CN103937799B - 一种胚乳特异表达启动子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胚乳特异表达启动子。本发明所提供的启动子为如下1)-3)中任一DNA分子：1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。实验证明，本发明所提供的启动子可以驱动目的基因在植物的胚乳中特异性高表达。本发明为人们研究植物基因在籽粒的表达、调控和利用基因工程方法改良作物提供了有用的核心元件；对于专一特异地改良和改造作物籽粒，从而培育新的作物品种具有重要意义。

Description

一种胚乳特异表达启动子

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种胚乳特异表达启动子。

背景技术

在基因表达调控的多级层次中，转录水平的调控对于植物体是非常经济有效的调控方式，各种调控因子通过与启动子结合，开启或关闭基因的表达而达到调控的目的。启动子是基因转录中最主要的一种调节方式，由于基因在不同层次上受不同的调节因子控制，这种控制机制不仅决定基因表达的水平，也决定基因表达的时空顺序，在转录环节中占有十分重要的地位。启动子是基因工程表达载体的重要元件，研究启动子对于基因表达调控机制，改善作物的生产性状，如高产、优质、抗逆等性状具有十分重要的意义。

目前，基因工程中广泛应用的植物组成型启动子逐渐暴露出一些问题，这类启动子驱动的基因在植物不同组织器官中均有不同程度的表达，而多数情况下，人们并不希望外源基因在转基因植物整个植株、整个生育期中广泛表达，因为一方面会增加植株的代谢负担，另一方面，有些外源蛋白对植物并非必需甚至有毒，不利于植物正常生长(KasugaM,LiuQ,MiuraS,etal.Improvingplantdrought,salt,andfreezingtolerancebygenetransferofasinglestress-inducibletranscriptionfactor.NatBiotechnol,1999,17:287-291.)。因此，研究和利用组织器官特异性启动子显得尤为重要，不仅可以实现对外源基因表达施行时、空、量的三维调控，同时具有经济、环保及生物安全等多方面的潜在价值(VenterM.Syntheticpromoters:geneticcontrolthroughcisengineering.TrendsPlantSci,2007,12:118-124.)。

谷类作物的籽粒(即种子)是人类最重要的食物来源之一，同时在基因工程中，人们也将谷类作物的籽粒作为重组蛋白和新陈代谢产物的生物反应器，将营养物质导入作物籽粒已获得成功(PaineJA,ShiptonCA,ChaggarS,etal.ImprovingthenutritionalvalueofGoldenRicethroughincreasedpro-vitaminAcontent.NatBiotechnol,2005,23:482-487.)。发育成熟的作物籽粒中，绝大部分是胚乳，大约能占到籽粒的90％左右(ZhouSR,YinLL,XueHW.Funtionalgenomicsbasedunderstandingofriceendospermdevelopment.CurrOpinPlantBiol,2013,16:236-246.)。专一特异地改良和改造作物籽粒，迫切需要利用具有高表达活性的胚乳特异性启动子。因此，寻找新的高表达活性的胚乳特异性启动子具有重要的科学意义和应用价值，可以为研究植物基因在籽粒的表达、调控和利用基因工程方法改良作物提供有用的核心元件。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有启动子功能的DNA分子。

本发明所提供的具有启动子功能的DNA分子，来源于小麦(TriticumaestivumL.)品种云麦33号，具体可为如下1)-3)中任一种：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中序列1由2276个核苷酸组成。

含有所述DNA分子(启动子)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为在pCAMBIA1391Z载体的多克隆位点插入所述DNA分子(启动子)得到的重组质粒；所述多克隆位点具体为BamHI和HindIII。

在本发明的另一个实施例中，所述重组载体具体为在载体A的多克隆位点插入所述DNA分子(启动子)得到的重组质粒；所述载体A为EcoRI不完全酶切pAHC25载体后得到的6800bp片段自连环化而成的载体；所述多克隆位点具体为BamHI和HindIII。

所述表达盒可以由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

在本发明的一个实施例中，所述目的基因具体为GUS基因(来源于所述pCAMBIA1391Z载体或所述载体A)；所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于所述pCAMBIA1391Z载体或所述载体A)。

所述DNA分子(启动子)在启动目的基因在植物表达中的应用也属于本发明的保护范围。

在所述应用中，所述表达为胚乳特异性表达。

利用所述DNA分子(启动子)培育转基因植物的方法也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的利用所述DNA分子(启动子)培育转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

a)将目的基因插入所述重组载体，使所述DNA分子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；

b)将步骤a)构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，得到在胚乳特异性表达所述目的基因的转基因植物。

将所述目的基因重组表达载体导入所述目的植物的方法可为农杆菌介导法、Ti质粒法、Ri质粒法、植物病毒载体法、直接DNA转化法、显微注射法、电导法等。在本发明的一个实施例中具体采用的为农杆菌介导法；在本发明的另一个实施例中具体采用的为基因枪转化法。

本发明的另一个目的是提供一种具有增强子功能的DNA分子。

本发明所提供的具有增强子功能的DNA分子，来源于小麦(TriticumaestivumL.)品种云麦33号，具体可为如下4)-6)中任一种：

4)序列表中序列4所示的DNA分子；

5)在严格条件下与4)限定的DNA序列杂交且具有增强子功能的DNA分子；

6)与4)或5)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有增强子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中序列4由43个核苷酸组成。

含有所述DNA分子(增强子)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子(增强子)在增强目的基因在植物表达中的应用也属于本发明的保护范围。

扩增所述DNA分子(所述启动子或所述增强子)全长或任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

在以上各应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

在本发明中，所述植物为单子叶植物，如小麦或水稻，具体如小麦(TriticumaestivumL.)品种小偃54或水稻(OryzasativaL.)品种Kitaake。

本发明提供的启动子可以驱动目的基因在植物的胚乳中特异性高表达。本发明为人们研究植物基因在籽粒的表达、调控和利用基因工程方法改良作物提供了有用的核心元件；对于专一特异地改良和改造作物籽粒，从而培育新的作物品种具有重要意义。

附图说明

图1为3种1Bx基因启动子的PCR扩增。M：DNA分子量标准；1：1Bx7启动子(Pro-1Bx7)；2：1Bx7^OE启动子(Pro-1Bx7^OE)；3：1Bx13启动子(Pro-1Bx13)。

图2为3种1Bx基因启动子的比较分析。3种1Bx基因启动子的主要差异在于存在序列插入和缺失。插入序列以方框表示，具体的插入序列及其长度在图中相应位置展示。

图3为实施例2中载体A的质粒图谱以及载体A的酶切鉴定图。其中，A为载体A的质粒图谱；B为载体A的BamHI和HindIII双酶切图谱，M：DNA分子量标准，P1-P10：10个待鉴定质粒。

图4为实施例2中瞬时表达GUS染色结果和定量结果。其中，A和B为瞬时转化后胚乳的GUS染色结果(A对应1Bx13启动子；B对应1Bx7启动子)；C为通过GUS点数目比较3种1Bx启动子强弱，其中1Bx7^OE启动子显著高于另两种1Bx启动子(星号表示统计分析有显著差异，p值小于0.01)。

图5为实施例3中转基因水稻中GUS染色结果和基因表达定量结果。其中，A为4种不同启动子转基因水稻籽粒、茎和叶GUS染色结果；B为4种不同启动子转基因水稻花后不同时间的籽粒中GUS基因相对表达量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小麦(TriticumaestivumL.)品种云麦33号：记载于“黄学源.抗锈高产小麦新品种——云麦33号.农业科技通讯,1985年07期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

小麦(TriticumaestivumL.)品种中国春：记载于“E.R.Sears,T.E.Miller,邹裕春.“中国春”小麦历史.麦类作物学报,1989年02期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

小麦(TriticumaestivumL.)品种济麦20：记载于“王小燕,张永丽,于振文.水氮互作对济麦20籽粒蛋白质品质及氮素和水分利用效率的影响.麦类作物学报,2010年02期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

小麦(TriticumaestivumL.)品种Atlas66：记载于“王洪政.小麦(TriticumaestivumL.)铝毒害以及钙对铝毒害的调控作用.南京农业大学,2006年,博士论文”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

小麦(TriticumaestivumL.)品种小偃54记载于“程建峰,马为民,陈根云等.小偃54和京411及其杂交后代稳定优选株系光合特性的动态变化.作物学报,2009年06期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

水稻(OryzasativaL.)品种Kitaake：记载于“向珣朝,何立斌,孙建明等.玉米PEPC基因在籼型水稻保持系不同遗传背景下的效应及转PEPC基因后代的耐光氧化特性.中国水稻科学,2009年03期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pAHC25载体：记载于“霍楠.转基因小麦B73-6-1品系特异性检测技术研究.东北农业大学,2012年,硕士论文”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pCAMBIA1391Z载体：可从商业途径购买，购自澳大利亚CAMBIA公司。记载于“王光达.小麦果聚糖合成酶基因启动子的克隆与功能分析.山西农业大学,2013年,硕士论文”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

农杆菌EHA105：记载于“高世武,郭晋隆,阙友雄.影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究.热带生物学报,2012年01期”一文，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、启动子序列的克隆

一、小麦基因组DNA提取

供试小麦品种：云麦33号、中国春、济麦20和Atlas66。

将4个供试小麦品种的种子萌发7-10天后，取新鲜叶片液氮中研磨成粉末，采用CTAB法提取基因组DNA。

CTAB提取缓冲液：0.1MTris-HCl(pH8.0)，20mMEDTA(pH8.0)，1.4MNaCl，2％(w/v)CTAB，2％(w/v)PVP40和3％(v/v)β-巯基乙醇(临用前加入)。

提取步骤：

1.取适量材料(5g)在液氮中充分研磨，磨好的粉末转入预冷的50ml离心管中，加入20mlCTAB提取缓冲液，迅速涡旋混匀，在65℃水浴中裂解45分钟；

2.加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)，充分颠倒混匀后，室温8000g离心20分钟，将上清转入新的离心管后，再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)重复抽提一次，将上清转入新的离心管；

3.加入1/10体积的醋酸钠(pH5.2)和2/3体积的异丙醇，颠倒混匀，直至出现絮状沉淀；

4.将DNA挑出转入2ml离心管，4℃8000g离心2分钟，小心弃去上清；

5.加入70％乙醇小心重悬洗涤，4℃8000g离心2分钟，小心弃去上清；

6.重复步骤5一次；

7.沉淀自然晾干，加入500μlTE溶液，待DNA完全溶解后再加入RNaseA溶液至终浓度20μg/ml，37℃温浴1小时；

8.用等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)抽提一次，除去其中的RNA酶；

9.按照步骤3沉淀DNA；

10.重复步骤4和5，最后将干燥的DNA溶于ddH₂O中，测定浓度后保存于-70℃备用。

二、1Bx基因启动子的获得

以步骤一获得的4个小麦品种DNA为模板，使用引物1Bx-PF1和1Bx-PR1进行PCR扩增，引物序列如下：

1Bx-PF1：5’-TGATGTGCCCTTGCTTGATTT-3’(序列1的第1-21位)；

1Bx-PR1：5’-CTCAGTGAACTGTCAGTGAATTG-3’(序列1的第2254-2276位的反向互补序列)。

反应体系：2×EasypfuPCRSupermix7.5μl；1Bx-PF1(10μM)1μl；1Bx-PR1(10μM)1μl；模板适量；ddH₂O补足至15μl。其中，2×EasypfuPCRSupermix为北京全式金生物技术有限公司产品，其产品目录号为AS211-01。

反应程序：94℃5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃2min，33个循环；72℃10min。

反应结束后，PCR扩增产物在1％琼脂糖胶上120伏恒压电泳30min后，获得扩增片段长度约为2.3kb的条带(见图1)，用刀片切下目的条带，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收DNA。回收的DNA与pEASY-Blunt载体(北京全式金生物技术有限公司)进行平端连接，连接产物热击法转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)。挑取大肠杆菌单克隆后测序(上海生工生物工程股份有限公司)，获得1Bx基因全长启动子序列。

经过测序共发现4种全长1Bx启动子序列，对应于小麦(TriticumaestivumL.)品种云麦33号的PCR产物的序列为序列表中序列1，将其命名为Pro-1Bx7^OE；对应于小麦(TriticumaestivumL.)品种中国春的PCR产物的序列为序列表中序列2，将其命名为Pro-1Bx7；对应于小麦(TriticumaestivumL.)品种济麦20和Atlas66的PCR产物的序列为序列表中序列3，将其命名为Pro-1Bx13。

三、1Bx基因启动子比较分析

比较4种启动子序列，除了一些单碱基互换或小片段DNA的缺失，主要差异是存在大片段的缺失和插入。以Pro-1Bx7启动子序列(序列2)为对照，与之相比，Pro-1Bx13启动子序列(序列3)在起始密码子上游-400bp处存在一个54bp片段缺失(54bp重复区域)，Pro-1Bx7^OE启动子序列(序列1)在起始密码子上游-1047bp存在一个43bp片段插入(见图2)。

实施例2、瞬时表达实验检测启动子活性

一、瞬时表达载体的构建

将pAHC25载体用EcoRI不完全酶切，从产物中选择6800bp的片段回收，回收片断加入DNA连接酶进行自连接，连接体系：T4DNA连接酶1μl；2×T4DNA连接酶缓冲液2.5μl；回收片断(6800bp)1.5μl。连接后转化即改造成可用的载体，记为载体A，载体A上携带有GUS基因，其质粒图谱如图3中A所示。

用BamHI和HindIII完全酶切该载体A，从载体图上明显可以看出，酶切后的片段大小应该为2000bp和4800bp，而酶切电泳结果显示两个片段的大小正好与之吻合(图3中B)，说明该载体A构建成功。

分别以实施例1获得Pro-1Bx7^OE启动子序列(序列1)、Pro-1Bx7启动子序列(序列2)和Pro-1Bx13启动子序列(序列3)为模板，通过引物1Bx-PF2和1Bx-PR2进行PCR扩增。

1Bx-PF2：5’-TACAAGCTTTGATGTGCCCTTGCTTGATTT-3’(下划线部分为酶切位点HindIII的识别序列，其前的序列为保护碱基，其后的序列为序列1的第1-21位)；

1Bx-PR2：5’-TCGGGATCCCTCAGTGAACTGTCAGTGAATTG-3’(下划线部分为酶切位点BamHI的识别序列，其前的序列为保护碱基，其后的序列为序列1的第2254-2276位的反向互补序列)。

反应体系和反应程序参照实施例1步骤二进行。

反应结束后，用BamHI和HindIII双酶切各PCR产物，胶回收后与经过同样双酶切的以上构建得到的载体A的骨架大片段(约4800bp的片段)相连，得到重组质粒。连接体系：T4DNA连接酶1μl；2×T4DNA连接酶缓冲液2.5μl；载体A骨架片段1μl；酶切后PCR产物0.5μl。

对连接所得重组质粒进行测序，将经测序表明将载体A的BamHI和HindIII之间的小片段(约2000bp的片段)替换为序列1所示的Pro-1Bx7^OE启动子序列的重组质粒命名为Pro-1Bx7^OE::GUS；将经测序表明将载体A的BamHI和HindIII之间的小片段(约2000bp的片段)替换为序列2所示的Pro-1Bx7启动子序列的重组质粒命名为Pro-1Bx7::GUS；将经测序表明将载体A的BamHI和HindIII之间的小片段(约2000bp的片段)替换为序列3所示的Pro-1Bx13启动子序列的重组质粒命名为Pro-1Bx13::GUS。

在重组表达载体Pro-1Bx7^OE::GUS中，Pro-1Bx7^OE启动子序列(序列1)位于GUS基因上游，启动GUS基因的转录，而在GUS基因下游连接有用于终止其转录的NOS转录终止子。

通过高纯度质粒小提中量试剂盒(北京天根生化科技有限公司)分别提取以上获得的3种重组表达载体，确保浓度在0.5μg/μl以上。提取好的质粒用于后续的基因枪瞬时转化实验。

二、小麦胚乳的瞬时转化及转化效果检测

1、小麦胚乳的准备

将授粉后14天的小麦(TriticumaestivumL.)品种小偃54的种子用酒精浸泡1min，倒掉酒精，用浓度为5％(体积分数)的次氯酸钠的水溶液浸泡10min，倒掉次氯酸钠，用灭菌过的ddH₂O洗三次。去胚、拨去外表皮仅留下白色的胚乳，把胚乳放在MS固体培养基(配方如表1所示)的中央，30粒胚乳/皿，准备轰击。

表1MS固体培养基配方

2、基因枪瞬时转化

(1)制备金粉微弹

称30mg金粉放入1.5ml离心管中，加1ml70％(体积分数)乙醇；涡旋3-5min，浸泡15min，离心5sec，去上清；重复以下步骤3次：加1ml灭菌水→涡旋1min→静置1min→离心→去上清；最后加入500μl无菌50％甘油(体积分数，溶剂为无菌水)，其中金粉含量为60mg金粉/ml。

(2)质粒DNA包被微弹

供试质粒DNA：步骤一构建得到的3种重组表达载体(Pro-1Bx7^OE::GUS、Pro-1Bx7::GUS和Pro-1Bx13::GUS)或载体B；所述载体B为用BamHI和HindIII完全酶切所述载体A，回收大片段(大小约为4800bp)补平末端并自连后得到的载体。

1)涡旋步骤(1)获得的在50％甘油内保存的金粉5min；

2)取50μl悬浮的金粉加入到1.5ml离心管中；

3)加25μl质粒DNA(1μg/μl)，混合；

4)加70μl2.5MCaCl₂(溶剂为水)，混合；

5)加30μl0.1M亚精胺(溶剂为水)，混合；

6)在4℃放置10min，离心2sec，去除上清；

7)70％(体积分数)乙醇冲洗；

8)100％(体积分数)乙醇冲洗；

9)加60μl100％(体积分数)乙醇，混匀。

10)取10μl制备的DNA/金粉混合液加到载片上，在超净台内静置使DNA/金粉混合液变干，固定于发射大膜上，使用PDS-1000台式基因枪(Bio-Rad)轰击步骤1准备好的小麦胚乳。将轰击后的培养皿25℃暗培养过夜。每个重组表达载体至少轰击100个小麦胚乳。

3、GUS染色

GUS组织化学染液(20mL)的配制：0.2mol/LNa₂HPO₄(pH7.0)5mL、EDTA(0.5mol/L，pH8.0)5mL、Tween-2080μL、K₃[Fe(CN)₆](170mmol/L)118μL、K₄[Fe(CN)₆](170mmol/L)118μL、X-Gluc(20mg/mL)1mL；加ddH₂O定容至20mL，分装后-20℃贮存。

将暗培养过夜后的胚乳放入GUS组织化学染液，37℃避光温育24h。倒掉反应液，70％(体积分数)乙醇4℃固定几小时，95％(体积分数)乙醇脱色。显色后的胚乳可以直接在体式显微镜(LeicaMZ16型)上观察统计每个胚乳上的GUS点的数目，并分析各组之间GUS点的数目是否有存在显著差异。

4、瞬时表达结果分析

瞬时表达结果显示，完全由1Bx基因启动子驱动的GUS基因能在胚乳中正常表达(图4中A和B)；并且不同的1Bx启动子表达强度有很大差别(图4中C)。其中，Pro-1Bx7^OE启动子驱动GUS的表达强度最大，显著高于Pro-1Bx7启动子和Pro-1Bx13启动子(P<0.01)。由于Pro-1Bx7^OE启动子和Pro-1Bx7启动子的序列差异基本上仅在于是否具有43bp(序列4)插入片段，表明这个43bp的插入片段(序列4)可以很大程度地增强GUS基因的表达强度，而无43bp插入片段(序列4)的Pro-1Bx7启动子驱动的GUS基因表达强度则很低。而转入所述载体B的小麦胚，由于载体B上不存在启动GUS基因表达的启动子，所以没有GUS点的存在。

瞬时表达结果表明：Pro-1Bx7^OE启动子是一个在胚乳中具有高活性的启动子，其高活性与43bp插入序列(序列4)密切相关。

实施例3、转基因水稻中启动子活性分析结果

一、转基因载体构建

分别以实施例1获得Pro-1Bx7^OE启动子序列(序列1)、Pro-1Bx7启动子序列(序列2)和Pro-1Bx13启动子序列(序列3)为模板，通过引物1Bx-PF2和1Bx-PR2(序列见实施例2步骤一)进行PCR扩增。

反应体系和反应程序参照实施例1步骤二进行。

反应结束后，用BamHI和HindIII双酶切各PCR产物，胶回收后与经过同样双酶切的pCAMBIA1391Z载体(CAMBIA,Canberra,Australia)的骨架大片段相连，得到重组质粒。连接体系：T4DNA连接酶1μl；2×T4DNA连接酶缓冲液2.5μl；pCAMBIA1391Z载体骨架大片段1μl；酶切后PCR产物0.5μl。

对连接所得重组质粒进行测序，将经测序表明将pCAMBIA1391Z载体的BamHI和HindIII之间含有Ubiquitin(UBI)启动子的片段替换为序列1所示的Pro-1Bx7^OE启动子序列的重组质粒命名为Pro-1Bx7^OE::pCAMBIA1391Z；将经测序表明将pCAMBIA1391Z载体的BamHI和HindIII之间含有UBI启动子的片段替换为序列2所示的Pro-1Bx7启动子序列的重组质粒命名为Pro-1Bx7::pCAMBIA1391Z；将经测序表明将pCAMBIA1391Z载体的BamHI和HindIII之间含有UBI启动子的片段替换为序列3所示的Pro-1Bx13启动子序列的重组质粒命名为Pro-1Bx13::pCAMBIA1391Z。

在重组表达载体Pro-1Bx7^OE::pCAMBIA1391Z中，Pro-1Bx7^OE启动子序列(序列1)位于GUS基因上游，启动GUS基因的转录，而在GUS基因下游连接有用于终止其转录的NOS转录终止子。

将以上构建成功的3种转基因表达载体通过高纯度质粒小提中量试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取，提取好的质粒用于后续的农杆菌转化实验。

二、农杆菌电击感受态的制备

1、从划线平板上挑取农杆菌EHA105单克隆，接种到5mlYEB培养基中，28℃、250rpm培养过夜；

2、按1:200(体积比)的比例接种到500mlYEP液体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平)中，培养至OD600为0.6-0.8左右；

3、将菌液分装到预冷并灭菌的50ml离心管内，4℃、4000rpm离心10min，收集菌体；

4、弃上清，加入50ml10％(体积百分含量)甘油悬浮菌体(甘油用超纯水配制，并灭菌)，4℃、4000rpm离心10min；

5、弃上清，加入25ml10％(体积百分含量)甘油悬浮菌体，4℃、4000rpm离心10min；

6、弃上清，加入5ml10％(体积百分含量)甘油悬浮菌体，4℃、4000rpm离心10min；

7、弃上清，加入1ml10％(体积百分含量)甘油悬浮菌体，分装为20μl/管，液氮速冻后存于-70℃备用。

三、农杆菌的电击转化

在Gibico公司的cellPorter电击仪上进行。

1、将步骤二制备的农杆菌EHA105感受态细胞、电击杯，以及步骤一构建的3种重组表达载体(Pro-1Bx7^OE::pCAMBIA1391Z、Pro-1Bx7::pCAMBIA1391Z或Pro-1Bx13::pCAMBIA1391Z)一起放到冰上直至感受态细胞融化；

2、打开电击仪的开关，并在电击槽内放入冰水混合物进行预冷；

3、将1μl步骤一构建的重组表达载体(Pro-1Bx7^OE::pCAMBIA1391Z、Pro-1Bx7::pCAMBIA1391Z或Pro-1Bx13::pCAMBIA1391Z)加入已融化的盛有农杆菌EHA105感受态的离心管内，轻弹管底混匀；

4、将已混匀的质粒和农杆菌感受态一起转移至电击杯中，注意不要有气泡，并将电击杯放到电击槽内；

5、将电击槽与电击仪连接好，将开关拧向CHARGE，按ΜP将电压升至390伏以上，将开关转向ARM，待电压降到390伏时，按trigger键(电击参数：电容为330μF；电击速度为fast)；

6、取出转化液，加入500μlYEP液体培养基，28℃、220rpm复苏培养3h；

7、取3μl培养液加入适量YEP液体培养基均匀涂布在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平的YEP固体平板上，28℃倒置培养2天，获得重组农杆菌。

8、采用1Bx-PF2和1Bx-PR2(序列见实施例2步骤一)对所得重组农杆菌进行PCR扩增。将经鉴定得到大小为2276bp，测序含有序列1所示DNA片段的重组农杆菌命名为EHA105/Pro-1Bx7^OE；将经鉴定得到大小为2234bp，测序含有序列2所示DNA片段的重组农杆菌命名为EHA105/Pro-1Bx7；将经鉴定得到大小为2169bp，测序含有序列3所示DNA片段的重组农杆菌命名为EHA105/Pro-1Bx13。

采用相同的方法，获得向农杆菌EHA105感受态细胞中转入pCAMBIA1391Z空载体的对照重组农杆菌，将其命名为EHA105/pCAMBIA1391Z。

四、转化用农杆菌菌液的制备

取步骤3经PCR检测和测序正确的各重组农杆菌菌液5μl接种于5mlYEB液体培养基(含50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平)中，28℃、250rpm培养30h。菌液按1：400(体积比)转接到300mlYEB液体培养基中，28℃、250rpm培养14h至OD6001.5-3.0。7000rpm、4℃离心15min收集菌液，重悬菌体于2倍体积的转化渗透液(配方：1/2MS+2％(2g/100ml)蔗糖+0.01mg/L6-BA+10mg/LVB1+1mg/LVB6+0.02％(体积分数)SilwetL-77)。

五、水稻转化

以下步骤中涉及的各种培养基的配方参见“中国专利，申请号：200910237907.9，发明名称：植物耐逆性相关蛋白TaFbox2及其编码基因与应用”。

1、水稻(OryzasativaL.)品种Kitaake的种子用70％(体积百分含量)乙醇进行表面消毒1min后，用20％(体积百分含量)次氯酸钠(滴加一滴Tween-20)消毒20min，无菌水冲洗4-5次，于滤纸上吸干，种子的胚朝上置于NB固体培养基上，26℃、16h/8h光周期下培养，诱导愈伤组织。

2、10-15d后，剥下成熟胚盾片处长出的愈伤组织，转入新的NB固体培养基在相同的条件下继代培养。3-4cm大小的愈伤组织即可用于侵染转化。

3、将步骤四制备的农杆菌菌液均匀涂在固体YEP平板(含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)上，28℃黑暗培养2-3d，用无菌药匙从平板上刮菌于液体共培养培养基AAM(含100μM乙酰丁香酮，简称AS)中，调整菌液浓度至OD600为0.2-0.5。

4、将步骤2的胚性愈伤组织放入步骤3的农杆菌悬浮液中浸没，不时轻轻摇动15min。倾除菌液，将水稻愈伤组织用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，置于NBco共培养基上，28℃、黑暗共培养2-3d。

5、共培养2-3d的愈伤组织用无菌水洗三次，用含有500mg/L的头孢霉素(cef)的水清洗15min，再用水冲洗一次，将愈伤组织吹干水分，转到含潮霉素的预筛选培养基NBps上，26℃暗培养。

6、培养7d后转入含潮霉素的筛选培养基NBs，诱导抗性愈伤组织2-3次。待抗性愈伤组织长到一定大小后，挑选色泽金黄、质地紧凑的抗性愈伤组织转入预再生培养基MSpr，将来源相同的抗性愈伤组织移至培养基的同一区域，作为同一株系，26℃光照培养。

7、7d后转入再生培养基MSr，直到出绿、分化出芽。长出的小苗到3-4cm后，移至生根培养基1/2MS的试管中，生根培养。生根培养2-3周，待小苗长出粗壮的根系后可移至温室培养。培养一段时间后即可移栽大田收获种子，得到T1代种子。

将T1代种子长成的植株进行PCR鉴定，采用引物为1Bx-PF2和1Bx-PR2(序列见实施例2步骤一)。对于转入Pro-1Bx7^OE的植株，经鉴定得到大小约为2276bp，测序为序列1所示DNA片段的植株为阳性；对于转入Pro-1Bx7的植株，将经鉴定得到大小为2234bp，测序为序列2所示DNA片段的植株为阳性；对于转入Pro-1Bx13的植株，将经鉴定得到大小为2169bp，测序为序列3所示DNA片段的植株为阳性。鉴定阳性的T1代植株自交得到T2代种子。T2代植株自交后获得T3代种子，用来进行后续的实验。

采用相同的方法，获得向水稻(OryzasativaL.)品种Kitaake中转入pCAMBIA1391Z空载体(UBI启动子启动GUS基因表达)的对照植株。

六、转1Bx启动子水稻的组织GUS染色分析和定量检测

将步骤五鉴定阳性的T3代转基因水稻种植在实验田中，分别在开花后10天、12天、14天、16天、18天取样，包括籽粒、叶片和茎。一半材料用于GUS组织化学染色，另一半材料冷冻于液氮中，用于提取籽粒总RNA进行荧光定量PCR检测。

1、GUS组织化学染色

将籽粒的外壳剥去，用解剖刀对一部分籽粒进行横切，把叶片和茎剪成小块，分别放入GUS组织化学染液(配方见实施例2)中，37℃温育2天，先后用75％，100％的乙醇进行脱色，放置于德国LeicaMZ16体式显微镜下进行观察，拍照。

组织染色结果如图5中A(水稻花后14天)所示。三种不同1Bx全长启动子(Pro-1Bx13、Pro-1Bx7、Pro-1Bx7^OE)驱动GUS在转基因水稻的籽粒中特异表达，均有显色现象(蓝色)，而在叶片和茎中不显色。而作为对照的Ubiquitin启动子(pCAMBIA-1391Z空载体携带)驱动GUS呈现组成性表达，在籽粒、叶片和茎中均有显色(蓝色)。证明三种全长1Bx启动子包含了控制胚乳特异性表达的顺式作用元件。且从图5中A的染色图片中，染色的深浅可以明显看出，转基因水稻组织化学染色结果与瞬时表达结果一致，与全长1Bx13和1Bx7启动子相比，1Bx7^OE全长启动子具有更强的胚乳特异表达活性(染色更深)，是一个有潜在应用价值的胚乳特异性表达强启动子。

2、荧光定量PCR检测

为进一步辅证GUS组织染色结果，使用ABI公司7300实时定量PCR系统对稳定转基因水稻花后10-18天籽粒中的GUS基因表达水平进行了荧光实时定量(qRT-PCR)检测，所使用的PremixExTaqTM试剂盒购自Takara公司。通过比较CT值法(ΔΔCT值法)(参见：SchmittgenTD.Real-TimeQuantitativePCR.Methods,2001,25:383-385)计算GUS基因在不同样品中的相对表达量(转入pCAMBIA1391Z空载体的转基因植株花后10天的籽粒中GUS基因的相对表达量设定为1)。GUS基因的检测设置3个重复，结果取平均值。以水稻GAPDH基因作为内参。

扩增GUS基因的引物如下(5'→3')：

上游引物：CAACGGGGAAACTCAGCAAG；

下游引物：TGAGCGTCGCAGAACATTACA。

扩增GAPDH基因引物如下(5'→3')：

上游引物：CGACCCGTTCATCACCACCGAC；

下游引物：AGCTAGCAGCCCTTCCACCTCTCCA。

结果见图5中B所示。在水稻花后10-14天的籽粒中，GUS表达水平均为上升趋势，并于花后14-16天达到一个峰值，并且Pro-1Bx7^OE转基因植株籽粒中GUS基因表达水平显著高于Pro-1Bx7和Pro-1Bx13转基因植株中的表达水平。相比之下，Ubiquitin驱动GUS表达水平变化不大(空载对照)。GUS基因荧光定量表达分析结果与组织染色结果是一致的，说明3种1Bx启动子具有胚乳特异表达特性，并且Pro-1Bx7^OE具有最高的表达活性。

Claims (12)

1.DNA分子，为序列表中序列1所示的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体。

3.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。

4.含有权利要求1所述DNA分子的重组菌。

5.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因在植物表达中的应用；

所述植物为小麦或水稻。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述表达为胚乳特异性表达。

7.利用权利要求1所述的DNA分子培育转基因植物的方法，包括如下步骤：

a)将目的基因插入权利要求2所述重组载体，使权利要求1所述的DNA分子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体；

b)将步骤a)构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，得到在胚乳特异性表达所述目的基因的转基因植物；

所述植物为小麦或水稻。

8.DNA分子，为序列表中序列4所示的DNA分子。

9.含有权利要求8所述DNA分子的重组载体。

10.含有权利要求8所述DNA分子的表达盒。

11.含有权利要求8所述DNA分子的重组菌。

12.权利要求8所述DNA分子在增强目的基因在植物表达中的应用；

所述植物为小麦或水稻。