CN117987428A

CN117987428A - 一种抗青枯病相关基因CaARF9及其应用

Info

Publication number: CN117987428A
Application number: CN202410203436.4A
Authority: CN
Inventors: 田莉; 蔡韡韡; 陶依林; 干蒋煌
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2024-02-23
Filing date: 2024-02-23
Publication date: 2024-05-07

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种抗青枯病相关基因CaARF9及其应用。基因CaARF9的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过研究发现，ARF转录因子CaARF9参与辣椒青枯菌侵染和抗病机制，利用病毒诱导的基因沉默技术证实沉默CaARF9会抑制辣椒对青枯菌的抗性，而过表达CaARF9会提升烟草组织器官对青枯菌的抗性。因此通过CaARF9可以创建青枯病的抗病品种。

Description

一种抗青枯病相关基因CaARF9及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种抗青枯病相关基因CaARF9及其应用。

背景技术

近年来随着各行各业对辣椒(Capsicum annuum L.)需求的不断上涨，我国的辣椒栽培数量持续增加，其种植面积已经超过白菜，成为产值居第一位的重要蔬菜，是调味料、色素、维生素与微量元素的重要来源。作为一种大田作物，辣椒在生产过程中，很容易受到各种病原微生物的胁迫如青枯病、卷叶病、疫病等土传病害严重危及到辣椒的产量。其中，辣椒青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种细菌性土传病害，引起细菌性枯萎病的青枯菌很早就被认为是引起毁灭性病害的植物病原菌之一。青枯病致病菌可以感染42个植物科的310多种植物。在世界各地，细菌性枯萎病造成的产量损失从20％到100％不等，且在高温高湿下发病尤其严重。青枯病典型的病害症状包括木质部的褐变，叶片的偏上性生长和致死性枯萎，其中枯萎症状来自于大量细菌在木质部的定殖和大量可以导致维管功能障碍的胞外多糖的产生，导致维管束阻塞。通常几天之内，大量的青枯菌就可以在感病的辣椒植株中生长，并最终导致辣椒的萎蔫死亡，造成多种农作物大量减产甚至绝收。

青枯菌具有高度的小种多样性，并具有强大适应能力，导致青枯病的防治较为困难。尽管已有许多防治措施应用于防控该病，如轮作、休耕、调节土壤pH值、施用生防菌、土壤和种子消毒处理、嫁接等，但仍然缺少一个对于大多数寄主植物有效且对环境友好的控制措施。因此，防治作物青枯病的根本手段仍然是培育抗病品种，故而研究植物对青枯病的抗病机制研究显得尤为必要和紧迫。目前对植物青枯病复杂的抗性机制理解仍然不够深入，主要集中在模式植物拟南芥上，关于辣椒，尤其是ARF转录因子在辣椒抗青枯病中的应用较少。

发明内容

鉴于以上技术问题，本发明的目的在于提供一种抗青枯病相关基因CaARF9及其应用，为植株抗病遗传改良提供基因资源。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面，提供一种抗青枯病相关基因CaARF9，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明第二方面，提供一种用于扩增所述基因CaARF9的引物对，所述引物对序列如下：

CaARF9-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGCAAATAAAGGTTATTT-3’；

CaARF9-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC GGCTGAAGTAGTTGTTT-3’。

本发明第三方面，提供一种用于鉴定所述基因CaARF9的实时荧光定量引物对，所述实时荧光定量引物对序列如下：

CaARF9-qF：5’-TCACAATTTCTCAGCTGAAGGTG-3’，

CaARF9-qR：5’-TGTTCCATATGACCTTGTGGAA-3’。

本发明第四方面，提供一种编码所述基因CaARF9编码的蛋白质，其氨基酸序列如如SEQ ID No.2所示。

本发明第五方面，提供一种包含所述基因CaARF9的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

本发明第六方面，提供一种所述基因CaARF9在调控植物对青枯菌抗性中的用途。

优选地，所述植物为辣椒或烟草。

优选地，通过沉默所述基因CaARF9降低辣椒对青枯病的抗病性。

优选地，通过过表达所述基因CaARF9提高烟草植株对青枯病的抗病性。

本发明第七方面，提供一种抗青枯病植株的构建方法，是使植株中基因CaARF9过表达。

对比现有技术，本发明的显著优点在于：

本发明提供了一种抗青枯病相关基因CaARF9及其应用。本发明研究发现，利用病毒介导的基因沉默技术沉默CaARF9基因可以显著降低辣椒对Ralstonia solanacearum的抗病能力。在本氏烟草中稳定超表达CaARF9基因，也可以显著提高烟草植株对Ralstoniasolanacearum的抗性。因此，CaARF9基因作为一个正向调控因子，可以赋予不同植物对Ralstonia solanacearum的抗病性。

附图说明

图1是CaARF9基因在Ralstonia solanacearum侵染寄主时显著上调表达。A、辣椒ARF家族基因在辣椒受青枯菌侵染时的表达情况；B、荧光定量PCR检测CaARF9基因在青枯菌侵染条件下的表达。mock，正常条件；RSI，青枯菌侵染。图2是沉默CaARF9基因降低辣椒对Ralstonia solanacearum的抗病性。A、利用荧光定量PCR对目标基因CaARF9进行相对定量分析；B、植株在青枯菌侵染6天后的表型图；C、植株病情指数情况；D、通过菌落数统计植株对青枯菌的抗性。TRV::00和TRV::CaARF9分别为对照植株和CaARF9沉默植株。

图3是稳定超表达CaARF9基因提高本氏烟草对Ralstonia solanacearum的抗病性。A、荧光定量PCR及免疫印迹实验分析CaARF9的表达；B、通过菌落数统计植株对青枯菌的抗性；C、植株在青枯菌侵染6天后的表型图；D、植株病情指数情况。WT和35S::CaARF9-GFP分别为对照烟草植株和过表达CaARF9的烟草植株，其中35S::CaARF9-GFP植株选取两个株系#1及#2进行确认。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。结合附图和实施例对本申请作进一步详细描述。

在进一步描述本申请具体实施方式之前，应当理解的是，本申请的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本申请实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本申请的保护范围；在本申请说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。除非另外定义，本申请中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本申请的记载，还可以使用与本申请实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本申请。

实施例1

辣椒CaARF9基因的克隆。

本发明克隆了一个在Ralstonia solanacearum侵染寄主过程中显著性上调表达的辣椒ARF转录因子编码基因CaARF9。具体步骤为：

1)利用Ralstonia solanacearum菌株FJ91侵染辣椒品种HN42，分别对不同侵染时间点(3h，12h，24h，48h)的辣椒根系样品进行取材，利用Trizol抽提法提取各个样品的总RNA；

2)采用III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)试剂盒，根据其说明书推荐的反应程序合成cDNA第一链；

3)设计特异引物PCR扩增CaARF9的开放阅读框序列，并利用Gateway技术将其构建到入门载体pDONR-207以及植物表达载体pEarleyGate 101中，得到pEarleyGate 101-CaARF9重组表达载体，并进行测序分析。最终得到一个辣椒ARF转录因子编码基因CaARF9，CaARF9基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.1：

ATGGCAAATAAAGGTTATTTTATGTCTCACAATTTCTCAGCTGAAGGTGAAGATGAATTGTATCAAGAGTTATGGAGATTATGTGCAGGTCCATTAGTTGATATTCCAAAAAATGAAGAAAGAGTTTATTATTTTCCACAAGGTCATATGGAACAATTGGAGGCATCAACAAACCGGGAGCTGAATCAGAGAATGCCAATGTTCAATCTGCAACCAAAGATCCTTTGTCGCGTTCTTGACATTCAACTTATGGCTGAGCAAGATACCGATGAGGTTTATGCGCAGATTACGTTGTTGCCAGAAGCAGATCAAGTTGAGCCGACTAATCCAGACCCATCCCCTCCTGAGCCTCCGAGGCCCAAAGTTCATTTCTTCTACAAGGTTCTAACTGCATCGGATACGAGCACTCATGGTGGATTTTCCATTTTCCGGAAACATGCTAACGAATGCTTACCTCCCCTGG

ACATGACCCAACCGACTCCAGCACAGGAATTGGTCGCCAAGGACCTTCATG

GTTTTGAGTGGCGCTTTAAACATATATTTAGAGGTCAACCCCGGAGGCATTT

ACTTACCACGGGGTGGAGTACCTTCGTTTCCTCAAAGAGATTAGTTGCGGG

GGATTCTTTTGTATTCTTGAGGAGTGAAAAAGGTGAAGTCCGAATAGGAATT

AGACGACTTGTTTGCCAACCATGTTCAATGCCACAATCAATGATTTCAAGTC

AGAGCATGCACCTAGGAGTGTTAGCTACTGCATCTCACGCTGTTGCGACCC

AGACCATGCTTGTCGTTTATTACAAACCGAGAACAAGTCAGTTTATCGTAGG

CTTAAACAAATATCTGGAGGCTGTCAATCATCGGTATTCAGTTGGCATGAGA

TTCAAGATGCATTTTGAAGGGGAAGAGGTTCCTGAGAGCAGATTTACAGGT

ACCATAGTCGGAGTTGAAGATAGTTCCTCGCAGTGGAAAGATTCTCAATGG

CGATCGTTGAAGGTTCAGTGGGATGAGCCAGCATCCGTTTCAAGACCTGAT

AGAGTTTCTCCTTGGGATATCGAACCATTTGTAGCGCCAGTCACTAGTCCTC

TCGTTCATCCAATGTCAGTGAAGAATAAAAGACATCGACCACATAACGAAC

CAAAAGTTTCAGGTGGAAACAAGCATTCTTTGAATATGTTTTTTGATGAGAC

AGAAGCTAATAAAATTGCTTCACCTCGGCCTGCTTTTACAAGCTTTGCATCC

TCACAATTCGGAAAGCAGAACGATGAGAGGAAAGGCGATACAATCATATCC

TGTAGATTGTTCGGTATTGACTTGAAAAGTCCCTCACTCGGTTCTGCTATTG

AGAATCGGACTCTAAAACCAGCCAACAACTCCGATAACTCTGCTGAAGGGT

GCTTTGGAAACACGACTTCTGCTGGTGATTCACAAGACAACTCCGGCCTTT

CAAAAGATCAAAAGCATGAGCATTTGCATTTGCCTCTGAACGAGGTCCACG

GCAAGCAGATTTGTTCCACAAGAAGTCGCACCAAGGTTCACATGCAAGGG

GTAGCTGTGGGTCGTGCAGTCGATTTAACTGTACTGAGCGGATATGATGAGC

TCGTAAAGGAACTCAAAGAGATGTTCGATATCCAGGAAGAGCTCCATGCAC

GAAATAAGTGGGAGATCGTTTTTACAGATGGTGAAGGGGATGTGATGCTTAT

GGGCGATCATCCTTGGCCAGAGTTCTGCAATGTCGCGAAGAAGATCTTCATT

TGTCCTAGTCAAGATAAGAAAAGTTTCAGTGCGGAAACCAAATCGCCATCT

TGTTTAGACAGTGAAACAACTACTTCAGCCTGA

SEQ ID No.2：

MEQLEASTNRELNQRMPMFNLQPKILCRVLDIQLMAEQDTDEVYAQITLLPEADQVEPTNPDPSPPEPPRPKVHFFYKVLTASDTSTHGGFSIFRKHANECLPPLDMTQPTPAQELVAKDLHGFEWRFKHIFRGQPRRHLLTTGWSTFVSSKRLVAGDSFVFLRSEKGEVRIGIRRLVCQPCSIPQSMISSQSMHLGVLATASHAVATQTMLVVYYKPRTSQFIVGLNKYLEAVNHRYSVGMRFKMHFEGEEVPESRFTGTIVGVEDSSSQWKDSQWRSLKVQWDEPASVSRPDRVSPWDIEPFVAPVTSSLVHPMSVKNKRHRPHNEPKVSGGNKHSLNMFFDETEANKIASPRPAFTSFASSQFGKQNDERKGDTIISCRLFGIDLKSPSLGSAIENRTLKPANNSDNSAEGCFGNTTSAGDSQDNSGLSKDQNHEHLHLPPNEVHGKQICSTRSRTKVHMQGVAVGRAVDLTVLSGYDELVKELKEMFDIQEELHARNKWEIVFTDDEGDVMLMGDHPWPEFCNVAKKIFICPSQDKKSFSAETKSPSCLDSETTTSA

其中，特异引物对序列如下：

CaARF9-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGCAAATAAAGGTTATTT-3’，如SEQ ID No.3所示；

CaARF9-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC GGCTGAAGTAGTTGTTT-3’，如SEQID No.4所示。

4)荧光定量PCR鉴定

以cDNA作为模板，采用CaARF9-qF和CaARF9-qR组成的引物对检测CaARF9基因的表达水平；以CaActin基因作为内参基因，采用CaActin-qF和CaActin-qR组成的引物对扩增CaActin基因。荧光定量PCR按照SYBR Premix ExTaqTM试剂盒说明书推荐的反应体系与扩增程序进行。反应体系为：模板2μL；正反向引物各0.2μL；2×SYBR 5μL；ddH₂O 2.6μL。反应程序为：94℃5s；94℃30s，60℃34s，40个循环；3个样品重复，每一个样品均平行扩增目标基因CaWRKY66和辣椒内参基因CaActin，采用2^-△△CT方法进行转录水平相对定量分析，荧光定量引物序列如下：

CaARF9-qF：5’-TCACAATTTCTCAGCTGAAGGTG-3’，如SEQ ID No.5

所示；

CaARF9-qR：5’-TGTTCCATATGACCTTGTGGAA-3’，如SEQ ID No.6所示；

CaActin-qF：5’-AGGGATGGGTCAAAAGGATGC-3’，如SEQ ID No.7所示；

CaActin-qR：5’-GAGACAACACCGCCTGAATAGC-3’，如SEQ ID No.8所示。

通过荧光定量PCR分析，结果显示ARF家族基因中，CaARF9基因的表达显著受到青枯菌侵染的诱导(图1A)，表达量随侵染进程持续提高(图1B)，说明CaARF9与辣椒抵御青枯菌机制有关。

实施例2

沉默CaARF9基因可以降低辣椒对Ralstonia solanacearum的抗病性。

本发明利用病毒介导的基因沉默(VIGS)技术在辣椒植株中沉默CaARF9基因，可以降低辣椒对Ralstonia solanacearum的抗病性。具体步骤为：

1)利用Gateway技术构建VIGS载体

(1)以辣椒叶片的cDNA为模板，用KOD高保真酶分别PCR扩增CaARF9基因cDNA上的400bp左右的特异序列片段，所用引物序列如下：

iARF9-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC TGGTGAAGGGGATGTGATGC-3’，如SEQ ID No.9所示；

iARF9-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC AGTCAACAAGGCGTCGACAA-3’，如SEQ ID No.10所示；

(2)将PCR产物iARF9分别通过DNA纯化回收试剂盒回收纯化，通过BP反应将回收片段连接到pDONR207上；

(3)转化大肠杆菌后挑取克单隆，通过PCR验证筛选出阳性克隆，提取质粒进行测序；

(4)将测序后对比结果正确的质粒通过LR反应把目的片段连接到目的载体pTRV2上，再次利用大肠杆菌转化筛选、PCR验证，验证正确后提取质粒；

(5)将上一步提取的质粒通过农杆菌转化筛选、PCR验证得到含有pTRV2:iARF9质粒的GV3101农杆菌菌株。

2)农杆菌的培养及侵染

(1)将分别含有pTRV2:iARF9、pTRV2(空载)、pTRV2:PDS(指示对照，PDS基因被沉默后，植株新生叶片漂白)、pTRV1的GV3101农杆菌菌株按照1:50(v/v)的比例加入含0.2wt％利福平、0.2wt％卡那霉素、0.1wt％庆大霉素的液体LB培养基的试管内，置于28℃恒温摇床上200rpm震荡过夜培养；

(2)次日，将菌液于4000rpm离心10min后去除上清。用侵染缓冲液(该缓冲液中含有10mM MgCl₂、10mM MES、200μM乙酰丁香酮；pH 5.6)重悬菌体，用分光光度计调节浓度至OD₆₀₀＝0.8；

(3)将含有pTRV2:iARF9、pTRV2、pTRV2:PDS的GV3101农杆菌菌株分别与含有pTRV1的GV3101农杆菌菌株等体积(V:V＝1:1)混合，对三叶期辣椒幼苗的两片子叶进行注射。

(4)将注射后的辣椒植株置于16℃下暗培养56h，再转移至正常的生长条件(25℃，75％湿度，60～70mmol光质子，16h光照/8h黑暗的光周期)，待20～25d后对VIGS辣椒植株进行相应的分子鉴定和抗病表型分析。

3)Ralstonia solanacearum接种与抗病性分析

当PDS基因沉默指示对照植株新生叶片出现3～4片叶漂白时，对CaARF9基因沉默植株(TRV:CaARF9)和对照植株(TRV:00)分别采用叶片接种和灌根接种进行抗病性鉴定。

叶片接种的方法为：将扩繁起来的青枯菌用侵染液重悬浮，调整浓度到OD₆₀₀≈0.8，注射辣椒叶片。

荧光定量PCR分析：提取接种叶片RNA，并合成cDNA第一链，以CaActin基因作为内参基因，利用荧光定量PCR对目标基因CaARF9进行相对定量分析。

其中，所述的荧光定量PCR引物如下:

CaARF9-qF：5’-TCACAATTTCTCAGCTGAAGGTG-3’，如SEQ ID No.11所示；

CaARF9-qR：5’-TGTTCCATATGACCTTGTGGAA-3’，如SEQ ID No.12所示；

CaActin-qF：5’-AGGGATGGGTCAAAAGGATGC-3’，如SEQ ID No.13所示；

CaActin-qR：5’-GAGACAACACCGCCTGAATAGC-3’，如SEQ ID No.14所示。

Cfu测定：用高压灭菌过的打孔器在每个叶片相同位置上打6个直径5mm的孔，放入2ml的离心管中，加入500μL的无菌水，用打样器打碎，再加入500μL的无菌水，接着按照逆浓度梯度稀释，最后在10^-4、10^-5、10^-6各取400μL涂入提前倒好的TTC固体培养基中，待培养基吹干后放于28℃的培养箱中培养，48h统计平板青枯菌菌落数。

灌根接种的方法为：利用剪刀对辣椒植株根系一侧进行侧切，保证每个植株受到的损伤一致，然后利用移液器准确量取20mL的青枯菌液灌入根系的土壤中，尽量避免菌液溅出。之后将实验材料置于人工气候箱进行培养(28℃，80％湿度)，用于植物抗病性的表型观察。分别于接种后0～12d进行病情指数的调查，分级标准见2011年农业农村部颁布的灌根接种法分级标准(NY/T 2060.1-2011)。

结果表明，CaARF9的表达在沉默植株中受到抑制(图2A)；与对照植株相比，CaARF9沉默植株在青枯菌侵染6天后明显萎蔫(图2B)，病情指数显著高于对照植株(图2C)。叶片侵染实验表明(图2D)，青枯菌在CaARF9沉默的叶片中繁殖更快，明显高于对照组，说明沉默CaARF9后，辣椒的抗青枯菌能力显著下降。

实施例3

稳定超表达CaARF9基因可以提高本氏烟草对Ralstonia solanacearum的抗病性。

本发明在本氏烟草中稳定超表达CaARF9基因，可以提高烟草植株对Ralstoniasolanacearum的抗病性。具体步骤为：

1)转基因烟草植株的获得

(1)将本氏烟草种子浸泡在无菌水中，洗去漂浮物。在超净工作台中向装有洗涤过的烟草种子的离心管加入75％乙醇，上下摇晃1min，吸除75％乙醇。加入无菌水上下摇晃1min，重复洗涤两次，除去无菌水。加入10％H₂O₂溶液，上下摇晃至烟草种子漂浮在溶液表面，除去10％H₂O₂溶液。用无菌水清洗烟草种子数次直至烟草种子重新沉在溶液底部，除去无菌水。将烟草种子撒在无菌滤纸上晾干，待无菌水挥发后，撒播在固体空白MS培养基上，做好密封工作，将培养皿置于植物组织培养室培养至出芽2cm左右。在超净工作台中将烟草移栽至装有固体空白MS培养基的罐头瓶中，旋紧瓶盖后置于植物组织培养室至烟草幼苗长至与罐头瓶齐高即可用于后续实验。

(2)在超净工作台中将无菌烟草苗的叶片用灭过菌的剪刀造成机械损伤，再将剪切过的叶片平铺在固体MS培养基上，用封口膜密封后移入植物组织培养室培养2d备用。

(3)利用Gateway技术将CaARF9基因导入pEarleyGate 101载体中，得到pEarleyGate 101-CaARF9重组表达载体。将含pEarleyGate 101-CaARF9超表达载体的农杆菌GV3101按照1:50(v/v)的比例加入含有0.2wt％利福平、0.2wt％壮观霉素、0.1wt％庆大霉素的液体LB培养基的试管内，置于28℃恒温摇床上200rpm震荡过夜培养；

(4)次日，将菌液于4000rpm离心10min后去除上清。用侵染液(1/2MS+10g/L蔗糖)将农杆菌OD值调到OD₆₀₀＝0.2，之后加入0.02％乙酰丁香酮，将剪切过的叶片用灭过菌的镊子轻轻夹到侵染液中，充分浸泡15min。待浸泡结束将叶片夹到灭过菌的滤纸上吸干表面残余的菌液，再将叶片平铺至固体空白MS培养基上，密封完毕后黑暗条件培养2d。

(5)漂洗叶片：在超净工作台中将侵染结束的烟草叶片夹到装有无菌水的锥形瓶中，轻轻摇晃10min，重复清洗3次。转移叶片至溶有羧苄西林的无菌水中，轻轻摇晃15min后，用无菌水反复洗涤叶片7次左右。将漂洗过的叶片转移到滤纸上吸干表面水分，再将叶片平铺在固体继代MS培养基上，密封后移至植物组织培养室培养，每隔7d需更换一次继代MS培养基直至长出愈伤组织。

(6)转基因植株的获得：当愈伤组织分化出的不定芽长至2cm左右，在超净工作台中用剪刀将不定芽切下，扦插至装有固体生根MS培养基的罐头瓶内培养。待不定芽长成壮苗后即可打开瓶盖加入少量无菌水进行炼苗培养，2d后即可移栽至营养土中。

(7)转基因植株的验证：采取烟草叶片提取RNA和蛋白质，使用特定引物进行荧光定量PCR以及免疫印迹实验验证CaARF9是否成功转进烟草基因组并被表达。对阳性株系进行留种，播种并套袋自交直至得到T2代转基因烟草。

荧光定量PCR引物序列如下：

CaARF9-qF：5’-TCACAATTTCTCAGCTGAAGGTG-3’，如SEQ ID No.15

所示；

CaARF9-qR：5’-TGTTCCATATGACCTTGTGGAA-3’，如SEQ ID No.16所示；

NbActin-qF：5’-TGCTGCTGTAACAAGATGGATGC-3’，如SEQ ID No.17所示；

NbActin-qR：5’-GAGATGGGGACAAAGGGGATT-3’，如SEQ ID No.18所示。

2)Ralstonia solanacearum接种与抗病性分析

对获得的T2代转基因株系(#1和#2)和野生型植株(WT)分别采用叶片接种和灌根接种进行抗病性鉴定。

叶片接种的方法为：将扩繁起来的青枯菌用侵染液重悬浮，调整浓度到OD₆₀₀≈0.8，沿主脉注射烟草叶片。

灌根接种的方法为：利用剪刀对烟草植株根系一侧进行侧切，保证每个植株受到的损伤一致，然后利用移液器准确量取20mL的青枯菌液灌入根系的土壤中，尽量避免菌液溅出。之后将实验材料置于人工气候箱进行培养(28℃，80％湿度)，用于植物抗病性的表型观察。分别于接种后0～12d进行病情指数的调查，分级标准见2011年农业农村部颁布的灌根接种法分级标准(NY/T 2060.1-2011)。

结果表明，CaARF9可以在烟草植株进行表达(图3A)；叶片侵染实验表明青枯菌的繁殖在表达CaARF9的烟草叶片中受到抑制，明显低于对照植株(图3B)；并且在青枯菌侵染6天后，对照植株明显萎蔫，而表达CaARF9的烟草植株没有表现明显的萎蔫情况(图3C)，病情指数显著低于对照植株(图3D)，说明在烟草中表达CaARF9可以明显提高烟草的抗青枯菌能力。

尽管本申请的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种抗青枯病相关基因CaARF9，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.一种用于扩增权利要求1所述基因CaARF9的引物对，其特征在于，所述引物对序列如下：

CaARF9-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGCAAATAAAGGTTATTT-3’；

CaARF9-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC GGCTGAAGTAGTTGTTT-3’。

3.一种用于鉴定权利要求1所述基因CaARF9的实时荧光定量引物对，其特征在于，所述实时荧光定量引物对序列如下：

CaARF9-qF：5’-TCACAATTTCTCAGCTGAAGGTG-3’，

CaARF9-qR：5’-TGTTCCATATGACCTTGTGGAA-3’。

4.一种编码权利要求1所述基因CaARF9编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.一种包含权利要求1所述基因CaARF9的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

6.一种权利要求1所述基因CaARF9在调控植物对青枯菌抗性中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述植物为辣椒或烟草。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，通过沉默所述基因CaARF9降低辣椒对青枯病的抗病性。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，通过过表达所述基因CaARF9提高烟草植株对青枯病的抗病性。

10.一种抗青枯病植株的构建方法，其特征在于，是使植株中基因CaARF9过表达。