CN106801061A

CN106801061A - 玉米ZmNST3基因及应用

Info

Publication number: CN106801061A
Application number: CN201611219552.7A
Authority: CN
Inventors: 于静娟; 肖文翰; 赵倩; 朱登云
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2017-06-06

Abstract

本发明首次克隆得到与玉米次生细胞壁发育相关的ZmNST3基因的CDS序列(SEQ ID No.1)，将所述基因转化到植物中可提高植物茎中次生细胞壁的积累，增加细胞壁中纤维素、木质素的含量。本发明提供了一种利用ZmNST3基因提高植物次生壁积累的新方法，可用于高生物质量植物新品种的培育，有利于生物质能源的开发和利用。

Description

玉米ZmNST3基因及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及玉米ZmNST3基因及应用。

背景技术

能源是国民经济和社会发展的重要物质基础。在当今的能源体系中，化石能源依然占据近90％的比重，而化石能源不可再生，储量有限。大量使用化石能源在带来能源资源短缺的同时，引发了一系列日益严重的环境问题，对生态系统和人类健康造成负面影响。寻求和开发新型能源，特别是环境友好的可再生能源迫在眉睫。生物质能是一种新型的可再生能源，发展可替代内燃机燃料的生物质先进液体燃料有助于缓解石油短缺。木质纤维素类生物质是制备生物质液体燃料的主要原料，而植物细胞中的次生细胞壁是植物中纤维素含量最高的组分。对植物次生壁的发育进行调控，可以培育出优良的能源植物。一些NAC家族的转录因子具有调控植物次生细胞壁发育的功能。

NAC转录因子家族是植物特有的一类转录因子，也是植物中最大的一类转录因子，广泛的参与了植物发育的各个阶段以及植物的逆境胁迫响应。如NAM基因能调控植物的顶端分生组织的发育(Souer,E.,van Houwelingen,A.,Kloos,D.,Mol,J.,and Koes,R.(1996).The no apical meristem gene of Petunia is required for patternformation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordiaboundaries.Cell 85,159-170.)；AtNAC2能调控侧根的发育(He,X.J.,Mu,R.L.,Cao,W.H.,Zhang,Z.G.,Zhang,J.S.,and Chen,S.Y.(2005).AtNAC2,a transcription factordownstream of ethylene and auxin signaling pathways,is involved in saltstress response and lateral root development.Plant J 44,903-916)；OsNAC2参与植物冷胁迫响应，过表达能增加转基因植株的抗冷能力等(Hu,H.,Dai,M.,Yao,J.,Xiao,B.,Li,X.,Zhang,Q.,and Xiong,L.(2006).Overexpressing a NAM,ATAF,and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance inrice.Proc Natl Acad Sci USA 103,12987-12992.)。近十年在拟南芥和杨树中的研究结果显示，一类NAC家族转录因子在次生壁发育调控过程中发挥着重要的功能，如拟南芥NST1，NST2，NST3(Mitsuda,N.,Iwase,A.,Yamamoto,H.,Yoshida,M.,Seki,M.,Shinozaki,K.,and Ohme-Takagi,M.(2007).NAC Transcription Factors,NST1and NST3,Are KeyRegulators of the Formation of Secondary Walls in Woody Tissues ofArabidopsis.Plant Cell19,270-280；Mitsuda,N.,Seki,M.,Shinozaki,K.,and Ohme-Takagi,M.(2005).The NAC transcription factors NST1and NST2of Arabidopsisregulate secondary wall thickenings and are required for antherdehiscence.Plant Cell 17,2993-3006.)等。目前，玉米中报道了ZmSWN1、ZmSWN3、ZmSWN6和ZmSWN7在拟南芥中过表达可以影响拟南芥茎束间维管细胞的次生壁沉积(Zhong,R.,Lee,C.,McCarthy,R.L.,Reeves,C.K.,Jones,E.G.,and Ye,Z.H.(2011).TranscriptionalActivation of Secondary Wall Biosynthesis by Rice and Maize NAC and MYBTranscription Factors.Plant Cell Physiol 52,1856-1871.)。除此以外，再无其他玉米次生壁相关NAC转录因子在调控次生壁发育方面的功能报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从玉米(Zea mays)幼苗的cDNA文库中克隆得到玉米ZmNST3基因。

本发明的另一目的是提供玉米ZmNST3基因在调控植物次生壁积累中的应用。

为了实现本发明目的，本发明从玉米幼苗的cDNA文库中克隆得到一个与拟南芥NST3同源的基因，命名为玉米NST3基因(ZmNST3基因)。该基因的CDS序列全长为1104bp，为双链核酸类型，线性，其核苷酸序列为：SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

ZmNST3蛋白包含NAC结构域，与拟南芥AtNST3序列相似度49.5％。亚细胞定位表明ZmNST3定位于细胞核中。半定量PCR分析ZmNST3基因的表达模式，表明其在玉米幼苗、根、茎、叶、及种子等组织中均表达，在茎中表达量相对较高。

进一步地，含有玉米NST3基因CDS序列的DNA分子也在本发明的保护范围内。

本发明还提供ZmNST3基因在调控植物次生壁积累中的应用。

所述调控植物次生壁积累是指调控植物细胞壁中纤维素、半纤维素及木质素含量。所述植物包括但不限于拟南芥、玉米等。

本发明进一步提供用于实时荧光定量PCR检测玉米ZmNST3基因的特异性引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物：5'-CCTCTTCCTACTGCGATCGT-3',

下游引物：5'-ATGTACTGCAGGATGTGGTC-3'。

本发明构建了含有ZmNST3基因的拟南芥和玉米表达载体。

在一个优选的实施方式中，拟南芥表达载体上的表达盒是由Super启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域构成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。优选地，所述表达载体的出发载体为pCambia1300载体，构建得到重组质粒pCambia1300-ZmNST3，其中ZmNST3基因正向插入，且由Super启动子驱动表达。

在另一个优选的实施方式中，玉米表达载体上的表达盒是由CaMV35s启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域构成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。优选地，所述表达载体的出发载体为pROK219载体，构建得到重组质粒pRH-ZmNST3，其中ZmNST3基因正向插入，并且由CaMV35s启动子驱动表达。

本发明将含有所述ZmNST3基因的重组表达载体转化植物，如拟南芥和玉米，获得了次生壁积累增加的转基因植物。

在一个优选的实施方式中，将含有所述ZmNST3基因的表达载体转化拟南芥，获得的转基因拟南芥束间纤维细胞次生壁积累增加。

另一个优选的实施方式中，将含有所述ZmNST3基因的表达载体转化玉米，获得的转基因玉米茎维管束中维管束鞘细胞、木质部细胞等细胞的次生壁积累增加。

本发明首次克隆得到与玉米次生壁发育调控相关的ZmNST3基因，将所述基因转化到植物中可提高植物次生壁积累。本发明提供了一种利用ZmNST3基因提高植物中纤维素、木质素含量的新方法，可用于高生物质量植物新品种的培育，有利于生物质能源的开发和利用。

附图说明

图1为本发明实施例2中含有ZmNST3基因的拟南芥表达载体的T-DNA区域图。

图2为本发明实施例3中含有ZmNST3基因的玉米表达载体ZmNST3和HPT基因表达框图谱。

图3为本发明实施例6中转基因拟南芥中ZmNST3基因的检测结果；其中：A为PCR检测结果，M:D2000plus DNA分子量标准，P：质粒作为阳性对照，WT：野生型作为负对照，H：H₂O作为负对照；B为RT-PCR扩增结果。

图4为本发明实施例7中转基因玉米中ZmNST3基因的检测结果；其中：A为PCR检测结果，M:D2000plus DNA分子量标准，P：质粒作为阳性对照，WT：野生型作为负对照，H₂O：H₂O作为负对照；B为实时荧光定量PCR结果。

图5为本发明实施例8中ZmNST3转基因拟南芥茎束间纤维细胞次生壁的扫描电镜结果。

图6为本发明实施例9中ZmNST3转基因玉米VT时期维管束次生壁的扫描电镜结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 ZmNST3的克隆

选取玉米V3时期幼苗提取总RNA，采用Promega公司的cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA，使用特异性引物进行扩增获得ZmNST3CDS序列，全长1104bp(SEQ ID No.1)。所述引物对的核苷酸序列为：

上游引物：5'-TGATGAGCATCTCGGTGAACGG-3',

下游引物：5'-GACTAGGCGTTGTTCATGGCCAA-3'。

实施例2用于拟南芥中表达ZmNST3基因的表达载体的构建及农杆菌转化

表达盒是由根癌农杆菌的Super启动子(即由mas启动子融合3个ocs增强子和1个mas增强子得到的，参见Leisner SM,Gelvin SB(1988)Structure of the octopinesynthse upstream activator SEQuence.Proc Natl Acad Sci USA 85,2553-2557)和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域(DepickerA,Stachel S.,Dhaese P,Zambryski P,Goodman HM(1982).Nopaline synthase:transcript mapping and DNASEQuence.J Mol.Appl Genet.1,561-573)组成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。其T-DNA区域如图1所示。

以含有ZmNST3基因的质粒为模板，利用PCR方法得到两端带有XbaI和SmaI酶切位点的ZmNST3基因片段，连接到pMD19T载体上，测序正确后用XbaI和SmaI进行双酶切，回收约1100bp的片段。pCambia1300载体含有过表达启动子super promoter，用XbaI和SmaI进行双酶切，回收载体大片段。将载体和目的片段连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到由Super启动子驱动的ZmNST3基因正向插入的重组质粒pCambia1300-ZmNST3。将pCambia1300-ZmNST3采用电击法直接转化农杆菌GV3101，获得含有重组质粒pCambia1300-ZmNST3的农杆菌GV3101(pCambia1300-ZmNST3)。

实施例3用于玉米中表达ZmNST3的表达载体的构建及遗传转化

表达盒是由CaMV35s启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的3’转录终止区域构成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。其表达框如图2所示。

以含有ZmNST3基因的质粒为模板，利用PCR方法得到两端带有SmaI和KpnI酶切位点的ZmNST3基因片段，连接到pMD19T载体上，测序正确后用SmaI和KpnI进行双酶切，回收约1100bp的片段。用SmaI和KpnI对表达载体pROK219(含CaMV35s启动子)进行双酶切，回收载体大片段。将载体和目的片段连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到由CaMV35s启动子驱动的ZmNST3基因正向插入的重组质粒pROK219-ZmNST3。随后，用HindIII对载体pHYG进行单酶切，回收约2kb的HPT表达框，用HindIII对pROK219-ZmNST3重组质粒进行单酶切，回收载体大片段，将载体和目的片段连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到含有潮霉素筛选标记的ZmNST3表达载体pRH-ZmNST3。高纯度重组质粒pRH-ZmNST3用于基因枪法转化玉米愈伤。

实施例4 pCambia1300-ZmNST3表达载体转化拟南芥

在野生型拟南芥抽苔4-5cm时剪去顶端花序，使腋生花序生长，约4-5天后进行转化。此时植物次级花序即将开花，或仅有极少的花已开，是转化最佳时期。转化前要使土壤尽量湿透，将大的花蕾去掉，只保留未开放的小花蕾。农杆菌转化拟南芥植株的方法采用花芽浸泡法(Clough SJ and Bent AF(1998)Floral dip:a simplified methodforAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16,735-743)。将拟南芥整株与花盆一起倒扣在盛有200ml稀释好的实施例2中制备的农杆菌GV3101菌液(OD₆₀₀＝0.8)的容器中浸泡2-3min，期间轻微晃动。浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，置22℃，盖上黑色塑料布，24h后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养。等果荚成熟后，收获种子。收获的T₀代转基因植株的种子用70％酒精处理2min，0.5％次氯酸钠消毒处理15-20min，再用无菌水洗涤4-6遍。将种子均匀置于含25μg/mlHyg的MS培养基上，于4℃暗培养2-3天进行春化，然后于22℃光照培养(16h光照，8h黑暗)7-10天，抗性苗表现为苗深绿色，有真叶，根伸长至培养基中。将抗性苗移栽到花盆(花卉营养土：蛭石＝1：1，重量比)培养，获得T₁代转基因种子。

实施例5 pRH-ZmNST3表达载体转化玉米

选取授粉后约11天的玉米果穗，去除苞叶后用75％乙醇消毒1-2min，在超净工作台中剥取未成熟的幼胚(约1-2mm)，平面朝下置于诱导愈伤组织的培养基(NB+2mg/L 2,4-D+0.7g/L脯氨酸+0.2g/L酸水解酪蛋白+0.1g/L肌醇+0.85mg/L AgNO₃+30g/L蔗糖+3.5g/L植物凝胶，pH 5.8)上，黑暗条件下28℃培养，约一周后长出愈伤组织，除去愈伤组织上的芽，继续培养，每两周继代一次。大约生长一个月后，选取颜色淡黄的愈伤组织作为遗传转化的受体材料。

选取状态好的愈伤组织，切碎后于高渗培养基(NB+2mg/L 2,4-D+0.7g/L脯氨酸+0.2g/L酸水解酪蛋白+0.1g/L肌醇+0.85mg/L AgNO₃+0.4M甘露醇+30g/L蔗糖+3.5g/L植物凝胶，pH 5.8)上预处理4-6h，随后利用基因枪法轰击预处理后的愈伤组织进行遗传转化。轰击时所用子弹制备及轰击参数如下：称取金粉30mg(60枪用)，分别用500μL 100％乙醇和500μL灭菌ddH₂O各漂洗三次，加入500μL灭菌的50％甘油重新悬浮金粉后，以每管33μL的量(4枪用)平均分配金粉。每管金粉加入4μL pRH-ZmNST3质粒(1μg/μL)，vortex混匀并依次加入50μL 2.5M CaCl₂，振荡5min；加入20μL 0.1M的亚精胺，冰上静置8min；短暂离心后去掉上清，加入200μL 100％乙醇漂洗，去掉上清后加入50μL 100％乙醇，振荡混匀并保持悬浮状态；取12.5μL微弹，均匀涂抹在微弹载体的内圈上，待乙醇自然挥发后，即为一枪的子弹。射击参数为：轰击压力(Acceleration pressure)：1100psi；间隙距离(Gap distance):20mm；微弹载体飞行距离(Macroprojectile flight distance)：10mm；微弹飞行距离(Particle flight distance)：7cm；真空度：25inches Hg。

基因枪轰击后的愈伤继续在高渗培养基上培养过夜，后转入恢复培养基(配方同愈伤诱导培养基)在28℃暗培养条件下培养一周；随后在含不同浓度潮霉素的筛选培养基(NB+2mg/L 2,4-D+0.7g/L脯氨酸+0.2g/L酸水解酪蛋白+0.1g/L肌醇+0.85mg/L AgNO₃++30g/L蔗糖+3.5g/L植物凝胶，pH 5.8)上进行3轮筛选培养，每轮筛选培养时间为2周，潮霉素浓度分别为10mg/L，15mg/L，20mg/L。筛选后的抗性愈伤组织置于筛选后恢复培养基(NB+2mg/L 2,4-D+0.7g/L脯氨酸+0.2g/L酸水解酪蛋白+0.1g/L肌醇+0.85mg/L AgNO₃+50g/L蔗糖+3.5g/L植物凝胶，pH 5.8)中28℃暗条件下继续培养1周，随后置于分化培养基(NB+0.7g/L脯氨酸+0.2g/L酸水解酪蛋白+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+3.5g/L植物凝胶，pH 5.8)上28℃见光培养2-3轮，每轮2周，约3轮后，一部分愈伤组织的表面会分化产生绿芽，将绿芽切分到生根培养基(MS+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+3.5g植物凝胶，pH5.8)中生根，待苗长大后，移栽到小盆里，置于温室培养。

实施例6转基因拟南芥中ZmNST3基因表达的检测

SDS法小量提取拟南芥叶片基因组DNA，利用ZmNST3基因特异引物(正向引物:5'-CCTCTTCCTACTGCGATCGT-3',反向引物:5'-ATGTACTGCAGGATGTGGTC-3')，进行PCR检测。结果如图3A所示，显示潮霉素筛选的多株转基因拟南芥均为阳性。

TRIzol法提取拟南芥叶片总RNA，反转录合成第一链cDNA。以cDNA为模板，利用ZmNST3基因特异引物(正向引物:5'-CCTCTTCCTACTGCGATCGT-3',反向引物:5'-ATGTACTGCAGGATGTGGTC-3')，进行RT-PCR扩增。结果如图3B所示，显示ZmNST3基因在转基因拟南芥中可以稳定转录。

实施例7转基因玉米中ZmNST3基因表达的检测

SDS法小量提取玉米叶片基因组DNA，利用筛选标记基因hpt特异引物(正向引物：5'-TCGGCTCCAACAATGTCCTG-3'，反向引物：5'-CGGTCGGCATCTACTCTATTCC-3')，进行PCR检测。结果如图4A所示，有5株鉴定为PCR阳性。

用TRIzol法提取玉米叶片总RNA，反转录成cDNA。以cDNA为模板，利用ZmNST3基因特异引物(正向引物:5'-CCTCTTCCTACTGCGATCGT-3',反向引物:5'-ATGTACTGCAGGATGTGGTC-3')，进行实时荧光定量RT-PCR扩增。结果如图4B所示，显示过表达株系L41中ZmNST3基因的表达量是野生型对照(WT)的3倍，而其他两个株系表达量低于对照。

实施例8 ZmNST3转基因拟南芥次生细胞壁积累情况分析

将播种后6周的野生型(WT)和转ZmNST3基因拟南芥纯合植株(L4和L6)的茎进行观察。取茎底部1cm的位置进行切片，后利用TM3000台式扫描电镜进行观察(日立，日本)。结果如图5A所示，在转ZmNST3的转基因拟南芥中，茎束间维管的次生壁厚度明显高于野生型；纤维素、半纤维素的含量测定结果如图5B所示，在转ZmNST3的转基因材料中，细胞壁中纤维素、半纤维素的含量明显增加。以上的研究结果表明，ZmNST3能促进拟南芥茎中束间维管细胞的次生壁积累。

实施例9 ZmNST3转基因玉米次生细胞壁积累情况分析

取VT时期的野生型(WT)和转ZmNST3基因玉米的茎进行观察。取第二节间进行徒手切片，厚度约100μm，利用TM3000台式扫描电镜进行观察(日立，日本)。结果如图6A所示，在过表达ZmNST3的转基因玉米中，茎中维管束的次生壁厚度大于野生型，且切面粗糙；纤维素、半纤维素的含量测定结果如图6B所示，在转ZmNST3的转基因玉米茎的细胞壁中，纤维素和半纤维素的含量显著提高。以上的研究结果表明，ZmNST3能促进玉米茎中维管束中维管束鞘细胞等细胞的次生壁积累。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 玉米ZmNST3基因及应用

<130> KHP161118945.3

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1104

<212> DNA

<213> ZmNST3

<400> 1

atgagcatct cggtgaacgg gcagtcggtg gtgcctccgg ggttccggtt ccacccgacg 60

gaggaggagc tgctgaccta ctacctgaag aagaaggtgg cgtcggagcg catcgacctg 120

gacgtcatcc gcgacgtgga cctcaacaag ctggagccat gggacatcca agacaagtgc 180

cgcgtcgggt cgtcgtcagg ccctcagaac gactggtact tcttcagcca caaggacagg 240

aagtacccga cggggacgcg caccaaccgc gccacggcgg ccgggttctg gaaggccacc 300

ggccgcgaca aggccatcta cgcggccggc ggcgccgccc gccgcatcgg catgcgcaag 360

acgctcgtct tctaccaggg ccgcgcgccg cacgggcaca agtccgactg gatcatgcac 420

gagtaccgcc tcgacgccgc cgacgccgac catcaccatc catgctgcta cccctcgccg 480

cctcctcttc ctactgcgat cgtccgtggc gcggcggggc cgggggacca agtgccgcag 540

gagcaggagg ggtgggtgat ctgcagggtg ttcaagaaga agaacctcgt gcaccacggc 600

gccgcccaga gcagcggcgg cggcggtacg gcggcggcgg cgtccaagat ggagagcagc 660

ccgaccagca ccaccatcat cggtgaccac gccagcgacg acgcgctcga ccacatcctg 720

cagtacatgg gcggcggcga caccaagccg gcgctgctga accacaacca acaccttgct 780

gccgcggcag atgctactac tactacgacc gccgcgtgtc ctgccgccgc cacaagcgcc 840

ggcctctacg ggaacaacaa gttcatgaag ctcccgcccc tcgagcacgc cggcggctgg 900

ctgccgccga gtccggggcc gtgcgagtac ggcgcctcgg ggatcgccga ctgggacgcc 960

ctggaccggc tcgccgccta cgagctcaac ggcctctccg acgcgtccaa gaacatggcc 1020

gccttcttcg acggcgacct ctggagcatg gccagatcgg tgtcggcgct acacgcggcg 1080

gatttggcca tgaacaacgc ctag 1104

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctcttccta ctgcgatcgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtactgca ggatgtggtc 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgatgagcat ctcggtgaac gg 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gactaggcgt tgttcatggc caa 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcggctccaa caatgtcctg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cggtcggcat ctactctatt cc 22

Claims

1.玉米ZmNST3基因，其特征在于，其核苷酸序列为：SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述基因在提高植物次生细胞壁积累中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物次生细胞壁的积累指在细胞壁中纤维素、半纤维素及木质素含量增加，次生细胞壁厚度增加。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物包括但不限于拟南芥、玉米。

5.转基因植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将含有所述ZmNST3基因的重组表达载体转入植物组织中，筛选转基因植株；或采用基因枪的方法，将含有所述ZmNST3基因的重组表达载体转入植物组织中，筛选转基因植株。

6.权利要求1所述基因在植物品质改良中的应用。