CN115232833B

CN115232833B - 一种农杆菌介导的芸薹属作物高效遗传转化方法

Info

Publication number: CN115232833B
Application number: CN202211066746.3A
Authority: CN
Inventors: 唐玉林; 史礼煜; 白永生; 刘美婷; 黄仕莉; 李灏
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2022-09-01
Filing date: 2022-09-01
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2042-09-01
Also published as: CN115232833A

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的芸薹属作物高效遗传转化方法，包括步骤：(1)构建含有目的基因的农杆菌；(2)制备农杆菌侵染悬浮液，所述侵染悬浮液含有蔗糖5％(m/v)、Silwet‑770.01％(v/v)和乙酰丁香酮0.1mM；(3)在芸薹属作物幼苗生长50‑60天后，对花蕾进行拨开苞叶、花瓣和损伤心皮处理，处理完成后，将花蕾浸泡于农杆菌侵染悬浮液中进行侵染，侵染结束后，套袋培养；(4)筛选、鉴定。本发明通过在农杆菌侵染悬浮液中添加乙酰丁香酮，并对花蕾进行拨开苞叶、花瓣和划伤心皮操作，从原理上解决花萼花被过于坚硬、闭合过紧、心皮闭合时间过长导致农杆菌无法侵染的问题，提高侵染效率。

Description

一种农杆菌介导的芸薹属作物高效遗传转化方法

技术领域

本发明涉及转基因作物领域，具体为一种农杆菌介导的芸薹属作物高效遗传转化方法，更具体地涉及农杆菌介导的菜心高效遗传转化方法。

背景技术

根癌农杆菌介导的植物转化法是目前应用最广、转化机理最清楚的遗传转化方法，第一批能成功地表达外源目的基因的转化植物就是利用根癌农杆菌介导的方法获得的，是目前植物转化的最常见手段。

根癌农杆菌细胞中通过Ti质粒(tumour inducing plasmid)的转移将DNA转入目的植株中，Ti质粒可分为以下4个区：(1)T-DNA区(transfer-DNA region)，T-DNA是在农杆菌浸染植物的细胞时，从根癌农杆菌Ti质粒上切割下来并转移入植物细胞的DNA片段。因此只要将目的基因与T-DNA区进行连接，即可利用农杆菌对植物侵染。(2)Vir区(virulenceregion)，此区段上的编码基因可以激活T-DNA的加工和转移，促使农杆菌表现出毒性，亦称为致毒区。(3)Con区(region encoding conjugations)，此区段有与细菌之间结合相关的tra基因，并对Ti质粒在根癌农杆菌之间的转移加以调控。(4)Ori区(origin ofreplication)。该区段基因调控Ti质粒在菌中的自我复制。农杆菌Ti质粒的T-DNA导入植物基因组的整个过程包括：(1)农杆菌对受伤部位的识别；(2)农杆菌的附着；(3)Vir区基因的诱导；(4)转移复合体的形成；(5)T-DNA的加工与转运；(6)T-DNA的整合6个步骤。农杆菌的许多菌株是高度移动的，并被许多糖和氨基酸所吸引。植物受伤的细胞会分泌某些酚类化合物(如乙酰丁香酮，AS)，这些化合物吸引农杆菌向受伤组织富集并进行附着。当根癌农杆菌附着于植物细胞后，Vir区基因接受植物细胞产生的创伤信号，会启动编码结合在膜上的一种化学受体蛋白VirA，该蛋白在与酚类化合物结合后产生一系列级联的蛋白磷酸化反应，促使一种跨膜通道蛋白VirB的表达，这种跨膜通道蛋白能帮助T-DNA完成第一步跨膜转动，进入到植物的细胞当中。在Vir基因激活后，还有一种新的VirD蛋白会在在质粒特定位点切割下单链的T-DNA，并以T链的5'端和Vir区编码的另一种蛋白结合，形成细长核酸-蛋白质丝，从而避免5端受到5'外切核酸酶的攻击。加工好的单链T-DNA的复合体能穿过由类结合孔进入到植物的受体细胞中，经VirD/E蛋白核导向作用而进入到植物的细胞核内并进行随机染色体的整合。

菜心(Brassica campestris L.var.parachinesis)为十字花科芸薹属中的一种二年生草本植物，是中国不结球白菜亚种的一个变种，又名“菜薹”。菜心是我国华南地区普遍种植的蔬菜，以花薹为食用器官，拥有独特的风味、品质脆嫩、营养丰富，其含量丰富的膳食纤维和维生素C等可以促进人体肠壁蠕动，帮助消化、预防心血管疾病。而随着菜心在市场上受到了广大群众越来越多的青睐，菜心种植面积以及在市场上的需求量日益增加。但菜心在种植生长过程中容易遭受虫害、极端天气等的影响，因此，选育抗虫、抗逆、抗除草剂和其他优良性状的菜心新品种是必要的，通过分子育种的方法获得新的品种或种质资源是一重要途径。近年来，芸薹属作物的遗传转化研究在油菜、青菜、白菜、芥菜、甘蓝等作物上取得了一定的进展。

自利用农杆菌介导法首次获得芸墓属转基因植株以来，芸薹属作物的遗传转化受到广泛关注。其中对油菜、白菜、甘蓝、芥菜、菜心等芸薹属植物遗传转化体系均有报道。而目前菜心经由农杆菌介导转化方法主要分为两大类：一是以植物组织培养为基础的遗传转化；二是不依赖植物组织培养的遗传转化。

(一)以菜心组织培养为基础的遗传转化将通常将不同植物组织(花药、带叶柄子叶、叶片等)作为外植体进行离体培养，通常经过预培养、侵染、共培养、恢复培养和继代培养等步骤得到稳定的转基因植株。但菜心离体培养能否成功受限于许多因素：植物组织类型、苗龄、菜心基因型、严苛的无菌环境、激素配比等。苏蔚等人以3天龄的带柄子叶为材料，侵染90个外植体，耗费11个月，最终得到2株成功转基因的外植体，转化成功率为2.2％；而不同品系的菜心，要建立离体再生体系通常还需要进行更多条件尝试、耗费冗长的周期才能得到遗传材料，而且往往难以得到稳定遗传表达的材料，相较于苏蔚等的方法，更加耗时耗力。

(二)不依赖植物组织培养的遗传转化体系包括：真空渗入法、简单浸花法等。1)真空渗入法是目前菜心不依赖植物组培的主要遗传转化方法，它主要借助真空泵的吸力作用，使农杆菌更有效的侵染受体植物。在真空状态下，农杆菌的浸染力大于植株的抗浸染力，在此环境中，更利于农杆菌感染受体植物，该方法操作简单、快速、实用性强，是目前菜心不依赖植物组培转化成功的报道文献最多的方法。2)简单的农杆菌介导的浸花(floral-dip)转化方法是近年发展起来的一种较简便的不依赖组织培养的转基因方法，在十字花科模式植物拟南芥的转基因中广泛应用。该方法是一种不依赖组织培养的较简便的转基因方法，即在非真空状态下就可以得到转化的种子，只是将花序浸没在有活性剂，蔗糖和基因转化媒介农杆菌的环境中。据实验验证，浸花法的转化部位是未完全成熟的花蕾，因此浸花法需要在子房发育成熟前、心皮闭合前对植株进行侵染。该方法的优点在于可以避开组织培养和继代培养，直接获得转基因的种子，且相对于真空渗透法，对仪器设备要求低。该方法排除了组织培养中因体细胞变异而给目的基因的正确表达带来的不利的遗传背景，同时大大缩短了菜心转化的周期。该方法具有方便快捷、低成本、得到的植株不易突变的优点。从拟南芥上发展来的浸染花序的方法在许多作物的转化中非常有效，但在芸薹属植物中却没有明显效果，韩笑等利用浸花法对大白菜进行侵染转化，未得到任何白菜的转基因植株。因此在该方法改良前，传统浸花法侵染菜心效率极其低下。其他不依赖植物组织培养的遗传转化的方法在菜心中也鲜有成功事例报道。

发明内容

为了解决现有技术中问题：1)由于菜心离体再生困难，受到外植体类型等诸多因素影响，因此通过离体组织转化费时费力，成功概率也低；2)传统浸花法侵染菜心效率极其低下，本发明旨在提供一种农杆菌介导的芸薹属作物高效遗传转化方法。

传统浸花法侵染菜心效率低的原因可能是：菜心花序发育节律及形态结构与拟南芥花序有差异，菜心花蕾的心皮闭合持续时间长，从闭合到花蕾开放需经15天左右。开放的心皮形成的孔道可能是农杆菌进入供试材料体内的途径之一，而浸花法转化发生的部位大多在未成熟花蕾中。由此可以推断，闭合的心皮可能是造成农杆菌不能顺利进入菜心的原因之一。菜心未开放的花苞外的萼片和花瓣坚硬厚实等也会影响农杆菌的侵染效率。本发明通过优化花序侵染条件，提高根癌农杆菌介导的菜心花序侵染方法的成功率。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供一种农杆菌介导的芸薹属作物高效遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)将含有目的基因序列的质粒转化进入农杆菌，构建含有目的基因的农杆菌；所述含有目的基因序列的质粒带有抗生素抗性基因；

(2)制备农杆菌侵染悬浮液，所述侵染悬浮液含有蔗糖5％(m/v)、Silwet-770.01％(v/v)和乙酰丁香酮0.1mM；

(3)在芸薹属作物幼苗生长50-60天后，即开始开花时，对花蕾进行拨开苞叶、花瓣和损伤心皮处理，处理完成后，将花蕾浸泡于步骤(2)所述农杆菌侵染悬浮液中进行侵染，侵染结束后，套袋培养；

(4)待步骤(3)芸薹属作物种子成熟后，分株收种，将得到的T0代种子在含抗生素的培养基上进行筛选、鉴定。

进一步地，所述方法还包括步骤(5)：对鉴定为含有目的基因阳性的植株进行繁殖，得到的种子再次使用抗性筛选，并进行鉴定。

进一步地，步骤(2)中所述农杆菌侵染悬浮液中农杆菌的OD₆₀₀值在0.5-1.0之间。

进一步地，步骤(3)具体步骤为：除去已开放的花朵和果荚，对即将开放的花蕾进行拨开苞叶、花瓣和损伤心皮处理，处理完成后，将花蕾浸泡于步骤(2)所述农杆菌侵染悬浮液中进行侵染15min-20min，侵染结束后，置于室温生长并用黑色塑料袋全部覆盖住植株，1-2天后取下袋子，每间隔5-7天用同样方式侵染一次，重复1-2次。

进一步地，步骤(4)中所述筛选的操作为：将得到的T0代种子铺散在含抗生素的1/2MS培养基上，播种一周后，筛选出根长与无抗生素条件下的野生型根长相当的植株。

进一步地，步骤(4)中所述鉴定的方法包括DNA分子鉴定和/或RNA分子鉴定。

进一步地，所述农杆菌为根癌农杆菌。

进一步地，所述芸薹属植物为菜心、青菜、白菜、油菜、芥菜或甘蓝。

本发明的有益效果为：

本发明通过在农杆菌侵染悬浮液中添加乙酰丁香酮，并对花蕾进行拨开苞叶、花瓣和划伤心皮操作，从原理上解决花萼花被过于坚硬、闭合过紧、心皮闭合时间过长导致农杆菌无法侵染的问题，提高菜心花序侵染法的侵染效率。

与“以植物组培为基础的转化体系”相比，本发明获得转基因植株时间更快，同时不受植物基因型及组培时各种严苛条件(激素配比、外植体类型、苗龄)带来的影响，容易获得稳定遗传株系。

与“真空渗透法”相比，本发明对实验设备、成本的要求较低，简单易行且侵染成功率仍较高。

附图说明

图1：实施例1的技术路线图。

图2：T1代植株在1/2MS平板(潮霉素抗性)筛选示意图，箭头指示为挑选的阳性植株。

图3：T1代第8组DNA的PCR检测电泳结果，1为野生型，2-8为第八组的阳性候选植株。

图4：T1代第8组RNA反转录后的PCR(RT-PCR)检测电泳结果，1为野生型，2-8为第八组阳性候选植株。

图5：T1代DNA测序后比对结果。

图6：T2代植株RNA反转录PCR电泳结果，1、2为野生型，3、4为T2代代表性植株。

图7：T3代植株RNA反转录PCR电泳结果，1为野生型，2、3、4、5为T3代代表性植株。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1

本实施例以自交亲和的油绿702品系(YL-702)菜心为材料，以带有GUS基因序列的pCAMBIA1301质粒(质粒带潮霉素抗性基因)转化根癌农杆菌GV3101为侵染菌株，对本发明技术方案进行详细说明，技术路线如图1所示，技术方案如下：

材料准备：

(1)以自交亲和的油绿702品系(YL-702)菜心为材料，进行土培。

(2)活化GV3101农杆菌，将带有GUS基因序列的pCAMBIA1301质粒(质粒带潮霉素抗性基因)转化进入GV3101农杆菌中，得到后续侵染菜心的农杆菌菌株。

花序侵染：

将油绿702自交亲和(YL702-sc)菜心种子置于1/2MS培养基(pH＝5.8)，在22℃光照培养箱无菌培养5-7天，移苗进行土培。待菜心生长至开花前期，采用不同物理方法(拨开苞叶、花瓣，损伤心皮)对花蕾进行操作，并将花蕾浸泡于150mL配置好的GV3101农杆菌悬浮液中(OD₆₀₀＝1.0，悬浮液含有0.1mM乙酰丁香酮，即AS)，侵染15min，侵染过程对花蕾进行轻轻按压，重复侵染三次。侵染结束后，菜心置于室内生长(约25℃)并进行套袋，持续1-2天后取下袋子。每隔5-7天重复侵染一次，重复两次。

筛选鉴定：

待菜心种子成熟后，分株收种。将得到的T0代种子铺散在含有50μg/L潮霉素(Hyg)的1/2MS培养基上进行筛选培养，一周后，与野生型种子萌发、生长情况进行对比，筛选出根长与正常培养基上生长的野生型根长相当的植株进行移苗，移至土壤中继续培养。待植株生长到合适阶段，对候选植株进行GUS基因的DNA鉴定、RNA鉴定、以及GUS染色。

可遗传性验证：

鉴定为GUS阳性的植株进行繁殖，得到的种子再次使用潮霉素(Hyg)进行筛选、DNA鉴定以及RNA鉴定，以验证该转化体系是否能稳定遗传。

上述技术方案的详细步骤如下：

一、自交亲和型---油绿702菜心(即YL702-sc)的种植

1.获得并采用自交亲和的YL702-sc菜心种子，将种子放置于4℃冰箱进行春化3-5天，打破种子的休眠期。

2.取YL702-sc菜心种子放置于1.5mL EP管中，加入1mL次氯酸钠进行消毒15min，重复2遍。

3.超净工作台内使用灭菌水清洗种子1min，重复该操作2遍。

4.用无菌镊子将种子散铺在1/2MS固体培养基上。

5.将菜心种子平板垂直放置于光照培养箱内培养5-7d，后将菜心幼苗移至营养土里继续生长培养，期间适当施加肥料和补充水分，以保证菜心的正常生长发育。

二、质粒转化根癌农杆菌GV3101的构建

(一)质粒载体的筛选鉴定与提取

利用实验室保存的含35S：GUS(pCAMBIA1301)的DH5α大肠杆菌进行质粒扩增并提取：

1.用平板划线法在LB(含50μg/mL卡那霉素)固体培养基平板上划线。

2.将LB固体平板倒置于37℃恒温培养箱过夜培养16h。

3.挑取四个单菌落分别溶于20μL无菌水中，并用移液枪吹打混匀。

4.引物：利用GUS序列和primer premier5软件设计检验引物(表1)

表1：GUS检测引物

5.配制10μL反应体系(表2)，置于PCR仪开始扩增，PCR扩增程序如下所示。利用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分析。

PCR扩增程序设置如下：

表2：菌落PCR反应体系

6.分析电泳条带，吸取10μl鉴定为阳性的单克隆大肠杆菌水溶菌液于1mLLB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)。放置于37℃恒温培养箱(220rpm)过夜培养。

7.用北京TIANGEN生化科技有限公司的质粒小提取试剂盒(DP103)进行质粒小提。

(二)转化根癌农杆菌GV3101

1.取-80℃保存的GV3101感受态农杆菌于室温融化，置于冰中。

2.取1μg上述步骤(一)中提取的质粒DNA加入到100μl农杆菌中，轻轻混匀。

3.将混合液依次放置于冰上静置5min，液氮5min，37℃水浴5min，最终冰浴5min。

4.加入500μl无抗生素LB，于28℃振荡培养2-3h。

5.平板涂布于LB(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平)固体培养基，倒置于28℃培养箱培养2-3天。

三、根癌农杆菌侵染悬浮液的制备

1.挑取上述转化后的农杆菌于10mL LB培养基中(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平)，放置于恒温摇床，28℃、200rpm培养12-16h，使得OD₆₀₀＝0.6-1.0左右。

2.取步骤1中6mL菌液置于新的200mLLB培养基中(LB含卡那霉素和利福平抗性)扩大培养，28℃、200rpm过夜培养。直至生长至OD₆₀₀约为0.8时，将扩大培养的农杆菌菌液于高速离心机中25℃、5000rpm离心10min，收集沉淀。

3.配制2组200mL侵染悬浮液(以水配置)，具体侵染悬浮液配方见表3，以不加AS为对照。

表3：根癌农杆菌侵染悬浮液配方

四、花序侵染

1.用剪刀剪去菜心已开放的花朵和果荚，用镊子对未开放花朵进行剥开花苞的花瓣和包叶(以不剥开为对照)、用解剖刀或针划开心皮(以不损伤心皮为对照)的物理处理，再分组进行侵染，每组进行三株植株重复，分组具体见表4。

表4：不同处理因子的分组

注释：AS为乙酰丁香酮；“+”代表添加AS、或对花苞进行物理损伤(拨开或损伤)；-代表不添加AS、或花苞不进行物理损伤。

2.将整个花序浸泡在农杆菌悬浮液中，并用手指不断轻微按压持续浸泡15-20min。

3.待全部侵染完成后，用黑色塑料袋全部覆盖住菜心植株进行暗处理16h。

4.间隔5-7d后重复上述步骤再次侵染，加肥料，浇水，植株套袋处理，期间每天用新鲜花药进行人工授粉。

五、筛选鉴定

(一)植株收种并进行抗性初步筛选：

待种子成熟后，分批收种。为了筛选出可能的阳性植株，将烘干后的菜心植株种子(T₀代种子，萌发后即为T₁代植株)逐组同一批次随机播种于含有潮霉素抗性(Hyg⁺)的固体培养基上进行初步筛选得到阳性候选植株，并将其移至土中培养。

1.取YL702scT₀代种子(以未转基因的种子作为对照)放置1.5mL EP管中，加入1mL次氯酸进行消毒15min，重复该操作消毒2遍。

2.灭菌水清洗1min，重复该操作2遍。

3.用镊子将消毒后的种子播种于含有50μg/ml Hyg⁺的1/2MS固体培养基上(以野生型种子和不加抗生素的培养基作为对照)。

4.将种子平板放置于4℃冰箱进行春化1-2d，打破种子的休眠期。

5.将种子平板放置于光照培养箱内培养5-7d后，对比侵染过的种子和野生型种子的根长，初步筛选与野生对照组的根长度相似的植株。将筛选获得的阳性候选植株幼苗移至营养土里继续生长培养，期间适当施加肥料和水分，以保证菜心的正常生长发育。

(二)抗性植株的分子鉴定：

1.待初步筛选植株生长至2-3周龄时，剪取菜心叶子用CTAB法(如下①)提取DNA、Trizon法提取RNA并进行反转(如下②)。

①CTAB法提取菜心DNA

1)取1-2g新鲜植物叶片放入2mL EP管中，加入研磨珠放于液氮中，将样品放置于研磨机中研磨成粉末。

2)取出加入400mL 2％CTAB溶液(65℃预热)，65℃保温15min，350rpm。

3)加入等体积的氯仿轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000rpm离心15min。

4)将上清液转入另一离心管中，加入等体积的异丙醇，轻颠倒离心管混匀，室温、12000rpm离心10min。

5)去上清液，加入500μL 75％乙醇漂洗沉淀两次，12000rpm，离心3min。

6)去上清吹干沉淀。

7)风干后加入100μL的纯水溶解DNA，测量浓度后稀释至10ng/μL

②Trizon法提取RNA、反转录获得cDNA

1)将菜心叶片放入2mL EP管中，加入研磨珠放于液氮中，将样品放置于研磨机中研磨成粉末。

2)加入1mL的trizol于1.5mL EP管中震荡混匀，4℃离心机12000rpm，离心10min取上清。

3)加入200μL氯仿剧烈震荡，4℃离心机12000rpm离心15min取上清。

4)加入1/3体积的无水酒精上下颠倒混匀，4℃离心机12000rpm离心10min去掉上清。

5)加入1mL75％的乙醇洗涤沉淀，4℃离心机7000rpm离心5min弃上清，重复一次。

6)将EP管放置超净工作台吹5-10min，晾干沉淀物，加入RNAase-free的水，在55℃-60℃溶解沉淀。

7)使用invitrogen的SuperScript^TMIII Reverse Transcriptase反转录试剂盒具体操作步骤见表5：

表5：反转录体系

2.利用Actin引物(表6)进行PCR验证DNA和RNA提取质量(PCR程序设置同质粒载体的筛选鉴定与提取步骤)；GUS引物进行PCR验证不同处理组的GUS基因是否转化成功(引物序列同表1，PCR程序设置同质粒载体的筛选鉴定与提取步骤)。

表6：Actin引物序列

实验组T1代第8组(添加AS、拨开花瓣、损伤心皮)经过DNA/RNA分子水平鉴定后分别确定成功侵染株植株(如图3、4)，且相较于其他不拨开花瓣、不损伤心皮转化率明显更高。

六、可遗传性验证

T2代及以后植株的培养与鉴定：至T1代植株成熟后收种、重复上述步骤对T2及T3代植株进行鉴定。T2代及T3代植株均能检测到GUS基因的存在(图6，图7)。

表7给出了T₀代不同处理组的种子转化阳性率(按T1、T2后代分子鉴定的结果计算)。

表7不同组别的阳性率统计表

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种农杆菌介导的芸薹属作物高效遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将含有目的基因序列的质粒转化进入农杆菌，构建含有目的基因的农杆菌；所述含有目的基因序列的质粒带有抗生素抗性基因；

（2）制备农杆菌侵染悬浮液，所述侵染悬浮液含有蔗糖5%(m/v)、Silwet-77 0.01%(v/v)和乙酰丁香酮0.1 mM；

（3）在芸薹属作物幼苗生长50-60天后，即开始开花时，对花蕾进行拨开苞叶、花瓣和损伤心皮处理，处理完成后，将花蕾浸泡于步骤（2）所述农杆菌侵染悬浮液中进行侵染，侵染结束后，套袋培养；

（4）待步骤（3）芸薹属作物种子成熟后，分株收种，将得到的T0代种子在含抗生素的培养基上进行筛选、鉴定；

所述芸薹属植物为菜心；

步骤（3）具体步骤为：除去已开放的花朵和果荚，对即将开放的花蕾进行拨开苞叶、花瓣和损伤心皮处理，处理完成后，将花蕾浸泡于步骤（2）所述农杆菌侵染悬浮液中进行侵染15 min-20 min，侵染结束后，置于室温生长并用黑色塑料袋全部覆盖住植株，1-2天后取下袋子，每间隔5-7天用同样方式侵染一次，重复1-2次；

所述农杆菌为根癌农杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤（5）：对鉴定为含有目的基因阳性的植株进行繁殖，得到的种子再次使用抗性筛选，并进行鉴定。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述农杆菌侵染悬浮液中农杆菌的OD₆₀₀值在0.5-1.0之间。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述筛选的操作为：将得到的T0代种子铺散在含抗生素的1/2 MS培养基上，播种一周后，筛选出根长与无抗生素条件下的野生型根长相当的植株。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述鉴定的方法包括DNA分子鉴定和/或RNA分子鉴定。