CN108220332B - 一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法，以根腐病原菌侵染大豆，提取大豆总RNA并反转录成cDNA；以cDNA为模板，根据大豆Glyma01g42670.1基因设计带有酶切位点的引物进行PCR扩增，获得GmTLP5片段；再通过酶切连接方法将GmTLP5片段克隆到目的载体上，获得重组载体；将重组载体转化根癌农杆菌GV3101，得到含有重组质粒的GV3101；利用含有重组质粒的GV3101侵染未萌发大豆子叶节，得到抗尖孢镰刀菌根腐病的转基因大豆。本发明提供的方法调控效果显著，结果准确可靠，调控方法操作简单、方便，可公式化，易于推广应用。

Description

一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法
技术领域
本发明涉及基因技术和植物学领域，具体地说，涉及一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法。
技术背景
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)属半知菌类、从梗孢目、瘤座孢科、镰刀菌属，是一种世界性分布的土传病原真菌，其寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。尖孢镰刀菌侵染植物根系，会造成根部腐烂，进而影响植物吸收水分和养分的功能，最后导致全株死亡。由尖孢镰刀菌引起的大豆根腐病会造成大豆严重减产，因此，研究提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法具有重要的理论和应用意义。
病程相关蛋白(PRs)是指由植物寄主的基因所编码，在病理或病理相关的环境下诱导由细胞合成和分泌到液体或细胞间隙的一类低分子量蛋白。PR-5蛋白是PRs蛋白家族中的一类，因其氨基酸序列与西非竹芋的甜蛋白高度同源，被称为类甜蛋白。类甜蛋白在抵抗生物和非生物胁迫中扮演着非常重要的作用，目前已在许多植物上分离出PR-5蛋白，并且不同植物所产生的PR-5蛋白的功能不同，KimY S等人从辣椒里分离的甜蛋白可有效抑制胶孢炭疽菌丝的生长；Wang H X从竹笋中分离出的一种PR-5蛋白能有效抑制灰霉菌丝的生长；Menu-Bouaouiche L从苹果、樱桃中分离的水果甜蛋白具有β-1,3葡聚糖酶活性；而关于大豆病程相关的类甜蛋白家族的研究较少，关于大豆PR-5家族在植物的抗逆性的研究较为滞后，因此，亟待对大豆PR-5基因进行研究，以揭示大豆根系生物学特性和抗逆胁迫机制，获得有效提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明提供一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法，通过向大豆中转入GmTLP5(Glyma01g42670.1，PR-5)基因提高大豆对尖孢镰刀菌根腐病的抗性。
本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：
一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法，其特征在于：通过转入GmTLP5基因提高大豆对尖孢镰刀菌根腐病的抗性。
一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)植物过表达载体的构建：以根腐病原菌侵染大豆，提取大豆总RNA并反转录成cDNA；以所述cDNA为模板，根据大豆Glyma01g42670.1基因设计带有酶切位点的引物进行PCR扩增，获得GmTLP5片段；再通过酶切连接方法将GmTLP5片段克隆到目的载体上，获得重组载体；
(2)转化：将重组载体转化根癌农杆菌GV3101，得到含有重组质粒的GV3101；利用含有重组质粒的GV3101侵染未萌发大豆子叶节，得到抗尖孢镰刀菌根腐病的转基因大豆。
进一步地，步骤(1)中所述根腐病原菌为腐霉菌、疫霉、尖孢镰刀菌或立枯丝核菌；侵染时间为12-48h并能高度表达GmTLP5基因。
进一步地，步骤(1)中所述引物如下：
GmTLP5-F：CGGGATCCCGATGGTTTACTTGGCACTGTGCT，CGGGATCCCG为BamHI酶切位点；
GmTLP5-R：CGAGCTCGTTACTGGTGGGCGGTACTAGC，CGAGCTCG为SacI酶切位点。
进一步地，步骤(1)中所述的PCR扩增：
50μLPCR反应体系为：20mM 10×PCR Buffer 5μL，10mM dNTP Mixture 4μL，5U/mlEx Taq HS polymerase 1μL，20mM MgCl2 1μL，10μg/μl cDNA 2μL，10mM GmTLP5-F 2μL，10mM GmTLP5-R 2μL，ddH2O 33μL；
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸60s共35循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
进一步地，步骤(1)中所述酶切连接方法为：将获得的GmTLP5片段连接到pGEM-T载体中，得到pT-GmTLP5载体；并将pT-GmTLP5和
pCAMBIA3300-GUS进行双酶切，过夜连接，得到pCAMBIA3300-GmTLP5重组载体。
进一步地，构建pT-GmTLP5载体的具体步骤为：构建pT-GmTLP5载体的具体步骤为：GmTLP5片段与pGEM-T克隆载体连接，连接产物导入大肠杆菌DH5α中，筛选阳性转化子，送公司测序，将测序正确的克隆载体命名为pT-GmTLP5。
进一步地，构建pCAMBIA3300-GmTLP5重组载体的具体步骤为：pT-GmTLP5克隆质粒用BamH I和Sac I双酶切，回收目的基因片段；质粒pCAMBIA3300-GUS用BamH I和Sac I双酶切，回收载体大片段；连接两个回收片段，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，用100mg/L的Km筛选重组子，得到的重组子用BamH I和Sac I酶切鉴定，新构建载体命名为pCAMBIA3300-GmTLP5。
有益效果：本发明公开了一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法，通过从根腐病原菌诱导后的大豆根中克隆大豆GmTLP5(Glyma01g42670.1)基因，构建了植物过表达载体，经根癌农杆菌介导获得了转基因植株，共转化植株经根腐病原菌接种鉴定，获得了抗尖孢镰刀菌的大豆植株，表明该基因提高了大豆对尖孢镰刀菌根腐病的抗性。本发明提供的方法调控效果显著，结果准确可靠，调控方法操作简单、方便，可公式化，易于推广应用。
附图说明
图1为腐霉菌侵染下抗病品种Hb-2中GmTLP5的表达模式；
图2为立枯丝核菌侵染下抗病品种Hb-2中GmTLP5的表达模式；
图3为疫霉菌1号侵染下抗病品种Hb-2中GmTLP5的表达模式；
图4为尖孢镰刀菌侵染下抗病品种Hb-2中GmTLP5的表达模式；
图5为腐霉菌侵染下不同抗性品种中GmTLP5的表达模式；
图6为立枯丝核菌侵染下不同抗性品种中GmTLP5的表达模式；
图7为疫霉菌侵染下不同抗性品种中GmTLP5的表达模式；
图8为尖孢镰刀菌侵染下不同抗性品种中GmTLP5的表达模式；
图9为植物过表达载体pCAMBIA3300-GmTLP5的构建技术路线；
图10为植物过表达载体pCAMBIA3300-GmTLP5构建过程中的酶切电泳图，其中各泳道分别为：M：DL15000；1：pCAMBIA3300-GUS BamH I和Sac I双酶切产物；2：pT-GmTLP5 BamHI和Sac I双酶切产物；3：pCAMBIA3300-GmTLP5 BamH I和Sac I双酶切产物；
图11为pCAMBIA3300-GmTLP5菌液PCR鉴定结果，其中各泳道分别为：M：DL2000；1，2：pCAMBIA3300-GmTLP5 PCR产物；
图12为转GmTLP5基因大豆植株DNA检测电泳图，其中，M：Marker D2000；1-9：GmTLP5转基因植株DNA；
图13为转GmTLP5基因大豆植株PCR检测电泳图，其中，M：Marker D2000；1：阳性对照质粒pCAMBIA3300-GmTLP5 PCR结果；2：阴性对照；3-16：GmTLP5转基因植株PCR结果；
图14为转GmTLP5基因大豆植株RNA提取电泳图，其中，M：Marker D2000；1-6：GmTLP5转基因植株RNA；
图15为GmTLP5转基因大豆植株不同株系叶片基因表达量情况，其中，1：阴性对照植株；2-12：GmTLP5转基因大豆植株；
图16为转GmTLP5植株叶片对腐霉菌的抗性表现；
图17为转GmTLP5植株叶片对尖孢镰刀菌生物抗性表现。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详述：
实施例1：大豆GmTLP5基因的诱导表达
大豆种质Hb-2、黑河38(Hh38)、绥农29(sh29)由黑龙江省农业科学院大豆研究所提供；腐霉菌(p.u)(即终极腐霉菌Pythium ultimum)、立枯丝核菌由黑龙江省农业科学院大豆研究所提供；疫霉菌1号、尖孢镰刀菌由黑龙江省农业科学院合江分院植保室提供。
1.不同根腐病原菌侵染下，抗病品种Hb-2的GmTLP5基因表达模式：
以抗病Hb-2为试验材料，研究其在腐霉菌(P.u)、立枯丝核菌、疫霉菌、尖孢镰刀菌侵染下GmTLP5基因表达量的变化。
取试验大豆饱满的种子80粒，8个平行，用蒸馏水洗净，氯气灭菌12h，然后用灭菌去离子浸没12h，无菌条件下，均匀摆放在以无菌蛭石为基质的塑料盆里，出苗前温度控制25-26℃，暗培养，出苗后温度控制在20-25℃。第8-10d真叶展开后，保留生长一致的幼苗接种，采用大豆子叶节下胚轴接种法接种根腐病原菌，分别在接种后6h、12h、24h取大豆植株根部组织提取RNA，样品为10株材料的混合样品，实验重复二次。
进一步地，通过数字基因表达谱对不同根腐病原菌侵染下GmTLP5基因表达差异进行分析。采用TR1201法对RNA进行提取，用Qubit Fluorometer进行片段检测，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，逆转录得到双链cDNA，纯化后样品通过Ⅲumina HisegTM2000系统得到clean Tag，与大豆参考基因组比对，确定基因差异表达倍数。
此外，采用实时荧光定量PCR对不同根腐病原菌侵染下GmTLP5基因表达差异进行分析。具体方法如下：
用TIANGEN公司的RNAPrep pure试剂盒提取总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，分别以不同根腐病原菌侵染下的大豆的cDNA为模板，以SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR。
实时荧光定量PCR设置lectin基因为内参，未受侵染大豆的下胚轴cDNA为对照，不同根腐病原菌侵染的大豆胚轴cDNA为样品，重复三次，设目的基因、内参基因和NTC各一个，绘制扩增曲线，溶解曲线、数据分析，采用
Figure BDA0001595614300000061
Figure BDA0001595614300000062
使用PrimerPremier5.0软件设计引物；
检测目的基因GmTLP5的引物为：
F:5'-ATTTGGCAACCAGGATTT-3'(SEQ ID NO.1)；
R:5'-TTGTGACACCCACCGTTTA-3'(SEQ ID NO.2)；
检测lectin基因的引物为：
F：5'-CTTCGCCGCTTCCTTCAA-3'(SEQ ID NO.3)；
R：5'-GCCCATCTGCAAGCCTTTT-3'(SEQ ID NO.4)。
反应体系为：Power
Figure BDA0001595614300000071
Green PCR Master Mix 8.5μL，10mM ForwardPrimer 0.34μL，10mM Reverse Primer 0.34μL，cDNA模板0.68μL，ddH2O(灭菌蒸馏水)7.14μL，总体积17.0μL。
反应程序为：95℃10min；95℃30s，60℃1min(40个循环)；95℃1min，55℃30s，95℃30s。
如图1-4中数字基因表达谱和实时荧光定量PCR检测结果可知：在腐霉和疫霉菌1号侵染下，抗病品种Hb-2中GmTLP5基因表达量增加且在12h时达到最高；在立枯丝核菌侵染下抗病品种Hb-2中GmTLP5基因的表达量随之增加，TPM值在12h时最高，而定量PCR的GmTLP5基因的表达量在24h时达到最高；抗病品种Hb-2感染尖孢镰刀菌后GmTLP5的TPM表达水平在12h时最低但到24h时期表达量明显增加，而定量PCR的结果随着侵染时间的增加而增加。
TPM(Transcript per million clean Tags)为每一百万clean Tags中包含该转录本的拷贝数；本实验的定量PCR为相对定量PCR，需要用到内参基因；虽然TPM和定量PCR的研究对象均为RNA，但二者在数据处理方式上存在差异，从而可能导致了TPM和定量PCR的结果出现一定程度的差异。
2.不同根腐病原菌侵染下，不同抗性品种的GmTLP5基因表达模式：
以Hb-2、Hh38、sh29为试验材料，研究其在腐霉菌(P.u)、立枯丝核菌、疫霉菌1号、尖孢镰刀菌侵染下GmTLP5基因表达量的变化，实验方法如上所述。表1所示为参试大豆品种对不同根腐病原菌的抗性。
表1 参试大豆品种对不同根腐病原菌的抗性
Figure BDA0001595614300000072
Figure BDA0001595614300000081
如图5-8所示，GmTLP5基因对不同根腐病原菌的侵染都有响应，不同病原菌侵染不同品种表达量存在差异：
腐霉(P.u)侵染下，抗病品种Hb-2的表达量在24小时时最高，感病品种Hh38、sh29表达量变化不显著；
立枯丝核菌侵染下，各品种的表达量变化不大；
疫霉菌1号侵染下抗病品种Hb-2的表达量在24小时时最高，感病品种Hh38的表达量在48小时最高；
尖孢镰刀菌侵染下，抗病品种的表达量在24小时最高，增长比率高，感病品种表达量变化较小。
由此可见，以腐霉(P.u)侵染抗病品种(Hb-2)24h，GmTLP5基因表达量最为显著。
实施例2：植物过表达载体的构建
首先，对所需扩增的GmTLP5基因(如SEQ ID NO.7)的cDNA序列进行特定引物的设计，并且在引物两端分别加入BamHI和SacI酶切位点。
GmTLP5基因引物序列为:
F：CGGGATCCCGATGGTTTACTTGGCACTGTGCT(SEQ ID NO.5)；
R：CGAGCTCGTTACTGGTGGGCGGTACTAGC(SEQ ID NO.6)；
CGGGATCCCG为BamH I酶切位点；CGAGCTCG为Sac I酶切位点。
以腐霉(P.u)侵染抗病品种Hb-224h后提取的RNA反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，获得GmTLP5片段。
50μL的PCR反应体系为：20mM 10×PCR Buffer 5μL，10mM dNTP Mixture 4μL，5U/ml Ex Taq HS polymerase 1μL，20mM MgCl2 1μL，10μg/μl cDNA 2μL，10mM GmTLP5-F 2μL，10mM GmTLP5-R 2μL，ddH2O 33μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸60s共35循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
如图9所示，使用限制性内切酶BamH I和Sac I对上述PCR产物GmTLP5和pGEM-T载体进行双酶切，获得含有BamH I和Sac I酶切位点的GmTLP5片段和pGEM-T线状质粒条带。
双酶切反应50μL体系为：10×Buffer 5μL，20000U/ml BamH I 2μL，20000U/mlSac I 2μL，PCR产物或pGEM-T载体25μL，ddH2O 16μL。
酶切反应程序为：37℃酶切4h，4℃保存。
酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳及AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，用T4连接酶于16℃进行过夜连接。
连接反应20μL体系为：10×ligase Buffer 2μL，5U/μL T4 DNA ligase 2μL，GmTLP5(BamH I+Sac I)13μL，pGEM-T(BamH I+Sac I)3μL。
通过热激法将上述连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆进行摇菌抽取质粒pT-GmTLP5。
将构建成功的pT-GmTLP5克隆载体及植物表达载体pCAMBIA3300-GUS进行BamH I和Sac I双酶切，得到GmTLP5片段和带有35S启动子和nos终止子的pCAMBIA3300线性片段；分别利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对目的条带进行回收，并用T4连接酶于16℃连接反应12h，连接产物采用热激法转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行摇菌抽取质粒，得到pCAMBIA3300-GmTLP5过表达重组载体，植物过表达载体的构建得酶切电泳图如图10所示。
上述操作中：大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根公司；pGEM-T克隆载体购自promega公司；pCAMBIA3300-GUS载体由黑龙江省农业科学院大豆研究所保存；限制性内切酶BamH I和Sac I购自BioLabs公司；T4连接酶购自Thermo公司；DNA凝胶回收试剂盒购自AxyGen公司。
实施例3：根癌农杆菌介导的植物遗传转化和转基因植株的筛选
本实验中根癌农杆菌GV3101由黑龙江省农业科学院大豆研究所保存，大豆JK506由黑龙江省农业科学院大豆研究所保存。
使用冻融法将pCAMBIA3300-GmTLP5重组载体转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，以根癌农杆菌GV3101菌液为模板进行菌液PCR验证，结果如图11所示，成功构建植物过表达载体。
进一步地，利用含有重组质粒的GV3101侵染未萌发子叶节，用含有草铵膦5mg/L-15mg/L的MS培养基筛选收获的T0大豆种子，T1代种植筛选得到T2代种子进行表型鉴定，得到抗尖孢镰刀菌根腐病的转基因大豆。
子叶节转化法具体步骤：
子叶节制备：采用氯气消毒法对选取的大豆种子进行消毒处理。将消毒后的大豆种子接种于发芽培养基【1/2MSB(MS培养基无机盐成分的1/2+B5培养基有机成分的1/2)，0.7％琼脂粉，pH5.8】上培养。取5～6d的无菌幼苗，从子叶节处纵向切开，保留3～4mm下胚轴，切去萌发的顶芽及侧芽，放入预培养培养基(B5培养基+1.7mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA，0.7％琼脂粉，pH5.7)。
菌液制备：从YEP培养平板上挑取含有目的基因植物表达载体的农杆菌单菌落，接种于含有相应抗生素的YEP液体培养中，28℃，200r/min振荡培养12～24h至OD600为1.0左右。4000r/min离心10min，弃上清，用等量的YEP重悬菌液备用。
转化及筛选培养：将预培养1d的子叶节放入菌液中侵染，侵染25～30min后接种在共培养培养基(B5培养基+1.7mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+100mg/L乙酰丁香酮，0.7％琼脂粉，pH5.2)上，暗培养3～4d。用含500mg/L Cef灭菌水漂洗4～5次，接种到除菌培养基(B5培养基+1.7mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+600mg/L Cef，0.7％琼脂粉，pH5.7)上培养一周，待长出丛生芽后将外植体接种到筛选培养基(B5培养基+1.7mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+600mg/L Cef+10mg/L草铵膦，0.7％琼脂粉，pH5.7)。
抗性植株的伸长与生根：筛选两周后接种于伸长培养基(B5培养基+1.7mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+600mg/L Cef+5mg/L草铵膦，0.7％琼脂粉，pH5.7)；待丛生芽长至3～4cm时，从芽基部将芽切下，并将芽的基部在过滤的IBA(1mg/mL)中浸泡1min，将芽接入生根培养基MSB，待根系发达并有侧根长出后移栽到花盆中。
实施例4：GmTLP5表达分析及转基因大豆植株的抗性鉴定
首先提取转基因大豆植株的总DNA，结果如图12所示。根据CaMV35S启动子和bar基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，扩增片段长度约为590bp；
引物序列为:
F：5′-TTCGCAAGACCCTTCCTC-3′(SEQ ID NO.8)；
R：5′-ACCCACGTCATGCCAGTT-3′(SEQ ID NO.9)。
PCR反应体系如下：10×PCR Buffer 2.0μL；dNTP Mixture(各10mM)2.0μL；10mMPrimer–F 1.0μL；10mM Primer–R 1.0μL；5U/ml KOD-Plus-Neo 0.5μL；DNA模板1.0μL；ddH2O 12.5μL，共20.0μL。
PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸5min。
以野生植株为对照，利用含目的片段的引物对抗性植株进行PCR检测，如图13所示，琼脂糖凝胶电泳检测发现野生植株没有扩增出目的片段，而GmTLP5抗性植株扩增出特异片段，且大小一致，可见GmTLP5片段已存在于转基因植株中。本实验共检测植株175株，其中阳性植株有34株，阴性植株有141株，转化率为19.43％。
其次，进行GmTLP5基因的转录水平分析：
分别提取两个月大的空载和转GmTLP5基因T1代大豆阳性株系叶片的总RNA并反转录成cDNA，利用实时定量PCR对GmTLP5基因在转基因大豆中的表达情况进行检测。
提取大豆叶片总RNA，用1％琼脂糖凝胶电泳和测OD值的方法来检测RNA。取2ulRNA在紫外分光光度计下测A260/A230处的吸收值以及总量，测定RNA的浓度和纯度；RNA电泳液和琼脂糖凝胶用灭菌的DEPC水配制，电泳槽用新配置的电泳液清洗，取1ul RNA样点电泳，110V电压，15min左右，电泳结束后，将胶置于紫外透射仪上拍照。
如图14所示，转基因植株总RNA提取成功，未出现明显降解，28SrRNA条带亮度约为18SrRNA条带亮度的2倍，且浓度和纯度检测都达到了理想的状态，可以进行逆转录。
进一步地，以浓度及纯度检测合格的RNA为模板用于cDNA的合成。
根据GmTLP5、Tublin的cDNA序列，依据Real Time PCR引物设计原则，利用PrimerPremier5.0软件设计qRT-PCR引物。
检测GmTLP5基因的引物序列为：
F：5′-GACATCTCTTTGGTGGACGG-3′(SEQ ID NO.10)；
R：5′-GTTAGAGCCAGCGGGACA-3′(SEQ ID NO.11)；
检测Tublin基因的引物序列为：
F：5′-AACCTCCTCCTCATCGTACT-3′(SEQ ID NO.12)；
R：5′-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3′(SEQ ID NO.13)。
以反转录得到的cDNA作为qRT-PCR反应模板进行qRT-PCR扩增；反应体系为：Power
Figure BDA0001595614300000131
Green PCR Master Mix 8.5μL，10mM Primer–F 0.34μL，10mM Primer–R 0.34μL，cDNA模板0.68μL，ddH2O(灭菌蒸馏水)7.14μL，总体积17.0μL；反应程序为：95℃10min；95℃30s，60℃1min，40个循环；95℃1min，55℃30s，95℃30s。
图15显示了该基因的不同株系叶片的表达情况：其中9株较非转基因植株的表达量明显提高，表达量较非转基因植株提高20倍以上的植株有6个。
最后，进行转基因大豆病原菌抗性的离体鉴定，具体方法如下：
取检测为阳性的大豆和对照大豆的幼嫩叶片，用打孔器切割成叶圆盘，用70％乙醇浸泡5min灭菌，后用20％次氯酸钠浸泡15分钟，无菌水漂洗5遍。将处理好的叶圆盘置于PDA培养基上，后在叶圆盘上分别接种7种病原菌菌丝，包括腐霉菌(p.u)、疫霉菌1号、疫霉菌2号、疫霉菌3号、尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌和立枯丝核菌；大豆腐霉菌和立枯丝核菌由黑龙江省农业科学院大豆研究所植保室提供，大豆疫霉菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌由黑龙江省农业科学院植保室提供。接种后置于在23～25℃下培养5天，5天后根据所接种叶圆盘的菌丝生长情况作为鉴定指标。
经过对7种菌多个株系的体外抑菌试验发现，其中转GmTLP5基因多个株系的新鲜叶片对其中的5种菌体没有抑制作用，菌丝在PDA培养基上的生长抑制作用不明显；转GmTLP5基因的多个株系的新鲜叶片对腐霉菌有抑制作用(图16)；转GmTLP5基因多个株系的新鲜叶片对于尖孢镰刀菌均有明显的抑菌作用，即与非转基因对照植株相比，GmTLP5转基因植株表现出更强的抑菌作用(图17)。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 黑龙江省农业科学院大豆研究所
<120> 一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
atttggcaac caggattt 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
ttgtgacacc caccgttta 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
cttcgccgct tccttcaa 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
gcccatctgc aagcctttt 19
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
cgggatcccg atggtttact tggcactgtg ct 32
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
cgagctcgtt actggtgggc ggtactagc 29
<210> 7
<211> 723
<212> DNA
<213> Glycine max
<400> 7
atggtttact tggcactgtg ctctctgcta acgttggcct tatctttggc cacaacacat 60
gcagcaaact tcgagatcgt caacaattgc ccctacacgg tgtgggccgc ggcgagtccg 120
ggtggaggcc ggcgtctgga ccgtggccaa acgtggaacc tctgggtgaa cccgggcact 180
gccatggccc gtatatgggg ccgcaccggg tgcaactttg atggcagcgg ccgcggccgc 240
tgccaaacgg gagactgcac gggcggcctc aattgccaag gctggggggt ccctcccaac 300
acacttgcgg aattcgcgtt gaaccaattt ggcaaccagg atttctacga catctctttg 360
gtggacgggt tcaacattcc gatggacttc taccctctaa acggtgggtg tcacaaaatc 420
agttgcagcg ctgatatcaa tgggcagtgc ccggggccat taagggcacc tgggggatgc 480
aacaacccct gcactgtgtt taagacgaat gagtattgct gcaccaatgg gcaaggaagc 540
tgtgggccca caaactactc aaggttcttc aaggataggt gccatgattc ttatagttac 600
cctcaggatg atccaacaag tacttttacg tgtcccgctg gctctaacta caaggtcgtc 660
ttctgtccat tgggagaacc tcatgttact cttcatatgc ctgctagtac cgcccaccag 720
taa 723
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
ttcgcaagac ccttcctc 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
acccacgtca tgccagtt 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
gacatctctt tggtggacgg 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
gttagagcca gcgggaca 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 12
aacctcctcc tcatcgtact 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 13
gacagcatca gccatgttca 20

Claims (1)

1.一种提高大豆尖孢镰刀菌根腐病抗性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)植物过表达载体的构建：以根腐病原菌侵染大豆，提取大豆总RNA并反转录成cDNA；以所述cDNA为模板，根据大豆Glyma01g42670.1基因设计带有酶切位点的引物进行PCR扩增，获得GmTLP5片段；再通过酶切连接方法将GmTLP5片段克隆到目的载体上，获得重组载体；
(2)转化：将重组载体转化根癌农杆菌GV3101，得到含有重组质粒的GV3101；利用含有重组质粒的GV3101侵染未萌发大豆子叶节，得到抗尖孢镰刀菌根腐病的转基因大豆；
步骤(1)中所述根腐病原菌为腐霉菌、尖孢镰刀菌、疫霉或立枯丝核菌；侵染大豆12-48h高度表达GmTLP5基因；
步骤(1)中所述引物如下：
GmTLP5-F：CGGGATCCCGATGGTTTACTTGGCACTGTGCT，CGGGATCCCG为BamHI酶切位点；
GmTLP5-R：CGAGCTCGTTACTGGTGGGCGGTACTAGC，CGAGCTCG为SacI酶切位点；
步骤(1)中所述的PCR扩增：
50μL PCR反应体系为：20mM 10×PCR Buffer 5μL，10mM dNTP Mixture 4μL，5U/ml ExTaq HS polymerase 1μL，20mM MgCl2 1μL，10μg/μl cDNA 2μL，10mM GmTLP5-F 2μL，10mMGmTLP5-R 2μL，ddH2O 33μL；
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸60s共35循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；
步骤(1)中所述酶切连接方法为：将获得的GmTLP5片段连接到pGEM-T载体中，得到pT-GmTLP5载体；并将pT-GmTLP5和pCAMBIA3300-GUS进行双酶切，过夜连接，得到pCAMBIA3300-GmTLP5重组载体；
构建pT-GmTLP5载体的具体步骤为：GmTLP5片段与pGEM-T克隆载体连接，连接产物导入大肠杆菌DH5α中，筛选阳性转化子，送公司测序，将测序正确的克隆载体命名为pT-GmTLP5；
构建pCAMBIA3300-GmTLP5重组载体的具体步骤为：pT-GmTLP5克隆质粒用BamH I和SacI双酶切，回收目的基因片段；质粒pCAMBIA3300-GUS用BamH I和Sac I双酶切，回收载体大片段；连接两个回收片段，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，用100mg/L的Km筛选重组子，得到的重组子用BamH I和Sac I酶切鉴定，新构建载体命名为pCAMBIA3300-GmTLP5。
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