接種により、雌性器官への遺伝子導入効率の向上が期待できる。そこで、実施例３で用いたアグロバクテリウム7菌株のうち、2菌株の菌懸濁液を、1：1で混合した21の組合せで、播種後50〜60日目のKd系統および変異体ghyへの接種実験を行った（表１０）。その結果、雌性器官で染色を確認した組合せは、Kd系統においては、GV3301株×ATCC15834株、GV3301株×MAFF211729株、GV3301株×MAFF663001株、MAFF212033株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株の5試験区であり（表１１）、変異体ghyにおいては、GV3301株×MAFF311303株、MAFF301276株×MAFF311303株、MAFF311303株×MAFF211729株、MAFF211729株×MAFF663001株の4試験区であった（表１２）。これらの雌性器官のGUS染色は、実施例３の結果と同様、がくや葯組織でも生じていたことから、雌性器官非特異的な発現であると考えられた。一方、切断・密閉処理（−）で、穂におけるGUS発現を確認した組合せは、Kd系統においてはGV3301株×MAFF301276株、GV3301株×MAFF663001株、ATCC15834株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF663001株の5試験区であり（表１１）、変異体ghyにおいては、GV3301株×MAFF301276株、ATCC15834株×MAFF301276株、ATCC15834株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF212033株、MAFF301276株×MAFF311303株、MAFF301276株×MAFF211729株、MAFF301276株×MAFF663001株の7試験区であった（表１２）。2菌株の共接種実験においても切断・密閉処理（−）条件における雌性器官のGUS発現は認めらなかった。
［改良菌（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）を用いたfloral dip非切断・密閉法による形質転換キヌアの作出］
（改良菌（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）を用いたfloral dip非切断・密閉法によるキヌア4系統へのgusA遺伝子の導入）
MAFF311303株は、floral dip切断密閉法により、雌性器官におけるGUS発現が、高い割合で認められた（図２３b）。しかし、MAFF311303株は非病原性のため、vir遺伝子を保持しておらず、遺伝子導入能力は低いと考えられる。一方、MAFF301276株は、キヌアカルスおよびキヌアの穂に、高効率でT-DNAを導入した（図１４、表８、図２６）。しかしMAFF301276株は、雌性器官への遺伝子導入が認められなかった（図２３）。さらに、MAFF301276株とMAFF311303株の共接種を行った場合においても、切断・密閉処理を行わない場合には、雌性器官のGUS発現が認められなかった（表１１、表１２）。そこで、MAFF301276株とMAFF311303株の特性を併せ持つMAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNAを作成した。この菌株にバイナリーベクターpCAMBIA1301を導入した後、従来のfloral dip法（切断・密閉処理無し）によりキヌア4系統（Kd、ghy、rebc、ghy/rebc）へ接種した。その結果、変異体ghyおよび変異体ghy/rebcにおいて、雌性器官特異的なGUS発現を確認した（図２７〜図２９）。
（改良菌（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）を用いたfloral dip非切断・密閉法によるキヌア4系統へのgusA遺伝子の導入）
MAFF311303株は、floral dip切断密閉法により、雌性器官におけるGUS発現が、高い割合で認められた（図２３b）。しかし、MAFF311303株は非病原性のため、vir遺伝子を保持しておらず、遺伝子導入能力は低いと考えられる。一方、MAFF301276株は、キヌアカルスおよびキヌアの穂に、高効率でT-DNAを導入した（図１４、表８、図２６）。しかしMAFF301276株は、雌性器官への遺伝子導入が認められなかった（図２３）。さらに、MAFF301276株とMAFF311303株の共接種を行った場合においても、切断・密閉処理を行わない場合には、雌性器官のGUS発現が認められなかった（表１１、表１２）。そこで、MAFF301276株とMAFF311303株の特性を併せ持つMAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNAを作成した。この菌株にバイナリーベクターpCAMBIA1301を導入した後、従来のfloral dip法（切断・密閉処理無し）によりキヌア4系統（Kd、ghy、rebc、ghy/rebc）へ接種した。その結果、変異体ghyおよび変異体ghy/rebcにおいて、雌性器官特異的なGUS発現を確認した（図２７〜図２９）。
（改良菌（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）を用いたfloral dip非切断・密閉法におけるアブシジン酸による形質転換効率への影響）
アブシジン酸（abscisic acid；ABA）は、植物の全身抵抗性（SAR）の誘導に関与するサリチル酸（SA）と拮抗関係にある（Durner J, Shah J, Klessig DF (1997) Trends inPlantScience.2(7):266-274：Yasuda M, Ishikawa A,Jikumaru Y, Seki M, Umezawa T, Asami T,Maruyama-Nakashita A, Kudo T, ShinozakiK, Yoshida S, Nakashita H (2008) PlantCell 20(6): 1678-1692.）。したがって、ABAを添加することにより、SARを抑制し、キヌアのfloral dip実験における形質転換効率が増加するのではないかと考えた。バイナリーベクターpCAMBIA1301を保有するMAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNAの菌懸濁液に500 mMのABAを添加し、従来のfloraldip法（切断・密閉処理無し）によりキヌア4系統（Kd、ghy、rebc、ghy/rebc）へ接種した。その結果、変異体ghy/rebcは、ABA無添加の場合と比較して6倍である、60％の個体で、雌性器官特異的なGUS発現を確認した（図３０、図３１）。
アブシジン酸（abscisic acid；ABA）は、植物の全身抵抗性（SAR）の誘導に関与するサリチル酸（SA）と拮抗関係にある（Durner J, Shah J, Klessig DF (1997) Trends inPlantScience.2(7):266-274：Yasuda M, Ishikawa A,Jikumaru Y, Seki M, Umezawa T, Asami T,Maruyama-Nakashita A, Kudo T, ShinozakiK, Yoshida S, Nakashita H (2008) PlantCell 20(6): 1678-1692.）。したがって、ABAを添加することにより、SARを抑制し、キヌアのfloral dip実験における形質転換効率が増加するのではないかと考えた。バイナリーベクターpCAMBIA1301を保有するMAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNAの菌懸濁液に500 mMのABAを添加し、従来のfloraldip法（切断・密閉処理無し）によりキヌア4系統（Kd、ghy、rebc、ghy/rebc）へ接種した。その結果、変異体ghy/rebcは、ABA無添加の場合と比較して6倍である、60％の個体で、雌性器官特異的なGUS発現を確認した（図３０、図３１）。
（変異体ghyにおける再分化条件の評価）
文献（包 金花 (2009) アグロバクテリウム法によるホウレンソウの形質転換系の確立と有用遺伝子の導入、千葉大学大学院博士論文）により報告されたホウレンソウの再分化培地組成を一部改変した培地を作成し、実験に用いた（表２）。Kd系統実生切片から誘導した非形質転換カルスを、設定した表１３の条件下で培養した。再分化誘導光条件が＋の区は20℃、8時間Light/16時間Dark条件のインキュベーター中で培養し、−の区は同条件のインキュベーター中で、スチール缶に入れ、遮光した状態で培養した。GA濃度が1の区は1 mg/L、2の区は2 mg/Lのジベレリンを添加した再分化培地上に非形質転換カルスを置床した。
ベタレイン色素を合成しない変異体ghy系統で形質転換カルスの形成に成功した。そこで、変異体ghyのカルスより、再分化の誘導を試みた。オーキシン様の作用を持つ植物ホルモンとして2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、サイトカイニン様の作用を持つ植物ホルモンとしてベンジルアデニンおよびカイネチンを種々の濃度で組み合わせ、再分化を試みた。サイトカイニン様の植物ホルモンを含む培地に置床したカルスは緑色となり、ベンジルアデニンを含む培地に置床したカルスはより濃い緑色を呈した。また、2,4-Dとサイトカイニン様の植物ホルモン（ベンジルアデニン、カイネチン）の濃度を共に高めると、硬く丸みを帯びたカルスとなった。さらに0.01 mg/Lもしくは0.1 mg/Lの2,4-Dのみ、0 mg/L−0.1mg/Lの2,4-Dとカイネチン、1 mg/Lもしくは2 mg/Lのベンジルアデニンのみを含む培地では不定根が再分化した。特に、1 mg/Lカイネチンと0.01mg/L 2,4-D、1 mg/L カイネチンのみを含む培地に置床したカルスは、不定根の伸長が顕著であった。しかし、その他の器官の再分化は認められなかった。
文献（包 金花 (2009) アグロバクテリウム法によるホウレンソウの形質転換系の確立と有用遺伝子の導入、千葉大学大学院博士論文）により報告されたホウレンソウの再分化培地組成を一部改変した培地を作成し、実験に用いた（表２）。Kd系統実生切片から誘導した非形質転換カルスを、設定した表１３の条件下で培養した。再分化誘導光条件が＋の区は20℃、8時間Light/16時間Dark条件のインキュベーター中で培養し、−の区は同条件のインキュベーター中で、スチール缶に入れ、遮光した状態で培養した。GA濃度が1の区は1 mg/L、2の区は2 mg/Lのジベレリンを添加した再分化培地上に非形質転換カルスを置床した。
ベタレイン色素を合成しない変異体ghy系統で形質転換カルスの形成に成功した。そこで、変異体ghyのカルスより、再分化の誘導を試みた。オーキシン様の作用を持つ植物ホルモンとして2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、サイトカイニン様の作用を持つ植物ホルモンとしてベンジルアデニンおよびカイネチンを種々の濃度で組み合わせ、再分化を試みた。サイトカイニン様の植物ホルモンを含む培地に置床したカルスは緑色となり、ベンジルアデニンを含む培地に置床したカルスはより濃い緑色を呈した。また、2,4-Dとサイトカイニン様の植物ホルモン（ベンジルアデニン、カイネチン）の濃度を共に高めると、硬く丸みを帯びたカルスとなった。さらに0.01 mg/Lもしくは0.1 mg/Lの2,4-Dのみ、0 mg/L−0.1mg/Lの2,4-Dとカイネチン、1 mg/Lもしくは2 mg/Lのベンジルアデニンのみを含む培地では不定根が再分化した。特に、1 mg/Lカイネチンと0.01mg/L 2,4-D、1 mg/L カイネチンのみを含む培地に置床したカルスは、不定根の伸長が顕著であった。しかし、その他の器官の再分化は認められなかった。
［floral dip切断・密閉法によるrebc変異体キヌアへの野生型REBC遺伝子の形質転換］
形質転換に用いる植物体として、本発明者らがキヌア種子の0.2％EMS（Ethylmethanesulfonate）処理により作出した、ブラッダー細胞が著しく減少した形質を有するrebc変異体キヌア（ブラッダー形成制御に関与するREBC遺伝子（Acc.No.XP_021715187をコードする遺伝子）にc.1139G>A（p.Trp380*）の変異を有することが確認された個体）を用いた。
rebc変異体キヌアのM3世代の種子を播種して、約2ヶ月後（開花期）の個体に、REBCプロモーター（配列番号１３）を接続した野生型REBC遺伝子を（配列番号１４）を挿入したバイナリーベクターpCAMBIA1301が導入された改良菌（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）を用いて、本発明のfloral dip切断・密閉法により、形質転換した（図３４）。
形質転換に用いる植物体として、本発明者らがキヌア種子の0.2％EMS（Ethylmethanesulfonate）処理により作出した、ブラッダー細胞が著しく減少した形質を有するrebc変異体キヌア（ブラッダー形成制御に関与するREBC遺伝子（Acc.No.XP_021715187をコードする遺伝子）にc.1139G>A（p.Trp380*）の変異を有することが確認された個体）を用いた。
rebc変異体キヌアのM3世代の種子を播種して、約2ヶ月後（開花期）の個体に、REBCプロモーター（配列番号１３）を接続した野生型REBC遺伝子を（配列番号１４）を挿入したバイナリーベクターpCAMBIA1301が導入された改良菌（MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA）を用いて、本発明のfloral dip切断・密閉法により、形質転換した（図３４）。
形質転換の結果、ブラッダーが回復している形質転換体を得られた（図３５）。
得られた形質転換体について、REBC遺伝子の配列決定を行い、REBC遺伝子の塩基配列が変異型であることを確認した（図３６、配列番号１５）。
このことから、形質転換によるブラッダーの回復は、導入された遺伝子による可能性が高いことが考えられた。
そこでブラッダーが回復した形質転換植物について、次世代シークエンサーを利用して形質転換体のゲノム配列を解読した。
その結果、形質転換植物ゲノム内に、REBC遺伝子が導入されたことを確認することができた（図３７）。同時に導入箇所も特定（Chr16, 75355785bp）した。
以上の結果より、本発明のfloral dip切断・密閉法を用いた形質転換では、植物体のブラッダーを発現させる（ブラッダー発現機能を回復させる）ことができ、該植物体は、形質転換体（rebc変異相補個体）であることを確認した。
得られた形質転換体について、REBC遺伝子の配列決定を行い、REBC遺伝子の塩基配列が変異型であることを確認した（図３６、配列番号１５）。
このことから、形質転換によるブラッダーの回復は、導入された遺伝子による可能性が高いことが考えられた。
そこでブラッダーが回復した形質転換植物について、次世代シークエンサーを利用して形質転換体のゲノム配列を解読した。
その結果、形質転換植物ゲノム内に、REBC遺伝子が導入されたことを確認することができた（図３７）。同時に導入箇所も特定（Chr16, 75355785bp）した。
以上の結果より、本発明のfloral dip切断・密閉法を用いた形質転換では、植物体のブラッダーを発現させる（ブラッダー発現機能を回復させる）ことができ、該植物体は、形質転換体（rebc変異相補個体）であることを確認した。
得られた形質転換体同士を受粉（交配）させた後、該形質転換体から収穫された種子（形質転換後代）を播種し、育成した。
その結果、後代の表現型は、ブラッダーをもつ野生型（導入遺伝子あり）と、rebc変異型（導入遺伝子なし）に分離した（図３８）。
この結果から、本発明のfloral dip切断・密閉法を用いた形質転換では、形質転換によって導入された遺伝子（例、ブラッダー発現機能遺伝子）は後代に遺伝させることができることを確認した。
その結果、後代の表現型は、ブラッダーをもつ野生型（導入遺伝子あり）と、rebc変異型（導入遺伝子なし）に分離した（図３８）。
この結果から、本発明のfloral dip切断・密閉法を用いた形質転換では、形質転換によって導入された遺伝子（例、ブラッダー発現機能遺伝子）は後代に遺伝させることができることを確認した。
［総論］
本実施例では当初、キヌアKd系統およびアグロバクテリウム（Rhizobiumradiobacter）GV3101株を用いて、組織培養による形質転換植物の作出を試みたが、再分化系の構築および遺伝子導入に成功しなかった。
キヌアの再分化系が未確立のため、floral dip法による形質転換実験を実施した。しかし、シロイヌナズナで汎用されているfloral dip法では（Clough SJ and Bent AF (1998)The Plant Journal 16(6):735-743）、穂のGUS発現は認められなかった（図８）。そこで、GV3101株を感染した穂に、切断・多湿密閉処理を行った。その結果、キヌアの穂でGUS発現を確認した（図９）。この結果から、切断・密閉処理により、キヌアへの遺伝子導入が可能となることが明らかとなった。さらに、雌性器官におけるGUS発現を確認した（図１０）。シロイヌナズナのfloral dip法において、アグロバクテリウムは雌性生殖器官を標的とすることが報告されている（Desfeux C, Clough SJ, Bent AF (2000) Plant physiology 123(3):895-904）。したがって、floral dip切断密閉法の適用により（図１１）、キヌアにおいても形質転換種子が得られる。
Kogaらは、イネ（Oryza sativa L.）葉鞘の切断により、イネいもち病原菌Magnaporthe griseaの感染に対する抵抗性WPSR（whole plant specific resistance）が低下することを明らかにしている（Koga H, Dohi H, Nakayachi O, Mori M (2004) PhysiologicalandMolecular Plant Pathology 64(2):67-72）。この現象は、切断処理により植物体内で合成されるアブシジン酸（ABA）が関与しており（Koga H, Dohia K, Mori M (2004)Physiological and Molecular PlantPathology 65(1):3-9）、ABAは植物の全身抵抗性（SAR）を誘導するサリチル酸と拮抗的に作用する（Yasuda M, IshikawaA, Jikumaru Y, Seki M, Umezawa T, Asami T,Maruyama-Nakashita A, Kudo T,Shinozaki K, Yoshida S, Nakashita H (2008) PlantCell 20(6): 1678-1692.）。すなわち、切断処理により、サリチル酸を介した植物の抵抗性が抑制され、GV3101株による遺伝子導入が可能になったと考えられる。
floral dip切断密閉法を行った穂のGUS発現は、播種後40〜50日目のキヌアでのみ認められた（表６）。シロイヌナズナのfloral dip実験では、形質転換種子が得られるのは開花の5日以上前に感染処理を行った場合に限られ、遺伝子導入が可能な時期は限定されることが明らかとなっている（Desfeux C,Clough SJ, Bent AF (2000) Plant physiology 123(3):895-904）。これは、開花3日前に、シロイヌナズナ雌性器官の柱頭に生じるキャップ構造が、アグロバクテリウムが胚珠へアクセスすることを妨害していることによると考えられている（Smyth DR, Bowman JL, Meyerowitz EM (1990) The Plant Cell 2:755-767）。キヌアのfloral dip実験においても同様に遺伝子導入時期が限られていたことから（表６）、シロイヌナズナとキヌアにおける植物体への遺伝子導入様式は類似していると考えられる。
形質転換カルスの形成率を指標に、キヌアの形質転換に適したキヌア系統およびアグロバクテリウム株の選抜を行った。GV3101株を用いて、Kd系統実生切片および変異体ghy実生切片への感染実験の結果、Kd系統では6.98％および変異体ghyでは6.78%のカルスでGUS発現を確認した（図３２、表１４）。そして、Kd系統の全ての形質転換カルスにおいてスポット状のGUS発現、変異体ghy形質転換カルスにおいて1個体でスポット状のGUS発現、3個体で2 mm2以上のGUS発現を確認した。スポット状の一過性のGUS発現は形質転換されておらず、変異体ghyにおいてのみ形質転換されていると考えられる。真菌類および細菌類への抗菌活性をもつベタレイン色素は（Polturak G, Grossman N, Vela-Corcia D, Dong Y, Nudel A, PlinerM,Levy M, Rogachev I, Aharoni A (2017) Proceedings of the National AcademyofSciences of the United States of America 114(34):9062-9067；Canadanovic-BrunetJM, Savatovic SS, Cetkovic GS (2011) Czech Journalof Food Sciences29(6):575-585）、Kd系統の形質転換において、阻害的に作用している可能性が示唆された。両系統の遺伝子発現頻度は同程度であり（表１４）、ベタレインはアグロバクテリウムの植物体への接近、および遺伝子導入におそらく影響はないと考えられる。これらのことから、ベタレイン色素はキヌアゲノムへのT-DNAの組込みに影響していることが考えられる。
キヌアの形質転換において、ベタレイン色素が阻害的に働くことが示唆された。一方で、キヌア85系統は、GV3101株およびMAFF301276株による形質転換実験で、最も高い形質転換効率を示した（図１７、図２０、表９、表１０）。したがって、85系統は、アグロバクテリウムによる形質転換に、有用なキヌア系統であると考えられる。形質転換カルス実験に供試した85系統の胚軸（播種後5日目）は、Kd系統や108系統と同様に赤色を呈している。しかし、成熟した85系統の穂は、オレンジ色を呈する。キヌアは、系統によって合成するフェノール化合物の量が異なると報告されている（Tang Y, Li X, Zhang B, Chen PX, Liu R, Tsao R6 (2015) FoodChemistry166:380-388）。フェノール類は、一般的にストレス耐性や抗菌活性を有するが、アセトシリンゴンを含む複数のフェノール化合物は、アグロバクテリウムのvir遺伝子を誘導することが報告されている（Bhattacharya A, SoodP, Citovsky V (2010) Molecular Plant Pathology11(5):705-719）。85系統の合成するフェノール化合物の詳しい機能は未解明であるが、85系統がGV3101株およびMAFF301276株のvir遺伝子を活性化するような物質を含む可能性が考えられる。
MAFF301276株およびMAFF311303株をキヌア実生に接種した場合に、茎頂付近で遺伝子導入が認められた（図３３）。この2菌株は、遺伝的な性質による分類（genomovar）では、G1に属する。このグループに属する菌株は、植物に生じた癌腫から頻繁に分離され（PortierP, Saux ML, Mougel C, Lerondelle C, Chapulliot D, ThioulouseJ, Nesme X (2006)Applied and Environmental Microbiology 72(11):7123-7131）、広い宿主範囲を持つと予測される。特にMAFF301276株は、Kd系統の胚軸切片への感染実験において、高い形質転換効率（85.6 ± 1.1%）を示した（図１４、表８）。また、キヌア6系統の胚軸切片への感染実験では、供試した全系統で形質転換カルスを形成した（図２０、表１０）。これらの結果は、MAFF301276株がキヌアへの強い感染能力および広域な宿主範囲を有することを示している。Jinらは、アグロバクテリウムの病原性および宿主範囲の拡大に、vir遺伝子の発現増加が関与していることを示唆している（Jin SG, Komari T, Gordon MP, Nester EW (1987) Journal ofBacteriology169(10):4417-4425）。したがって、MAFF301276株の優れた特性には、Tiプラスミド上のvir遺伝子が関与していると推測した。MAFF301276株によるキヌアゲノムへの遺伝子の導入は、次世代シーケンサーを用いた遺伝子解析およびPCR解析の結果により証明された（図２２）。また、これらの解析により、MAFF301276株由来のpTiプラスミドとバイナリーべクターpCAMBIA1301の一部が、融合して組み込まれていることが明らかとなった（図２２）。2つのT-DNAの融合が、菌体内で生じたのか、あるいは宿主植物への遺伝子導入の過程で生じたのかは不明である。しかし、T-DNAの融合が、MAFF301276株の優れた感染能力に関与している可能性が考えられる。
一方、MAFF311303株は遺伝子導入に不可欠なvir遺伝子群を欠損しており非病原性に分類されている。非病原性とされるMAFF311303株が、GUS遺伝子をどのようにして植物細胞内へ導入しているかは興味深い。アグロバクテリウムの感染には、宿主植物側の作用も重要であり、植物の損傷部位から分泌されるアセトシリンゴンは、vir遺伝子の活性化に関与する（Bhattacharya A, Sood P,Citovsky V (2010) Molecular Plant Pathology11(5):705-719）。また、シロイヌナズナのVIP1タンパク質は、宿主核内へのT-DNA移行に関与することが知られている（Tzfira T, Vaidya M, Citovsky V (2001) The EMBO Journal20(13):3596-3607）。しかし、アグロバクテリウムの感染における、宿主植物側の働きは完全に解明されていない。したがって、非病原性MAFF311303株によるGUS遺伝子の導入は、植物側の新規作用により生じたと推測した。また、Kd系統胚軸切片への感染実験において、MAFF311303株は形質転換カルスを形成できなかったことから（図１４、表８）、この作用は、茎頂付近の組織特異的に起こると推測した。MAFF301276株およびMAFF311303株は野生株であり、研究報告が少ない（太田光輝, 西山 幸司(1984) 花き類の根頭がんしゅ病に関する研究.病害の発生ならびに病原細菌の細菌学的性質. 日本植物病理学会報 (日植病報) 50: 197-204）。次世代シーケンサー技術の進展が著しい現在、未知のゲノム情報を、短時間かつ容易に入手できるようになった。各菌株のゲノム解析やRNA解析により、MAFF301276株の持つ優れた形質転換能力、およびMAFF311303株の遺伝子導入のメカニズムが解明され、形質転換効率の高い新規アグロバクテリウム菌株の構築に寄与できると考えている。そして、アグロバクテリウムによる遺伝子導入が困難な植物種において、強力な遺伝子導入ツールとしての利用が期待される。
MAFF301276株による形質転換カルスの作出により、残された課題は再分化系の確立である。そこで、再分化への影響が考えられるベタレイン色素を合成しない変異体ghyを用いて再分化培地の検討を行った。その結果、Kd系統の再分化検討では認められなかった、不定根の再分化が確認できた。このことから、ベタレイン色素が根の形成に関与していると考えられる。カルス誘導の期間や、再分化培地の植物ホルモンの種類および濃度、光や温度といった培養条件、そして供試する組織などの検討により、ghyカルスの再分化を誘導できる可能性が示唆された。
キヌア4系統およびアグロバクテリウム7菌株を用いたfloral dip切断密閉法において、MAFF301276株は、切断・密閉処理の有無に関わらず、供試したキヌア全系統の穂でGUS発現が認められた（図２６）。この結果は、形質転換カルス形成実験の結果と一致する（図２０、表１０）。したがって、MAFF301276株は、キヌアの系統を問わず、SARを打破する強い病原性を有すると考えられる。一方で、floral dip切断密閉法による、雌性器官へのGUS遺伝子導入は認められなかった（図２３）。雌性器官へのGUS発現が認められた菌株は、MAFF212033、MAFF311303およびMAFF211729であり、組織培養およびfloral dip法による遺伝子導入実験の結果から、弱毒性菌株であると考えられる（図１４、図２６a、表８）。これらの結果は、病原性の強さと雌性器官へのアプローチ能力に相関関係が存在しないということを示唆している。
切断・密閉処理の有無に関わらず、ブラッダー細胞抑制変異体（rebc、ghy/rebc）の穂におけるGUS発現率が高かった（図２６）。したがって、変異体rebcおよび変異体ghy/rebcはfloral dip法による遺伝子導入に有効であることが示唆された。この2つの変異体が欠損しているブラッダー細胞はキヌアの穂を覆うように存在している（図２〜図５）。そのため、アグロバクテリウムの植物表面への接近に、物理的障害となっているのではないかと推測した。この推測は、GUS遺伝子や緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein；GFP）を使用し、アグロバクテリウムの挙動を可視化することで明らかにできるのではないかと推測した。
組織培養およびfloral dip切断密閉法により選抜したアグロバクテリウム2菌株（MAFF301276株、MAFF311303株）を用いて、MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA株を作出した。この菌株を、floraldip法（切断・密閉処理無し）により、変異体ghyおよび変異体ghy/rebcへ接種した結果、雌性器官特異的なGUS発現が認められた（図２７〜図２９）。この結果は、MAFF311303株が、MAFF301276株の強い病原性を獲得したことにより、SARを打破し、雌性器官への遺伝子導入が可能になったということを示唆している。すなわち、MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA株およびキヌア変異体を用いることにより、切断・密閉処理を行わない、汎用的なfloral dip法が適用でき、キヌアの形質転換種子が得られる。そして、SARを抑制するABAの適用により（Koga H, Dohia K, Mori M (2004)Physiological and Molecular PlantPathology 65(1):3-9；YasudaM, Ishikawa A, Jikumaru Y, Seki M, Umezawa T, Asami T,Maruyama-Nakashita A, KudoT, Shinozaki K, Yoshida S, Nakashita H (2008) PlantCell 20(6): 1678-1692.）、変異体ghy/rebcで形質転換効率の増加が認められた（図３０、図３１）。したがって、本手法による、キヌア雌性器官の形質転換効率の向上に、ABAの使用は有効である可能性がある。種子の選抜という最終段階まで到達した。
本実施例で構築したキヌアの新規形質転換法には、キヌア変異体および新しいアグロバクテリウム菌株の存在が重要である。しかし、キヌア85系統が合成するベタレイン色素や、MAFF301276株およびMAFF311303株のキヌアへの優れた形質転換能力の解析を進めることにより、汎用的なキヌア形質転換法の確立が期待できる。そして、キヌアの形質転換法の確立により、キヌア研究が一層進展し、新しい特性を持つキヌアの作出が期待できる。例えば、キヌアはサポニンという植物毒を種子に含み、塩地で栽培したキヌアはサポニン含有量が高くなる場合がある（山本紀夫（2014）中央アンデス農耕文化論―とくに高地部を中心として―. 国立民族学博物館調査報告117）。加えて、脱粒性を有するため、大量生産を目指した機械化が困難である（藤倉雄司,本江昭夫,山本紀夫 (2009) 植物のドメスティケーション:キヌアは栽培植物か? ―アンデス産雑穀の栽培化に関する一試論―. 国立民族学博物館調査報告 84:225-244）。そこで、これらの形質を欠損させることにより、キヌアの優れた特性を食料危機の改善策として十分に発揮できる。本実施例の成果により遺伝子レベルのキヌア研究の進展に貢献できる。
加えて、本実施例で構築したキヌアの新規形質転換法によって導入された遺伝子は後代に遺伝させることができることを確認した。すなわち、本実施例で構築したキヌアの新規形質転換法により、目的遺伝子が導入された種子（目的遺伝子の機能が発現する種子）を得ることができる。
本実施例では当初、キヌアKd系統およびアグロバクテリウム（Rhizobiumradiobacter）GV3101株を用いて、組織培養による形質転換植物の作出を試みたが、再分化系の構築および遺伝子導入に成功しなかった。
キヌアの再分化系が未確立のため、floral dip法による形質転換実験を実施した。しかし、シロイヌナズナで汎用されているfloral dip法では（Clough SJ and Bent AF (1998)The Plant Journal 16(6):735-743）、穂のGUS発現は認められなかった（図８）。そこで、GV3101株を感染した穂に、切断・多湿密閉処理を行った。その結果、キヌアの穂でGUS発現を確認した（図９）。この結果から、切断・密閉処理により、キヌアへの遺伝子導入が可能となることが明らかとなった。さらに、雌性器官におけるGUS発現を確認した（図１０）。シロイヌナズナのfloral dip法において、アグロバクテリウムは雌性生殖器官を標的とすることが報告されている（Desfeux C, Clough SJ, Bent AF (2000) Plant physiology 123(3):895-904）。したがって、floral dip切断密閉法の適用により（図１１）、キヌアにおいても形質転換種子が得られる。
Kogaらは、イネ（Oryza sativa L.）葉鞘の切断により、イネいもち病原菌Magnaporthe griseaの感染に対する抵抗性WPSR（whole plant specific resistance）が低下することを明らかにしている（Koga H, Dohi H, Nakayachi O, Mori M (2004) PhysiologicalandMolecular Plant Pathology 64(2):67-72）。この現象は、切断処理により植物体内で合成されるアブシジン酸（ABA）が関与しており（Koga H, Dohia K, Mori M (2004)Physiological and Molecular PlantPathology 65(1):3-9）、ABAは植物の全身抵抗性（SAR）を誘導するサリチル酸と拮抗的に作用する（Yasuda M, IshikawaA, Jikumaru Y, Seki M, Umezawa T, Asami T,Maruyama-Nakashita A, Kudo T,Shinozaki K, Yoshida S, Nakashita H (2008) PlantCell 20(6): 1678-1692.）。すなわち、切断処理により、サリチル酸を介した植物の抵抗性が抑制され、GV3101株による遺伝子導入が可能になったと考えられる。
floral dip切断密閉法を行った穂のGUS発現は、播種後40〜50日目のキヌアでのみ認められた（表６）。シロイヌナズナのfloral dip実験では、形質転換種子が得られるのは開花の5日以上前に感染処理を行った場合に限られ、遺伝子導入が可能な時期は限定されることが明らかとなっている（Desfeux C,Clough SJ, Bent AF (2000) Plant physiology 123(3):895-904）。これは、開花3日前に、シロイヌナズナ雌性器官の柱頭に生じるキャップ構造が、アグロバクテリウムが胚珠へアクセスすることを妨害していることによると考えられている（Smyth DR, Bowman JL, Meyerowitz EM (1990) The Plant Cell 2:755-767）。キヌアのfloral dip実験においても同様に遺伝子導入時期が限られていたことから（表６）、シロイヌナズナとキヌアにおける植物体への遺伝子導入様式は類似していると考えられる。
形質転換カルスの形成率を指標に、キヌアの形質転換に適したキヌア系統およびアグロバクテリウム株の選抜を行った。GV3101株を用いて、Kd系統実生切片および変異体ghy実生切片への感染実験の結果、Kd系統では6.98％および変異体ghyでは6.78%のカルスでGUS発現を確認した（図３２、表１４）。そして、Kd系統の全ての形質転換カルスにおいてスポット状のGUS発現、変異体ghy形質転換カルスにおいて1個体でスポット状のGUS発現、3個体で2 mm2以上のGUS発現を確認した。スポット状の一過性のGUS発現は形質転換されておらず、変異体ghyにおいてのみ形質転換されていると考えられる。真菌類および細菌類への抗菌活性をもつベタレイン色素は（Polturak G, Grossman N, Vela-Corcia D, Dong Y, Nudel A, PlinerM,Levy M, Rogachev I, Aharoni A (2017) Proceedings of the National AcademyofSciences of the United States of America 114(34):9062-9067；Canadanovic-BrunetJM, Savatovic SS, Cetkovic GS (2011) Czech Journalof Food Sciences29(6):575-585）、Kd系統の形質転換において、阻害的に作用している可能性が示唆された。両系統の遺伝子発現頻度は同程度であり（表１４）、ベタレインはアグロバクテリウムの植物体への接近、および遺伝子導入におそらく影響はないと考えられる。これらのことから、ベタレイン色素はキヌアゲノムへのT-DNAの組込みに影響していることが考えられる。
キヌアの形質転換において、ベタレイン色素が阻害的に働くことが示唆された。一方で、キヌア85系統は、GV3101株およびMAFF301276株による形質転換実験で、最も高い形質転換効率を示した（図１７、図２０、表９、表１０）。したがって、85系統は、アグロバクテリウムによる形質転換に、有用なキヌア系統であると考えられる。形質転換カルス実験に供試した85系統の胚軸（播種後5日目）は、Kd系統や108系統と同様に赤色を呈している。しかし、成熟した85系統の穂は、オレンジ色を呈する。キヌアは、系統によって合成するフェノール化合物の量が異なると報告されている（Tang Y, Li X, Zhang B, Chen PX, Liu R, Tsao R6 (2015) FoodChemistry166:380-388）。フェノール類は、一般的にストレス耐性や抗菌活性を有するが、アセトシリンゴンを含む複数のフェノール化合物は、アグロバクテリウムのvir遺伝子を誘導することが報告されている（Bhattacharya A, SoodP, Citovsky V (2010) Molecular Plant Pathology11(5):705-719）。85系統の合成するフェノール化合物の詳しい機能は未解明であるが、85系統がGV3101株およびMAFF301276株のvir遺伝子を活性化するような物質を含む可能性が考えられる。
MAFF301276株およびMAFF311303株をキヌア実生に接種した場合に、茎頂付近で遺伝子導入が認められた（図３３）。この2菌株は、遺伝的な性質による分類（genomovar）では、G1に属する。このグループに属する菌株は、植物に生じた癌腫から頻繁に分離され（PortierP, Saux ML, Mougel C, Lerondelle C, Chapulliot D, ThioulouseJ, Nesme X (2006)Applied and Environmental Microbiology 72(11):7123-7131）、広い宿主範囲を持つと予測される。特にMAFF301276株は、Kd系統の胚軸切片への感染実験において、高い形質転換効率（85.6 ± 1.1%）を示した（図１４、表８）。また、キヌア6系統の胚軸切片への感染実験では、供試した全系統で形質転換カルスを形成した（図２０、表１０）。これらの結果は、MAFF301276株がキヌアへの強い感染能力および広域な宿主範囲を有することを示している。Jinらは、アグロバクテリウムの病原性および宿主範囲の拡大に、vir遺伝子の発現増加が関与していることを示唆している（Jin SG, Komari T, Gordon MP, Nester EW (1987) Journal ofBacteriology169(10):4417-4425）。したがって、MAFF301276株の優れた特性には、Tiプラスミド上のvir遺伝子が関与していると推測した。MAFF301276株によるキヌアゲノムへの遺伝子の導入は、次世代シーケンサーを用いた遺伝子解析およびPCR解析の結果により証明された（図２２）。また、これらの解析により、MAFF301276株由来のpTiプラスミドとバイナリーべクターpCAMBIA1301の一部が、融合して組み込まれていることが明らかとなった（図２２）。2つのT-DNAの融合が、菌体内で生じたのか、あるいは宿主植物への遺伝子導入の過程で生じたのかは不明である。しかし、T-DNAの融合が、MAFF301276株の優れた感染能力に関与している可能性が考えられる。
一方、MAFF311303株は遺伝子導入に不可欠なvir遺伝子群を欠損しており非病原性に分類されている。非病原性とされるMAFF311303株が、GUS遺伝子をどのようにして植物細胞内へ導入しているかは興味深い。アグロバクテリウムの感染には、宿主植物側の作用も重要であり、植物の損傷部位から分泌されるアセトシリンゴンは、vir遺伝子の活性化に関与する（Bhattacharya A, Sood P,Citovsky V (2010) Molecular Plant Pathology11(5):705-719）。また、シロイヌナズナのVIP1タンパク質は、宿主核内へのT-DNA移行に関与することが知られている（Tzfira T, Vaidya M, Citovsky V (2001) The EMBO Journal20(13):3596-3607）。しかし、アグロバクテリウムの感染における、宿主植物側の働きは完全に解明されていない。したがって、非病原性MAFF311303株によるGUS遺伝子の導入は、植物側の新規作用により生じたと推測した。また、Kd系統胚軸切片への感染実験において、MAFF311303株は形質転換カルスを形成できなかったことから（図１４、表８）、この作用は、茎頂付近の組織特異的に起こると推測した。MAFF301276株およびMAFF311303株は野生株であり、研究報告が少ない（太田光輝, 西山 幸司(1984) 花き類の根頭がんしゅ病に関する研究.病害の発生ならびに病原細菌の細菌学的性質. 日本植物病理学会報 (日植病報) 50: 197-204）。次世代シーケンサー技術の進展が著しい現在、未知のゲノム情報を、短時間かつ容易に入手できるようになった。各菌株のゲノム解析やRNA解析により、MAFF301276株の持つ優れた形質転換能力、およびMAFF311303株の遺伝子導入のメカニズムが解明され、形質転換効率の高い新規アグロバクテリウム菌株の構築に寄与できると考えている。そして、アグロバクテリウムによる遺伝子導入が困難な植物種において、強力な遺伝子導入ツールとしての利用が期待される。
MAFF301276株による形質転換カルスの作出により、残された課題は再分化系の確立である。そこで、再分化への影響が考えられるベタレイン色素を合成しない変異体ghyを用いて再分化培地の検討を行った。その結果、Kd系統の再分化検討では認められなかった、不定根の再分化が確認できた。このことから、ベタレイン色素が根の形成に関与していると考えられる。カルス誘導の期間や、再分化培地の植物ホルモンの種類および濃度、光や温度といった培養条件、そして供試する組織などの検討により、ghyカルスの再分化を誘導できる可能性が示唆された。
キヌア4系統およびアグロバクテリウム7菌株を用いたfloral dip切断密閉法において、MAFF301276株は、切断・密閉処理の有無に関わらず、供試したキヌア全系統の穂でGUS発現が認められた（図２６）。この結果は、形質転換カルス形成実験の結果と一致する（図２０、表１０）。したがって、MAFF301276株は、キヌアの系統を問わず、SARを打破する強い病原性を有すると考えられる。一方で、floral dip切断密閉法による、雌性器官へのGUS遺伝子導入は認められなかった（図２３）。雌性器官へのGUS発現が認められた菌株は、MAFF212033、MAFF311303およびMAFF211729であり、組織培養およびfloral dip法による遺伝子導入実験の結果から、弱毒性菌株であると考えられる（図１４、図２６a、表８）。これらの結果は、病原性の強さと雌性器官へのアプローチ能力に相関関係が存在しないということを示唆している。
切断・密閉処理の有無に関わらず、ブラッダー細胞抑制変異体（rebc、ghy/rebc）の穂におけるGUS発現率が高かった（図２６）。したがって、変異体rebcおよび変異体ghy/rebcはfloral dip法による遺伝子導入に有効であることが示唆された。この2つの変異体が欠損しているブラッダー細胞はキヌアの穂を覆うように存在している（図２〜図５）。そのため、アグロバクテリウムの植物表面への接近に、物理的障害となっているのではないかと推測した。この推測は、GUS遺伝子や緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein；GFP）を使用し、アグロバクテリウムの挙動を可視化することで明らかにできるのではないかと推測した。
組織培養およびfloral dip切断密閉法により選抜したアグロバクテリウム2菌株（MAFF301276株、MAFF311303株）を用いて、MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA株を作出した。この菌株を、floraldip法（切断・密閉処理無し）により、変異体ghyおよび変異体ghy/rebcへ接種した結果、雌性器官特異的なGUS発現が認められた（図２７〜図２９）。この結果は、MAFF311303株が、MAFF301276株の強い病原性を獲得したことにより、SARを打破し、雌性器官への遺伝子導入が可能になったということを示唆している。すなわち、MAFF311303pTiMAFF301276ΔT-DNA株およびキヌア変異体を用いることにより、切断・密閉処理を行わない、汎用的なfloral dip法が適用でき、キヌアの形質転換種子が得られる。そして、SARを抑制するABAの適用により（Koga H, Dohia K, Mori M (2004)Physiological and Molecular PlantPathology 65(1):3-9；YasudaM, Ishikawa A, Jikumaru Y, Seki M, Umezawa T, Asami T,Maruyama-Nakashita A, KudoT, Shinozaki K, Yoshida S, Nakashita H (2008) PlantCell 20(6): 1678-1692.）、変異体ghy/rebcで形質転換効率の増加が認められた（図３０、図３１）。したがって、本手法による、キヌア雌性器官の形質転換効率の向上に、ABAの使用は有効である可能性がある。種子の選抜という最終段階まで到達した。
本実施例で構築したキヌアの新規形質転換法には、キヌア変異体および新しいアグロバクテリウム菌株の存在が重要である。しかし、キヌア85系統が合成するベタレイン色素や、MAFF301276株およびMAFF311303株のキヌアへの優れた形質転換能力の解析を進めることにより、汎用的なキヌア形質転換法の確立が期待できる。そして、キヌアの形質転換法の確立により、キヌア研究が一層進展し、新しい特性を持つキヌアの作出が期待できる。例えば、キヌアはサポニンという植物毒を種子に含み、塩地で栽培したキヌアはサポニン含有量が高くなる場合がある（山本紀夫（2014）中央アンデス農耕文化論―とくに高地部を中心として―. 国立民族学博物館調査報告117）。加えて、脱粒性を有するため、大量生産を目指した機械化が困難である（藤倉雄司,本江昭夫,山本紀夫 (2009) 植物のドメスティケーション:キヌアは栽培植物か? ―アンデス産雑穀の栽培化に関する一試論―. 国立民族学博物館調査報告 84:225-244）。そこで、これらの形質を欠損させることにより、キヌアの優れた特性を食料危機の改善策として十分に発揮できる。本実施例の成果により遺伝子レベルのキヌア研究の進展に貢献できる。
加えて、本実施例で構築したキヌアの新規形質転換法によって導入された遺伝子は後代に遺伝させることができることを確認した。すなわち、本実施例で構築したキヌアの新規形質転換法により、目的遺伝子が導入された種子（目的遺伝子の機能が発現する種子）を得ることができる。
本発明により、キヌアの形質転換法を提供することが可能になった。
Claims (16)
- 以下の工程を含む形質転換植物、該植物の種子又は該植物のカルスの作製方法：
（１−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（１−２）植物体を切断する工程、及び
（１−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にして、目的遺伝子が導入された植物体を得る工程、
又は、
（２−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（２−２）植物体を切断する工程、
（２−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（２−４）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程、
又は、
（３−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（３−２）接種した植物体を多湿・暗条件下にする工程、
（３−３）植物体を切断する工程、
（３−４）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（３−５）該植物体からカルスを作製する工程、
ここで、該植物体がキヌアであり、かつ、該アグロバクテリウムがMAFF311303株、GV3101株、又はMAFF301276株である、方法。
- 前記アグロバクテリウムが、MAFF311303株である、請求項１に記載の方法。
- 前記アグロバクテリウムが、MAFF301276株である、請求項１に記載の方法。
- 以下の工程を含む形質転換植物、該植物の種子又は該植物のカルスの作製方法：
（１−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（１−２）植物体を切断する工程、及び
（１−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にして、目的遺伝子が導入された植物体を得る工程、
又は、
（２−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（２−２）植物体を切断する工程、
（２−３）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（２−４）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程、
又は、
（３−１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、
（３−２）接種した植物体を多湿・暗条件下にする工程、
（３−３）植物体を切断する工程、
（３−４）目的遺伝子が導入された部位を含む切断した植物体を多湿・暗条件下にする工程、及び
（３−５）該植物体からカルスを作製する工程、
ここで、該アグロバクテリウムが、植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株である、方法。
- さらに工程（１−１）若しくは工程（２−１）の前に、工程（１−１）若しくは工程（２−１）と同時に、又は、工程（１−１）及び工程（１−２）の間若しくは（２−１）及び工程（２−２）の間に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程を含む、請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
- 病原性アグロバクテリウム株由来のTiプラスミド及びキヌアで目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株。
- T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株。
- 病原性アグロバクテリウム株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含む形質転換剤。
- T-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミド及び植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含む形質転換剤。
- アグロバクテリウムMAFF311303株を含むキヌア用形質転換剤。
- アグロバクテリウムMAFF311303株を含むキヌア用雌性器官特異的形質転換剤。
- キヌアで目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を含むキヌア用形質転換剤。
- アグロバクテリウムMAFF301276株を含むキヌア用形質転換剤。
- 以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程。
- 以下の工程を含む形質転換植物の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株を対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程。
- 以下の工程を含む形質転換植物の種子の作製方法：
（１）植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクターが形質転換されたアグロバクテリウムを対象の植物体に接触させることによりアグロバクテリウムを接種する工程、及び
（２）工程（１）の前に、工程（１）と同時に、又は工程（１）の後に、アブシジン酸を対象の植物体に接触させる工程、及び
（３）種子を収穫できるまで生育し、目的遺伝子が導入された種子を得る工程、
ここで、該アグロバクテリウムが、植物体内で目的遺伝子を発現誘導可能なプロモーター制御下に目的遺伝子を担持した発現ベクター及びT-DNA領域を除去したアグロバクテリウムMAFF301276株由来のTiプラスミドが形質転換されたアグロバクテリウムMAFF311303株である、方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019053945 | 2019-03-21 | ||
| JP2019053945 | 2019-03-21 | ||
| PCT/JP2020/012253 WO2020189756A1 (ja) | 2019-03-21 | 2020-03-19 | 形質転換植物の作製方法及び形質転換剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2020189756A1 JPWO2020189756A1 (ja) | 2021-04-01 |
| JP6876877B2 true JP6876877B2 (ja) | 2021-05-26 |
Family
ID=72520215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020542455A Active JP6876877B2 (ja) | 2019-03-21 | 2020-03-19 | 形質転換植物の作製方法及び形質転換剤 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220090103A1 (ja) |
| EP (1) | EP3959967A4 (ja) |
| JP (1) | JP6876877B2 (ja) |
| CN (1) | CN113939187A (ja) |
| WO (1) | WO2020189756A1 (ja) |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03272682A (ja) * | 1990-03-20 | 1991-12-04 | Q P Corp | ゴマ毛状根の培養方法 |
| JP2007300903A (ja) * | 2006-05-15 | 2007-11-22 | Hiroshima Univ | 根頭がんしゅ病菌の増殖を阻害する細菌含有組成物およびその利用 |
| CN100575494C (zh) * | 2007-01-22 | 2009-12-30 | 大连理工大学 | 一种用于植物直接基因转化的组合物 |
| JP2010161989A (ja) * | 2009-01-16 | 2010-07-29 | Bridgestone Corp | ラテックス産生植物の形質転換細胞の作成方法、形質転換植物、及び形質転換植物の作成方法 |
| JP6353197B2 (ja) * | 2012-05-31 | 2018-07-04 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 植物成長阻害ホルモンを用いた植物形質転換方法 |
| WO2014159394A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-10-02 | The Regents Of The University Of California | Modified pyr/pyl receptors activated by orthogonal ligands |
| JP2016111926A (ja) * | 2013-03-29 | 2016-06-23 | 日本たばこ産業株式会社 | 植物の形質転換方法に使用するためのアグロバクテリウム細菌 |
| JP6710668B2 (ja) | 2017-09-19 | 2020-06-17 | 株式会社東芝 | 活物質、電極、二次電池、電池パック、及び車両 |
| CN111788216B (zh) * | 2017-12-18 | 2023-06-23 | 森正之 | 盐泡细胞形成控制作用剂和导入了该作用剂的植物体 |
-
2020
- 2020-03-19 CN CN202080022876.XA patent/CN113939187A/zh active Pending
- 2020-03-19 EP EP20773366.8A patent/EP3959967A4/en active Pending
- 2020-03-19 JP JP2020542455A patent/JP6876877B2/ja active Active
- 2020-03-19 WO PCT/JP2020/012253 patent/WO2020189756A1/ja unknown
- 2020-03-19 US US17/440,239 patent/US20220090103A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPWO2020189756A1 (ja) | 2021-04-01 |
| CN113939187A (zh) | 2022-01-14 |
| WO2020189756A1 (ja) | 2020-09-24 |
| EP3959967A4 (en) | 2023-06-28 |
| EP3959967A1 (en) | 2022-03-02 |
| US20220090103A1 (en) | 2022-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6990653B2 (ja) | 迅速な植物形質転換のための方法および組成物 | |
| JP5329412B2 (ja) | 選択を含まない植物形質転換 | |
| Crane et al. | Transgenic Medicago truncatula plants obtained from Agrobacterium tumefaciens-transformed roots and Agrobacterium rhizogenes-transformed hairy roots | |
| US20080229447A1 (en) | Transformation of immature soybean seeds through organogenesis | |
| JP2008511294A (ja) | 非病害性アグロバクテリウム株、Ｒｉプラスミド、およびそれらに基づく形質転換方法 | |
| Kiyokawa et al. | Genetic transformation of Begonia tuberhybrida by Ri rol genes | |
| JP2023544016A (ja) | 単子葉外植片の迅速な形質転換 | |
| WO2020198408A1 (en) | Plant explant transformation | |
| CN115058449A (zh) | 一种利用CsWRKY43干扰以提高柑橘溃疡病抗性的方法 | |
| US20090023212A1 (en) | Method for transforming soybean (Glycine max) | |
| Gherbi et al. | Post-transcriptional gene silencing in the root system of the actinorhizal tree Allocasuarina verticillata | |
| CN106967720B (zh) | 一个逆境诱导启动子SlWRKY31P的克隆及应用 | |
| CN106916818B (zh) | 一种干旱诱导型启动子、其制备方法、重组表达载体及转化子 | |
| CN116732047A (zh) | 基因OsMADS5在调控植物根系伸长中的应用 | |
| JP6876877B2 (ja) | 形質転換植物の作製方法及び形質転換剤 | |
| CN113416735B (zh) | 一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用 | |
| CN107164373B (zh) | 大豆低温诱导人工合成启动子sp5及应用 | |
| US7202083B1 (en) | Plant promoters and plant terminators | |
| US8067672B2 (en) | Flower tissue-specific promoter and uses thereof | |
| CN117660451B (zh) | 一种紫花苜蓿根尖特异启动子及其应用 | |
| CN116515857B (zh) | 一种仁用杏PaPIP1-2基因及其在提高植物抗寒性中的应用 | |
| CN113493501B (zh) | 一种与植物耐逆性相关的GmNTF2B-1蛋白及其编码基因与应用 | |
| KR102103189B1 (ko) | 염분 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법 | |
| KR101040579B1 (ko) | 스트레스 유도성 자가-절단형 식물형질전환 벡터 및 이를이용한 선발 마커 프리 식물체의 제조방법 | |
| CN116444637A (zh) | 调控植物叶片衰老和产量相关蛋白GmWRKY100及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200922 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200922 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20200922 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20201026 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201119 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210118 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210318 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210329 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210421 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210426 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6876877 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE Ref document number: 6876877 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |